deteccion rapida de contaminacion en producto terminado de
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DETECCION RAPIDA DE CONTAMINACION EN PRODUCTO TERMINADO DE DETECCION RAPIDA DE CONTAMINACION EN PRODUCTO TERMINADO DE
BEBIDA DE MALTA Y REFRESCOS PASTEURIZADOS POR EL METODO DE BEBIDA DE MALTA Y REFRESCOS PASTEURIZADOS POR EL METODO DE
BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO EN PLACA EN UNA EMPRESA DE BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO EN PLACA EN UNA EMPRESA DE
BOGOTA D.CBOGOTA D.C
CRISTINA BURGOS GRAJALESCRISTINA BURGOS GRAJALES
LILIANA MURILLO SÁNCHEZLILIANA MURILLO SÁNCHEZ
TRABAJOTRABAJO DE GRADO DE GRADO
Como requisito parcial para optar el titulo de Microbióloga IndustrialComo requisito parcial para optar el titulo de Microbióloga Industrial
ISABEL CRISTINA GUTIERREZISABEL CRISTINA GUTIERREZ
DirectorDirector
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANAPONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIASFACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIALDEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Carrera de Microbiología IndustrialCarrera de Microbiología Industrial
Bogotá, D.C, 2001.Bogotá, D.C, 2001.
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnas en este Trabajo de Grado”alumnas en este Trabajo de Grado”
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946.Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946.
DETECCION RAPIDA DE CONTAMINACION EN PRODUCTO DETECCION RAPIDA DE CONTAMINACION EN PRODUCTO TERMINADO DE TERMINADO DE
BEBIDA DE MALTA Y REFRESCOS PASTEURIZADOS POR EL METODO DE BEBIDA DE MALTA Y REFRESCOS PASTEURIZADOS POR EL METODO DE
BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO EN PLACA EN UNA EMPRESA DE BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO EN PLACA EN UNA EMPRESA DE
BOGOTA D.CBOGOTA D.C
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LILIANA MURILLO SÁNCHEZLILIANA MURILLO SÁNCHEZ
ISABEL CRISTINA GUTIERREZ ISABEL CRISTINA GUTIERREZ JANETH ARIAS JANETH ARIAS Microbióloga Bacterióloga Microbióloga Bacterióloga Director CoDirector Co-- DirectorDirector
OLGA LUCIA VARGAS OLGA LUCIA VARGAS ANDREA AGUIRRE ANDREA AGUIRRE Microbióloga BacteriólogaMicrobióloga Bacterióloga Jurado JuradoJurado Jurado
Las autoras expLas autoras exp resan sus agradecimientos a:resan sus agradecimientos a:
& DIOSDIOS por la sabiduría, fortaleza y esperanza brindadas para la culminación de esta
investigación.
& La Empresa Productora de Bebidas, a la División de Producción y al Departamento
de Investigación y Desarrollo por la oportunidad y el patrocinio total brindado para
el desarrollo de este proyecto.
& La Dra. ISABEL CRISTINA GUTIÉRREZ, directora del proyecto, por depositar su
confianza en nosotras y por el constante apoyo científico para el éxito de esta
investigación.
& La Dra. JANETH ARIAS, Co-Directora del Proyecto, por su colaboración en el
desarrollo de la investigación.
& La División de Materiales por su constante preocupación, apoyo y calidez
brindados durante la realización de esta investigación.
& El profesor Miguel Pinzón por su desinteresada colaboración y paciencia en la etapa
final de esta investigación.
& Todas las personas que en una u otra forma contribuyeron al logro de esta
investigación.
TABLA DE CONTENIDOTABLA DE CONTENIDO
PáginaPágina 1. INTRODUCCION1. INTRODUCCION 1 2. MARCO TEORICO2. MARCO TEORICO 4 2.1 RESEÑA HISTORICA DE LA CONSERVACION 4 2.2 RESEÑA HISTORICA DE LA PRODUCCION DE JUGOS 5 2.3 DEFINICIONES 7 2.3.1 Alteración 7 2.3.2 Refrescos de fruta 7 2.3.3 Pulpa natural de fruta 7 2.3.4 Pulpa concentrada 7 2.4 DE LOS REFRESCOS DE FRUTA 8 2.5 PROCESO DE ELABORACION DE REFRESCOS 13 2.5.1 Elaboración de refrescos 13 2.6 MICROBIOLOGIA DE LOS REFRESCOS DE FRUTA 14 2.6.1 Bacterias 15 2.6.2 Levaduras 16 2.6.3 Mohos 17 2.7 CONSERVACION DE REFRESCOS 20 2.7.1 Conservación de alimentos por altas temperaturas 20 2.7.2 Pasteurización 21 2.7.3 Teoría de la pasteurización 22 2.7.4 Pasteurización Instantánea o Flash 23 2.7.4.1 Funcionamiento del sistema 24 2.7.4.2 Transferencia de calor 25 2.7.4.3 Función 26 2.8 BEBIDAS DE MALTA 29 2.9 DEFINICIONES 30 2.9.1 Malta 30 2.9.2 Cebada Malteada 30 2.10 BEBIDAS DE CEBADA MALTEADA 31 2.11 PROCESO DE MALTEADO 33 2.12 MICROBIOLOGIA DE LA MALTA 35 2.12.1 Levaduras 36
2.12.2 Bacterias 37 2.12.3 Mohos 38 2.13 CONSERVACION DE BEBIDAS DE MALTA 40 2.13.1 Pasteurización Túnel 41 2.14 BIOLUMINISCENCIA 43 2.14.1 Breve historia de la bioluminiscencia 43 2.14.2 Adenosin Trifosfato 44 2.14.2.1 Metabolismo Celular 44 2.14.2.2 Importancia del ATP en el Metabolismo Celular 45 2.14.2.3 Modelos Nutricionales de los microorganismos 47 2.14.2.4 Determinación del ATP 48 2.14.3 Sistema de bioluminiscencia 50 2.14.3.1 Zonas de limpieza 52 2.14.3.2 Sensibilidad del equipo 53 2.14.3.3 Diseño básico del equipo 53 2.14.3.4 Ventajas de la bioluminiscencia frente a métodos tradicionales 55 2.15 MÉTODOS PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS 56 2.15.1 Recuento en Placa 56 2.16 VALIDACION DE METODOS ANALITICOS PARA EL CONTROL DE ALIMENTOS 59 3. JUSTIFICACION3. JUSTIFICACION 62 4. OBJETIVOS4. OBJETIVOS 63 4.1 Objetivo general 63 4.2 Objetivos específicos 63 5. MATERIALES Y METODOS5. MATERIALES Y METODOS 64 5.1 MUESTREO 64 5.1.1 Prueba piloto 64 5.2 ANALISIS MICROBIOLÓGICO 65 5.2.1 Procesamiento de las muestras 65 5.2.1.1 Prueba piloto 65 5.2.1.2 Prueba final 67 5.3 CRIOCONSERVACIÓN 68
