UNIVERSIDAD CENTRAL“MARTA ABREU” DE LAS VILLAS

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA DE LAS PLANTAS

Tesis presentada para optar por el grado académico deMaster en Biotecnología Vegetal

Determinación de compuestos bioquímicos y su relacióncon la respuesta de plantas de Musa spp. inoculadas

artificialmente con Mycosphaerella fijiensis, en casa decultivo

Autora: Cynthia Sánchez García

Tutora: Dra. Yelenys Alvarado Capó

Santa Clara2010

A mi familia

Que sirvan estas cortas líneas para expresar todo mi agradecimiento a las personas queme han ayudado y han hecho posible este trabajo:

- En primer lugar quiero agradecer a mi tutora la Dra. Yelenys Alvarado Capó, por su

ayuda, su preocupación y por haberme enseñado y guiado en estos años de vida

laboral.

- A mis padres, por ser mi mayor inspiración tanto personal como profesionalmente,

por su apoyo incondicional y sobre todo por su cariño infinito.

- A mi esposo por ser mi buen compañero en las buenas y en las malas, por su

positivismo, su apoyo, su paciencia y sobre todo por su amor.

- A mis amigos y compañeros del laboratorio, Mileidy, Mayra, Michel y Berkys, por su

disposición y gran ayuda en todo momento, sin la cual no hubiera podido lograrlo.

- A mi amigo Pepín, por su apoyo imprescindible y su paciencia

- A Ángel Mollineda por su amistad sincera, su disposición y su ayuda incondicional.

- Al Dr. Orelvis Portal, al Dr. Elio Jiménez, a Aminael Sánchez y a la Dra. Novisel

Veitía por su ayuda y sus acertados consejos.

- A los integrantes del laboratorio de Biología Molecular: Miladys, Luis, Baby, Neyda

y María Ileana por su apoyo y disposición en todo momento.

- A Amado y los demás trabajadores de la fase de aclimatización, por su labor

silenciosa pero esencial.

- Al Dr. Raúl Barbón, a Martha y Osmildo por su apoyo.

- A todos los profesores de la Maestría en Biotecnología Vegetal por su peso

decisivo en mi formación profesional

A todos aquellos que de una forma u otra han tenido que ver con esta

investigación. A todos, muchas gracias.

RESUMEN

La enfermedad denominada Sigatoka negra, causada por el hongo Mycosphaerella

fijiensis es clasificada como la enfermedad foliar de plátanos y bananos más devastadora

en todo el mundo. Aún es muy limitado el conocimiento de los eventos bioquímicos

involucrados en la interacción Musa spp.-M. fijiensis, por lo que el estudio de este

patosistema brinda nuevas herramientas para los programas de mejoramiento genético

para el control de la enfermedad. Es por esto que el objetivo de este trabajo fue determinar

compuestos bioquímicos y su relación con la respuesta de plantas de Musa spp.

inoculadas artificialmente con M. fijiensis, en casa de cultivo. Para esto, se detectó la

presencia de dichos compuestos en los diferentes estados de síntoma en hojas de los

genotipos de Musa ‘Grande naine’ (susceptible) y ‘Calcutta 4’ (resistente) y se cuantificó su

acumulación en el tiempo, después de la inoculación. Como resultado, se observó un

incremento significativo en la actividad peroxidasa, fenilalanina amonio liasa y β-1,3

glucanasa, así como en el contenido de fenoles totales, anión superóxido y antocianinas,

en plantas de ‘Calcutta 4’ inoculadas, respecto a las no inoculadas. Resultados similares

se observaron en el genotipo ‘Grande naine’, con excepción en la actividad β-1,3

glucanasa, donde no se encontraron diferencias entre las plantas inoculadas y los

controles. Se demostró la relación entre el aumento de estos compuestos bioquímicos y la

respuesta de la planta ante la inoculación del patógeno, en ambos genotipos. Además,

que la inducción de la mayoría de ellos estuvo relacionada directamente con la aparición

de los primeros síntomas, la que ocurrió más tempranamente en el genotipo resistente.

Estos resultados ofrecen nuevas evidencias de los mecanismos de respuesta defensiva de

las plantas de Musa spp ante la infección con M. fijiensis, a la vez que brindan nuevas

herramientas para los programas de mejoramiento para el control de la enfermedad.

1. INTRODUCCIÓN

Los bananos y plátanos constituyen la principal fuente de alimentos para más de 400

000000 de personas en el mundo y son además, un renglón fundamental en la economía

de muchos países tropicales (Martín et al., 2006).

Entre la enfermedades que atacan a estos cultivo se encuentra la denominada Sigatoka

negra, causada por el hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet (anamorfo:

Pseudocercospora fijiensis (Morelet) Deighton), la cual es considerada la enfermedad foliar

más destructiva y costosa de los plátanos y bananos a nivel mundial (Arzanlou et al.,

2008).

La Sigatoka negra causa una reducción significativa en el área fotosintética de la hoja y la

madurez prematura de los frutos durante su transportación y almacenaje, lo que ocasiona

grandes pérdidas en la exportación de este cultivo (Cañas-Gutiérrez et al., 2006). Esta

enfermedad, desde que fue descrita su presencia en Cuba (Vidal, 1992), ha tenido un alto

impacto en el aumento de los costos de producción de los plátanos y bananos (Pérez,

2002).

La Sigatoka negra se controla fundamentalmente mediante la aplicación de fungicidas

químicos, ya que las restantes alternativas no han brindado un control aceptable en el

contexto productivo (Henderson et al., 2006). En este sentido, las labores culturales juegan

un papel importante para eliminar o reducir las condiciones óptimas para que se desarrolle

la enfermedad. Sin embargo, estas medidas son insuficientes cuando no se complementan

con el uso de fungicidas (Cho et al., 2008).

Algunos géneros y especies bacterianas tales como: Pseudomonas, Serratia entomophyla,

Serratia marcescens y Bacillus cereus han sido utilizados para el control de M. fijiensis

(Riveros et al., 2003). No obstante, los resultados han sido discretos en el control de la

enfermedad.

Debido al alto costo de los fungicidas, a la existencia de especies resistentes, así como a

los daños medioambientales que provocan su utilización, los genotipos resistentes ofrecen

el único método de control viable y durable, sin cambiar las técnicas tradicionales de

manejo que utilizan los productores (Raut y Ranade, 2004). A pesar de esto, aún se

consideran insuficientes los resultados en el mejoramiento genético en plantas de Musa

spp. ante esta enfermedad, es por esto que las investigaciones encaminadas a la

obtención de genes candidatos para ser utilizados en la transformación genética, cobran

cada vez una mayor relevancia.

Se conoce muy poco acerca de la filogenia y la biología molecular de los bananos, a pesar

de ser el cultivo frutal número uno en el mundo (Thomas-Hall et al., 2007) y aun son

escasas las evidencias experimentales de lo que constituye la respuesta defensiva de la

planta, en el patosistema Musa spp.-M. fijiensis. No obstante, se han realizado estudios

genómicos en Musa spp., por ejemplo, en Musa acuminata subsp. burmannicoides

'Calcutta 4' (Vilarinhos et al., 2003), en Musa balbisiana 'Pisang Klutuk Wulung' (Šafá et

al., 2004) y en Musa acuminata 'Tuu' (Ortiz et al., 2005). De igual forma, Portal (2008)

identificó genes involucrados en la respuesta defensiva de Musa spp. ante M. fijiensis, en

plantas del cultivar ‘Grande naine’ (AAA).

Aunque se ha avanzado en el estudio de los genes involucrados en la interacción Musa

spp.-M. fijiensis, este conocimiento aun es limitado e insuficiente, por lo que es necesario

aumentar el conocimiento relacionado con la respuesta de la planta a otros niveles

moleculares, con el fin de lograr un entendimiento global de esta interacción planta-

patógeno.

La interacción planta-patógeno desencadena una compleja red de eventos moleculares y

citológicos, los cuales proveen al hospedero de resistencia o susceptibilidad frente al

patógeno (Garcion et al., 2007). La defensa constitutiva o pasiva constituye el primer

obstáculo que tiene que evadir un patógeno y está representada por elementos

morfológicos, estructurales y químicos. Estas barreras las constituyen características

estructurales tales como: presencia de apéndices epidérmicos, espesor, dureza y

composición química de los tejidos, cantidad y calidad de la cera y cutícula, tamaño y

frecuencia de estomas y lenticelas, lignificación y suberificación de zonas abiertas por

daños mecánicos o heridas, etc. (Ferreira et al., 2007).

Tras el ataque de los patógenos a la planta, ésta pone en marcha mecanismos de

respuesta inducida como son la lignificación, la formación de papilas, el enriquecimiento de

la pared celular con glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, o la oclusión vascular. Junto al

desarrollo de estructuras locales para bloquear la entrada de los patógenos, también se

acumulan sustancias alrededor del lugar de la infección, conocidas como fitoalexinas

(fenoles, terpenoides, poliacetilenos y derivados de ácidos grasos), que incluyen una

variedad de productos naturales que se producen en mayor cantidad tras la entrada de un

patógeno y poseen capacidad antimicrobiana, así como la síntesis de proteínas

relacionadas con la patogénesis PR (del inglés: Pathogenesis Related) (Montesinos,

2000).

Se han encontrado evidencias de la existencia de tales mecanismos defensivos en las

plantas ante el ataque por el patógeno en varios patosistemas como: Cucumis sativus-

Pythium aphanidermatum (Chen et al., 2000), Triticum spp.-Fusarium graminearum

(Mohammadi y Kazemi 2002), Sorghum vulgare-Sclerotium rolfsii (Maurya et al., 2007);

Oryza sativa L.-Pyricularia grisea (Sundravadana et al., 2007; Bhadauria et al., 2010), sin

embargo, en el patosistema Musa spp.-M. fijiensis tales evidencias se desconocen o son

muy limitadas. Es por ello, que el análisis bioquímico de esta interacción, resulta necesario

para lograr un entendimiento global de este complejo proceso.

En este trabajo, por primera vez se determinarán compuestos bioquímicos relacionados

con la respuesta de plantas de los genotipos de Musa ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ ante la

inoculación artificial con M. fijiensis.

Para esto, se trazaron los objetivos siguientes:

Objetivo general:

Determinar compuestos bioquímicos y su relación con la respuesta de plantas de Musa

spp. inoculadas artificialmente con Mycosphaerella fijiensis, en casa de cultivo.

Objetivos específicos:

1. Caracterizar fenotípicamente plantas de ‘Grande naine’ y ’Calcutta 4’ en casa de

cultivo.

2. Detectar la presencia de compuestos bioquímicos en los diferentes estados de

síntoma en hojas de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ inoculadas

artificialmente con M. fijiensis.

3. Cuantificar compuestos enzimáticos y no enzimáticos en diferentes tiempos

después de la inoculación en hojas de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’

inoculadas artificialmente con M. fijiensis.

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Generalidades del cultivo de Bananos y Plátanos

Los bananos y plátanos constituyen la principal fuente de alimentos para más de 400

000000 de personas en el mundo y son además, un renglón fundamental en la economía

de muchos países tropicales (Martin et al., 2006). Países de Asia, India y algunos países

latinoamericanos lideran la producción de bananos; solamente en la India se produjeron

más de 20 mil millones de toneladas en el año 2007 (FAOSTAT, 2008).

Entre las enfermedades más importantes que afectan a los bananos y plátanos está el Mal

de Panamá causado por Fusarium oxysporum f. sp. var. cubense, la enfermedad causada

por el virus Bunchy Top del banano (BBTV) y la enfermedad del Moko causada por

Ralstonia solanacaearum (Marín et al., 2003). Sin embargo, ninguna de estas

enfermedades ha producido daños tan severos a la producción mundial de bananos y

plátanos, como las manchas foliares de Sigatoka causadas por Mycosphaerella spp., la

cual es conocida como Sigatoka negra o Rayado negro de la hoja (Mourichon y Fullerton,

1990; Carlier et al., 2000).

2.2 La Sigatoka negra en Musa spp.

La Sigatoka negra o Rayado negro de la hoja es considerada la enfermedad foliar más

destructiva y costosa de los plátanos y bananos a nivel mundial (Arzanlou et al., 2008).

Esta enfermedad fue observada por primera vez en el valle de Sigatoka en Fiji en el año

1963 y subsecuentemente se ha detectado desde el Pacífico al Sudeste asiático.

Posteriormente fue identificada en Honduras en 1972, en Zambia en 1973 y en varias

regiones productoras de bananos y plátanos de América Latina, África y Australia

(Stansbury et al., 2006).

La Sigatoka negra tiene poco efecto sobre el comportamiento vegetativo de la planta:

emergencia de nuevas hojas, altura de la planta, etc.; sin embargo, tiene un efecto

significativo sobre el rendimiento del cultivo: peso del racimo, cantidad de racimos por

hectárea y por ciclo de cultivo (Valerio et al., 2002). Además, causa una reducción

significativa en el área fotosintética de la hoja y provoca madurez prematura de los frutos

durante su transportación y almacenaje, lo que ocasiona grandes pérdidas en la

exportación de este cultivo (Cañas-Gutiérrez et al., 2006).

Esta enfermedad, desde que fue descrita su presencia en Cuba (Vidal, 1992), ha tenido un

alto impacto en el aumento de los costos de producción de los plátanos y bananos (Pérez,

2002).

2.2.1 Agente causal

La Sigatoka negra es causada por el hongo heterotálico Mycosphaerella fijiensis Morelet

(Mourichon et al., 1990; Conde-Ferraéz et al., 2007), su ciclo de vida está caracterizado

por dos estados: perfecto (teleomorfo) e imperfecto (anamorfo) (Alexoupoulos y Mims,

1979).

Estado perfecto: (Teleomorfo): Clase: Ascomycetae, Subclase: Euascomyceta, Orden:

Pseudospaeriles, Familia: Mycosphaerellaceae, Género: Mycosphaerella, Especie: fijiensis

Estado imperfecto: (Anamorfo): Clase: Deuteromycetae, Subclase: Hyphomycetae, Orden:

Hyphomycetales, Familia: Dematiaceae, Género: Pseudocercospora, Especie: fijiensis

Los estudios citológicos realizados por Lepoivre et al. (2002) demuestran que M. fijiensis

es un parásito biotrófico en los primeros estados, que coloniza inicialmente los espacios

intercelulares sin la formación de haustorios. Posterior a la penetración a través de los

estomas, las hifas crecen entre las células dentro del tejido, que se torna necrótico,

momento en que el hongo crece saprofíticamente en el tejido muerto; por esto es

clasificado con un hongo hemibiótrofico, por su compleja interacción con el hospedante

(Lepoivre et al., 2002).

Sintomatología

La Sigatoka negra fue descrita por primera vez en 1964 por Rhodes, pero fueron Meredith

y Lawrence (1969) quienes realizaron la descripción detallada de los síntomas basándose

en sus observaciones. Fouré (1985), redefinió los síntomas y propuso seis estadios de

desarrollo de la enfermedad, acorde con la evolución de los síntomas en plantas adultas

cultivadas en condiciones naturales (Tabla 1).

Tabla 1. Estado de desarrollo de los síntomas de la enfermedad Sigatoka negra en condiciones decampo (Marín et al., 2003)

Meredith y Lawrence(1969)

Fouré(1985)

Descripción

........ Estado 1a Marcas despigmentadas (blanquecinas o amarillas)solo observadas por la parte abaxial de la hoja

Estado inicial de pecas Estado 1b Pecas rojo parduzcas en la parte abaxial de la hoja

Primer estado de raya Estado 2 Pecas rojo parduzcas en la parte abaxial y adaxialde la hoja

Segundo estado deraya

Estado 3 Rayas que cambian de rojizas a pardo oscuro

Primer estado demancha

Estado 4 Rayas pardo oscuras en la parte abaxial de la hojay negras en la adaxial

Segundo estado demancha

Estado 5 Manchas pardo oscuras a negras con halo clorótico

Tercer (maduro)estado de manchas

Estado 6 Manchas pardo oscuras a negras con centrossecos de color gris

Fullerton y Olsen (1995) establecieron una escala para la evaluación de la enfermedad,

utilizando la inoculación artificial en casa de cultivo. Estos autores solo reconocieron cinco

estados, los cuales difieren de los descritos por Fouré (1985). Posteriormente esta escala

fue redefinida por Alvarado et al. (2003), como se muestra en la tabla 2.

Tabla 2. Escala descriptiva para la evaluación del desarrollo de los síntomas en hojas de Musa spp.inoculadas con M. fijiensis Morelet en casa de cultivo (Alvarado et al., 2003)

Estado Descripción

Estado 0 Hoja sin síntoma

Estado 1 Hojas con pequeñas lesiones puntiformes de coloración rojiza por la parte abaxial y sinsíntoma la adaxial

Estado 2 Hoja con manchas de contornos regulares o irregulares de coloración pardo-rojiza por ella parte abaxial y sin síntoma la adaxial

Estado 3 Hoja con manchas de contornos regulares o irregulares de coloración pardo-rojiza por laparte adaxial

Estado 4 Hojas con manchas negras (elípticas o circulares) con bordes cloróticos y halo acuoso.La hoja mantiene áreas de tejido verde

Estado 5 Hojas con manchas negras con centros secos grises, las hojas pueden estarcompletamente necrosadas y colgar del pseudotallo

Epifitiología

Aunque M. fijiensis se disemina básicamente por ascosporas (estructuras de reproducción

sexual), los conidios (estructuras de reproducción asexual) juegan un papel importante en

la diseminación de la enfermedad, a pesar de encontrarse en cantidades inferiores (Burt,

2003) (Figura 1). Las ascosporas son producidas en el pseudotecio, en las lesiones

maduras de las hojas más viejas o muertas de la planta y se producen en la parte adaxial

y abaxial de las hojas (Meredith y Lawrence, 1969), no obstante Gaulh et al. (2000)

encontraron que existen mayor número de pseudotecios y ascosporas en la parte abaxial

de las hojas.

Algunos factores climáticos como la temperatura y la humedad, son determinantes en la

velocidad de evolución de los síntomas de la enfermedad (Porrás y Pérez, 1997). El viento

se ha considerado como el principal medio de transportación de los conidios y ascosporas

hacia las plantas de Musa spp. cercanas (Burt, 2003).

Figura 1. Ciclo infeccioso de M. fijiensis en Musa spp. (tomado de Bennet y Arneson, 2003)

2.2.2 Medidas de control

Uso de fungicidas

La Sigatoka negra se controla fundamentalmente mediante la aplicación de fungicidas

químicos, ya que las restantes alternativas no han brindado un control aceptable en el

contexto productivo (Henderson et al., 2006). El manejo de esta enfermedad basado

solamente en el uso de productos químicos es posible, pero implica un costo muy elevado,

especialmente para los pequeños y medianos productores que son los más afectados

(Marín et al., 2003).

