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Detección y EnumeraciónMétodos Convencionales y
RápidosEsther Z. Vega, Ph.D.Microbiología Aplicada
Métodos ConvencionalesMuestreo
• Muestra representativa• Esterilidad• Tiempo de colección Análisis• Procesamiento muestra
– Suspención homogénea
Limitaciones de contaje deplacas
• Asume– Cada célula forma una colonia– Cada colonia proviene de una sola célula bacterial– Algunas colonias puede ser originadas de una
“agrupamiento”de bacterias• Se reporta como
- Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo óml.- NO como bacterias totales
APC
• Vertido vs. esparcido– Spiral plater
• 104 - 1
• Filtración por membranas– Plate vs. DMC– “Direct epifluorescent filter
technique”
Leche, carnes, aves,superficies
APC
• “Hydrophobic Grid Membrane Filter”– 1,600 celdas que restringen crecimiento– MPN
Métodos basados enmetabolismo
• Reacciones Redox– Tintes como azul de metileno, resazurin y
tetrazolium• Prueba de Reductasa
– Resultados comparan com SPC
Resazurin A-C
Importancia del muestro
• Revela fuentes de contaminación secundariaen el ambiente de procesamiento– Contaminación – presencia de Pseudomonas– Presencia de patógenos – Listeria
• Permite el diseño de procesos de sanitización– Define un lugar con CCP en un plan HACCP
Métodos Rápidos
Basados en aspectos inmunológicos,bioquímicos, microbiológicos, moleculares yserológicosAislamientoDetecciónEnumeraciónCaracterización Identificación
Métodos Rápidos
• En general,patógenos alimentariosestán presentes en números bajos
• Enriquecimiento, pre-enriquecimiento,y/o enriquecimieto selectivo
• Límites de detección 102-105 CFU/g en<12-24 hrs.
Requerimientos
• Validación• Tiempo de procesamiento de muestra• Certeza (accuracy)• Costos
El ensayo debe ser…
• Fácil de ejecutar• Equipo de fácil operación• Resultados de fácil interpretación• Ensayo de acuerdo al alimento• Método aceptable en la industria y en
las agencias reguladoras
Organizaciones de validación
• International Standard Organization• International Dairy Federation• AOAC International
Métodos Rápidos: MétodosTradicionales
• Diluidores Automáticos• Sistemas automatizados para placas• “Colony Counting System”
Métodos Rápidos: MétodosTradicionales
• Sistema Petrifilm• SIM Plate (MPN)• Medio especializado
SIM Plate
Métodos Rápidos:Inmunológicos
• Policlonal:monoclonal• Límite detección: 103-105
– Coating of latex particles• Latex agglutination step >106
Métodos Rápidos:Inmunológicos
• Separación inmunomagnética– Placas– PCR– ELISA
E. coli O157:H7, Listeria, Salmonella
Métodos Rápidos:Inmunológicos
• Inmunodifusión- movimiento deproteínas por agar y formación decomplejo antígeno-anticuerpo
Inmunodifusión
• Salmonella 1-2 Test• VIP Test• Reveal Test• Safe Path• PATH STIK
Salmonella 1-2 Test
Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria,Campylobacter
“ELISA based”
• TECRA- Salmonella, Campylobacter,E.coli O157:H7
• Listeria TEK• Assurance EIA
Métodos Moleculares
• PCR-BAX• Electroforesis de campo de pulso• Ribotipos-• Tipificación de plasmidios• Amplificación al azar de DNA-• Polimorfismo de fragmentos de
restricción-
Otros
• Luminiscencia• Citometría de flujo• Impedancia