5.4 ANALISIS ESTADISTICO 70 6.6. RESULTADOS Y DISCUSION RESULTADOS Y DISCUSION 71 6.1 COMPORTAMIENTO MICROBIOLÓGICO A TRAVES DEL TIEMPO 71 6.2 PRUEBA PARA DETERMINAR SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA TÉCNICA DE BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA PARA REFRESCOS DE FRUTA Y BEBIDA DE MALTA 80 6.3 LIMITES DE CONFIANZA PARA LA MEDIA DE UNA POBLACION REPRESENTADA EN UFC Y URL 91 6.4 Tablas de resultados curvas de crecimiento 93 7. CONCLUSIONES7. CONCLUSIONES 112 8. RECOMENDACIONES8. RECOMENDACIONES 114
ANEXOSANEXOS BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAFIA
LISTA DE TABLAS
PáginaPágina
Tabla 1Tabla 1. Porcentaje de fruta en los refrescos de fruta
8
Tabla 2Tabla 2. Características microbiológicas de los refrescos de fruta Higienizados Con duración máxima de 30 días 9 Tabla 3Tabla 3. Características microbiológicas de los refrescos de fruta higienizados Con duración mayor de 30 días 10 Tabla 4Tabla 4. Contenido máximo de metales pesados en los refrescos de Fruta 12 Tabla 5Tabla 5 . Requisitos físico- químicos de la malta 31 Tabla 6Tabla 6. Requisitos microbiológicos de la malta 32 Tabla 7Tabla 7. Clasificación nutricional de los organismos 48 Tabla 8Tabla 8 . Microorganismos para ensayos en refrescos y bebida de Malta 65 Tabla 9Tabla 9 . Análisis microbiológico de refrescos de fruta 66 Tabla 10Tabla 10. Análisis microbiológico de bebida de malta 66 Tabla 11Tabla 11. Análisis microbiológico de refrescos de los refrescos de Fruta 67
Tabla 12Tabla 12. Análisis microbiológicos de bebida de malta 67 Tabla 13Tabla 13. Probabilidad de hallazgo de microorganismos para la Técnica De Bioluminiscencia 88 Tabla 14Tabla 14. Rangos de UFC de productos en estudio 90 Tabla 15Tabla 15. Limites de confianza para la media de la población en estudio 92
LISTA DE FIGURASLISTA DE FIGURAS
PáginaPágina
Figura 1Figura 1. Bacillus licheniformis 15 Figura 2Figura 2. Rhodotorula rubra 17 FiguraFigura 3 3. Penicillium sp. 18 Figura 4Figura 4. Pasteurizador Instantáneo o Flash 24 Figura 5Figura 5. Placas intercambiadoras de calor 25 Figura 6Figura 6. Transferencia de calor 26 Figura 7Figura 7. Componentes del intercambiador de calor 27 FigFigura 8ura 8 Hansenula anomala 36 Figura 9Figura 9. Lactobacillus plantarum 37 Figura 10Figura 10. Penicillium sp 38 Figura 11Figura 11. Pasteurizador Túnel 41 Figura 12Figura 12. Equipo y dispositivo de hisopo 51 Figura 13Figura 13. Diseño del equipo 54
LISTA DE GRAFICAS
PáginaPágina
Gráficas 1 y 2Gráficas 1 y 2 Refresco de naranja + B. l i cheni formis (UFC) y (URL) 72
Gráficas 3 y 4Gráficas 3 y 4 Refresco de naranja + Rhodotoru la sp (UFC) y (URL) 72
Gráficas 5 y 6Gráficas 5 y 6 Refresco de naranja + Penic i l l ium sp (UFC) y (URL) 73
Gráficas 7 y 8Gráficas 7 y 8 Refresco de mora + B. l i cheni formis (UFC) y (URL) 73
GráficaGráficas 9 y 10s 9 y 10 Refresco de mora + Rhodotoru la sp (UFC) y (URL) 74
Gráficas 11 y 12Gráficas 11 y 12 Refresco de mora + Penic i l l ium sp (UFC) y (URL) 74
Gráficas 13 y 14Gráficas 13 y 14 Refresco de mango + B. l i cheni formis (UFC) y (URL) 75
Gráficas 15 y 16Gráficas 15 y 16 Refresco de mango + Rhodotoru la sp (UFC) y (URL) 75
Gráficas 17 y 18Gráficas 17 y 18 Refresco de mango + Penic i l l ium sp (UFC) y (URL) 76
Gráficas 19 y 20Gráficas 19 y 20 Refresco de durazno + B. l i cheni formis (UFC) y (URL) 76
Gráficas 21 y 22Gráficas 21 y 22 Refresco de durazno + Rhodotoru la sp (UFC) y (URL) 77
Gráficas 23 y 24Gráficas 23 y 24 Refresco de durazno + Penic i l l ium sp (UFC) y (URL) 77
Gráficas 25 y 26Gráficas 25 y 26 Bebida de malta + Lactobaci l lus sp (UFC) y (URL) 78
Gráficas 27 y 28Gráficas 27 y 28 Bebida de malta + Hansenu la sp (UFC) y (URL) 78
Gráficas 29 y 30Gráficas 29 y 30 Bebida de malta + Penic i l l ium sp (UFC) y (URL) 79
LISTA DE ANEXOSLISTA DE ANEXOS
Página Página
ANEXO 1ANEXO 1. Medios de cultivo 115
ANEXO 2ANEXO 2. Bioquímicas 117
ANEXO 3ANEXO 3. Utilización del luminómetro 120
ANEXO 4ANEXO 4. Proceso de elaboración de la bebida de malta 124
ANEXO 5ANEXO 5. Proceso de elaboración de refrescos de fruta 125
RESUMEN
En la actualidad las industrias productoras de alimentos se ven en la
necesidad de implementar metodologías que faciliten la obtención de
resultados en un tiempo corto. Es por esto que en esta investigación se
buscó validar la técnica de Bioluminiscencia como una alternativa de
control microbiológico que proporcione resultados rápidos y sensibles
basados en la reacción por ATP con la enzima luciferasa presente en
todos lo organismos vivos.
Para llevar a cabo dicha validación se enfrento la técnica de
bioluminiscencia con la de Recuento Estándar en Placa (utilizando PDA,
SPC, SDA como medios de cultivo) ya que esta ultima es la prueba
estándar utilizada en la planta para el control microbiológico de los
refrescos de fruta y la bebida de malta.
El procedimiento realizado consistió en la inoculación de los productos en
estudio con microorganismos (bacterias, mohos y levaduras) identificados
en estudios anteriores , para garantizar que los resultados obtenidos se
acomodaran a la situación real de los productos en la planta. A partir de
la inoculación se procedió a tomar muestras paralelas para las dos técnicas
con un intervalo de dos horas para cada toma en condiciones controladas
durante un periodo de 12 horas.