Pseudotecio

Las ascosporas sondiseminadas por el viento alargas distancia hasta una

nueva planta

Las ascosporas infectan las hojas através de los estomas

Los conidióforos emergen através del estoma y producen

conidios

Los conidióforos infectan lashojas a través de los estomas

Los espermogonios fertilizanhifas vecinas para producir

pseudotecios

espermogonioespermacios

La infección produce rayasestrechas de color marrón las

cuales se oscurecen yexpanden formando grandes

áreas de tejido necrótico

Se producenestructuras sexuales

en las lesionesmaduras

Ascosporas

Labores culturales

Las labores culturales juegan un papel importante en eliminar o reducir las condiciones

óptimas para que se desarrolle la enfermedad. Estas comprenden la eliminación de las

hojas infectadas, la existencia de un espacio adecuado entre las plantas y un eficiente

drenaje en las plantaciones. Sin embargo, estas medidas son insuficientes cuando no se

complementan con el uso de fungicidas (Cho et al., 2008).

Control biológico

La aparición de cepas de M. fijiensis resistentes a los fungicidas químicos usados

tradicionalmentes, así como el incremento mundial de las demandas por lograr mayor

limpieza en la producciones, ha propiciado un aumento en el interés de encontrar

alternativas biológicas para el control de la Sigatoka negra (Marín et al., 2003).

Algunos géneros y especies bacterianas tales como: Pseudomonas, Serratia entomophyla,

Serratia marcescens y Bacillus cereus han sido utilizados para el control de M. fijiensis

(Riveros et al., 2003). Serenade® es un producto de AgraQuest Inc., elaborado a partir de

Bacillus subtilis, el cual posee tres grupos de metabolitos conocidos como lipopéptidos que

actúan de manera sinérgica para destruir el tubo germinativo del patógeno y las

membranas miceliales (Edgecomb y Manker, 2006).

No obstante, los resultados con la aplicación del control biológico han sido discretos en el

control de la enfermedad.

Uso de genotipos resistentes

Debido al alto costo de los fungicidas, a la existencia de especies resistentes a estos, así

como por los daños medioambientales que provoca su utilización, los genotipos

resistentes ofrecen el único método de control viable y duradero, sin cambiar las técnicas

tradicionales de manejos que utilizan los productores (Raut y Ranade, 2004).

Los bananos y plátanos son cultivos difíciles de mejorar genéticamente, debido a que la

mayoría de las variedades importantes y populares son estériles, no producen semillas y

en su mayoría son partenocárpicas (Heslop-Harrison y Schwarzacher, 2007). A pesar de

esto, han tenido éxito los programas de mejoramiento genético mediante hibridación

llevados a cabo en el Instituto Internacional de Agricultura Tropical (IITA), en Nigeria (Ortiz

y Vuylsteke, 1997) y la Fundación Hondureña de Investigación Agrícola (FHIA), donde se

han desarrollado híbridos resistentes (FHIA-01, FHIA-03, FHIA-18, FHIA-21, FHIA-25) a la

Sigatoka negra (FHIA, 2007).

La transformación genética se ha convertido en una herramienta importante para el

mejoramiento de plátanos y bananos, lo que ha permitido la obtención de plantas

transgénicas de banano que expresan proteínas antifúngicas (Remy et al., 1998) y

péptidos antimicrobianos (Pérez-Hernández, 2000).

A pesar de esto, aún se consideran insuficientes los resultados en el mejoramiento

genético en plantas de Musa spp. ante esta enfermedad. Es por esto, que las

investigaciones encaminadas a la obtención de genes candidatos para ser utilizados en la

transformación genética cobran cada vez una mayor relevancia.

2.3 Interacción Musa spp.-Mycosphaerella fijiensis

2.3.1 Tipos de interacción

La interacción entre plantas de Musa spp. y M. fijiensis permaneció desconocida por un

largo período de tiempo (Lepoivre et al., 2003). Un estudio en condiciones naturales, con

alrededor de 50 especies de Musa, pertenecientes a diferentes grupos genéticos e

infectadas con M. fijiensis, permitió la agrupación de genotipos de banano en tres

categorías: altamente resistente (interacción incompatible), parcialmente resistente y

susceptible (interacción compatible) (Carlier et al., 2002).

Los cultivares de banano interactúan con el patógeno M. fijiensis en una de las dos formas

distintas, ya sea mediante una interacción compatible o una incompatible (Hoss et al.,

2000). En el caso de la interacción compatible, ocurre el desarrollo completo de la

enfermedad y está asociada a la necrosis de los tejidos y la esporulación del hongo. Un

ejemplo de este tipo de interacción ocurre en plantas del Subgrupo Cavendish (Musa

acuminata cv ‘Grande naine’, AAA). En la interacción incompatible, se observa una

resistencia a la enfermedad, el desarrollo de los síntomas se bloquea y no ocurre la

esporulación sexual o asexual del hongo (Hoss et al., 2000). Un ejemplo de este tipo de

interacción ocurre en Musa acuminata L.A. Colla subsp. burmannicoides E.A. (‘Calcutta 4’,

AA) (De Langhe, 1996). Este fenotipo es muy similar a la respuesta de hipersensibilidad

observada en otras interacciones planta-patógeno (Hoss et al., 2000).

2.3.2 Bases moleculares de la interacción

El largo periodo de co-evolución entre las plantas y los microorganismos ha conducido a la

existencia de complejos mecanismos de defensa y ataque, los cuales comprenden un

sistema de defensa innato en las plantas y la presencia de factores de virulencia en los

patógenos (Stahl y Bishop, 2000).

Este sistema defensivo comienza con el reconocimiento por parte de la planta, de

moléculas microbianas conservadas. Este mecanismo puede suprimirse por la presencia

de factores de virulencia (efectores), codificados por genes avr (del inglés: Avirulence

genes) en el patógeno, ante lo cual las plantas responden mediante un mecanismo

defensivo que involucra los genes de resistencia R (del inglés: Resistance). Estos genes R

codifican proteínas que reconocen los denominados efectores del patógeno, lo que

consecuentemente activa la respuesta defensiva en la planta a través de complejas

cascadas de señalización (Bent y Mackey, 2007).

Mediante el empleo de marcadores moleculares se han realizado estudios acerca de la

diversidad genética de M. fijiensis, sin embargo, se conoce muy poco acerca de los

mecanismos moleculares involucrados en la interacción hospedero-patógeno en este

patosistema (Cho et al., 2008).

No obstante, autores como Pei et al. (2007) señalaron la presencia de regiones

conservadas de sitios de unión a nucleótido (NBS) (del inglés: Nucleotide-Binding Sites) y

de repeticiones ricas en leucina (LRR) (del inglés: Leucine-Rich Repeat), en genes R del

genoma de cinco cultivares de banano (AAA, AAB, ABB, AA y BB) y específicamente en el

genotipo ‘Calcutta 4’ resistente a la Sigatoka negra.

Además, se han identificado transcriptos de ARNm descubiertos a partir de bibliotecas

EST (del inglés: Expressed Sequence Tags) en M. fijiensis, en donde se han identificado

genes potenciales involucrados en la interacción compatible de Musa spp.-M. fijiensis, los

cuales poseen homología con genes de virulencia de otros patógenos (Cho et al., 2008).

En este sentido, Portal (2008) identificó genes involucrados en la respuesta defensiva de

Musa spp. ante M. fijiensis, en el cultivar ‘Grande naine’ (interacción compatible) mediante

la construcción de una biblioteca de ADN complementario (ADNc). Este autor identificó

genes involucrados en la ruta de los fenilpropanoides, en el mecanismo de transducción

de señales vía ácido jasmónico y etileno, varias proteínas relacionadas con la patogénesis

así como otras enzimas relacionadas con la síntesis de compuestos detoxificantes.

Además, Cruz-Cruz et al. (2009) encontraron una fitoanticipina con actividad antifúngica in

vitro contra M. fijiensis en una infusión de hojas de plantas del cultivar ‘Grande naine’ de

cuatro meses de crecidas

Aunque se ha avanzado principalmente en el estudio de los genes involucrados en el

patosistema Musa spp.-M. fijiensis, el conocimiento de los mecanismos moleculares que

se desencadenan tanto el la interacción compatible como incompatible aun es limitado e

insuficiente. Es por ello, que los estudios a nivel de proteínas y de otros compuestos

bioquímicos relacionados con la respuesta de la planta ante el patógeno, juegan un papel

importante para lograr un entendimiento global de esta interacción.

2.3.3 Respuesta de defensa de la planta

Las plantas poseen varias líneas de defensa contra la invasión de patógenos, las cuales

incluyen barreras preexistentes y la respuesta inducida. La interacción planta-patógeno

desencadena una compleja red de eventos moleculares y citológicos, los cuales proveen

al hospedero de resistencia o susceptibilidad frente al patógeno. Usualmente existe una

distinción entre barreras preexistentes y defensa inducida en la planta, lo cual conduce a

los conceptos de defensa constitutiva (pasiva) o inducida (activa) (Garcion et al., 2007).

Defensa constitutiva

La defensa constitutiva o pasiva constituye el primer obstáculo que tiene que evadir un

patógeno antes de colonizar el tejido vegetal y está representada por elementos

morfológicos, estructurales y químicos (Ferreira et al., 2006). Estas barreras las

constituyen características estructurales tales como: presencia de apéndices epidérmicos

(pelos, escamas, papilas, etc.); espesor, dureza y composición química de los tejidos

epidérmicos; cantidad y calidad de la cera y cutícula que recubre las células epidérmicas;

tamaño y frecuencia de estomas y lenticelas; lignificación y suberificación de zonas

abiertas por daños mecánicos o heridas. Además de estas barreras, las plantas acumulan

metabolitos secundarios, que en muchos casos poseen propiedades antimicrobianas y que

van a actuar en el lugar de penetración del patógeno (Ferreira et al., 2007).

Respuesta defensiva inducida

Tras el ataque del patógeno a la planta, ésta pone en marcha mecanismos de respuesta

local como son la lignificación, la formación de papilas, el enriquecimiento de la pared

celular con glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, o la oclusión vascular. Junto al desarrollo

de estructuras locales para bloquear la entrada de los patógenos, también se acumulan

sustancias alrededor del lugar de la infección, conocidas como fitoalexinas (fenoles,

terpenoides, poliacetilenos y derivados de ácidos grasos), que incluyen una gran cantidad

de compuestos constitutivos que se producen en mayor cantidad tras la entrada de un

patógeno y poseen capacidad antimicrobiana; así como la síntesis de proteínas

relacionadas con la patogénesis PR (del inglés: Pathogenesis Related) (Montesinos,

2000).

Lignificación

Debido a sus propiedades químicas y mecánicas, la lignina representa una importante

barrera contra los patógenos (Humphreys y Chapple, 2002). La lignina es un polímero

complejo formado por cadenas largas de ácidos fenólicos, este es un componente

estructural principal de la pared celular de las plantas. Tanto la lignina como sus

precursores fenólicos son de por sí tóxicos a la mayoría de los patógenos (Basha et al.,

2006) y su polimerización hace a la pared celular más gruesa y resistente, lo que restringe

la penetración y la degradación de esta ante el ataque de patógenos (Ferreira et al., 2007).

La lignina relacionada con la defensa de la planta ante la infección por patógenos puede

estar depositada sobre toda la pared de la célula o grupo de células afectadas, o

solamente alrededor del sitio de infección. Algunos artículos científicos reseñan la

evidencia de la correlación entre la inducción de la formación de la lignina y el proceso de

defensa de la planta (Moersbacher y Mendgen, 2000; Smith et al., 2007). Se ha

demostrado además, que la lignina de defensa depositada en respuesta a estrés biótico o

abiótico, posee una composición diferente a la lignina depositada durante el proceso de

crecimiento y desarrollo de la planta (Garcion et al., 2007).

Aunque no existen evidencias experimentales de eventos relacionados con la inducción de

deposición de lignina en plantas de Musa spp. ante la infección por M. fijiensis, estos han

sido descritos en otros patosistemas.

En este sentido, autores como Smith et al. (2007) utilizando técnicas histoquímicas,

observaron la inducción de lignificación en el sitio de penetración en dos especies de

Eucalipto (Eucalyptus globulus y Eucalyptus nitens) frente a la infección por

Mycosphaerella spp. De igual forma, Sundravadana et al. (2007) observaron un

incremento en la producción de enzimas relacionadas con el proceso de lignificación en

plantas de Oryza sativa L. contra el patógeno Pyricularia grisea.

Compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos se inducen en la mayoría de los tejidos vegetales brindando

resistencia a la planta. Este es considerado uno de los eventos moleculares más

importantes como parte del proceso defensivo ante el ataque por patógenos (Walters et

al., 2005).

La acumulación de compuestos fenólicos es un proceso muy controlado y su nivel de

expresión y composición varía considerablemente entre los organismos, tejidos, etapas de

desarrollo y con las condiciones medioambientales (Winkel-Shirley, 2002).

Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios antimicrobianos encontrados en

las plantas, que en algunos casos son directamente tóxicos a patógenos como:

Colletotrichum falcatum Went (Ramesh et al., 2001) y Rhizoctonia solani Kuhn (Kalim et

al., 2003).

Los niveles de expresión de varios genes que codifican las enzimas clave en la biosíntesis

de los fenoles, en la ruta de los fenilpropanoides, se incrementan en respuesta a factores

tanto abióticos como bióticos. Estas enzimas incluyen la fenilalanina amonio-liasa (PAL, de

sus siglas en inglés: Phenylalanine ammonia-lyase), la cinamato 4-hidroxilasa (C4H) y la

4-cumarato coenzima A ligasa (4CL) (Clé et al., 2008).

El incremento en la producción de compuestos fenólicos y su papel en el proceso de

defensa de las plantas ha sido observado en varios patosistemas como: Cucumis sativus-

Pythium aphanidermatum (Chen et al., 2000), Triticum spp.-Fusarium graminearum

(Mohammadi y Kazemi 2002), Sorghum vulgare-Sclerotium rolfsii (Maurya et al., 2007),

entre otros. Sin embargo, en el patosistema Musa spp.-M. fijiensis dicho mecanismo de

respuesta no ha sido descrito.

Especies reactivas de oxígeno

Las Especies Reactivas del Oxígeno (ROS) se forman por la sucesiva reducción de un

electrón del oxígeno molecular (O2). Entre ellas se incluyen el anión superóxido (O2-), el

peróxido de hidrógeno (H2O2), el radical hidroxilo (OH.) y el radical hidroperoxil (HO2.). Las

ROS se generan durante el proceso de desarrollo de la planta y además, por una gran

cantidad de factores ambientales (Shetty et al., 2008).

Durante la interacción planta-patógeno, la generación y acumulación de las ROS coincide

con la inducción de muerte celular, como parte de la respuesta hipersensible en las

plantas (Grant y Loake, 2000) y se ha demostrado que se producen principalmente en la

membrana plasmática (Sagi y Fluhr, 2001). Incluso en condiciones normales, las plantas

superiores producen a menudo especies reactivas de oxígeno durante los procesos

metabólicos, por la vía de la reacción de Mehler en los cloroplastos, el transporte

electrónico en la mitocondria y la fotorespiración en los peroxisomas (Neil et al., 2002).

El papel de estas especies reactivas de oxígeno en la respuesta de plantas de Musa spp.

ante la infección por M. fijiensis, todavía se desconoce, no obstante, Leiva et al., 2004

evaluaron el patrón de expresión de la enzima superóxido dismutasa (SOD), la cual esta

directamente relacionada con el estrés oxidativo y las ROS, en plantas de los cultivares

‘Grande naine’ y ‘Fougamou’ inoculados con una toxina de M. fijiensis (juglone). Estos

autores observaron una variación en el patrón de expresión de esta enzima, la cual fue

mayor en las plantas inoculadas respecto a los controles.

Además, existen evidencias del papel de estas ROS en la defensa de la planta en otros

patosistemas. En este sentido, Patykowski y Urbanek (2003) informaron acerca del

aumento en el contenido del anión superóxido, el radical hidroxilo, así como de la actividad

de enzimas relacionadas con las ROS en la fracción apoplástica de hojas de tomate ante

la infección por Botrytis cinerea. Estos autores señalan que el aumento de estas moléculas

se produce en la fase temprana de la infección y que ocurre en plantas con cierta

resistencia a la enfermedad, en comparación con las plantas susceptibles.

Igualmente, Davies et al. (2006) observaron un aumento en la producción de especies

reactivas de oxígeno en suspensiones celulares de Arabidopsis thaliana en respuesta a la

aplicación de un elicitor de F. oxysporum y resaltaron su implicación en la resistencia basal

de la planta.

Compuestos enzimáticos

El desarrollo de un sistema de defensa antioxidante en las plantas, las protege contra el

daño oxidativo, debido a la supresión parcial de la producción de las especies reactivas de

oxígeno, a la vez que detoxifican la célula de los residuos producidos por estas (Murgia et

al., 2004). En esta tarea participan tanto compuestos enzimáticos como no enzimáticos

(Yoshimura et al., 2004).

El aumento en el nivel de la actividad de enzimas como peroxidasa, fenilalanina amonio-

liasa, lipooxigenasas, superóxido dismutasa, glutatión reductasa, catalasa, entre otras, se

usan frecuentemente como indicador de estrés oxidativo en las plantas (Tan et al., 2006;

Sundravadana et al., 2007).

La enzima peroxidasa pertenece al grupo de las enzimas hemoproteicas, la cual cataliza la

oxidación de un electrón en varios sustratos tanto orgánicos como inorgánicos, que utiliza

el oxígeno del peróxido de hidrógeno como aceptor de hidrógeno. Este tipo de enzimas

están involucradas en varios procesos como la elongación celular, a través de las

peroxidasas unidas a la pared celular, en el proceso de lignificación (Cai et al., 2006) y en

los mecanismos de defensa de la planta (Morkunas y Gmerek, 2007). Es por esto, que las

peroxidasas sirven como parámetro de la actividad metabólica durante alteraciones

producidas durante el crecimiento, condiciones de estrés ambiental, aumento de la rigidez

de la pared celular, la formación de lignina, entre otros procesos.

En el patosistema Triticum sp.-F. graminearum, Mohammadi y Kazemi (2002) describieron

un aumento en la actividad de las enzimas peroxidasa y polifenol oxidasa en plantas

infectadas, al compararlas con las plantas no inoculadas, lo que demuestra su papel en

esta interacción. En hojas de plantas de Musa spp. infectadas con filtrado de cultivo de F.

oxysporium f. sp. cubense raza 1 se ha observado que la actividad peroxidasa aumentó en

genotipos resistentes respecto a genotipos susceptibles, como respuesta de la planta ante

la infección (Companioni et al., 2005). Además, autores como Sundaravadana et al. (2007)

observaron un aumento en la actividad peroxidasa en plantas de O. sativa infectadas con

P. grisea, así como de otras enzimas relacionadas con los mecanismos de defensa de la

planta, específicamente con el proceso de lignificación y acumulación de compuestos

fenólicos, donde esta enzima juega un papel importante.

Aunque el rol de la peroxidasa en la interacción planta-patógeno ha sido estudiado en

varios patosistemas, en Musa spp.-M. fijiensis, no existen evidencias de estudios que

vinculen dicha enzima con la respuesta de la planta ante la infección del patógeno.

La ruta metabólica secundaria de los fenilpropanoides, donde se ubican enzimas como la

PAL, la C4H y la 4CL, entre otras, constituye una de las principales en las plantas, que

resulta en la síntesis de una variedad de compuestos como flavonoides, fitoalexinas,

lignina, etc. (Winkel-Shirley, 2001).