De acuerdo a los resultados obtenidos se establecieron rangos de
medición, sensibilidades y especificidades de las técnicas con el fin de
conocer cual es la más precisa y más confiable para la detección de
microorganismos en producto alterado. Finalmente se pudo concluir que
la técnica de Recuento Estándar en Placa es más sensible y especifica
obteniendo resultados cuantitativamente confiables en un periodo mas
largo de tiempo.
1. 1. INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Los refrescos de frutas son obtenidos en su mayor parte por homogeneización de
pulpa de fruta o bien de frutas enteras, con adición de azúcares y agua y en algunos
casos, también de ácido cítrico y ascórbico.
La proporción de fruta en el producto final es del 8% estando reglamentada esta en las
normas y procedimientos reglamentarios de la Industria de Alimentos por la ANDI
(Resolución 7992/91).
Algunas de las frutas utilizadas para su elaboración son : mango, mora, durazno,
naranja, entre otras. Estas son sometidas al lavado, trituración y calentamiento con el
objetivo de inactivar enzimas. La pasta así obtenida es tratada con mezclas de enzimas
para conseguir por degradación de la protopectina una desintegración del tejido del
fruto manteniendo al mismo tiempo la estructura intacta de las células. Las pectinas
altamente esterificadas y de gran peso molecular así obtenidas a partir de la
protopectina determinan que estos productos posean una alta viscosidad y una
buena estabilidad de la turbidez. Por último son sometidos a mezclas con aditivos
necesarios , homogeneización y pasteurización. (Berlitz, 1989).
La bebida de malta es un producto natural, refrescante, sin alcohol, que resulta de la
maceración y cocción de una mezcla conformada por agua potable, cebada malteada y
lúpulo. Parte del proceso de elaboración incluye azúcar refinada y caramelizada la cual
junto al gas carbónico, convierten a la malta en una bebida agradable y nutritiva. La
malta contiene vitaminas como la Tiamina, la Riboflavina, la- Niacina y la Piridoxina.
Es una excelente fuente de carbohidratos, entre los que se cuentan la maltosa y la
glucosa. Tiene un alto contenido de minerales como el potasio y el magnesio. Gracias a
su proceso tecnológico y método de conservación no requiere preservativos. Al ser su
materia prima de origen vegetal no requiere saborizantes ni otros aditivos. (Berlitz,
1989).
El uso de temperaturas altas para conservar dichas bebidas se basa en los resultados
destructores de los microorganismos. Con respecto a la conservación de cualquier
alimento existen dos tipos de uso habitual: temperatura de pasteurización y
temperaturas de esterilización. (Res, 1994). Tanto el tiempo como la temperatura que
se utiliza en el proceso, dependen del procesamiento empleado y del alimento a tratar.
(Frazier, 1993)
El proceso de pasteurización es un tratamiento térmico, que destruye esencialmente
los microorganismos patógenos y en gran parte a microorganismos banales presentes
que generalmente supone la aplicación de temperaturas inferiores a los 100 ºC en un
corto periodo de tiempo. Su única finalidad es mejorar la estabilidad biológica del
producto final. (EBC, 1995).
Debido a las diferentes técnicas de manufactura y presentación del producto existe
una necesidad creciente de verificar la ausencia de microorganismos viables en un
volumen determinado del producto.
El control microbiológico estándar utilizado es el Recuento en Placa con un tiempo de
cuarentena de 10 a 15 días. La Bioluminiscencia por ATP como una alternativa a los
procedimientos de control de calidad microbiológica tradicionales proporciona
resultados rápidos, exactos y sensibles a través de una operación sencilla. La técnica
de detección está basada en la reacción ATP (Adenosin-trifosfato) presente en todos
los organismos vivos. La cantidad de luz emitida es proporcional a la cantidad de ATP
presente, ya sea en una mesada (lote) o en el producto final. Mediante un Luminómetro
portátil se mide la cantidad de fotones emitidos en Unidades Relativas de Luz (URL) que
es proporcional a la cantidad de microorganismos presentes.
(http://www.jenck.com/celsis.htm)
Este proyecto pretende comparar el método de Bioluminiscencia basado en la reacción
de ATP que permite la detección rápida de microorganismos como una estrategia
dinámica frente a la metodología estática de Recuento en Placa que depende de la
producción de biomasa visible.
2.2. MARCO TEORICOMARCO TEORICO
2.1 RESEÑA HISTORICA DE LA CONSERVACION2.1 RESEÑA HISTORICA DE LA CONSERVACION
La palabra conservar deriva de la latina conservare , que significa mantener intacto o
inalterado, por ello se aplica al procedimiento que permite que los alimentos sean
resistentes al deterioro. La conservación de los alimentos por calor la realizó por
primera vez Nicolás Appert (1750-1841) en 1809, francés a quien Napoleón otorgó un
premio de 12000 francos por haber logrado un método de conservación de alimentos
envasados en vidrio bajo la acción del calor. (Muller, 1981)
Appert mantuvo la creencia de que la causa de alteración de los alimentos era el
contacto con el aire y de que el éxito de su técnica era debido a la eliminación del aire
del producto. Esta creencia persistió con, a veces, fatales consecuencias durante otros
50 años hasta que las investigaciones de Pasteur establecieron la relación entre la
actividad microbiana y la putrefacción. (Adams, 1995)
El término pasteurización apareció en el siglo antepasado (1865-1867) en las vinerías
como un método para tratar el vino con el propósito de prolongar la vida de
almacenamiento. Sin embargo, el calentamiento de productos con el fin de incrementar
la vida de almacenamiento ya había sido ensayado en 1782 por el científico sueco Carl
Wilhelm Scheele. El resultado de estos experimentos fueron olvidados por largo tiempo
pero posteriormente fueron investigados y desarrollados por Pasteur de quien proviene
su nombre. (EBC, 1995)
2.2 RESEÑA HISTORICA DE LA PRODUCCION DE JUGOS2.2 RESEÑA HISTORICA DE LA PRODUCCION DE JUGOS
Es posible que los jugos de fruta, en una u otra forma, se hayan consumido durante
muchos años. Sin embargo, hasta el siglo XIX el único medio de conservación conocido
era la fermentación y la consiguiente transformación a vino o sidra. La industria
comercial de jugos se inicia el 1869 con el embotellado de jugo de uvas sin fermentar
por la compañía Welch de Vineland, New Jersey. Esta industria introdujo el principio de
conservación mediante la pasteurización. La industria se desarrolló lentamente, aunque
en Estados Unidos comenzó una tendencia a la expansión en la década de los años 20
que se aceleró en los 30. El valor nutritivo de las frutas, especialmente por su
contenido de vitamina C, se reconoció durante los años de hambruna de la gran
depresión y la demanda se estimuló posteriormente por los desarrollos tecnológicos,
tales como la pasteurización relámpago, la cual mejoró en gran medida la calidad del
producto. En este momento, el consumo en gran escala era principalmente un
fenómeno norteamericano y en el caso del jugo de naranja, más del 75% de la
producción mundial se encontraba en Estados Unidos.
El jugo de fruta se siguió extendiendo en Estados Unidos siendo estimulada su
producción por la demanda del ejercito, que reconoció el valor nutritivo del jugo. El
avance tecnológico que permitió la producción de jugos concentrados congelados
supuso un empuje adicional.
Durante la década de los años 50, el jugo de fruta se convirtió en un componente más
de la dieta norteamericana. La industria se desarrolló mucho más despacio en Europa y
así en Gran Bretaña, el consumo de Jugo de fruta se limitó a pequeñas botellas o latas
de jugo frecuentemente edulcoradas. Los jugos de frutas tendieron a ser considerados
como bebidas para “ocasiones especiales” y el incremento en su consumo se asoció
con frecuencia a las tendencias sociales, como el mayor auge de los restaurantes y los
cambios en los hábitos de bebida. Sin embargo, en la segunda mitad de los años 70
tuvo lugar un enorme incremento de su consumo. Esto fue como consecuencia de una
demanda de bebidas que fueran compatibles con la idea de adoptar un estilo de vida
saludable, pero este empuje se vio favorecido por la aplicación de tratamientos de
esterilización UHT y envasado aséptico de los jugos de fruta. Esa tecnología permitió la
elaboración, a menudo a partir de concentrados, de un producto de alta calidad y larga
vida útil, previamente de acuerdo con las consideraciones de un producto “sano”.
(Varnam, 1997)
2.3 DEFINICIONES2.3 DEFINICIONES
2.3.1 ALTERACION2.3.1 ALTERACION
Las palabras alteración y deterioro se refieren a todo cambio que ocurre en un
alimento, en virtud del cual se convierte en no apto para el consumo humano. Esta
definición incluye tanto los defectos de seguridad como los de calidad. (Doyle, 2001)
2.3.2 REFRESCOS DE FRUTA2.3.2 REFRESCOS DE FRUTA
Se consideran refrescos a los productos obtenidos a partir de jugos concentrados,
clarificados, congelados o deshidratados a los cuales, se les ha agregado agua, azúcar
y demás productos naturales. (ICONTEC, 1995)
2.3.3 PULPA NATURAL DE FRUTA2.3.3 PULPA NATURAL DE FRUTA
Es la obtenida a partir de la fruta fresca o congelada. Esta fruta puede ser conservada
por congelación o pasteurizada (mayor a 87- 90 ºC) dependiendo de la fruta de la cual
sea la pulpa y envasada asépticamente o congelada. (ICONTEC, 1995)
2.3.4 PULPA CONCENTRADA2.3.4 PULPA CONCENTRADA
Es elaborada a partir de la pulpa natural y concentrada por evaporación al vacío. Esta
pulpa es conservada por congelación o puede ser envasada en calor en cuyo caso no
necesita refrigeración. (ICONTEC, 1995)
2.4 DE LOS REFRESCOS DE FRUTA2.4 DE LOS REFRESCOS DE FRUTA
Artículo 25Artículo 25. Condiciones para su elaboración: Los refrescos de fruta deben elaborarse
en condiciones sanitarias apropiadas, con frutas frescas, sanas y limpias.
Artículo 26.Artículo 26. De las características de los refrescos de frutas: Los refrescos de frutas
deben presentar las siguientes características:
a.a. Organolépticas:Organolépticas:
- Los refrescos de fruta deben ser líquidos y deben estar libres de materias y sabores
extraños.
- Deben poseer color y olor semejante al de la fruta.
A estos refrescos no se les puede agregar conservantes en su elaboración, pero si han
sido fabricados con jugos, pulpas o concentrados previamente conservados, se acepta
la presencia de sorbato de potasio y benzoato de sodio en cantidad no mayor a 250
mg/kg y anhídrido sulfuroso 60 mg/kg.
Artículo 27.Artículo 27. De los ingredientes: El porcentaje mínimo de fruta agregado para la
preparación de los refrescos, referido al Brix natural de la fruta, se ha indicado en la
siguiente tabla.
FRUTAFRUTA % MINIMO DE FRUTA% MINIMO DE FRUTA Masa/MasaMasa/Masa
% MINIMO DE SOLIDOS SOLUBLES % MINIMO DE SOLIDOS SOLUBLES APORTADOS POR LA FRUTA A LA APORTADOS POR LA FRUTA A LA
FORMULACION DEL REFRESCOFORMULACION DEL REFRESCO
DURAZNO 8 0.92
MANGO 8 1.0
MORA 8 0.52
NARANJA 8 0.72
TabTab la 1. Porcentaje de fruta en los refrescos de fruta.la 1. Porcentaje de fruta en los refrescos de fruta. Fuente: ANDI, 1991.Fuente: ANDI, 1991.
b. Fisicoquímicas:b. Fisicoquímicas:
- Sólidos solubles por lectura refractométrica a 20ºC (Brix) % m/m mínimo 10
- pH a 20ºC máximo 4.0
- Acidez titulable expresada como Acido cítrico en % mínimo 0.1
b.b. MMicrobiológicas: icrobiológicas: Las características microbiológicas de los refrescos de fruta
higienizadas , con duración máxima de 30 días, son las siguientes:
nn mm MM cc
Recuento de microorganismos
mesofílicos/cm3
3 1000 3000 1
NMP Coliformes Totales/cm3 3 9 29 1
NMP Coliformes fecales/cm3 3 <3 - 0
Recuento esporas Clostridium Sulfito
reductor/cm3
3 <10 - 0
Recuento de hongos y levaduras/cm3 3 100 200 1
Tabla 2. Características microbiológicas de los refrescos de fruta Tabla 2. Características microbiológicas de los refrescos de fruta higienizados con duración máxima de 30 díashigienizados con duración máxima de 30 días FueFuente: ANDI, 1991.nte: ANDI, 1991.
Donde:
n = número de muestras a examinar
m = índice máximo permisibles para identificar nivel de buena calidad
M = índice máximo permisible para indicar nivel aceptable de calidad
c = número máximo de muestras permisibles con resultado entre m y M
Las características microbiológicas de los refrescos de frutas higienizadas, con
duración mayor de 30 días, son las siguientes:
nn MM MM cc
Recuento de microorganismos
mesofílicos/cm3
3 100 300 1
NMP Coliformes Totales/cm3 3 <3 - 0
NMP Coliformes fecales/cm3 3 <3 - 0
Recuento esporas Clostridium Sulfito
reductor/cm3
3 <10 - 1
Recuento de hongos y levaduras/cm3 3 10 100 1
Tabla 3. Características microbiológicas de los refrescos de fruTabla 3. Características microbiológicas de los refrescos de fru ta ta higienizados con duración mayor de 30 díashigienizados con duración mayor de 30 días Fuente: ANDI, 1991.Fuente: ANDI, 1991.
Art. 28. Art. 28. De los aditivos: Se permiten los siguientes:
a.a. Conservantes:Conservantes:
- Acido benzóico y sus sales de calcio, potasio y sodio en cantidad máxima de 1000
mg/kg expresada como ácido benzóico.
- Acido sórbico y sus sales de calcio, potasio y sodio en cantidad máxima de 1000
mg/kg expresada como ácido sórbico.