La enzima fenilalanina amonio-liasa es una enzima crucial en el metabolismo de

numerosos compuestos, que cataliza la formación del ácido trans-cinámico por L-

desaminación de la fenilalanina. Estudios en plantas transgénicas de Nicotiana tabacum

que expresan un gen de esta enzima de Phaseolus vulgaris, revelaron que la regulación

de la actividad de esta enzima era uno de los pasos importantes de la ruta de los

fenilpropanoides (Howles et al., 1996).

La actividad de la PAL parece ser extremadamente sensible al estado fisiológico de la

planta. Los cambios en la actividad de esta enzima pueden ocurrir durante el crecimiento o

frente a eventos traumáticos o patológicos, o por la acción de la luz (Sreelakshmi y

Sharma, 2008).

Se ha planteado que en la interacción Musa spp.-M. fijiensis, la infección causada por el

patógeno es capaz de inducir un incremento en la actividad de la enzima fenilalanina

amonio-liasa (Hoss et al., 2000). En este sentido, Luis et al. (1994) plantearon que la

resistencia en Musa spp. frente a M. fijiensis parece estar estrechamente relacionada con

mecanismos de activación post-transcripcional, así como por la inducción de fitoalexinas

como productos de la ruta de los fenilpropanoides.

En plantas de Musa spp. se han encontrado principalmente dos tipos de fitoalexinas frente

al ataque por patógenos: 4-fenilfenalenonas (Luis et al., 1994) y 9-fenilfenalenonas o

musalonas (Luis et al., 1996) . Algunos de estos fenilfenalenonas poseen una fuerte

actividad antifúngica (Quiñones et al., 2000).

Recientemente, en el cultivar resistente ‘Yangambi km5’ se encontraron cuatro fitoalexinas

del tipo fenilfenalenonas y dos nuevos compuestos del tipo perinaftenona, los cuales

mostraron actividad in vitro contra M. fijiensis (Otálvaro et al., 2007).

Aunque se ha avanzado en el conocimiento de compuestos involucrados en la ruta

metabólica de los fenilpropanoides en la interacción Musa spp.-M. fijiensis y su papel en la

defensa de la planta, el conocimiento general de los mecanismos involucrados en dicha

interacción es aun muy limitado.

Un mecanismo importante como parte de la respuesta defensiva lo constituye la inducción

de proteínas relacionadas con la patogénesis (PR). Estas proteínas son producidas

durante el desarrollo normal de las plantas o como parte de la defensa inducida por

patógenos fúngicos. La proteínas PR se agrupan en 17 familias numeradas de acuerdo

con el orden en que fueron descubiertas, de la PR-1 a la PR-17 (Ferreira et al., 2007).

Las β-1,3 glucanasas de plantas pertenecen al grupo de las proteínas PR-2. Esta hidroliza

uniones de β-1,3 glucanos, los cuales constituyen los componentes principales de la pared

celular en la mayoría de los hongos y en unión con la enzima quitinasa producen un efecto

sinérgico que aumenta de la resistencia de las plantas frente a los patógeno (van Loon et

al., 2006).

Estas enzimas se dividen en tres clases. Las glucanasas clase I, son proteínas básicas de

aproximadamente de 33 kDa y se localizan en las vacuolas. Las clase II y III incluyen

proteínas extracelulares ácidas, de aproximadamente 36 kDa (Theis y Stahl, 2004). Estas

enzimas participan en varios procesos fisiológicos y del desarrollo de la planta.

Se ha señalado el papel de estas proteínas en la defensa de las plantas frente a los

patógenos, en este sentido, se ha observado que la acumulación de proteínas PR, como

PR-2, PR-5 (proteínas tipo taumatina), PR-9 (peroxidasa) y PR-10 (proteínas inducidas por

Probenzol), así como proteínas tipo isoflavona reductasa y proteínas inducidas por estrés

salino, se inducen durante la interacción tanto compatible como incompatible en el

patositema O. sativa-P. grisea (Bhadauria et al., 2010).

En el mecanismo defensivo de las plantas de Musa spp. frente a M. fijiensis se ha

señalado que la inducción de proteínas relacionadas con la patogénesis tiene una

estrecha relación con la resistencia de las plantas ante el patógeno (Lepoivre et al., 2003),

pero aun es limitado el conocimiento del papel de estas proteínas en la interacción planta-

patógeno. No obstante, autores como Dagert et al. (2002) realizaron una biblioteca

substractiva en el cultivar ‘Yangambi km5’ (AAA, resistente a la enfermedad) infectado con

M. fijiensis y encontraron la expresión diferencial de una glucanasa, lo que demuestra su

relación con el proceso de respuesta de la planta ante el patógeno.

Se conoce muy poco acerca de la filogenia y la biología molecular de los bananos, a pesar

de ser el cultivo frutal número uno en el mundo (Thomas-Hall et al., 2007) y aun son

escasas las evidencias experimentales de lo que constituye la respuesta defensiva de la

planta, en el patosistema Musa spp.-M. fijiensis. Es por esto que el análisis bioquímico de

esta interacción, resulta necesario para lograr un entendimiento global de este complejo

proceso, a la vez que brinda nuevas herramientas para los programas de mejoramiento

genético en plantas de Musa spp.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se utilizaron plantas de ‘Grande naine’ (Musa AAA) y ‘Calcutta 4’ (Musa AA) propagadas

in vitro vía organogénesis según el protocolo descrito por Orellana (1994).

El material vegetal para el establecimiento in vitro de ‘Grande naine’ provino de la empresa

¨La Cuba¨, Ciego de Ávila y del Banco de Germoplasma del INIBAP (ITC 0249, Bélgica) se

obtuvieron plantas in vitro de ‘Calcutta 4’ en fase de multiplicación.

Las plantas se sembraron en bolsas de polietileno con sustrato compuesto por 50% de

casting, 30% de compost y 20% de zeolita y se mantuvieron en fase de aclimatización

durante 45 días. Posteriormente, se transfirieron a macetas plásticas de 20 cm de

diámetro con 1L de capacidad con igual sustrato por 45 días (en los períodos de febrero-

marzo y junio-julio) hasta alcanzar como mínimo 20 cm de altura y tres hojas activas

(Figura 2).

Las plantas se colocaron en una casa de cultivo con luz solar, con una media en la

intensidad luminosa de 3 841 µmol.m2.s (medido con Extech Light Meter 401025, USA) y

riego tres veces al día.

Figura 2. Plantas de ‘Grande naine y ‘Calcutta 4’ aclimatizadas durante tres meses en casa decultivo

Inoculación artificial

La preparación de la suspensión micelial de M. fijiensis así como el proceso de inoculación

artificial se llevaron a cabo según el protocolo descrito por Alvarado et al. (2003), que se

describe brevemente.

Aislado del hongo

Se empleó la cepa CCIBP-Pf83 de M. fijiensis procedente de la Colección de Cultivos

Microbianos del Laboratorio de Microbiología Aplicada del Instituto de Biotecnología de las

Plantas, Cuba.

Preparación de la suspensión micelial

Se tomó un fragmento de micelio de la cepa CCIBP-Pf83 crecida en tubos de ensayo en

medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA, del inglés: Potato Dextrose Agar),

conservados a 4ºC y se inoculó en frascos Erlenmeyer (250 mL de volumen) con 100mL

de medio de cultivo Caldo Papa Dextrosa (PDB) (Difco), pH 5,6. Los frascos se colocaron

en una zaranda orbital (Retomed), a 120 rpm durante 14 días, a temperatura ambiente.

Después de transcurrido este tiempo se eliminó el medio de cultivo por decantación, se

tomó 1g de micelio y se homogeneizó con 30 mL de agua destilada estéril en tubos

plásticos de 45 mL (FALCON) utilizando una batidora (Ultraturrax T25), durante 1 min.

Posteriormente se filtró (40 μm), se determinó la concentración mediante observación en

un microscopio óptico Olympus (100x), usando una cámara de Neubauer y se ajustó la

concentración con agua destilada estéril hasta aproximadamente 5,7.105 fragmentos de

micelio/mL. Finalmente se le adicionó gelatina al 1% (p/v) para aumentar la adhesión del

inóculo a la superficie de la hoja. La inoculación se realizó por la parte abaxial de las hojas

y con la ayuda de un pincel (Figura 3).

Figura 3. Procedimiento general para la inoculación artificial de plantas de Musa spp. en casa decultivo empleando suspensiones miceliales de M. fijiensis (Alvarado et al., 2003)

Se inocularon las tres primeras hojas de 30 plantas con suspensión micelial del hongo e

igual número de plantas con gelatina al 1% (p/v), las cuales se usaron como controles. Las

plantas se ubicaron completamente al azar en casa de cultivo.

Procesamiento estadístico

El procesamiento estadístico de los datos de las variables estudiadas se realizó con el

paquete estadístico Statistic Package for Social Science (SPSS) versión 16 para Windows.

En cada acápite se detalla el procedimiento utilizado para el análisis de las diferentes

variables. En todos los casos se utilizó la posibilidad de generar hasta 10 000 muestras

con distribución similar a la real mediante la técnica de Monte Carlo, con una significación

del 99% de confianza.

3.1 Caracterización fenotípica de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ en casa de

cultivo

Con el objetivo de caracterizar fenotípicamente plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’,

estas se describieron morfológicamente y se determinó el grosor, a sí como la densidad

estomática de las hojas.

3.1.1 Descripción morfológica de las plantas

Con el fin de describir las plantas según sus características fenotípicas en condiciones de

casa de cultivo, se emplearon los siguientes descriptores para plantas de Musa spp.

adultas en condiciones de campo y se utilizó como referencia la tabla de colores adjunta

(IPGRI-INIBAP/CIRAD, 1996):

- Hábito foliar

- Altura del pseudotallo (cm)

- Color del pseudotallo

- Apariencia del pseudotallo

- Color de la savia

- Canal del peciolo de la hoja 3

- Longitud de la lámina (cm)

- Ancho de la lámina (cm)

- Color de la cara superior de la lámina

- Aspecto de la cara superior de la lámina

- Color de la cara inferior de la lámina

- Aspecto de la cara inferior de la lámina

- Presencia de cera en la lámina

- Forma de la base de la lámina

Se observaron y registraron estas características en 20 plantas de ‘Grande naine’ e igual

número de plantas de ‘Calcutta 4’ y se organizaron en una tabla resumen.

3.1.2 Determinación del grosor de la hoja

Para comparar el grosor de las hojas de ambos genotipos, se colectó la tercera hoja de

diez plantas seleccionadas al azar. Se realizaron cortes transversales a mano, con la

ayuda de una cuchilla afilada, a partir de fragmentos foliares de 5 cm2 de área fijados en

alcohol al 70% (v/v), los cuales fueron coloreados con azul de toluidina al 0,5% (v/v) y

colocados en glicerina acuosa 1:1(v/v). Las observaciones se realizaron empleando un

microscopio óptico Olympus con un aumento de 200x. Se determinó el grosor de las hojas

utilizando un micrómetro ocular. En total se realizaron 50 mediciones en cada genotipo.

Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no

paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y

heterogeneidad de varianza.

3.1.3 Determinación de la densidad estomática

La densidad estomática fue determinada en la parte abaxial de la hoja, en las tres

primeras hojas de diez plantas, de ambos genotipos. Se tomaron tres fragmentos (2 cm2

de área) de cada sección de la hoja (basal, media y apical), por cada hoja. Posteriormente,

se colocaron en un portaobjetos con una gota de agua, se colocó un cubreobjeto y se

observó al microscopio óptico Olympus (200x). Se contó el número de estomas en diez

campos (0,58 mm2) del microscopio óptico, por cada segmento de la hoja analizado, para

un total de 90 mediciones en cada genotipo. Los resultados fueron expresados como

densidad estomática (número de estomas/mm2).

Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no

paramétrica de Kruskal-Wallis, previa comprobación de los supuestos de normalidad y

heterogeneidad de varianza.

3.1.4 Determinación del contenido de lignina

Para comparar el contenido de lignina constitutiva en las hojas de ambos genotipos, se

colectaron las tres primeras hojas de cinco plantas seleccionadas al azar. Se cuantificó el

contenido de lignina según el protocolo descrito por Kirk y Obst (1988). Las muestras se

procesaron inmediatamente después de colectadas y se homogeneizaron en nitrógeno

líquido usando un mortero y pistilo preenfriados. Posteriormente, se extrajeron en metanol

y fueron secadas en campana, proceso que se repitió cuatro veces. De cada muestra se

tomaron 200 mg y se hidrolizaron en 4 mL de H2SO4 al 72% (v/v) a 30ºC durante 1 h. El

hidrolizado fue diluido en 112 mL de agua y mantenido en autoclave a 121ºC y 1,2 atm,

durante 1 h. La solución fue filtrada utilizando papel de filtro Whatman No. 41 y el residuo

sólido fue lavado con abundante agua, posteriormente secado en campana y luego se

pesó en balanza analítica (Sartorius) y se determinó el porcentaje de residuos de la pared

celular con respecto a los 200 mg para cada muestra. El contenido de lignina se expresó

como porcentaje de residuos de la pared celular.

Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no

paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y

heterogeneidad de varianza.

3.2 Detección de la presencia de compuestos bioquímicos en los diferentes estados

de síntoma en hojas de plantas de ‘Grande naine‘ y ‘Calcutta 4‘ inoculadas

artificialmente con M. fijiensis

Con el objetivo de detectar la presencia de compuestos bioquímicos tales como: lignina,

fenoles y peróxido de hidrógeno, se evaluó el desarrollo y evolución de los síntomas en

ambos genotipos y se emplearon técnicas histoquímicas.

3.2.1 Evaluación del desarrollo y evolución de los síntomas

Se inocularon plantas según el procedimiento descrito (Inoculación artificial) y se

observaron cada tres días para describir la evolución de los síntomas desde el día tres

hasta los 63 días posteriores a la inoculación (dpi). La evaluación cualitativa de los

síntomas en las tres hojas inoculadas por planta se realizó según la escala propuesta por

Alvarado et al. (2003).

Además, se utilizaron variables epifitiológicas que permitieron comparar la evolución de los

síntomas en ambos fenotipos de la resistencia. Para esto se determinó el período de

incubación definido como el número de días desde el momento de la inoculación hasta la

aparición de los primeros síntomas (Molina y Castaño, 2003) y el tiempo de evolución de

los síntomas definido como la duración en días de la evolución de los síntomas desde el

estado 1 al 6 propuestos por Fouré (1985) (Hernández y Pérez, 2001).

3.2.2 Detección de la presencia de compuestos bioquímicos por estado de síntoma

Colecta de las muestras

Para el análisis histoquímico se colectaron al azar tres lesiones por estado de síntoma de

tres plantas inoculadas, para un total de nueve lesiones por estado de síntoma, de ambos

genotipos. Se colectaron además, igual número de fragmentos de tejido sin síntomas de

plantas controles.

Deposiciones de lignina

Las deposiciones de lignina en las paredes celulares se visualizaron utilizando una tinción

con solución de fluoroglucina al 1% (p/v) en etanol al 70% (v/v), durante 5 minutos

(Southerton y Deverall, 1990). Se adicionaron dos gotas de ácido clorhídrico (HCl)

concentrado, se enjuagó, se colocó un cubreobjeto y se observó utilizando un microscopio

Olympus (400x). Ante la presencia de lignina se observan áreas de color rojo/rosado

(Gahan, 1984). Las observaciones fueron fotografiadas inmediatamente.

Acumulación de peróxido de hidrógeno

Las muestras se sumergieron durante 30 min en una solución de 1 mg/mL de 3,3’

diaminobenzidina en HCl, pH 4, con el fin de detectar la presencia de peróxido de

hidrógeno (H2O2) en el tejido vegetal (Thordal-Christensen et al., 1997) y se observaron a

través de un microscopio óptico (400x). La diaminobenzidina se polimeriza y forma un

color marrón intenso como producto de la reacción con H2O2 en presencia de la enzima

peroxidasa. Esta pigmentación se observa al remover la clorofila del tejido vegetal

hirviéndolo en una solución de etanol al 95% (v/v), durante 5 min. Las observaciones

fueron fotografiadas inmediatamente.

Acumulación de compuestos fenólicos

Para la detección de compuestos fenólicos se empleó el método colorimétrico descrito por

Reeve (1951). Se agregó una gota de nitrato de sodio acuoso al 10% (v/v), una gota de

ácido acético acuoso al 10% (v/v) y luego una gota de urea acuosa al 20% (p/v). Después

de 3 min, se adicionaron dos gotas de NaOH 2N. Los fragmentos vegetales se colocaron

en un portaobjetos y se cubrieron con un cubreobjetos, para ser observados al

microscopio óptico (200x). En presencia de los compuestos fenólicos se observa una

coloración roja intensa. Las observaciones fueron fotografiadas inmediatamente.

3.3 Cuantificación de compuestos enzimáticos y no enzimáticos en diferentes

tiempos después de la inoculación en hojas de plantas de ‘Grande naine‘ y ‘Calcutta

4‘ inoculadas artificialmente con M. fijiensis

Para comparar la respuesta en el tiempo de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’

inoculadas artificialmente con M. fijiensis se determinó la actividad de tres enzimas y se

cuantificó la presencia de otros tres compuestos no enzimáticos relacionados con la

respuesta defensiva de la planta. La inoculación de las plantas se llevó a cabo según el

procedimiento descrito (Inoculación artificial). Las muestras se colectaron a los 3, 6, 8, 10,

14 y 16 días posteriores a la inoculación (dpi) y se conservaron a -80ºC hasta su

procesamiento.

3.3.1 Determinación de actividad enzimática

Para determinar la actividad enzimática peroxidasa, fenilalanina amonio-liasa y β-1,3

glucanasa se utilizaron las tres primeras hojas de tres plantas inoculadas y no inoculadas

(control) de ‘Grande naine’ y ’Calcutta 4’. Se homogeneizaron (0,5 g) en nitrógeno líquido

usando un mortero y pistilo preenfriados. Se extrajeron en 2 mL de solución tampón de

Sodio-fosfato 0,1 M (pH 7,0), con la adición de inhibidor de proteasa (Protease Inhibitor

Cocktail for General Use. Sigma-Aldrich). El homogenizado fue centrifugado a 10 000 g

durante 20 min, a 4ºC y el sobrenadante (SN) fue usado como extracto enzimático para las

determinaciones de la actividad enzimática. Se utilizaron tres réplicas de cada muestra, en

ambos genotipos.

Se compararon además, los resultados obtenidos de la cuantificación de las distintas

actividades enzimáticas, entre las plantas inoculadas de ambos genotipos.

Peroxidasa (EC 1.11.1.7)

La actividad peroxidasa fue determinada mediante un ensayo colorimétrico según Cakmak

et al. (1993). La mezcla de reacción consistió en 1,5 mL de guayacol al 0,05% (v/v), 0,5

mL del extracto enzimático y 0,5 mL de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 1% (v/v). La

mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se registró el

incremento en la Densidad Óptica (DO) debido a la oxidación del guayacol a 470 nm (ξ =

26,6 mM-1 cm-1), a intervalos de 20 segundos durante 3 min utilizando un

espectrofotómetro UV-visible (Genesys 6, Thermo Electron Corporation, USA). El extracto

enzimático fue calentado en agua hirviendo durante 5 min y fue usado como blanco

(Hammerschmidt et al., 1982). La actividad enzimática (AE) se expresó como µmol/min/g

de masa fresca.

Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no

paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y

heterogeneidad de varianza.

Fenilalanina amonio-liasa (EC 4.3.1.24)

La actividad enzimática fenilalanina amonio-liasa se cuantificó mediante el método descrito

por Ross y Sederoff (1992). La mezcla de reacción contuvo 100 µL de extracto enzimático,

500 µL de solución tampón Tris-HCl a 50 mM (pH 8,8) y 600 µL de L-fenilalanina a 1mM,

luego fue incubada a temperatura ambiente por 30 min. La reacción se detuvo adicionando

HCl a 2 N. Posteriormente, se agregaron 1,5 mL de tolueno, se mezcló vigorosamente

durante 30 s, se centrifugó (1 000 g, 5 min) y se separó la fracción de tolueno que contenía

el ácido trans-cinámico. Se registró la lectura de la DO en espectrofotómetro (Genesys 6,

Thermo Electron Corporation, USA) a una longitud de onda de 290 nm contra un blanco de

tolueno. Se utilizó una curva patrón con concentraciones conocidas de ácido cinámico en

tolueno, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. La actividad enzimática se

expresó como nmoles de ácido cinámico liberado/min/g de masa fresca.

Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no

paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y

heterogeneidad de varianza.

β-1,3 glucanasa (EC 3.2.1.39)

La actividad enzimática β-1,3 glucanasa se cuantificó mediante un ensayo colorimétrico

(Pan et al., 1991), a través de la determinación de los residuos de azúcares reducidos

liberados. Se utilizó laminarin como sustrato y glucosa como estándar. La mezcla de

reacción consistió en 62,5 µL de extracto enzimático y 62,5 µL de laminarin al 4% (p/v),

posteriormente se incubó a 40ºC, durante 10 min. La reacción se detuvo con la adición de

375 µL de ácido dinitrosalicílico (300 mL de NaOH al 4,5% en 880 mL que contenían 8,8 g

de ácido dinitrosalicílico y 22,5 g de tartrato de sodio-potasio) y se calentó por 5 min en

baño de agua hirviendo. La solución coloreada resultante se diluyó con agua destilada, se

mezcló vigorosamente y se registró la DO a 500 nm en espectrofotómetro UV-visible

(Genesys 6, Thermo Electron Corporation, USA). El extracto enzimático mezclado con el

laminarin al tiempo cero, se usó como blanco. La actividad enzimática se expresó como µg

de glucosa liberada/min/g de masa fresca.

Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no

paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y

heterogeneidad de varianza.

3.3.2 Cuantificación de compuestos no enzimáticos

Para cuantificar el contenido de fenoles totales, del anión superóxido y de antocianinas, se

utilizaron las tres primeras hojas de tres plantas inoculadas y no inoculadas (control) de

ambos genotipos. Se utilizaron tres réplicas de cada muestra, en ambos genotipos.

Se compararon, además, entre las plantas inoculadas de ambos genotipos, los resultados

de la cuantificación de los tres compuestos.

Fenoles totales

El contenido de compuestos fenólicos totales se determinó según procedimiento descrito

por Bray y Thorpe (1954). Las muestras (0,5 g) se homogeneizaron en nitrógeno líquido

usando un mortero y pistilo preenfriados, se mezclaron con 5 mL de etanol al 80% (v/v) y

posteriormente se calentaron a 50ºC, por 30 min. El extracto se centrifugó a 8 000 g por 10

min. Se tomó una alícuota de 1 mL del sobrenadante y se enrasó hasta 3 mL con agua

destilada, se agregó 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 2 mL de carbonato de sodio al

20% (p/v). Las muestras se calentaron durante 1 min en baño de agua hirviendo y

posteriormente se enfriaron en agua corriente. La solución se diluyó hasta 10 mL con agua

destilada y la densidad del color azul se midió a 750 nm en espectrofotómetro (Genesys 6,

Thermo Electron Corporation, USA) contra el blanco (1mL de etanol al 80 % en lugar del

extracto y se siguió todo el procedimiento descrito anteriormente).

Se empleó ácido gálico como estándar a partir del cual se calculó la concentración de

fenoles totales de la muestra. El contenido de fenoles se expresó como mg de fenoles

totales/g de masa fresca.

Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no

paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y

heterogeneidad de varianza.

Anión superóxido

Se midió la reducción del Nitroblue tretazolium (NBT) (Sigma-Aldrich) utilizando el método

descrito por Doke (1983) para la determinación del anión superóxido (O*-2). Las muestras

se homogeneizaron en nitrógeno líquido usando un mortero y pistilo preenfriados, se

adicionaron 2 mL de solución tampón de Sodio-fosfato 0,1 M (pH 7). El homogenizado fue

centrifugado a 10 000 g durante 20 min, a 4ºC y el sobrenadante (SN) fue usado como

extracto vegetal. El extracto vegetal (30 µL) se incubó con 3 mL de tampón fosfato de

potasio 0,01 M, pH 7,8, que contenía 0,05 % (p/v) de NBT y NaN3 (azida sódica) a 10 Mm,

durante 30 min. Posteriormente la mezcla se calentó a 85ºC por 15 min y luego se enfrió a

temperatura ambiente. El contenido del anión susperóxido se expresó como el Incremento

de la DO a 580 nm (1h)/g de masa fresca.

Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no

paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y

heterogeneidad de varianza.

Antocianinas

Las muestras se procesaron inmediatamente después de colectadas y se homogeneizaron

usando nitrógeno líquido con la ayuda de un mortero y pistilo preenfriados. La extracción

se realizó con 10 mL de metanol acidificado (40 mL H2SO4, 1 760 mL de metanol, pH 1).

Las muestras se calentaron en baño de agua hirviendo, durante 1,5 min y luego se

mantuvieron en la oscuridad durante 24 h, a 4ºC. Posteriormente se centrifugaron (699 g;

10 min) y se midió la DO a 530 y 657 nm, utilizando un espectrofotómetro UV-visible

(Genesys 6, Thermo Electron Corporation, USA). La concentración de antocianinas se

corrigió para los productos de degradación de la clorofila utilizando la fórmula:

DO 530nm-0,25 * DO 657nm (Mancinelli et al., 1975).

El resultado se expresó como contenido de antocianinas (mg/g de masa fresca).

Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante una prueba no

paramétrica de Mann-Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y

heterogeneidad de varianza.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Caracterización fenotípica de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ en casa de

cultivo

4.1.1 Descripción morfológica de las plantas

Las características fenotípicas de las plantas de ambos genotipos en casa de cultivo

coinciden en su mayoría con las descritas en el Catálogo de Germoplasma de Musa spp.

(Daniells et al., 2001), para plantas crecidas en condiciones de campo.

En cuanto al color del pseudotallo, se observaron diferencias entre ambos genotipos; en el

caso de ‘Grande naine’, esta característica difiere además, de la descrita para las plantas

adultas en condiciones de campo. En las plantas analizadas de dicho cultivar, se observó

un color verde-rojizo, mientras que en las plantas adultas el pseudotallo es de color verde-

amarillo. En las plantas de ‘Calcutta 4’ el color verde-amarillo del pseudotallo coincide con

el descrito para plantas adultas.

Sin embargo, en cuanto a la apariencia del pseudotallo, en las plantas evaluadas de

ambos genotipos, las características coinciden con las descritas para plantas adultas en

campo: brillante (no ceroso) y opaco (ceroso) para ‘Grande naine y ‘Calcutta 4’,

respectivamente. Las características evaluadas se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Características morfológicas de plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ crecidas durantetres meses en condiciones de casa de cultivo

Descriptores de la planta ‘Grande naine’ ‘Calcutta 4’

Hábito foliar

Normal Decumbente

Altura del pseudotallo (cm) 14,16 14,93

Color del pseudotallo

Verde-rojizo Verde-amarillo

Apariencia del pseudotallo Brillante (no ceroso) Opaco (ceroso)Color de la savia Lechoso Lechoso

Canal del peciolo de la hoja 3

Abierto con márgenes alados Estrecho con márgenes erectos

Longitud de la lámina (cm) 22,96 21,25Ancho de la lámina (cm) 9,78 7,69

Color de la cara superior de lalámina

Verde oscuro con rojo violáceo(presencia de machas grandes rojo

violáceo)Verde medio

Aspecto de la cara superior dela lámina

Opaco Opaco

Color de la cara inferior de lalámina

Verde plateado Verde claro

Aspecto de la cara inferior dela lámina

Opaco Brillante

Presencia de cera en la lámina Muy ceroso Poca cera

Forma de la base de la lámina

Ambas afiladas Una redondeada y una afilada

Se observó la presencia de cera en las hojas de las plantas de ‘Grande naine’ y fue mayor

en la parte abaxial de la hoja respecto a la adaxial, mientras que en plantas de ‘Calcutta 4’,

se observó la presencia de muy poca cera en las hojas, tanto por la parte adaxial como por

la abaxial.

La presencia de cera en las hojas de plantas de Musa spp. ha sido descrita por Sandoval

(1989) en plantas de tres meses de aclimatización en invernadero. Este autor planteó

además, que la cera presente en las plantas crecidas en estas condiciones es mucho

menor que la observada en plantas de campo, como consecuencia de la alta humedad

relativa y alta temperatura que se genera.

4.1.2 Determinación del grosor de la hoja

No se encontraron diferencias significativas en cuanto al grosor de las hojas entre ambos

genotipos a nivel de casa de cultivo; los valores medios obtenidos fueron de 33,11 µm y

32,75 µm en ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’, respectivamente.

Las características morfológicas de las hojas, en cuanto a la composición y distribución de

las distintas capas celulares, fueron semejantes en ambos genotipos y coinciden además

con las descritas por Sandoval (1989) en plantas de diferentes genotipos de Musa,

aclimatizadas durante tres meses en invernadero.

Se observó, además, la presencia de cutícula en la superficie adaxial de las hojas en

ambos genotipos.

Aunque en este trabajo no se observaron diferencias significativas, autores como Valerio

et al. (2002) encontraron diferencias significativas en el grosor de la hoja de varios

genotipos de Musa con diferente grado de susceptibilidad a la Sigatoka negra, los mayores

valores se observaron en los cultivares resistentes de FHIA y el somaclón ‘CIEN BTA-03’ y

estos fueron bajos en el cultivar ‘Yangambí km5’, también resistente. Esto evidencia que

aunque estos caracteres constituyen barreras mecánicas en los órganos vegetales que

dificultan el contacto o entrada de los agentes patógenos, la resistencia a la enfermedad

no está ligada directamente a los caracteres anatómicos en algunos cultivares.

4.1.3 Determinación de la densidad estomática

En este estudio se observó que la densidad estomática entre ambos genotipos fue

significativamente diferente; en el genotipo resistente ‘Calcutta 4’ (AA) el valor medio fue

de 224,54 estomas/mm2, mientras que en el genotipo susceptible ‘Grande naine’ (AAA) fue

de 154,80 estomas/mm2, (Figura 4). Se ha planteado que estas diferencias en cuanto a la

ploidía afectan la expresión fenotípica de caracteres cuantitativos en plantas de Musa spp.,

según han señalado autores como Vandenhout et al. (1995), los cuales plantean que bajos

niveles de ploidía están significativamente correlacionados con altas densidades

estomáticas.

Figura 4. Densidad estomática en la zona abaxial de hojas de A) ‘Grande naine’ (baja densidadestomática) y B) ‘Calcutta 4’ (alta densidad estomática), a: zona apical, m: zona media y b: zonabasal de la hoja (200x)

A a m b

B a m b

En ambos genotipos, la densidad estomática fue significativamente mayor en la zona

apical respecto a las zonas media y basal de la hoja (Tabla 4). Al respecto, se ha

identificado que la densidad de los estomas en hojas de musáceas es mayor en la parte

abaxial y en la zona apical de la hoja, sitios donde el tubo germinativo del hongo tiene una

mayor probabilidad de penetrar (Sandoval y Muller, 1999).

Tabla 4. Densidad estomática (No. de estomas/mm2) en las distintas zonas de la hoja de plantas de‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’

‘Grande naine’ ‘Calcutta 4’Zona Media Rangos

medios Media Rangosmedios

Apical 235,31 202,30 a 163,16 177,85 aMedia 231,19 143,59 b 155,33 166,59 bBasal 207,51 65,12 c 145,71 66,56 c

Rangos medios con letras diferentes en una misma columna difieren por Prueba no paramétrica deKruskal-Wallis para p<0,01

Estos resultados coinciden con los informados por Valerio et al. (2002), los cuales

observaron una mayor densidad estomática en el cultivar resistente ‘Yangambí km5’, que

en otros híbridos de mayor ploidía analizados. Sin embargo, autores como Hernández et

al. (2006) observaron que los cultivares de plátano FHIA 20, FHIA 21 y topocho ‘Pelipita’,

caracterizados como resistentes a la Sigatoka negra, presentaron una densidad

estomática mucho menor respecto a la de los clones de plátano ‘Hartón’ y ‘África’

clasificados como susceptibles a la enfermedad.

Se ha planteado, que la densidad estomática es uno de los mecanismos de resistencia

estructural que actúan como barreras físicas que impiden la penetración del patógeno en

la planta. Además, el número de estomas puede indicar la eficiencia de determinada

especie vegetal en el proceso de respiración y fotosíntesis, que contribuyen, entre otras

funciones, en la formación de sustancia químicas capaces de frenar el avance del

patógeno en la hoja (Beveraggi et al., 1995). No obstante, algunos estudios realizados en

evaluaciones sobre las características morfológicas y fisiológicas de los estomas en hojas

de plantas de Musa spp., mostraron que la resistencia a la Sigatoka negra, no está

determinada por este elemento morfológico (Vuylsteke et al., 1998).

Es por esto que, a pesar de que la densidad estomática constituye una barrera mecánica

que dificulta el contacto o entrada del patógeno, no constituye un elemento determinante

en el fenotipo de la resistencia de algunos genotipos, lo que se cumple para los dos

genotipos analizados en este trabajo.

4.1.4 Determinación del contenido de lignina

En este estudio no se encontraron diferencias significativas en cuanto al contenido de

lignina constitutiva en las hojas de las plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ analizadas;

la media de los valores obtenidos fue de 14,06 y 13,78 (% de residuos de la pared celular),

respectivamente.

El contenido de lignina constitutiva se ha relacionado con el mecanismo de defensa de la

planta, como parte de la respuesta constitutiva de esta ante la infección del patógeno. En

este sentido, se ha demostrado que en plantas de O. sativa infectadas con P. grisea la

penetración del patógeno es principalmente a través de la lignina de la pared celular

(Schaffrath et al., 1996).

Se conoce además, que la lignina, los flavonoides, la dopamina, el ácido ferúlico, entre

otros, son componentes constitutivos que pueden estar involucrados en los mecanismos

de defensa constitutiva o pasiva en las plantas, actuando como barreras físicas y químicas

ante la penetración del patógeno (Valette et al., 1998). Debido a la compleja naturaleza de

los polímeros de lignina, es difícil su degradación, por lo cual este constituye uno de los

prerrequisitos para la patogénesis en la interacción planta-patógeno.

En general, aunque se ha planteado que la resistencia de algunas variedades de Musa sp.

a la Sigatoka negra está relacionada directamente a la presencia de barreras físicas

asociadas a la anatomía foliar (Valerio et al., 2002), en el caso de los genotipos ‘Grande

naine’ y ‘Calcutta 4’, características como el grosor de la hoja, la densidad estomática y el

contenido de lignina constitutiva en las hojas, no parecen ser determinantes en el tipo de

respuesta susceptible o resistente que se establece en este patosistema. Es por esto que,

se requiere el estudio de la respuesta inducida de la planta ante la infección del patógeno

para lograr un mayor entendimiento de esta interacción.

4.2 Detección de la presencia de compuestos bioquímicos en los diferentes estados

de síntoma en hojas de plantas de ‘Grande naine‘ y ‘Calcutta 4‘ inoculadas

artificialmente con M. fijiensis

4.2.1 Evaluación del desarrollo y evolución de los síntomas

Las características de los síntomas y su evolución pudieron observarse en ambos

genotipos utilizando el método de inoculación artificial descrito previamente. El período de

incubación en plantas infectadas de ‘Grande naine’ fue de 14 días, mientras que en

plantas infectadas de ‘Calcutta 4’ fue de seis días aproximadamente (Figura 5A y B). En

plantas infectadas del cultivar susceptible ‘Grande naine’ se observó la evolución completa

de los síntomas desde el estado 1 hasta el 5. El tiempo de evolución de estos fue de 52

días, lo que coincide con los resultados descritos por Alvarado et al. (2003) y Leiva (2008)

en dicho cultivar, bajo condiciones experimentales similares.

En el genotipo resistente ‘Calcutta 4’ se observaron síntomas que solo evolucionaron

hasta el estado 3 de la enfermedad, resultados similares fueron descritos por Leiva (2008)

en el genotipo resistente ‘Yangambí km5’ en condiciones similares.

Figura 5. Evolución de los síntomas en plantas de A) ‘Grande naine’ y B) ‘Calcutta 4’ inoculadas conM. fijiensis, en casa de cultivo

En las plantas inoculadas de ‘Grande naine’, se observó la presencia de lesiones

puntiformes de color pardo-rojizo por la parte abaxial de las hojas alrededor de los 14 dpi

(Figura 5A y 6A a). Dichas lesiones evolucionaron hacia la formación de manchas de

contornos irregulares de coloración pardo-rojizas alrededor de los 21 dpi (Figura 5A y 6A

b), los cuales fueron visibles por la parte adaxial de las hojas (Figura 5A y 6A c) a los 30

dpi aproximadamente. A partir de los 38 dpi se observaron manchas negras con bordes

cloróticos y halos acuosos (Figura 5A y 6A d). Posteriormente, al cabo de los 52 dpi, se

observó la presencia de manchas grises circulares o elípticas con centros secos (Figura

5A y 6A e), las cuales en su mayoría, se unieron y formaron manchas necróticas. La

evolución de los síntomas en el genotipo ‘Grande naine’ así como sus características

coinciden con lo descrito por Leiva (2008) en dicho cultivar bajo condiciones similares.

En plantas inoculadas de ‘Calcutta 4’ los primeros síntomas se observaron a los 6 dpi

(Figura 5A y 6B a) y estos presentaron las mismas características observadas en las

plantas infectadas de ‘Grande naine’, igualmente ocurrió con los síntomas en estado 2, los

cuales se observaron alrededor de los 14 dpi (Figura 5A y 6B b) y con los síntomas en

estado 3, los cuales se observaron a los 21 dpi (Figura 5A y 6B c).

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

14 17 21 24 30 38 45 52 60

Días posteriores a la inoculación

Frec

uenc

ia d

e ap

aric

ión

de lo

ssí

ntom

as543210

A

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

6 10 14 21 24 30 38 45 60

Días posteriores a la inoculación

Frec

uenc

ia d

e ap

aric

ión

de lo

ssí

ntom

as

543210

B

Figura 6. Síntomas en hojas de plantas de A) ‘Grande naine’ y B) ‘Calcutta 4’ en diferentes estados,causados por la inoculación artificial de M. fijiensis., en casa de cultivo. (a) Lesiones puntiformesrojizas (estado 1), (b) manchas con contornos irregulares de coloración pardo-rojiza por la parteabaxial de la hoja (estado 2), (c) manchas con contornos irregulares de coloración pardo-rojiza porla parte adaxial de la hoja (estado 3) y (d) mancha negra con borde clorótico y halo acuoso (estado4) y (e) mancha negra con centro gris seco (estado 5)

4.2.2 Detección de la presencia de compuestos bioquímicos por estado de síntoma

Se detectó la presencia de lignina, fenoles y peróxido de hidrógeno, como respuesta de la

planta ante el ataque del patógeno, mediante las técnicas histoquímicas empleadas.