Cuando se empleen mezclas de ellos su suma no deberá exceder de 1250 mg/kg.
b.b. Antioxidantes:Antioxidantes:
- Acido ascórbico limitado por Buenas Prácticas de Manufactura (BPM).
Cuando se declare como vitamina C en el producto, se debe adicionar mínimo el 60%
de la recomendación fijada en la resolución Nº 11488/84.
c.c. Estabilizantes:Estabilizantes:
- Alginatos de amonio, calcio, potasio y propilenglicol.
- Carboximetil celulosa de sodio.
- Carragenina.
- Goma Xantán.
- Pectina.
Solos o en mezclas en cantidad máxima de 2 g/L
d.d. Saborizantes:Saborizantes:
Saborizantes naturales y artificiales.
e.e. Colorantes:Colorantes:
Se permite la adición de los colorantes artificiales establecidos en la resolución Nº
10593/85 en una cantidad n mayor de 30 mg/L.
f.f. AcidulantesAcidulantes
- Acido cítrico.
- Acido tartárico.
- Acido málico.
- Acido fumárico.
Limitados por las BPM.
Artículo 29. Artículo 29. Aditivos no permitidos: En los refrescos de frutas no se permite la
adición de sustancias diferentes indicadas en el artículo anterior.
Artículo 30.Artículo 30. Límite máximo de defectos: En los refrescos de frutas se admite se
admite un máximo de 10 defectos visuales no mayores de 2 mm en 20 cm3 de muestra
analizada. En 100 cm3 del producto no se admite la presencia de insectos sus
fragmentos.
Art. 31. Art. 31. Contenido máximo de metales pesados:
METALMETAL Mg/kgMg/kg
COBRE como Cu 5
PLOMO como Pb 0.3
ARSENICO como As 0.1
ESTAÑO como Sn 150
Tabla 4. Contenido máximo de metales pesados en los refrescos de frutasTabla 4. Contenido máximo de metales pesados en los refrescos de frutas Fuente: ANDI, 1991.Fuente: ANDI, 1991.
Art. Art. 32. 32. Denominación: Los refrescos de frutas se designaran con la palabra “refresco
de...” seguida del nombre de la fruta utilizada. En el producto elaborado con dos o más
frutas se debe indicar en el rótulo el nombre de las frutas utilizadas.
Parágrafo:Parágrafo: En el rótulo y la publicidad de los refrescos de frutas no pueden incluirse
los términos “natural o 100% natural”. (ANDI, 1991. Capítulo 4)
2.5 PROCESO DE ELABORACION DE REFRESCOS2.5 PROCESO DE ELABORACION DE REFRESCOS
Anexo 5Anexo 5
2.5.1 ELABORACION DE REFRESCOS 2.5.1 ELABORACION DE REFRESCOS
En la producción a escala industrial de refrescos se inicia el proceso con la adición de
la pulpa, el azúcar, el agua y otros aditivos al tanque de crudos. El zumo fluye hacia
tanques de almacenamiento dotados con un agitador para mantener la pulpa en
suspensión. Las principales operaciones tecnológicas antes del envasado son la
extracción del aceite residual y la pasteurización, la cual junto con el pH bajo del
producto garantizan su estabilidad. (Varnam, 1997). Posteriormente el refresco pasa al
envasado y sellado aséptico para después ser distribuido.
2.6 MICROBIOLOGIA DE REFRESCOS DE FRUTA2.6 MICROBIOLOGIA DE REFRESCOS DE FRUTA
No todos los tipos de microbios inicialmente presentes en la fruta se desarrollan por
igual en el refresco, debido a su composición química y sobre todo a su pH bajo, los
refrescos de fruta son un buen medio de cultivo para el desarrollo de levaduras y
mohos, mientras que las bacterias y estreptomicetos apenas pueden crecer, aunque a
veces sobrevivan a los tratamientos de elaboración.
El crecimiento microbiano abundante durante la obtención de zumo origina
transformaciones perjudiciales, tales como descomposición de azúcares y producción
de alcohol y dióxido de carbono. Puesto que la conservación de zumo de frutas
depende de su contenido microbiano durante la elaboración de aquel habrá que
procurar reducir la carga microbiana, ello se consigue mediante un tratamiento rápido
y una limpieza adecuada. Sin embargo, tan poco deben olvidarse las alteraciones
bioquímicas de origen microbiano.
De acuerdo con las investigaciones realizadas, en la primera fase de obtención de
zumos aumenta mucho la carga microbiana original, por el contrario, durante la
clarificación disminuyen los microorganismos presentes, así sucede tanto en zumos
filtrados, como los centrifugados. La intensa actividad metabólica microbiana origina
siempre modificaciones químicas perjudiciales. (Muller, 1981)
Con la excepción de pequeñas cantidades de zumo que contienen benzoato o que
están carbonatadas el principal factor (y en muchas ocasiones el único) que controla el
crecimiento microbiano es el pH. El pH de los zumos varía, pero en todos los casos es
suficientemente bajo para ser selectivo para las levaduras, mohos, bacterias ácido
lácticas y bacterias ácido acéticas. Muchos de estos microorganismos son capaces de
crecer rápidamente en el zumo, por lo que se precisa la aplicación de la refrigeración
como un factor extrínseco de control en los zumos no tratados térmicamente. En
algunos casos el zumo es deficiente en nutrientes para las levaduras, mohos y
bacterias ácido lácticas, aunque en la práctica esto tiene una importancia muy limitada.
(Varnam, 1997)
2.6.1 BACTERIAS 2.6.1 BACTERIAS
Las bacterias productoras de endosporas constituyen un problema especial,
seguramente las formas vegetativas de estas bacterias mueren en las condiciones
ordinarias de esterilización comercial, pero las esporas de Baci l lus y Clostr id ium
pueden sobrevivir a dicho tratamiento al ser muy termorresistentes. (Muller, 1981)
- B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s
Figura 1. Figura 1. B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s Fuente:Fuente:http://www.microbiologyatlas.kvl.dk/biologi/english/showmorf.asp?articleid=6
Bacilo Gram positivo, esporulado, no es patógeno común, se encuentra en el suelo,
agua, polvo, leche, exterior de las plantas y materia en descomposición.
Frecuentemente se encuentra como contaminante ordinario de laboratorios. Es
productor de sustancias antibióticas como la Bacitracina. (Frazier, 1993) Estudios
realizados demuestran que algunas cepas de este microorganismo pueden estar
relacionadas con intoxicaciones alimenticias. (M. S. Salkinoja-Salonen, 1999)
2.6.2 LEVADURAS2.6.2 LEVADURAS
Las levaduras son el agente causal más frecuente de las alteraciones de los refrescos.
Los patrones de alteración se caracterizan por la formación de películas, fermentación
con producción de gas, turbidez y sedimentos y de aromas “afrutados”. De los
refrescos y de sus ingredientes se han aislado numerosos géneros de levaduras. Entre
las más importantes que causan alteraciones están: Cándida, Bret tanomyces,
Saccharomyces y Zygosaccharomyces la cual presenta una especial
resistencia a los conservantes y puede llegar a ser difícil de erradicar de la planta
productora mientras que Bre t t anomyces puede causar problemas en refrescos
altamente carbonatados. También suelen aislarse con frecuencia los géneros
Rhodotoru la y Cryptococcus, aunque parecen tener una baja capacidad
alteradora. (Varnam, 1997)
- R h o d o t o r u l a s pR h o d o t o r u l a s p
Figura 2.Figura 2. R h o d o t o r u l a s p . R h o d o t o r u l a s p . Fuente:Fuente: http:// www.asmusa.org/branch/brscal/photos.rhodotorula.html
La mayoría de las levaduras son hongos unicelulares microscópicos que no forman
micelio y por lo tanto se presentan como células sencillas. Las levaduras tienen forma
redonda, ovalada o elongada siendo relativamente constante para la misma especie. La
mayoría de las levaduras se reproduce asexualmente por gemación y unas pocas lo
hacen por fisión simple como las bacterias. El tiempo de regeneración de la mayoría de
las células es de 20-30 minutos en condiciones ideales.
Las levaduras falsas que no producen ascosporas pertenecen a los hongos
imperfectos, grupo al que pertenece la Rhodotoru la sp . (Hayes, 1993)
Estas levaduras son faces amórficas de Basidiomicetos. En el género
Rhodospor id ium se encuentran las productoras de teliosporas. Se reproducen por
gemación multilateral y no son fermentadoras. Las dos especies que mas abundan en
los alimentos son: Rhodotoru la g lut in is y Rhodotoru la muc i lag inosa .
Producen pigmentos de color variable desde rosa a rojo y la mayoría son de color
naranja a rosa salmón. El género incluye algunas especies/cepas psicrotrofas que se
encuentran en las canales frescos de aves, en los camarones, en la carne de vacuno y
en el pescado. Algunas crecen en la superficie de la mantequilla. ( Jay, 1994)
2.6.3 MOHOS2.6.3 MOHOS
Por su condición de aerobios viven en la superficie de los refrescos, por ejemplo en los
tanques de almacenamiento forman un micelio blanco algodonoso. En ocasiones la
película formada se hunde y va al fondo, mientras en otros permanece en la superficie,
como si se tratase de una cubierta micelial que flota en el liquido. Los pigmentos
originados por los mohos se difunden en parte por el refresco y dan lugar a cambios de
coloración que también se originan por destrucción microbiana de los pigmentos
naturales de los refrescos de frutas. Muchos Deuteromycetos, como el Penic i l l ium y
el Asperg i l lus, dan el típico sabor a moho. De otro lado destruyen los ácidos de la
fruta como el cítrico y el ascórbico o sintetizan otros como el glucónico y el oxálico
por lo que se modifica el pH y el sabor del jugo. (Muller, 1981)
- P e n i c i l l i u m s pP e n i c i l l i u m s p
Figura 3. Figura 3. P e n i c i l l i u m s p .P e n i c i l l i u m s p . Fuente:Fuente: http:// www.botany.utoronto.ca/researchlab/malloch/moulds/penicillium
Es un género grande, en la taxonomía más reciente y completa se reconocen 200
especies. Estudios posteriores, indican que este número es demasiado bajo. 50
especies, al menos, son muy corrientes. Todas las especies corrientes crecen y
esporulan bien en medios sintéticos o semi sintéticos y son generalmente fácilmente
identificables hasta nivel de género. La clasificación de los penicilos se basa
principalmente en su morfología microscópica. El género Pen ic i l l ium se divide en
dos subgéneros atendiendo al número y disposición de las fiálidas (estructuras
productoras de conidios), métulas y ramas (estructuras que soportan las fiálidas) que
parten de las células del estipe principal o pie. La clasificación de Pitt incluye 4
subgéneros: Asperg i l lo ides, cuyas fiálidas parten directamente de los estipes sin la
intervención de elementos de soporte; Furcatum y Bivert ic i l l ium con fiálidas
soportadas por métulas y Penic i l l ium que corrientemente poseen métulas y ramas.
La mayoría de las especies toxigénicas y productoras de alteración alimenticia forman
parte del subgénero Penic i l l ium . (Doyle, 2001)
2.7 CONSERVACION DE REFRESCOS2.7 CONSERVACION DE REFRESCOS
La conservación de los refrescos tiene por objeto poner a los alimentos en condiciones
en las que las causas internas o externas de alteración se eliminen o el proceso de
descomposición resulte retardado. La conservación se utiliza a veces como sinónimo
de prolongación del plazo de utilización. Muchas veces se trata de la combinación de
varios procesos simultáneos o de realización sucesiva.
Para valorar correctamente los resultados de las operaciones implicadas hay que
distinguir entre:
÷ Operaciones que eliminan completamente (esterilización) o una parte considerable
(pasteurización) los microorganismos presentes en el alimento.
÷ Los que inhiben la multiplicación de los microorganismos transitoriamente o de
forma permanente.
2.7.1 CONSERVACION DE ALIMENTOS POR ALTAS TEMPERATURAS2.7.1 CONSERVACION DE ALIMENTOS POR ALTAS TEMPERATURAS
El empleo de altas temperaturas en la conservación de alimentos se basa en sus
efectos destructivos sobre los microorganismos. Por alta temperatura se entiende
aquella que es superior a la ambiental. Con respecto a la conservación de alimentos, se
emplean constantemente dos clases de temperatura: pasteurización y esterilización.
(Roger, 1998)
Es necesario conocer los microorganismos o enzimas existentes para fijar el
correspondiente factor de reducción. La intensidad del tratamiento será función del
factor de reducción elegido para el parámetro. En el caso de los microorganismos es
muy importante partir de una materia prima que tenga un nivel de contaminación
mínimo. En la selección de la especia de microorganismos más adecuada para el
establecimiento de los estándares de pasteurización, hay que tener en cuenta, que este
presente y que pueda desarrollarse en el alimento, que el organismo sea tóxico, que
sea el más termorresistente y que, a su vez, sea activo a temperatura ambiente.
(Rodríguez, 1990)
2.7.22.7.2 PASTEURIZACION PASTEURIZACION
La pasteurización pretende destruir los microorganismos patógenos no esporulados y
reducir significativamente la microbiota banal para ofrecer al consumidor un producto
seguro con una vida útil aceptable para que sea consumido en un corto plazo. A veces,
puede conseguirse la estabilidad microbiológica, como es el caso del vinagre en que se
pretende destruir la microbiota más termorresistente (mohos y levaduras) que puede
desarrollarse al pH tan bajo del producto.