Deposiciones de lignina

Se observó la presencia de deposiciones de lignina en las paredes de las células cercanas

al posible sitio de penetración del patógeno en ambos genotipos, solo en el tejido vegetal

con síntomas.

Tanto en el genotipo susceptible como en el resistente, en los primeros estados de

síntomas las deposiciones de lignina se presentaron de forma más localizada, mientras

que a medida que estos evolucionaron estas aumentaron gradualmente involucrando un

mayor número de células dañadas, lo que estuvo en correspondencia con la evolución de

los síntomas observada macroscópicamente (Figura 7A y B).

a b c d e

a b c

A

B

Figura 7. Deposiciones de lignina en las paredes celulares en hojas de plantas inoculadas con M.fijiensis, de A) ‘Grande naine’, en tejido sin síntomas (0) y en diferentes estados de síntomas (1-5) yde B) ‘Calcutta 4’, en tejido sin síntomas (0) y en diferentes estados de síntomas (1-3), (400 x)

Al respecto, autores como Smith et al. (2007) observaron que en lesiones de plantas de

Eucalyptus globulus (susceptible) y Eucalyptus nitens (resistente), infectadas naturalmente

con Mycosphaerella spp., ocurrieron deposiciones de lignina en las paredes celulares, las

cuales se incrementaron a medida que evolucionaron los síntomas y fueron mayores en el

genotipo resistente.

Igualmente, la acumulación de lignina y compuestos fenólicos ha sido relacionada con la

resistencia a enfermedades en otros patosistemas, tales como: Tricuticum aestivum-

Puccinia graminis f. sp. tritici (Beardmore et al.,1983), S. lycopersicum-Verticillium

alboatrum (Robb et al., 1987) y O. sativa-Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Reimers y

Leach, 1991). Estos autores observaron deposiciones de lignina en el tejido de plantas

4321 50

0 1 2 3

A

B

infectadas como respuesta al ataque del patógeno y en algunos casos estas deposiciones

fueron mayores en las plantas con resistencia al patógeno, respecto a las susceptibles.

Se ha demostrado además, que después que ocurre la infección por parte del patógeno la

planta responde rápidamente mediante la acumulación de fitoalexinas en el sitio de

penetración y produce lignina y otros productos con el fin de frenar el crecimiento del

patógeno. Esto evidencia el papel de la lignificación de las células en el incremento de la

resistencia en la planta frente al ataque fúngico (Ferreira et al., 2007).

En este sentido, existen varios informes en plantas de cereales tratadas con enzimas

inhibidoras de la formación de lignina, en las cuales se favoreció la penetración del

patógeno en el tejido vegetal (Zeyen et al., 1995). Igualmente, se ha planteado que la

lignina juega un papel importante en el mecanismo de respuesta hipersensible (HR). En

plantas de Hordeum vulgare, Triticum spp. y Avena sativa tratadas con inhibidores de

precursores de la lignina, la HR se suprimió y la infección del patógeno fue exitosa (Zeyen

et al., 1995; Khurana et al., 2005; Vianello et al., 2007).

Acumulación de peróxido de hidrógeno

Se observó la acumulación de peróxido de hidrógeno en los tejidos de hojas analizados,

tanto en el genotipo susceptible como en el resistente. La acumulación de peróxido se

observó en los fragmentos foliares correspondientes a todos los estados de síntomas, la

cual aumentó a medida que estos evolucionaron como se observa en las figuras 8A y B.

Esta acumulación de peróxido no se observó en el tejido sin síntomas analizado.

Figura 8. Acumulación de peróxido de hidrógeno en hojas de plantas inoculadas con M. fijiensis, deA) ‘Grande naine’, en tejido sin inocular (0) y en diferentes estados de síntomas (1-5) y de B)‘Calcutta 4’, en tejido sin inocular (0) y en diferentes estados de síntomas (1-3), (400 x)

En las muestras de ‘Calcutta 4’, se observó una mayor intensidad en la coloración

respecto a las muestras de ‘Grande naine’, lo cual está relacionado directamente con una

mayor acumulación de peroxido de hidrógeno alrededor del posible sitio de infección.

Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Asselbergh et al. (2007) en plantas de

S. lycopersicum, quienes observaron una rápida y mayor acumulación de peróxido de

hidrógeno en el sitio de inoculación del patógeno en un mutante resistente al hongo B.

cinerea, al compararlo con el genotipo silvestre.

Igualmente, la acumulación de peroxido de hidrógeno alrededor del sitio de infección ha

sido observado como mecanismo de defensa en plantas en otros patosistemas como:

Sorghum vulgare-Sclerotium rolfsii (Maurya et al., 2007) y Lactuca sativa- Bremia lactucae

43210 5

0 1 2 3

A

B

(Lebeda et al., 2008). Estos autores observaron la acumulación de peróxido de hidrógeno

solo en las plantas inoculadas y en una mayor proporción en las plantas resistentes

respecto a las susceptibles.

El papel del H2O2 en la defensa de la planta frente al patógeno ha sido demostrado

además por autores como Cohen et al. (2009), los cuales observaron en plantas de

Lactuca sativa L. tratadas con DL-β- ácido amino-butírico, con resistencia a Bremia

lactucae, un aumento de la acumulación de peróxido de hidrógeno en el sitio de

penetración del patógeno, mientras que en plantas no tratadas, no se observó dicha

acumulación en el tejido vegetal.

Se ha planteado que el incremento en los niveles de H2O2 y de otras especies reactivas del

oxígeno desencadena la respuesta hipersensible, así como la rápida muerte celular en el

sitio de infección, lo que se traduce en la formación de lesiones visibles en las plantas

(Mateo et al., 2004). Además, se ha señalado que el H2O2 tiene un importante papel en la

restricción de la penetración de los patógenos, así como en la activación de varios genes

relacionados con el proceso de defensa de la planta (Apel y Hirt, 2004).

Acumulación de compuestos fenólicos

En este trabajo se observó que las células cercanas al posible sitio de penetración de M.

fijiensis se modificaron con la acumulación de compuestos fenólicos, la cual aumentó

gradualmente en la medida en que evolucionaron los síntomas en ambos genotipos. La

acumulación de fenoles solo se observó en el tejido foliar correspondiente a las lesiones

de plantas inoculadas, no siendo así en el tejido sin síntomas de plantas controles (Figura

9A y B).

Figura 9. Acumulación de fenoles en hojas de plantas inoculadas con M. fijiensis, de A) ‘Grandenaine’, en tejido sin síntomas (0) y en diferentes estados de síntomas (1-5) y de B) ‘Calcutta 4’, entejido sin síntomas (0) y en diferentes estados de síntomas (1-3), (200 x)

Este resultado concuerda con lo informado por varios autores en otros patosistemas,

quienes observaron la acumulación de fenoles en el tejido foliar de plantas inoculadas con

el patógeno (Maurya et al., 2007; Asselbergh et al., 2007; Cohen et al., 2009).

Igualmente, Chen et al. (2000) y Mohammadi y Kazemi (2002), en plantas de Cucumis

sativus infectadas con Pythium aphanidermatum y en plantas de T. sativum inoculadas con

F. graminearum, respectivamente, observaron la acumulación de fenoles en el tejido

vegetal en las plantas inoculadas respecto a los controles.

En este sentido, se ha señalado que la acumulación de fenoles cercano al sitio de

penetración es una evidencia del desencadenamiento de la respuesta defensiva en las

43210 5

0 1 2 3

A

B

plantas y se ha descrito como uno de los eventos moleculares más importantes como

parte del proceso defensivo ante el ataque por patógenos (Walters et al., 2005).

Además, los compuestos fenólicos se inducen en la mayoría de los tejidos vegetales como

respuesta de defensa en la interacción con el patógeno y al igual que la lignina, los fenoles

son de por sí tóxicos a los patógenos (Basha et al., 2006) y su polimerización hace a la

pared celular más gruesa y fuerte (Ferreira et al., 2006).

Se ha demostrado a través de observaciones microscópicas, que justo después de que el

hongo penetra a través de los estomas, se producen reacciones químicas de

hipersensibilidad que evitan la expansión del patógeno por el tejido vegetal. No obstante,

en muchos casos, el patógeno supera rápidamente esta resistencia química y por

consiguiente no es duradera (Hernández et al., 2006).

Además, existen evidencias substanciales de que la rapidez de la respuesta histoquímica

está relacionada directamente con la resistencia ante la infección en otras interacciones

planta-patógeno como son S. lycopersicum-Cladosporium fulvum (Lazarovits y Higgins,

1976) y S. lycopersicum-F. oxysporum (Beckman et al., 1982).

En general, en ambos genotipos se observó una respuesta histoquímica local, cercana al

posible sitio de penetración de M. fijiensis, evidenciada por la acumulación de lignina,

peróxido de hidrógeno y compuestos fenólicos. Esta respuesta estuvo relacionada

directamente con la aparición de los primeros síntomas observados a simple vista; en

‘Calcutta 4’ ocurrió en los primeros días después de la inoculación (6 dpi) mientras que en

‘Grande naine’ ocurrió en días posteriores (14 dpi).

Además, en ambos genotipos las deposiciones de lignina y la acumulación de peróxido de

hidrógeno y compuestos fenólicos, solo se observaron en el tejido foliar correspondiente a

las lesiones de plantas inoculadas, lo que relaciona directamente estos eventos entre sí y

con la respuesta de defensa de la planta ante la infección del patógeno.

La diferencia en cuanto al tiempo de aparición de los síntomas entre ambos genotipos

pudiera estar relacionada con el fenotipo de la resistencia que presentan ambos ante la

enfermedad. Es por esta razón que se requiere evaluar el comportamiento en el tiempo

(antes de la aparición de los primeros síntomas), de varios compuestos bioquímicos

resultantes de las principales rutas metabólicas, descritas como parte de los mecanismos

de defensa en plantas ante el ataque por patógeno.

4.3 Cuantificación de compuestos enzimáticos y no enzimáticos en diferentes

tiempos después de la inoculación en hojas de plantas de ‘Grande naine‘ y ‘Calcutta

4‘ inoculadas artificialmente con M. fijiensis

Se pudo determinar la actividad de las enzimas analizadas, así como los compuestos no

enzimáticos relacionados con la respuesta defensiva en las plantas de ambos genotipos

utilizando la metodología descrita.

4.3.1. Determinación de actividad enzimática

Peroxidasa

Se observó que en las plantas infectadas de ambos genotipos, la actividad de esta enzima

varió significativamente en los días posteriores a la inoculación respecto a los controles, a

diferentes tiempos después de la inoculación (Figuras 10A y B).

En las plantas inoculadas de ‘Grande naine’ la actividad peroxidasa fue significativamente

mayor respecto a las plantas controles al día 14 dpi el cual corresponde con el día de

aparición de los primeros síntomas (Figura 10A).

En las plantas de ‘Calcutta 4’, se observó un aumento significativo en la actividad

peroxidasa en las plantas inoculadas respecto a los controles, a partir del día 6 dpi

(momento en que se observaron los primeros síntomas) y hasta el día 14. El mayor valor

se observó al día 10 dpi (Figura 10B).

Figura 10. Efecto de la infección con M. fijiensis en la actividad peroxidasa, en plantas de A)‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control (cc). Valoresmedios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitneypara p <0,01

La actividad peroxidasa ha sido vinculada con la respuesta de la planta ante el patógeno

en otros patosistemas como son: Solanum tuberosum-Phytophthora infestans, Ipomoea

batatas-Ceratostomella fimbriata, Gossipium arboreos-Verticillium sp., Vicia faba-

Uromyces faba y Vigna sinensis-Pseudocercospora sp. (Mohammadi y Kazemi, 2002). En

todos los casos, estos autores observaron mayores valores de la actividad peroxidasa en

las plantas inoculadas respecto a las plantas sin inocular.

0

0,20,4

0,60,8

11,2

1,41,6

1,8

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

EA (µ

mol

es/m

in/g

de

mas

a fre

sca)

gc

gib

a A

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

AE (µ

mol

/min

/g d

e m

asa

fresc

a)

cc

ci

a

b

a

b

a

b

B

Al comparar las plantas inoculadas de ambos genotipos, se pudo apreciar un

comportamiento similar en la variación de la actividad peroxidasa en el tiempo. La principal

diferencia lo constituyó la velocidad en el incremento de dicha actividad enzimática, la cual

ocurrió antes en el genotipo resistente respecto al genotipo susceptible (Figura 11).

Figura 11. Actividad peroxidasa en plantas inoculadas con M. fijiensis de A)‘Grande naine‘ (gi) y B)‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difierenpor prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01

En este sentido, el aumento en la actividad de esta enzima ha sido relacionado con la

resistencia a patógenos en plantas de T. sativum (Flott et al., 1989), H. vulgare (Kerby y

Somerville, 1989), O. sativa (Reimers et al., 1992; Young et al., 1995) y Saccharum

officinarum (McGhie et al., 1997). Estos autores observaron el incremento de la actividad

peroxidasa en las plantas infectadas, respecto a las no infectadas y además, que durante

la interacción compatible en las plantas susceptibles, la actividad peroxidasa fue tardía o

no varió al compararlas con las plantas resistentes.

Al respecto, se ha señalado que las peroxidasas son un grupo de enzimas oxido-

reductoras que participan en la respuesta de defensa de la planta en procesos como la

00,2

0,40,6

0,81

1,21,4

1,61,8

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

EA (µ

mol

/min

/g d

e m

asa

fresc

a)

ci

gi

a

b

a

b

a

ba

b

formación de la pared celular a través de la oxidación de fenoles, la suberización y la

lignificación de las paredes de las células vegetales durante la respuesta de defensa ante

agentes patogénicos (Aguiar et al., 2000; Horling et al., 2002). Además, varios estudios

han indicado que las enzimas peroxidasa y polifenol oxidasa participan en la respuesta

defensiva en general y en la reacción de hipersensibilidad en plantas resistentes a virus,

bacterias y hongos (Mohammadi y Kazemi, 2002).

Fenilalanina amonio-liasa

Se observó un aumento significativo de la actividad PAL a partir del día 8 hasta el 16 dpi

en plantas de ‘Grande naine’ inoculadas respecto a las no inoculadas, el mayor valor se

obtuvo a los 14 dpi, momento en el que aparecieron los primeros síntomas en las plantas

infectadas (Figura 12A).

En las plantas de ‘Calcutta 4’, el valor de la actividad PAL fue mayor en las plantas

inoculadas respecto a las plantas controles a partir del día 8 hasta el 14 dpi y el mayor

valor se observó al día 10 dpi (Figura 12B).

Estos resultados coinciden con lo planteado por autores como Hoss et al. (2000), en

plantas de Musa spp. inoculadas con toxinas del patógeno, quienes afirmaron que en la

interacción Musa spp.-M. fijiensis el patógeno es capaz de inducir un incremento en la

actividad PAL en las planta infectada respecto a los controles.

Figura 12. Efecto de la infección con M. fijiensis en la actividad fenilalanina amonio-liasa en plantasde A) ‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control (cc).Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01

Estos resultados coinciden además, con lo informado por autores como Chen et al. (2000),

quienes observaron altos niveles de esta enzima en las raíces de plantas de Cucumis

sativus inoculadas con Pythium aphanidermatum.

La relación de esta enzima con la respuesta defensiva de la planta ha sido señalada

además por Way et al. (2002), quienes encontraron que una sobrexpresión del gen que

codifica para la enzima PAL en plantas de tabaco transgénico, produjo una disminución en

0

50

100

150

200

250

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

nmol

es d

e ác

ido

ciná

mic

olib

erad

os/m

in/g

de

mas

a fre

sca

gc

gi

a

b b

a

a

b

a

b

A

0

50

100

150

200

250

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

nmol

es d

e ác

ido

ciná

mic

olib

erad

os/m

in/g

de

mas

a fre

sca

ccci

a

b

a

b

a

b

B

el tamaño de las lesiones después de cinco inoculaciones con Phytophthora parasitica pv.

nicotianae y Cercospora nicotianae.

Al comparar el aumento de la actividad enzimática en ambos genotipos se observó que

aunque tienen una tendencia similar, en las plantas inoculadas del genotipo resistente los

mayores valores ocurrieron en los primeros días después de la inoculación, mientras que

en las plantas del genotipo susceptible ocurrió en días posteriores (Figura 13).

Figura 13. Actividad fenilalanina amonio-liasa en plantas inoculadas con M. fijiensis de A) ‘Grandenaine‘ (gi) y B) ‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales en cadatiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01

Al respecto, autores como Anand et al. (2007) observaron un aumento en la actividad de

esta enzima en plantas de S. lycopersicum tratadas con elicitores y con resistencia a

Alternaria solani, al compararlas con los controles y las plantas susceptibles. Además, Shi

et al. (2007) señalaron un comportamiento similar en plantas de Cucurbita spp. tratadas

con elicitores, con resistencia a Sphaerotheca fuliginea y Erysiphe cichoracearum.

La enzima fenilalanina amonio-liasa cataliza la conversión de la fenilalanina a ácido

cinámico, el cual constituye el primer paso en la ruta general de los fenilpropanoides.

Como ha sido señalado, esta ruta de síntesis provee a las plantas de compuestos como

0

50

100

150

200

250

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

nmol

es d

e ác

ido

ciná

mic

olib

erad

o/m

in/g

de

mas

a fre

sca

ci

gia

b

a

b

a

b

a

b

antocianinas, flavonoides así como flavonas con acción fotoprotectiva ante los daños

causados por varios tipos de estrés (Ferrer et al., 2008).

β-1,3 glucanasa

Como resultado de este trabajo se observó que en el genotipo ‘Grande naine’ la acción de

la actividad β-1,3 glucanasa no varió en el tiempo en las plantas inoculadas respecto a las

no inoculadas (Figura 14A). En el genotipo ‘Calcutta 4’ se observó un rápido y significativo

aumento en la actividad de esta enzima, desde los primeros días después de la

inoculación (entre los 3 y 8 dpi), en las plantas inoculadas respecto a las plantas controles.

El mayor valor de la actividad enzimática correspondió al día 6 dpi, momento en el que

fueron observados los primeros síntomas en este genotipo (Figura 14B).

0

2

4

6

8

10

12

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

µg d

e gl

ucos

a lib

erad

a/m

in/g

de

mas

a fre

sca

gc

gi

A

Figura 14. Efecto de la infección con M. fijiensis en la actividad β-1,3 glucanasa en plantas de A)‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control (cc). Valoresmedios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitneypara p <0,01

Se ha señalado el papel de esta enzima en la defensa de la planta en varios patosistemas.

Por ejemplo, Joosten y De Wit (1989) observaron el aumento de la actividad β-1,3

glucanasa en hojas de plantas de tomate inoculadas con C. fulvum, así como Zareie et al.

(2002) en hojas de plantas de H. vulgare L. infectadas con Rhynchosporium secalis.

Igualmente, Castro y Bach (2004) en plantas de cebada infectadas con Bipolaris

sorokiniana y Anand et al. (2007) en el patosistema S. lycopersicum-Pseudomonas

fluorescens, observaron el aumento de la actividad β-1,3 glucanasa en las plantas

infectadas, al compararlas con las plantas sin inocular y señalaron su posible papel en la

defensa de la planta en la interacción con el patógeno.

Aunque se ha señalado la presencia de la enzima β-1,3 glucanasa en varias especies de

hongos entre los que se encuentra M. fijiensis (Cho et al., 2008), en este caso, el aporte al

aumento significativo de la actividad de dicha enzima, en las plantas de ‘Calcutta 4’

inoculadas respecto a las no inoculadas, es insignificante, debido a que solo se observó en

los primeros días posteriores a la inoculación donde hay poco crecimiento del patógeno.

Otro hecho que respalda esta afirmación, es que en las plantas de ‘Grande naine’, no hubo

0

2

4

6

8

10

12

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

ug d

e gl

ucos

a lib

erad

a/m

in/g

de

mas

afre

sca cc

ci

aa

a

b b b

B

diferencias significativas entre las plantas inoculadas con el hongo y los controles. Por lo

que se puede relacionar el aumento de dicha enzima con la respuesta de las plantas ante

la inoculación del patógeno, en el genotipo resistente.

Como resultado de la comparación entre las plantas inoculadas de ambos genotipos, se

observó que la actividad β-1,3 glucanasa en las plantas de ‘Calcutta 4’ fue

significativamente superior respecto a las plantas de ‘Grande naine’, en los primeros días

después de la inoculación (Figura 15).

Figura 15. Actividad β-1,3 glucanasa en plantas inoculadas con M. fijiensis de A) ‘Grande naine‘ (gi)y B) ‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales en cada tiempodifieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01

Estos resultados coinciden con lo informado por Joosten y De Wit (1989), quienes

observaron en hojas de plantas de tomate inoculadas con C. fulvum que el incremento en

la actividad de esta enzima y de la enzima quitinasa, ocurrió más rápidamente y fue mayor

en plantas del cultivar resistente respecto al cultivar susceptible, dichos autores plantearon

además, que esto pudiera ser resultado de la velocidad en el reconocimiento por el

hospedero de elicitores específicos producidos por el patógeno.

0

2

4

6

8

10

12

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

ug d

e gl

ucos

a lib

erad

a/m

in/g

de

mas

afre

sca ci

gi

a

b

b

aa

b

Se conoce que la enzima β-1,3 glucanasa hidroliza uniones de β-1,3 glucanos, los cuales

constituyen los componentes principales de la pared celular de la mayoría de los hongos

(Datta et al., 2001) y en unión con la enzima quitinasa producen un efecto sinérgico que

aumenta la resistencia de las plantas frente a los patógeno (van Loon et al., 2006).

En la interacción Musa spp.-M. fijiensis se ha señalado que la inducción de proteínas PR

tiene una estrecha relación con la resistencia de las plantas ante la infección por

patógenos, pero el conocimiento del papel exacto de estas proteínas en este patosistema

es aun limitado (Lepoivre et al., 2003). No obstante, autores como Dagert et al. (2002)

realizaron una biblioteca susbstractiva en el cultivar resistente 'Yangambí km5' en plantas

infectadas con M. fijiensis y encontraron la expresión diferencial de secuencias con

homología a genes de glucanasas.

La actividad de esta enzima no está vinculada solamente a la acción directa sobre el

patógeno sino que al igual que la enzima peroxidasa está relacionada con el proceso de

ensamblaje de los componentes de la pared celular en las plantas, así como la

polimerización de monómeros de lignina y suberina con la subsecuente resistencia a los

patógenos, lo cual se ha señalado en varios patosistemas (Ferreira et al., 2007).

En general, se observó que la actividad de las enzimas peroxidasa, PAL y β-1,3

glucanasa, varió significativamente en las plantas inoculadas respecto a los controles en el

genotipo ‘Calcutta 4’, igualmente ocurrió en el caso de ‘Grande naine’, excepto en el caso

de la actividad β-1,3 glucanasa. Además, se observó que en las plantas inoculadas de

‘Calcutta 4’ la variación significativa de dicha actividad ocurrió antes en el tiempo, respecto

a las plantas inoculadas de ‘Grande naine’. Es por esto, que en ambos genotipos, el

aumento en la actividad de estas enzimas se puede relacionar directamente con la

respuesta de defensa de la planta ante la inoculación del patógeno, así como con su

posible influencia en el fenotipo de resistencia que presentan estos.

4.3.2 Cuantificación de compuestos no enzimáticos

Fenoles totales

Se observó un incremento significativo en el contenido de fenoles totales en las plantas

inoculadas del genotipo susceptible al compararlas con las no inoculadas, a partir del día

14, el cual fue el tiempo de aparición de los primeros síntomas; este incremento se

mantuvo hasta los 16 días después de la inoculación (Figura 16A).

En el genotipo resistente, se observó un aumento significativo en la acumulación de

fenoles en las plantas inoculadas, respecto a las no inoculadas a partir del día 6 dpi,

momento en que se observaron los primeros síntomas, esta diferencia significativa en el

contenido de fenoles entre las plantas inoculadas y los controles se mantuvo en todo el

período de tiempo evaluado (Figura 16B).

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3 6 8 10 14 16Días posteriores a la inoculación

mg

de fe

nole

s to

tale

s/g

de m

asa

fresc

a

gecgei

a

a

bb

A

Figura 16. Efecto de la infección con M. fijiensis en el contenido de fenoles totales en plantas de A)‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control (cc). Valoresmedios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitneypara p <0,01

En este sentido, el incremento en la producción de compuestos fenólicos y su papel en el

proceso de defensa de las plantas ha sido informado en varios patosistemas, como: T.

aestivum-Puccinia graminis f. sp. tritici (Beardmore et al., 1983), S. lycopersicum-

Verticillium alboatrum (Robb et al., 1987), O. sativa-X. oryzae pv. oryzae (Reimers y

Leach, 1991), C. sativus-Pythium aphanidermatum (Chen et al., 2000), Triticum spp.-F.

graminearum (Mohammadi y Kazemi 2002), S. vulgare-S. rolfsii (Maurya et al., 2007) y O.

sativa-P. grisea (Sundravadana et al., 2007). Estos autores observaron un aumento

significativo en los compuestos fenólicos en las plantas infectadas respecto a las no

infectadas. En este sentido, autores como Bélanger et al. (2003) vinculan la acumulación

de estos compuestos con la supresión directa del crecimiento de los patógenos fúngicos.

Al comparar la variación del contenido de los compuestos fenólicos totales en las plantas

inoculadas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’, se observó que en el genotipo resistente, la

acumulación de estos compuestos ocurrió antes y fue significativamente mayor que en el

genotipo susceptible. Además, en ambos casos, el mayor valor coincidió con el momento

de aparición de los primeros síntomas (Figura 17).

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

mg

de fe

nole

s to

tale

s/g

de m

asa

fresc

a

ccci

a

a

a

b

a

b

a

B

b b b

Figura 17. Contenido de fenoles totales en plantas inoculadas con M. fijiensis de ‘Grande naine‘ (gi)y ‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difierenpor prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01

Anión superóxido

La cantidad de Nitroblue tetrazolium reducido es equivalente a la producción del anión

superóxido. En este sentido, en plantas de ‘Grande naine’ inoculadas, la producción del

O2.- fue significativamente mayor que en los controles a partir del día 8 dpi. El mayor valor

se observó a los 10 dpi, el cual fue disminuyendo gradualmente en el tiempo (Figura 18A).

En las plantas de ‘Calcutta 4’ inoculadas se observaron fluctuaciones en la producción del

anión superóxido. A los seis días después de la inoculación se obtuvo el valor más alto, el

cual fue significativamente mayor que en las plantas controles, dicho valor disminuyó

drásticamente en el día 8 dpi; posteriormente se observó un nuevo aumento significativo

respecto a las plantas sin inocular, alrededor del día 10 posterior a la inoculación (Figura

18B).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

mg

de fe

nole

s to

tale

s /g

de

mas

a fre

sca

cigei

a

b

a

b

Figura 18. Efecto de la infección con M. fijiensis en la producción del anión superóxido (O2.-) en

plantas de A) ‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control(cc). Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica deMann-Whitney para p <0,01

En ambos genotipos se observó la disminución de la producción de dicho anión en un

corto período de tiempo, lo cual pudiera estar asociado al hecho de que el anión O2.- es un

radical libre relativamente inestable y que se reconvierte fácilmente en oxígeno molecular

(O2) y en H2O2, mediante reacciones espontáneas o catalizadas por la enzima superóxido

dismutasa (SOD). En contraste con el anión O2.-, el H2O2 pertenece a las ROS de tipo no-

radical el cual no pose carga neta, por lo que posee una vida media más larga que el

radical superóxido y constituye además una molécula de señalización de más larga

distancia (Vranová et al., 2002).

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

Incr

emen

to d

e D

O a

580

nm

(1h)

/ g d

em

asa

fresc

a

gcgi

b

a

b b

a

b

a

a

A

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

Incr

emen

to d

e D

O a

580

nm

(1h)

/ g d

em

asa

fresc

a

ccci

a

a

bb

B

Se ha planteado que la acción de las O2.-/ROS está directamente relacionada con la

respuesta de la planta ante el patógeno; se ha vinculado además, con la protección celular

ante el estrés oxidativo causado por el patógeno, así como con la inducción de otros

mecanismos antioxidantes como la actividad peroxidasa (Ferreira et al., 2007), la cual

como se señaló anteriormente en este trabajo, se incrementó en las plantas inoculadas

respecto a las no inoculadas en ambos genotipos.

Al comparar los dos genotipos, se observó que en las plantas inoculadas de ‘Calcutta 4’ a

los 6 dpi ocurrió un pico en la acumulación del anión superóxido el cual fue antes y

significativamente mayor que en las plantas de inoculadas de ‘Grande naine’. En las

plantas del cultivar susceptible, el incremento en la acumulación de este anión ocurrió más

tarde, sobre el día 10 posterior a la inoculación. Se observó además, que a partir del día

ocho, dicha acumulación presentó una tendencia muy similar durante el período de tiempo

evaluado, en ambos genotipos (Figura 19).

Figura 19. Acumulación del anión superóxido (O2.-) en plantas inoculadas con M. fijiensis de

‘Grande naine‘ (gi) y ‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales encada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01

00,020,04

0,060,08

0,10,120,140,160,18

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

Incr

emen

to d

e D

O a

580

nm

(1h)

/ gde

mas

a fre

sca

gici

a

b

Estos resultados coinciden con los obtenidos por Patykowski y Urbanek (2003), los cuales

informaron acerca del aumento significativo de la acumulación de superóxido en plantas

de tomate infectadas con B. cinerea, respecto a las plantas controles. Dichos autores

también observaron que el aumento en la producción de O2.- fue mayor y más rápido en

las plantas del cultivar más resistente en comparación con el susceptible.

Antocianinas

Como resultado de la cuantificación en el tiempo del contenido de antocianinas, se

observó que este varió entre las plantas inoculadas y los controles, en ambos genotipos.

En plantas inoculadas del genotipo susceptible hubo un aumento abrupto a partir del día

ocho después de la inoculación, el cual fue significativamente mayor que en las plantas

controles y se mantuvo durante todo el período de tiempo analizado (Figura 20A).

En las plantas inoculadas del genotipo resistente se observó un comportamiento distinto;

el contenido de antocianinas fue significativamente mayor entre plantas inoculadas y los

controles entre los días 6 y 8 dpi, a partir del momento en que se observaron los primeros

síntomas en las hojas y posteriormente este disminuyó durante el tiempo evaluado (Figura

20B).

La relación entre el aumento del contenido de antocianinas y el proceso de respuesta de la

planta ante el patógeno, ha sido planteado por autores como Neil et al. (2002) quienes

además, vinculan el incremento de la concentración de antocianinas a la protección por

parte de estos compuestos, de las estructuras celulares ante el daño fotooxidativo.

En este sentido, se ha señalado que los síntomas causados por M. fijiensis, en plantas de

Musa spp., se caracterizan por lesiones pronunciadas con la presencia de halos cloróticos

y con el consecuente daño fotooxidativo, lo cual sugiere la liberación de toxinas por parte

del patógeno (Carlier et al., 2000). Ha sido referido además, que los cloroplastos son el

sitio de acción específico de estas toxinas, las cuales juegan un importante papel en el

desarrollo de la enfermedad (Busogoro et al., 2004).

Figura 20. Efecto de la infección con M. fijiensis en la concentración de antocianinas en plantas deA) ‘Grande naine‘ (gi), respecto al control (gc) y de B) ‘Calcutta 4‘ (ci), respecto al control (cc).Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difieren por prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01

Estos resultados concuerdan además, con lo informado por autores como Grayer y

Kokubun (2001), en varias interacciones planta-patógeno, así como con estudios

realizados por Smith et al. (2007), en hojas de plantas de dos especies de Eucalipto

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

3 6 8 10 14 16Días posteriores a la inoculación

Con

teni

do d

e an

toci

anin

as (m

g/g

dem

asa

fresc

a)

gcgi

b b

a

a a

a

bb

A

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

Con

teni

do d

e an

toci

anin

as (m

g/g

dem

asa

fresc

a)

ccci

b

a

b

a

B

infectadas con Mycosphaerella spp., quienes observaron un aumento significativo en las

plantas infectadas, respecto a las plantas controles.

Al comparar ambos genotipos, se observó que en los primeros días después de la

inoculación hubo un aumento en el contenido de antocianinas en las plantas inoculadas

del genotipo resistente, el cual fue significativamente mayor que en las del susceptible. No

obstante, a partir del día 8 dpi, se observó un gran aumento de dicho contenido en las

plantas inoculadas de ‘Grande naine’, el cual se mantuvo durante todo el período evaluado

y fue significativamente mayor que en las plantas inoculadas de ‘Calcutta 4’ (Figura 21).

Figura 21. Contenido de antocianinas en plantas inoculadas con M. fijiensis de ‘Grande naine‘ (gi) y‘Calcutta 4’ (ci), en casa de cultivo. Valores medios con letras desiguales en cada tiempo difierenpor prueba no paramétrica de Mann-Whitney para p <0,01

Sin embargo, autores como Roux et al. (2003), encontraron que en mutantes del cultivar

‘Grande naine’, seleccionados por su tolerancia a la toxina de M. fijiensis: juglone, el

contenido de antocianinas fue significativamente mayor que en las plantas no tolerantes a

la enfermedad.

A partir de los resultados de este trabajo, se puede afirmar que aunque existen diferencias

en cuanto a las características fenotípicas entre las plantas de los genotipos de Musa spp.

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

3 6 8 10 14 16

Días posteriores a la inoculación

Con

teni

do d

e an

toci

anin

as (m

g/g

de m

asa

fresc

a)

ci

gia

b

a

b

a

b

a

b

a

b

analizados, estas no son determinantes en el tipo de interacción que se establece entre la

planta y el patógeno. Además, se puede corroborar que en ambos genotipos, la

acumulación de compuestos como lignina, fenoles y peróxido de hidrógeno que ocurre en

el tejido vegetal con síntomas de plantas inoculadas, está relacionada entre sí y con la

respuesta de la planta ante el patógeno. Igualmente, el aumento en la actividad de las

enzimas peroxidasa, β-1,3 glucanasa y fenilalanina amonio-liasa, así como la acumulación

de fenoles, del anión superóxido y de antocianinas, está directamente relacionada con la

respuesta de la planta ante el patógeno. Se observó además, que en ambos genotipos, la

mayor acumulación de estos compuestos relacionados con la defensa ocurrió

generalmente antes de la aparición de los primeros síntomas y que en las plantas

inoculadas de ‘Calcutta 4’ esta ocurrió, en todos los casos, antes que en las plantas

inoculadas de ‘Grande naine’.

Los resultados de este trabajo constituyen además, los primeros estudios sobre la

caracterización bioquímica de la respuesta de plantas de Musa spp. inoculadas

artificialmente con suspensiones miceliales de M. fijiensis, a la vez que brindan nuevos

aportes en el estudio de los mecanismos involucrados en la interacción planta-patógeno,

en este importante patosistema.

5. CONCLUSIONES

1 A partir de la caracterización fenotípica de plantas de ‘Grande naine’ y ’Calcutta 4’

en casa de cultivo, se demostró que aunque existen diferencias entre las plantas

de ambos genotipos, estas no son determinantes en el fenotipo de la resistencia a

la infección por M. fijiensis.

2 Mediante la detección histoquímica de lignina, fenoles y peróxido de hidrógeno en

hojas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’, con diferentes estados de síntoma, se

comprobó que su acumulación estaba relacionada con la respuesta de la planta

ante la inoculación artificial con M. fijiensis.

3 Se demostró que el incremento de la actividad enzimática peroxidasa, fenilalanina

amonio-liasa y β-1,3 glucanasa, así como del contenido de fenoles, anión

superóxido y antocianinas, estuvo relacionado con la respuesta defensiva de

plantas de ‘Grande naine’ y ‘Calcutta 4’ inoculadas artificialmente con M. fijiensis.

4 A través de la determinación de compuestos bioquímicos en plantas de dos

genotipos de Musa inoculados artificialmente con M. fijiensis fue posible establecer,

que estos intervienen en su respuesta defensiva ante el patógeno, que en ambos

se inicia generalmente antes de la aparición de los primeros síntomas y que en las

plantas inoculadas de ‘Calcutta 4’ tuvo lugar antes que en las plantas inoculadas de

‘Grande naine’.

6. RECOMENDACIONES

1 Realizar estudios de histología en plantas inoculadas de ambos genotipos con

cepas de M. fijiensis transformadas con la proteína verde fluorescente para

observar el desarrollo y evolución de la enfermedad a partir de la inoculación.

2 Continuar los estudios para la caracterización molecular de la interacción tanto

compatible como incompatible, antes de la aparición de los primeros síntomas de la

enfermedad.

3 Cuantificar otros compuestos bioquímicos relacionados con la respuesta de la

planta ante el patógeno, descritos en otros patosistemas.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

· Aguiar, E.A., Turner, D.W. y Sivasithamparam, K. (2000). Fusarium oxysporum f.sp.

cubense inoculation and hypoxia alter peroxidase and phenilalanine ammnia-lyase

enzyme activities in nodal roots of banana cultivars (Musa sp.) differing in their

susceptibility to Fusarium wilt. Australian Journal of Botany. 48: 589-596.

· Alexoupoulos, C.J. y Mims, C.W. (1979). Introductory Mycology. En: John y Sons

(eds). New York. pp. 321-329.

· Alvarado, Y., Leiva, M., Rodríguez, M.A., Acosta, M., Cruz, M., Portal, O., Kosky,

R.G., García, L., Bermúdez, I. y Padrón, J. (2003). Early evaluation of Black leaf

streak resistance by using mycelial suspension of Mycosphaerella fijiensis.

Mycosphaerella leaf spot diseases of bananas: present status and outlook. En:

(Jacome, L., Leproive, P., Martin, D., Ortiz, R., Romero, R. y Escalant, J.V.