Existen dos modalidades de pasteurización:
a. LTH ( low temperature holding) o pasteurización baja: es un sistema discontinuo
adecuado cuando de pretende pasteurizar volúmenes pequeños (por ejemplo 100 a
500 litros). Se utilizan tiempos largos (aproximadamente 30 minutos) y
temperaturas bajas ( 62 a 68 ºC) y se lleva acabo en tanques de doble pared
provistos de una agitador y un termómetro. Por la doble pared circula el fluido
calefactor y el refrigerante.
b. HTST (high temperature, short time) o pasteurización alta: este método se realiza
en sistema de flujo continuo con cambiadores de calor (tubulares o de placas). Se
utilizan temperaturas elevadas (72-85 ºC) y tiempos cortos (15-20 segundos).
Como siempre sobrevivirán al tratamiento un número determinado de
microorganismos, no es necesario un envasado aséptico, que encarecería
innecesariamente el producto final, basta con que sea higiénico. Los envases
utilizados pueden ser botellas de vidrio o plástico, bolsas de plástico, cartones,
etc. (Ordoñes, 1998).
2.7.3 TEORIA DE LA PAS2.7.3 TEORIA DE LA PASTEURIZACIONTEURIZACION
La pasteurización es un proceso físico mediante el cual se protegen los productos,
generalmente de tipo alimenticio, de los microorganismos que pueden estar presente
en ellos, los cuales pueden descomponer todo el producto. El proceso es un
calentamiento a temperaturas que sean capaces de matar dichos microorganismos, o
por lo menos inactivarlos, pero no lo suficientemente elevadas para que pudieran casar
efectos secundarios adversos que puedan afectar las características organolépticas de
los productos tratados.
Pasteur de acuerdo a sus investigaciones, demostró que los líquidos de carácter ácido
se esterilizan a temperaturas más bajas que aquellos de carácter alcalino o neutro.
Para evaluar cualquier ciclo de pasteurización, se requieren dos componentes: una
curva de letalidad (también referida como curva de muerte térmica) de organismos que
pueden sobrevivir en un producto y una curva de tiempo - temperatura del proceso de
pasteurización. (Master Brewers, 1982)
2.7.4 PASTEURIZACIÓN INSTAN2.7.4 PASTEURIZACIÓN INSTANTANEA O FLASHTANEA O FLASH
El calentamiento por corto tiempo es, con un margen muy amplio sobre los demás, el
proceso que más respecta la integridad de la bebida. Hay que ser consientes, sin
embargo, que aquí únicamente se incluyen los microorganismos de infecciones
primarias, que en la industria de las bebidas, en el caso de las infecciones, solo
constituyen una proporción cercana al 50%. La otra mitad de los problemas biológicos
se desencadena mediante las infecciones secundarias en el área de embotellado.
(embotelladoras, selladoras, botellas, tapas, aire exterior, etc.). (Werner, 1993)
Figura 4. Pasteurizador Instantáneo o Flash.Figura 4. Pasteurizador Instantáneo o Flash.
Fuente: Fuente: ALFA LAVAL, 1995.ALFA LAVAL, 1995.
2.7.4.1 FUNCIONAMIENTO DEL SISTEMA2.7.4.1 FUNCIONAMIENTO DEL SISTEMA
Cuando se colocan juntas las placas de un paquete, los orificios de las esquinas
forman túneles o conectores de distribución que conducen los medios (que participan
en el proceso de transmisión de calor) desde ellas entradas hasta el paquete de placas,
en donde se distribuye a los estrechos canales entre las placas. Debido a la disposición
de las juntas en las placas , y a la colocación de placas A y B alternativamente, los dos
líquidos entran en canales alternos, es decir, el líquido caliente entre canales impares,
y el frío entre canales pares. De este modo, los medios están separados por una fina
pared metálica. En la mayoría de los casos los líquidos circulan en direcciones
opuestas. A su paso por el aparato, el líquido caliente cede parte de su energía
calorífica a la pared metálica, la cual, a su vez, la cede instantáneamente al líquido más
frío que se encuentra al otro lado. El líquido caliente desciende de temperatura, a la vez
que el frío aumenta la suya. Por último los líquidos se introducen en túneles similares
al otro lado de las placas y abandonan el intercambiador.
Figura 5. Placas Intercambiadoras de Calor.Figura 5. Placas Intercambiadoras de Calor. Fuente: Fuente: ALFA LAVAL, 1995. ALFA LAVAL, 1995.
2.7.4.2 TRANSFERENCIA DE CALOR2.7.4.2 TRANSFERENCIA DE CALOR
La finalidad del aparato es la transmisión de calor de un medio a otro. Este calor pasa
muy fácilmente a través de la fina pared que separa ambos medios.
La nueva corrugación que se da al material de las placas no solo proporciona
resistencia y rigidez, sino que también aumenta el grado de transmisión de calor del
medio más caliente a la pared metálica y de esta al otro medio. Este alto flujo de calor
a través de las paredes puede verse reducido de manera importante por la formación de
sedimentos de diversos tipos sobre la superficie de la pared.
El tipo de corrugación Alfa Laval visto anteriormente induce un flujo muy turbulento.
Esta turbulencia provoca una fuerte resistencia a la formación de sedimentos en la
superficie de la placa, pero no siempre se puede eliminar el ensuciamiento. Dichos
sedimentos, que pueden incrementar sensiblemente el grosor total de la pared, están
formados por materiales con una conductividad térmica mucho menor que la de la
placa metálica. Por consiguiente, una capa de sedimentos puede disminuir
considerablemente el coeficiente global de transmisión de calor.
Figura 6. Transferencia de Calor.Figura 6. Transferencia de Calor.
Fuente: Fuente: ALFA LAVAL, 1995. ALFA LAVAL, 1995.
2.7.4.3 FUNCION2.7.4.3 FUNCION
En los intercambiadores de calor de placas Alfa Laval, el calor se transfiere de un medio
a otro a través de finas placas metálicas prensadas según un modelo de corrugación
muy especial.
Figura 7. Componentes del Intercambiador de Calor.Figura 7. Componentes del Intercambiador de Calor.
Fuente: ALFA LAVAL, 1995. Fuente: ALFA LAVAL, 1995.
1. Barra soporte
2. Placa de bastidor
3. Conexiones: Orificios que coinciden con la entrada de la tubería a través de la placa
de bastidor, permitiendo así que los medios a tratar entren en el intercambiador.
4. Pernos de apriete: El paquete de placas que cuelga entre la placa de bastidor y la
placa de presión se comprime mediante un cierto número de pernos de apriete
hasta que las placas hacen contacto metálico y presionan juntas lo suficiente para
sellar los estrechos canales que se forman entre las placas.
5. Placas de canal: En una ranura que bordea la placa y rodea los orificios se
encuentra una junta, generalmente de material elastómero. El calor se transfiere a
través de la superficie que abarca la junta, excepto en pequeñas zonas próximas a
las esquinas. El número de placas del paquete de su intercambiador está
determinado por la magnitud de la superficie de transmisión de calor requerida.
6. Placa de presión: Placa de acero que es móvil como las placas de transmisión de
calor. En algunos casos las tuberías pueden conectarse a la placa de presión.