(eds)).pp 169-175.INIBAP, Montpellier. ISBN 2-910810-57-7.

· Anand, T., Chandrasekaran, A., Kuttalam, S., Raguchander, T., Prakasam, V. y

Samiyappan, R. (2007). Association of some plant defence enzyme activities with

systemic resistance to early leaf blight and leaf spot induced in tomato plants by

azoxystrobin and Pseudomonas fluorescents. Journal of Plant Interactions. 2(4):

233-244.

· Apel, K. y Hirt, H. (2004). Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress,

and signal transduction. Annual Review of Plant Biology. 55: 373-399.

· Arzanlou, M., Groenewald, J.Z., Fullerton, R.A., Abeln, E.C.A., Carlier, J., Zapater,

M.F., Buddenhagen, I.W., Viljoen, A. y Crous, P.W. (2008). Multiple gene

genealogies and phenotypic characters differentiate several novel species of

Mycosphaerella and related anamorphs of banana. Persoonia. 20:19-37.

· Asselbergh, B., Curvens, K., França, S.C, Audenaert, K., Vuylsteke, van B.F. y

Höfte, M. (2007). Resistance to Botrytis cinerea in sitiens, an abscisic acid-deficient

tomato mutant, involves timely production of hydrogen peroxide and cell wall

modifications in the epidermis. Plant Physiology. 144:1863-4877.

· Basha, S.A., Sarma, B.K., Singh, D.P. y Singh, U.P. (2006). Differential methods of

inoculation of plant growth-promoting rhizobacteria induce synthesis of

phenylalanine ammonia-lyase and phenolic compounds differentially in chickpea.

Folia Microbiol. 51: 463-468.

· Beardmore, J., Ride, J.P. y Granger, J.W. (1983). Cellular lignification as a factor in

the hypersensitive resistance of wheat to stem. Physiol. Plant Pathol. 22: 209-220.

· Beckman, C.H., Mueller, W.C., Tessier, B.J. y Harrisson, N.A. (1982). Recognition

and callose deposition in response to vascular infection in fusarium wilt-resistant or

susceptible tomato plants. Physiol Plant Pathol. 20:1-10.

· Bélanger, R.R., Benhamou, N. y Menzies, J.G. (2003). Cytological evidence of an

active role of silicon in wheat resistance to powdery mildew (Blumeria graminis f.

sp. tritici). Phytopathology. 93:402-412.

· Bennet, R.S. y Arnerson, P.A. (2003). Black Sigatoka. The Plant Health Instructor,

disponible en: http://www.apsnet.org/education/LessonsPlantPath/BlackSigatoka

(consultado Diciembre, 2009).

· Bent, A., y Mackey, D. (2007). Elicitors, effectors and R genes: the new paradigm

and a lifetime supply of questions. Annual Review of Phytopathology. 45: 399-436.

· Beveraggi, A., Zapater, M.F. y Mourichon, X. (1995). Análisis de la resistencia de

los bananos a la Sigatoka negra causada por Mycospharella fijensis (Cercospora

fijensis). CIRAD-CA. Montpellier, Francia. En: Referencias bibliográficas Musa.

1999, sobre bananos y plátanos de las Memorias XIII Reunión ACORBAT,

Guayaquil, Ecuador.1998. pp 6-11.

· Bhadauria, V., Banniza, S., Wang, L., Wei, Y. y Peng, Y. (2010). Proteomic studies

of phytopathogenic fungi, oomycetes and their interactions with hosts. Eur J Plant

Pathol. 126:81-95.

· Bray, W. y Thorpe, V. (1954). Analysis of phenolic compounds of interest in

metabolism. Meth Biochem Analysis. 1:27-52.

· Burt, A. (2003). Airborne dispersal of Mycosphaerella fijiensis. En: Mycosphaerella

leaf spot disease of bananas, present status and outlook. Proceding of the

Workshop on Mycosphaerella leaf spot disease, San José. Costa Rica, INIBAP.

· Busogoro, J.P., Etamé, J.J., Lognay, G., Messiaen, J., Van Cutsem, P. y Lepoivre,

P. (2004). Analysis of the mechanisms of action of Mycosphaerella fijiensis toxins

during the development of Black leaf streak disease. En: Jain, M. y Swennen, R.

(eds) Banana improvement: cellular, molecular biology, and induced mutations.

Science Publishers. Enfield. pp. 171-181.

· Cai, Ch., Xu, Ch., Li, X., Ferguson, I. y Chen, K. (2006). Accumulation of lignin in

relation to change in activities of lignification enzymes in loquat fruit flesh after

harvest. Postharvest Biol. Technol. 40: 163-169.

· Cakmak, I., Strboe, D. y Marschner, H. (1993). Activities of hydrogen peroxides

scavenging enzymes in germinating wheat seeds. J. Exp. Bot. 44: 127-132.

· Cañas-Gutiérrez, G.P., Patiño, L.F., Rodríguez-Arango, E. y Arango, R. (2006).

Molecular Characterization of Benomyl-resistant Isolates of Mycosphaerella fijiensis

Collected in Colombia. J. Phytopathology. 154: 403-409.

· Carlier, J., Fouré, E., Gauh, l.F., Jones, D., Lepoivre, P., Mourichon, X., Pasberg-

Gauhl, C. y Romero, R. (2000). Black leaf streak. En: Jones, D.R. (ed.) Disease of

Banana, Abacá and Enset, CABI. Wallinford. pp. 37-79.

· Carlier, J., Fouré, E., Gauhl, F., Jones, D., Lepoivre, P., Mourichon, X., Pasberg-

Gauhl, C. y Romero, R. (2000). Black Leaf Streak. En: Jones, D.R. (ed.). Fungal

Disease of the Foliage. Cap. 2. pp. 37-79.

· Carlier, J., De-Waele, D. y Escalant, J.V. (2002). Evaluación global de la resistencia

de los bananos al marchitamiento por Fusarium, enfermedades de las manchas

foliares causadas por Mycosphaerella y nemátodos. Evaluación del

comportamiento (Vézina, A. y Picq, C. eds). Guías técnicas INIBAP 6. Red

Internacional para el Mejoramiento del Banano y el Plátano, Montpellier, Francia.

· Castro, O., Erna, L. y Bach, E. (2004). Increased production of ß-1,3 glucanase and

proteins in Bipolaris sorokiniana pathosystem treated using commercial xanthan

gum. Plant Physiology and Biochemistry. 42: 165-169.

· Chen, C.Q., Belanger, R.R., Benhamou, N. y Paulitz, T.C. (2000). Defense

enzymes induced in cucumber roots by treatment with plant growth-promoting

rhizobacteria (PGPR) and Pythium aphanidermatum. Physiological Molec Plant

Pathol. 56:13-23.

· Cho, Y., Hou, S. y Zhong, S. (2008). Analysis of Expressed Sequence Tags from

the Fungal Banana Pathogen Mycosphaerella fijiensis. The Open Mycology

Journal. 2: 61-73.

· Clé, C., Hill, L.M., Niggeweg, R., Martin, C.R., Guisez, Y., Prinsen, E. y Jansen,

M.A.K. (2008). Modulation of chlorogenic acid biosynthesis in Solanum

lycopersicum; consequences for phenolic accumulation and UV-tolerance

Phytochemistry. 69: 2149-2156.

· Cohen, Y., Rubin, A.E. y Kilfin, G. (2009). Mechanisms of induced resistance in

lettuce against Bremia lactucae by DL-β-amino-butyric acid (BABA). Eur J Plant

Pathol. 11-31.

· Companioni, B., Mora, N., Díaz, L., Pérez, A., Arzola, M., Espinosa, P., Hernández,

M., Ventura, J., Pérez, M.C., Santos, R. y Lorenzo, J.C. (2005). Identification of

discriminant factors after treatment of resistant and susceptible banana leaves with

Fusarium oxysporum f. sp. cubense culture filtrates. Plant Breeding. 124:79-85.

· Conde-Ferráez, L., Waalwijk, C., Canto-Canché, B.B., Kema, G.H.J., Crous, P.W.,

Andrew, C.J., Abeln, E.C.A. (2007) Isolation and characterization of the mating type

locus of Mycosphaerella fijiensis, the causal agent of black leaf streak disease of

banana. Molecular Plant Pathology. 8 (1): 111-120.

· Cruz-Cruz, C.A., Ramírez-Tec, G., García-Sosa, K., Escalante-Erosa, F., Hill, L.,

Osbourn, A.E. y Peña-Rodríguez, L.M. (2009). Phytoanticipins from banana (Musa

acuminate cv. ‘Grande Naine’) plants, with antifungal activity against

Mycosphaerella fijiensis, the causal agent of black Sigatoka. Eur J Plant Pathol.

DOI 10.1007/s10658-009-9561-9.

· Dagert, M., Boscán, K., Briceño, A. y Rangel, S. (2002). Búsqueda de genes de

defensa contra la Sigatoka Negra en musáceas. En: Acorbat. Memorias XV

reunión. Realizada en Cartagena de Indias, Colombia. 27 de octubre al 02

noviembre. Medellín (COL): Asociación de bananeros de Colombia AUGURA. 54-

58.

· Daniells, J., Jenny, C., Karamura, D. y Tomekpe, K. (2001). Musalogue: A

catalogue of Musa Germplasm. Diversity in the genus Musa (Arnaud, E. y Sharrock,

S., compil.). International Network for the Improvement of Banana and Plantain,

Montpellier, France.

· Datta, K., Tu, J., Oliva, N., Ona, I.I., Velazhahan, R., Mew, T.W, Muthukrishnan, S.,

y Datta, S.K. (2001). Enhanced resistance to sheath blight by constitutive

expression of infection-related rice chitinase in transgenic elite indica rice cultivars.

Plant Sci. 160:405-414.

· Davies, D.R., Bindschedler, L.V., Strickland, T.S. y Bolwell, G.P. (2006). Production

of reactive oxygen species in Arabidopsis thaliana cell suspension cultures in

response to an elicitor from Fusarium oxysporum: implications for basal resistance

Journal of Experimental Botany. 57(8): 1817-1827.

· De Langhe, E. (1996). Banana and plantain: The earliest fruit crop. En: INIBAP

Annual Report, 1995. Monpellier, France, INIBAP. pp. 6-8.

· Doke, N. (1983). Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive

response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of

Phytophtora infestans and to the hyphal wall components. Physiol. Plant. Pathol.

23: 345-357.

· Edgecomb, D.W. y Manker, D. (2006). Bacillus subtilis strain QST 713, bacterial

disease control in fruit, vegetable and ornamental production. En: Proceedings of

the 1st International Symposium on Biological Control of Bacterial Plant Diseases.

408: 167-169.

· FAOSTAT. (2008). Food and agriculture organization of the United Nations,

disponible en http://faostat.fao.org (consultado el 10 de Diciembre de 2009).

· Ferreira, R.B., Monteiro, S., Freitas, R., Santos, C.N., Chen, Z., Batista, L.M.,

Duarte, J., Borges, A. y Teixeira, A.R. (2006). Fungal pathogens: The battle for

plant infection. Crit Rev Plant Sci. 25: 505-524.

· Ferreira, R.B., Monteiro, S., Freitas, R., Santos, C.N., Chen, Z., Batista, L.M.,

Duarte, J., Borges, A. y Teixeira, A.R. (2007). The role of plant defence proteins in

fungal pathogenesis. Molecular Plant Pathology. 5: 677-700.

· Ferrer, J.L., Austin, M.B., Stewart, Jr C. y Noel, J.P. (2008). Structure and function

of enzymes involved in the biosynthesis of phenylpropanoids. Plant Physiology and

Biochemistry. 46: 356-370.

· FHIA. (2007). Bananos y plátanos de la FHIA para la seguridad alimentaria. FHIA.

Informa. 15 (1): 6-8.

· Flott, B.E., Moerschbacher, B.M. y Reisener, H. (1989). Peroxidase isoenzyme

patterns of resistant and susceptible wheat leaves following stem rust infection.

New Phytol. 111: 413-421.

· Fouré, E., Grisoni, M. y Zurfluh, R. (1984). Les cercosporioses du bananier et leurs

traitements. Comportement des variétés II. Etude de la sensibilité variétale des

bananiers et plantains á Mycosphaerella fijiensis Morelet et de quelques

caractéristiques biologiques de la maladie de raies noires au Gabon. Fruits. 39:

365-378.

· Fouré, E. (1985). Les cercosporioses du bananier et leurs traitements. Etude de la

sensibilité variétale des bananiers et plantains á Mycosphaerella fijiensis Morelet au

Gabon. Fruits. 40: 393-399.

· Fullerton, R. y Olsen, R.H. (1995). Pathogenic variability in Mycosphaerella fijiensis

Morelet, cause of black Sigatoka in banana and plantain. Journal of Crop and

Horticultural Science. 23: 39-48.

· Gahan, P.B. (1984). Plant Histochemistry and Cytochemistry. London: Academic

Press.

· Garcion, C., Lammotte, O. y Métraux, J. (2007). Mechanisms of defence to

pathogens: Biochemistry and physiology. En: Walters, D., Newton, A. y Lyon, G.

(eds.) .Induced resistance for plant defence a sustainable approach to crop

protection. Blackwell Publishing Oxford. pp. 109-124.

· Gaulh, F., Pasberg-Gauhl, C. y Jones, D. (2000). Diseases of Banana; Abacá and

Enset (eds.). CAB International, Wallingford, UK.

· Grant, J.J. y Loake, G.J. (2000). Role of reactive oxygen intermediates and cognate

redox signalling in disease resistance. Plant Physiology 124: 21-30.

· Grayer, R.J. y Kokubun, T. (2001). Plant-fungal interactions: the search for

phytoalexins and other antifungal compounds from higher plants. Phytochemistry.

56: 253-263.

· Hammerschmidt, R., Nuckles, E.M, y Kuc, J. (1982). Association of enhance

peroxidase activity with induced systemic resistance of cucumber to Colletotrichum

lagenarium. Physiol Plant Pathol. 20:73-82.

· Henderson, J., Pattemore, J.A., Porchun, S.C., Hayden, H.L., Van-Brunschot, S.,

Grice, R.E, Peterson, R.A, Thomas-Hall, S.R. y Aitken, E.A.B. (2006). Black

Sigatoka disease: new technologies to strengthen eradication strategies in

Australia. Australasian Plant Pathology. 35: 181-193.

· Hernández, A. y Pérez, L. (2001). Reaction of Banana and plantains cultivars to

Black Sigatoka disease caused by Mycosphaerella fijiensis Morelet.

Epidemiological components of the resistance. Fitosanidad. 5(3): 9-19.

· Hernández, Y., Portillo, F., Portillo, M.P., Navarro, C., Rodríguez, M. y Velazco, J.

(2006). Densidad estomática en materiales de plátano (Musa AAB, AAAB y ABB)

susceptibles y resistentes a Sigatoka Negra (Mycosphaerella fijiensis, Morelet).

Rev. Fac. Agron. 23(3):114-121.

· Heslop-Harrison, J.S. y Schwarzacher, T. (2007). Domestication, genomics and the

future for banana. Annal of Botany. 100: 1073-1084.

· Horling, F., König, J. y Dietz, K.J. (2002). Type II peroxiredoxin C, a member of the

peroxiredoxin family of Arabidopsis thaliana: its expression and activity in

comparison with other peroxiredoxins. Plant Physiol Biochem. 40: 491-499.

· Hoss, R., Helbig, J. y Bochow, H. (2000). Function of host and fungal metabolites in

resistance response of banana and plantain in the black Sigatoka disease

pathosystem (Musa spp.-Mycosphaerella fijiensis). Journal of Phytopatology.

148:387-394.

· Howles, P.A., Sewalt, V.J.H., Paiva, N.L., Elkind, Y., Bate, N.J., Lamb, C., y Dixon,

R.A. (1996). Overexpression of L-phenylalanine ammonia-lyase in transgenic

tobacco plants reveals control points for flux into phenylpropanoid biosynthesis.

Plant Physiol. 112:1617-1624.

· Humphreys, J.M. y Chapple, C. (2002). Rewriting the lignin road map. Current

opinion in Plant Biology. 5:224-229.

· IPGRI-INIBAP/CIRAD. (1996). Descriptores para el banano (Musa spp.). Instituto

Internacional de Recursos Fitogenéticos, Roma, Italia; Red Internacional para el

Mejoramiento del Banano y el Plátano, Montpellier, Francia; y el Centre de

coopération intenationale en recherche agronomique pour le développement,

Montpellier, Francia.

· Joosten, M.H.A.J. y De Wit, P.J.G.M. (1989). The tomato–Cladosporium fulvum

interaction: A Versatile Experimental System to Study Plant-Pathogen Interactions.

Annual Review of Phytopathology. 37: 335-367.

· Kalim, S., Luthra, Y.P. y Gandhi, S.K. (2003). Cowpea root rot severity and

metabolic changes in relation to manganese application. J. Phytopathol. 151:92-

97.

· Kerby, K. y Somerville, S. (1989). Enhancement of specific intercellular peroxidase

following inoculation of barley with Erysiphe graminis f. sp. hordei, Physiol. Mol.

Plant Pathol. 35: 323-337.

· Khurana, S.M.P., Pandey, S.K. y Sarkar, D. (2005). Apoptosis in plant disease

response: A close encounter of the pathogen kind. Current Sci. 88:740-752.

· Kirk, T.K y Obst, J.R. (1988). Lignin determination. Methods Enzymol.161: 87-101.

· Lazarovits, G. y Higgins, V.J. (1976). Biological activity and specificity of a toxin

produced by Cladosporium fulvum. Physiol. Biochem. 69:1056-1061.

· Lebeda, A., Sedlarova, M., Petrivalsky, M., y Prokopova, J. (2008). Diversity of

defence mechanisms in plant-Oomycete interactions: a case study of Lactuca spp.

and Bremia lactucae. European Journal of Plant Pathology. 122: 71-89.

· Leiva, M., Bussogoro, J. P. y Lepoivre, P. (2004). Efecto de la inyección foliar de

juglone sobre el sistema antioxidante de las Superóxido dismutasa en dos

cultivares de Musa spp. Biotecnología Vegetal. 4(2): 107-110.

· Leiva, M. (2008). Evaluación temprana Musa spp. a Mycosphaerella fijiensis

Morelet. En casa de cultivo. Tesis para aspirar por el grado científico de doctor en

ciencias Agrícolas. UCLV. IBP. Santa Clara, Cuba. 100 p.

· Lepoivre, P., Busogoro, J. y Etame, J. (2002). Banana-Mycosphaerella fijiensis

interactions. pp. 151-159. En: Proceedings of the 2nd International workshop on M.

fijiensis leaf spot diseases. San José, Costa Rica.

· Lepoivre, P., Busogoro, J.P., Etame, J., El-Hadrami, A., Carlier, J., Harelimana, G.,

Mourichon, X., Panis, B., Riveros, S., Sallé, G., Strosse, H. y Swennen, R. (2003).

Banana-Mycosphaerella fijiensis interactions. En: Jacome, L., Lepoivre, P., Marín,

D., Ortiz, R., Romero, R. y Escalant, V. (eds). Mycosphaerella leaf spot disease of

bananas, present status and outlook. Proceeding of the Workshop on

Mycosphaerella leaf spot disease held in San José, Costa Rica. pp. 151-159.

· Luis, J.G., Fletcher, W.Q., Echeverri, F. y Grillo, T.A. (1994). Phenalenone-type

phytoalexins from Musa acuminata. Synthesis of 4-phenyl-phenalenones.

Tetrahedron. 50: 4117-4130.

· Luis, J.G., Quiñones, A., Echeverri, F., Kishi, P. y García, F. (1996). Musalones:

four 9-phenylphenalenones from rhizomes of M. acuminata. Phytochemistry.

41:753-757.

· Mancinelli, A.L., Yang, C.P.H., Lindquist, P., Anderson, O.R. y Rabino, I. (1975).

Photocontrol of anthocyanin synthesis III. The action of streptomycin on the

synthesis of chlorophyll and anthocyanin. Plant Phys. 55: 251-257.

· Marín, D., Romero, R., Guzmán, M. y Sutton, T. (2003). Black Sigatoka: An

increasing threat to banana cultivation. Plant disease. 87(3): 208-222.

· Martin, K.P., Zhang, C., Slater, A. y Madassery, J. (2006). Control of shoot necrosis

and plant death during micro-propagation of banana and plantains (Musa spp.).

Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 88: 51-59.

· Mateo, A., Mühlenbock, P., Restérucci, C., Chi-Chang, C., Miszalski, Z., Karpinska,

B., Parker, J.E., Mullineaux, P.M. y Karpinski, S. (2004). Lesion Simulating Disease

required for acclimation to conditions that promote excess excitation energy. Plant

Physiol. 136: 2818-2830.

· Maurya, S., Singh, R., Singh, D.P., Singh, H. B., Srivastav, JS. y Singh, U. (2007).

Phenolic compounds of Sorghum vulgare in response to Sclerotium rolfsii infection

S. Journal of Plant Interactions. 2(1): 25-29.

· McGhie, T.K., Masel, N.P., Maclean, D., Croft, B.J. y Smith, G.R. (1997).

Biochemical responses of suspension-cultured sugarcane cells to an elicitor derived

from the root pathogen Pachymetra chaunorhiza. Aust. J. Plant Physiol. 24: 143-

149.

· Meredith, D.S. y Lawrence, J.S. (1969). Black leaf streak disease of bananas

(Mycosphaerella fijiensis): Symptoms of disease in Hawaii, and notes on the

conidial state of the causal fungus. Transaction British Mycology Society. 52: 459-

476.

· Moersbacher, B. y Mendgen, K. (2000). Structural aspects of defence. En: van

Loon, L.C., Fraser, R.S.S. (eds). Mechanisms of resistance to Plant Diseases.

Dordrecht: Kluwer. pp. 231-277.

· Mohammadi, M. y Kazemi, H. (2002). Changes in peroxidase and polyphenol

activity in susceptible and resistant wheat heads inoculated with Fusarium

graminearum and induced resistance. Plant Sci. 162:491-498.

· Molina, O. y Castaño, J. (2003). Resistencia en los FHIA híbridos a Mycosphaerella

spp. INFOMUSA. 12 (2):25-27.

· Montesinos, E. (2000). Pathogenic plant–microbe interactions. What we know and

how we benefit? Int. Microbiol. 3: 69-70.

· Morkunas, I. y Gmerek, J. (2007). The possible involvement of peroxidase in

defense of yellow lupine embryo axes against Fusarium oxysporium. J. Plant

Physiol. 164:185-194.

· Mourichon, X. y Fullerton, R. (1990). Geografical distribution of the two species

Mycosphaerella musicola Leach (Cercospora musae) y M. fijiensis Morelet

(Cercospora fijiensis), respectively agent of Sigatoka disease and Black Streak

Disease in bananas and plantains. Fruits. 45: 213-218.

· Mourichon, X., Beveraggi, A. y Salle, G. (1990). Preformed substances as potential

protectants against Mycosphaerella fijiensis in banana leaves. Leaf Spot Diseases

of Bananas. INIBAP. Montpellier, Francia.

· Murgia, I., Tarantino, D., Vannini, C., Bracale, M., Carravieri, S. y Soave, C. (2004).

Arabidopsis thaliana plants overexpressing thylakoidal ascorbate peroxidase show

increased resistance to paraquat-induced photooxidative stress and to nitric oxide-

induced cell death. Plant J. 38: 940-953.

· Neil, S.O., Gould, K.S., Kilmartin, P.A., Mitchell, K.A. y Markham, K.R. (2002).

Antioxidant capacities of green and cyanic leaves in the sun species, Quintinia

serrata. Func. Plant Biol. 29:1437-1443.

· Orellana, P. (1994). Tecnología para la micropropagación in vitro de clones de

Musa spp. Tesis para aspirar por el grado científico de doctor en ciencias

Agrícolas. UCLV. IBP. Santa Clara, Cuba. 120 p.

· Ortiz, E., Kaemmer, D., Zhang, H. B., Muth, J., Rodríguez, M., Arias, C. y James, A.

(2005). Construction and characterization of a plant transformation-competent

BIBAC library of the black Sigatoka-resistant banana Musa acuminata cv. Tuu Gia

(AA). Theoretical and Applied genetics. 110 (4): 706-713.

· Ortiz, R. y Vuylsteke, D. (1997). Inheritance of black Sigatoka resistance in

plantain-banana (Musa spp.) Hybrids. Theoretical and Applied genetics. 89: 146-

152.

· Otálvaro, F., Nanclares, J., Vázquez, L.E., Quiñones, W., Echeverri, F., Arango, R.

y Schneider, B. (2007). Phenalenone-type compounds from Musa acuminata var.

‘Yangambí km 5’ (AAA) and their activity against Mycosphaerella fijiensis. Journal

of Natural Products. 70:887-890.

· Pan, S.Q., Ye, X.S. y Kuc, J. (1991). Association of β-1,3 glucanase activity and

isoform pattern with systemic resistance to blue mold in tobacco induced by stem

injection with Peronospora tabacina or leaf inoculation with tobacco mosaic virus.

Physiol. Mol. Plant Pathol. 39:25-39.

· Patykowski, J. y Urbanek, H. (2003). Activity of enzymes related to H2O2 generation

and metabolism in leaf apoplastic fraction of tomato leaves infected with Botrytis

cinerea. J. Phytophatology. 151:153-161.

· Pei, X., Li, S., Yiang, Y., Zhang, Y., Wang, Z. y Jia, S. (2007). Isolation,

characterization and phylogenetic analysis of the resistance gene analogues

(RGAs) in banana (Musa spp.). Plant Science. 172: 1166-1174.

· Pérez, L. (2002). Morfología de las especies de Mycosphaerellas asociadas a

manchas de las hojas en Musa spp. Fitosanidad. 6 (3): 6-9.

· Pérez-Hernández, J.B. (2000). Development and application of Agrobacterium-

mediated genetic transformation to increase fungus resistance in banana (Musa

spp.). PhD Thesis No. 442, Katholieke Universiteit Leuven, Belgium.187pp.

· Porrás, A. y Pérez, V.L. (1997). Efecto de la temperatura en el crecimiento de los

tubos germinativos de las ascosporas de Mycosphaerella spp. causantes de

Sigatoka en plátanos. Cálculo de las sumas de velocidades de desarrollo para el

pronóstico de los tratamientos a partir de la temperatura máxima y mínima diarias

en Cuba. Infomusa. 6(2): 27-31.

· Portal, O. (2008). Development of molecular Tools to study the interaction between

banana and Mycosphaerella fijiensis, the causal agent of Black Leaf Streak

Disease. PhD thesis. Ghent University, Belgium.

· Quiñones, W., Escobar, G., Echeverri, F., Torres, F., Rosero, Y., Arango, V.,

Cardona, G. y Gallego, A. (2000). Synthesis and antifungal activity of Musa

phytoalexins and structural analogs. Molecules. 5: 974-980.

· Ramesh, S.A., Velazhahan, R., Viswanathan, R., Padmanaban, P. y

Vidhyasenkaran, P. (2001). Induction of systemic resistance to Colletotrichum

falcatum in sugarcane by a Synthetic Signal Molecule, Acibenzolar-S-Methyl

(CGA-245704). Phytoparasitica. 29:231-242.

· Raut, S.P. y Ranade, S. (2004). Diseases of Banana and their Management. En:

Naqui, SAMH (ed) Diseases of Fruits and Vegetables. Volume II. Kluwer

Academic Publishers. pp. 37-52.

· Reeve, R.M. (1951). Histochemical tests for polyphenols in plant tissues. Stain.

Tech. 26: 91-96.

· Reimers, P.J. y Leach, J.E. (1991). Race-specific resistance to Xanthomonas

oryzae pv. oryzae conferred by bacterial blight resistance gene Xa-10 in rice

Oryzae sativa involves accumulation of a lignin-like substance in host tissues,

Physiol. Mol. Plant Pathol. 38: 39-55.

· Reimers, P.J., Guo, A. y Leach, J.E. (1992). Increased activity of a cationic

peroxidase associated with an incompatible interaction between Xanthomonas

oryzae pv. oryzae and rice (Oryza sativa). Plant Physiol. 99: 1044-1050.

· Remy, S., Buyens, A., Cammue, B.P.A., Swennen, R. y Sági, L. (1998).

International Symposium on Banana in the Subtropics: Production of transgenic

banana plants expressing antifungal proteins. ISHS. Acta Horticulturae. pp. 490.

· Rhodes, P.L. (1964). A new banana disease in Fiji. Commonw. Phytopath. News.

10: 38-41.

· Riveros, A., Giraldo, C.I. y Gamboa, A. (2003). Microbiological control of black leaf

streak disease. Mycosphaerella leaf spot disease of banana: present status and

outlook. Proceeding of the workshop of the Mycosphaerella leaf spot diseases.

INIBAP. San José, Costa Rica.

· Robb, J., Powell, D.A. y Street, P.F.S. (1987). Time course of wall-coating secretion

in Verticillium-infected tomatoes. Physiol. Plant Pathol. 31:217-226.

· Ross, W.W. y Sederoff, R.R. (1992). Phenilalanine ammnia-lyase from loblolly Pine:

Purification of the enzyme and isolation of complementary DNA clone. Plant

Physiol. 98: 380-386.

· Roux, N., Toloza, A., Busogoro, J., Panis, B., Strosse, H., Lepoivre, P., Swennen,

R. y Zapata, F. (2003). Mutagenesis and somaclonal variation to develop new

resistance to Mycosphaerella leaf spot diseases. En: Jacome, L., Lepoivre, P.,

Marín, D., Ortiz, R., Romero, R .y Escalant, V. (eds.) Mycosphaerella leaf spot

disease of bananas, present status and outlook. Proceeding of the Workshop on

Mycosphaerella leaf spot disease held in San José, Costa Rica. pp 239-250.

· Šafá, J., Noa, J.C., Vrána, J., Bartoš, J., Alkhimova, O., Sabau, X., Šimková, H.,

Lheureux, F., Caruana, M. L., Dole, J. y Piffanelli, P. (2004). Creation of a BAC

resource to study the structure and evolution of the banana (Musa balbisiana)

genome. Genome. 47: 1182-1191.

· Sagi, M. y Fluhr, R. (2001). Superoxide production by plant homologues of the

gp91phox NADPH oxidase. Modulation of activity by calcium and by tobacco

mosaic virus infection. Plant Physiology. 126: 1281-1290.

· Sandoval, J. y Müller, L. (1999). Anatomía y morfología de la planta de banano

(Musa AAA). Corbana. 24(51): 43-60.

· Sandoval, J.A. (1989). Estudio de la anatomía y morfología vegetativas de plantas

de Musa in vitro, en condiciones de aclimatación y en el campo. Tesis de Maestría.

Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza. CATIE. Turrialba,

Costa Rica.

· Schaffrath, U., Thieron, M., Scheinpug, H. y Reisener, H.J. (1996). Biochemical

and cytological aspects of genetical and acquired resistance in the rice blast

interaction. Cahiers Options Mediterraneennes. 15:125-130.

· Shetty, N.P., Jorgensen, H.J.L., Jensen, J.D., Collinge, D.B. y Shetty, H.S. (2008).

Roles of reactive oxygen species in interactions between plants and payhogens.

Eur J Plant Pathol. 121: 267-280.

· Shi, Z., Wang, F., Zhou, W., Zhang P. y Fan, Y.J. (2007). Application of Osthol

Induces a Resistance Response Against Powdery Mildew in Pumpkin Leaves Int. J.

Mol. Sci. 8: 1001-1012.

· Smith, A. H., Gill, W.M., Pinkard, E.A. y Mohammed, C.L. (2007). Anatomical and

histochemical defence responses induced in juvenile leaves of Eucalyptus globulus

and Eucalyptus nitens by Mycosphaerella infection. For. Path. 37: 361-373.

· Southerton, S.G. y Deverall, B.J. (1990). Histochemical and chemical evidence for

lignin accumulation during the expression of resistance to leaf rust fungi in wheat.

Phys. Mol. Plant Path. 36: 483-494.

· Sreelakshmi, Y. y Sharma, R. (2008). Differential regulation of phenilalanine

ammonia-lyase activity and protein level by light in tomato seedlings. Plant

Physiology and Biochemistry. pp. 1-8.

· Stahl, E.A. y Bishop, J.G. (2000). Plant–pathogen arms races at the molecular

level. Current Opinion in Plant Biology. 3 (4): 299-304.

· Stansbury, C., KMcKirdy, S. y Power, G. (2006). Black Sigatoka disease: new

technologies to strengthen eradication strategies in Australia. Aust Plant Pathol. 35:

181-93.

· Sundravadana, S., Alice, D., Kuttalam, S. y Samiyappan, R. (2007). Azoxystrobin

induces lignification-related enzymes and phenolics in rice (Oryza sativa L.) against

blast pathogen (Pyricularia grisea) Journal of Plant Interactions. 2(4): 219-224.

· Tan, Y., Liang, Z., Shao, H.B. y Du, F. (2006). Effect of water deficits on the activity

of anti-oxidative enzymes and osmoregulation among three different genotypes of

Radix Astragali at seeding stage. Colloids Surf B Biointerfaces. 49:60-65.

· Theis, T. y Stahl, U. (2004). Antifungal proteins: targets, mechanisms and

prospective applications. Cell Mol. Life Sci. 61:437-455.

· Thomas-Hall, S., Campbell, P., Carlens, K., Kawanishi, E., Swennen, R., Sági, L. y

Schenk, P. (2007). Phylogenetic and molecular analysis of the ribulose- 1,5-

bisphosphate carboxylase small subunit gene family in banana. Journal of

Experimental Botany. 58: 2685-2697.

· Thordal-Christensen, H., Zhang, Z., Wei, Y. y Collinge, D.B. (1997). Subcellular

localization of H2O2 in plants: H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive

response during the barley-powdery mildew interaction. Plant J. 11: 1187-1194.

· Valerio, R., Lindorf, H. y de García, E. (2002). Relación entre la anatomía foliar de

variedades de Musa sp. y su comportamiento frente a la Sigatoka (amarilla y

negra). En: Acorbat, Memorias XV Reunión. Realizada en Cartagena de Indias,

Colombia. 27 de octubre al 02 noviembre de 2002. Medellín (COL): Asociación de

Bananeros de Colombia, AUGURA 2002.

· Valette, C., Andary, C., Geiger, J.P., Sarah, J.L. y Nicole, M. (1998). Histochemical

and Cytochemical Investigations of Phenols in Rootsof Banana Infected by the

Burrowing Nematode Radopholus similis. Nematology. 88(11): 75-81.

· van Loon, L.C., Rep, M. y Pieterse, C.M.J. (2006). Significance of Inducible

Defense-related Proteins inInfected Plants Annu. Rev. Phytopathol. 44:135-62.

· Vandenhout, H., R., Ortiz, D., Vuylsteke, R., Swennem, R. y Bai, K. V. (1995).

Effect of Ploidy on stomatal and other quantitative traits in plantain and banana

hybrids. Euphytica. 83: 117-122.

· Vianello, A., Zancani, M., Peresson, C., Petrussa, E., Casolo, V., Krajñáková,

Patui, S., Braidof, E. y Macri, F. (2007). Plant mitochondrial pathway leading to

programmed cell death. Physiologia Plantarum. 129: 242-252.

· Vidal, A. (1992). Sigatoka negra en Cuba. En nuevos focos de plagas y

enfermedades. Boletín fitosanitario de la FAO. 40: 1-2.

· Vilarinhos, A.D., Piffanelli, P., Lagoda, P., Thibivilliers, S., Sabau, X., Carreel, F. y

D'Hont, A. (2003). Construction and characterization of a bacterial artificial

chromosome library of banana (Musa acuminata Colla). Theoretical and Applied

Genetics. 106 (6): 1102-1106.

· Vranová, E., Inzé, D. y Van Breusegem, F. (2002). Signal transduction during

oxidative stress. J Exp Bot. 53: 1227-1236.

· Vuylsteke, D.R., Ekanayake, I. y Ortiz, R. (1998). Conductancia estomática de las

hojas y morfología de los estomas del material genético de Musa. Euphytica. 99(3):

211-229.

· Walters, D., Newton, A. y Lyon, G. (2005). Induced resistance: Helping plants to

help themselves. Biologist. 52: 28-33.

· Way, H.M., Kazan, K., Mitter, N., Goulter, K.C., Birch, R.G. y Manners, J.M. (2002).

Constitutive expression of a phenylalanine ammonia-lyase gene from Stylosanthes

humilis in transgenic tobacco leads to enhanced disease resistance in paired plant

growth. Physiological and Molecular Plant Pathology 60: 275-282.

· Winkel-Shirley, B. (2001). Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics,

biochemistry, cell biology and biotechnology. Plant Physiol. 126: 485-493.

· Winkel-Shirley, B. (2002). Biosynthesis of flavonoids and effects of stress. Curr.

Opin. Plant Biol. 5: 218-223.

· Yoshimura, K., Miyao, K., Gaber, A., Takeda, T., Kanaboshi, H., Miyasaka, H. y

Shigeoka, S. (2004). Enhancement of stress tolerance in transgenic tobacco plants

overexpressing Chlamydomonas glutathione peroxidase in chloroplasts or cytosol.

Plant J. 37: 21-33.

· Young, S.A., Guo, A., Guikema, J.A., White, F.F. y Leach, J.A. (1995). Rice cationic

peroxidase accumulates in xylem vessels during incompatible interactions with

Xanthomonas oryzae pv. Oryzae. Plant Physiol.107: 1333-1341.

· Zareie, R., Melanson, D.L. y Murphy, P.J. (2002). Isolation of Fungal Cell Wall

Degrading Proteins from Barley (Hordeum vulgare L.) Leaves Infected with

Rhynchosporium secalis MPMI. 5 (10): 1031-1039.

· Zeyen, R.J., Bushnell, W.R., Carver, T.L.W., Robbins, M.P., Clark, T.A., Boyles,

D.A. y Vance, C.P. (1995). Inhibiting phenylalanine ammonia-lyase and cinnamoyl

alcohol dehydrogenase suppresses Mla1 (HR) but not Mlo5 (Non-HR) barley

powdery mildew resistances. Physiol Mol Plant Pathol. 47: 119-140.