7. Barra guía: Las placas cuelgan de una barra soporte y se mantienen alineadas
gracias a una barra guía situada en la parte inferior.
8. Columna soporte: Las dos barras están suspendidas entre la placa de bastidor y
una columna soporte.
9. Junta.
2.8 BEBIDAS DE MALTA2.8 BEBIDAS DE MALTA
Las bebidas no alcohólicas han tenido gran aceptación en los últimos años, ejemplo de
esto son las bebidas de malta ya que por su gran porcentaje en carbohidratos posee un
alto contenido energético para las personas en todas las etapas de la vida. En este tipo
de bebidas las vitaminas como: riboflavina, tiamina y niacina son importantes
cofactores enzimáticos que catalizan oxidaciones y deshidrataciones de aminoácidos,
aldehidos y piridinucleótidos esenciales para las funciones vitales del organismo;
también son usados como suplementos alimenticios, lo que la convierte en una bebida
refrescante, vigorizante y nutritiva. (Fenneman, 1993)
Estas bebidas se elaboran a partir de la cebada malteada es decir que ha pasado por
diversos procesos de control como: selección, remojo, germinación (este es tal vez uno
de los proceso más importantes ya que aquí se activan las proteínas, el almidón y la
grasa del grano) y por último el secado y el tostado, para de esta forma obtener el color
deseado para el producto final. Después de estos procesos la malta es colocada en un
periodo de calentamiento ya que va de aproximadamente los 35 ºC a los 76 ºC, en este
momento las enzimas de la malta digieren los almidones y liberan los azúcares,
proteínas y aminoácidos. (Brock, 1997)
2.9 DEFINICIONES2.9 DEFINICIONES
2.9.1 MALTA2.9.1 MALTA
Es la cebada carbonatada la cual es elaborada a partir de cebada malteada, adicionada o
no de otros compuestos acidulantes, aromatizantes, saborizantes, edulcorantes, color
caramelo y suplemento vitamínico. (Norma Técnica Colombiana 4474)
2.9.2 CEBADA MALTEADA2.9.2 CEBADA MALTEADA
Cebada de variedad que ha sido sometida a un proceso de germinación controlada y
posterior tostado en condiciones adecuadas para su empleo en la elaboración de malta.
(Norma Técnica Colombiana 4474)
2.10 BEBIDAS DE CEBADA MALTEADA (Norma Técnica Colombiana 4474)2.10 BEBIDAS DE CEBADA MALTEADA (Norma Técnica Colombiana 4474)
MALTA MALTA
OBJETOOBJETO
Esta norma establece los requisitos de debe cumplir y los ensayos a los cuales se debe
someter la bebida de cebada malteada la cual es denominada malta.
REQUISITOS GENERALESREQUISITOS GENERALES
- El color, olor y el sabor de la malta deben ser característicos del producto.
- La malta debe presentar aspecto limpio, libre de cuerpos extraños, sin sedimentos
ni materiales en suspensión que no correspondan a las características de diseño
del producto.
REQUISITOS ESPECIFICOSREQUISITOS ESPECIFICOS
- La malta debe cumplir los siguientes requisitos fisico-químicos:
REQUISITOREQUISITO ESPECIFICACIONESPECIFICACION
Extracto total expresado como Plato o % m/m.
mínimo.
7.5
CO2, mínimo, expresado como: volumen de
CO2/g CO2/dm3
2.0
4.0
Proteína, expresada como: % m/v mínimo 0.2
Plomo , expresado como Pb (mg/dm3), máximo 0.1
Cobre, expresado como Cu (mg/dm3), máximo 1.0
Zn, expresado como Zn (mg/dm3). máximo 1.0
Arsénico, expresado como As (mg/dm3),
máximo
0.1
Tabla 5. Requisitos físicoTabla 5. Requisitos físico -- químicos de la malta químicos de la malta Fuente: Norma Técnica Colombiana 4474.Fuente: Norma Técnica Colombiana 4474. - La malta debe cumplir los siguientes requisitos microbiológicos:
MICROORGANISMOSMICROORGANISMOS NMPNMP F ILTRACION POR F ILTRACION POR
MEMBRANA (UFC)MEMBRANA (UFC)
S IEMBRA EN S IEMBRA EN
PLACA PLACA
PROFUNDA (UFC)PROFUNDA (UFC)
Coliformes - <1/100/cm3 0/cm3
Recuento de Mesófilos - <10/100/cm3 <=100/cm3
Recuento de Levaduras - <1/100/cm3 <=10/cm3
TabTab la 6. Requisitos microbiológicos de la maltala 6. Requisitos microbiológicos de la malta Fuente: Norma Técnica Colombiana 4474.Fuente: Norma Técnica Colombiana 4474.
2.11 PROCESO DE MALTEADO2.11 PROCESO DE MALTEADO
La cebada para maltear ha sido objeto de largos programas de selección con lo que han
sido obtenidas variedades como la Triumph que presenta una aceptable calidad y un
alto rendimiento para su malteado. Además, la identificación del papel de las
proantocianidinas derivadas de la malta en la formación de turbidez no biológica ha
llevado a la búsqueda de variedades de cebada con bajo contenido de
proantocianidinas.
El malteado es un proceso de germinación controlada (modificación), en el que se
sintetizan y movilizan enzimas y se liberan gránulos de almidón del endospermo. En
los últimos años se han logrado grandes avances en la mejora del proceso del
malteado, el cual ahora dura 8-9 días en comparación con los 14 días que constaba en
los años 50. Además, la cantidad de materia perdida durante el malteado se ha
reducido de un 10 hasta un 5% o menos.
Tras un secado y limpieza iniciales de los granos, estos se remojan a 10-16 ºC para
elevar su contenido en agua hasta el 42-46%, punto en el cual comienza la
germinación. Sin embargo, la discriminación entre remojo y germinación es artificial.
La cebada recién recolectada no germina debido a que se encuentra en un estado
durmiente, pero éste se puede acortar mediante un secado. La falta de oxígeno en el
agua de remojo también inhibe la germinación, pero esto se soluciona drenando y
aireando periódicamente los granos en remojo o bien aireando el agua. En el malteado
moderno se emplean cajas o tanques mixtos de remojo y germinación que se
caracterizan por tener un lecho poco profundo y un flujo de aire elevado.
Los principales avances en el proceso del malteado que se han conseguido en los
últimos años provienen del mejor conocimiento de la fisiología del grano de cebada. La
germinación se puede acelerar y uniformizar mediante la adición, tras el remojo, de
ácido giberélico para desencadenar la producción de enzimas por los gránulos de
aleurona. También es posible estimular el paso del ácido giberélico hacia las células de
la aleurona mediante el raspado mecánico de la cubierta y de la capa subyacente. Este
proceso se realiza comercialmente para acelerar el malteado o para facilitar el malteado
de cebada de no muy buena calidad. En la práctica moderna las condiciones durante la
germinación se controlan mediante el paso de aire, humedad y temperaturas
controladas a través de los granos. Durante el malteado se intenta que las pérdidas por
respiración y por el desarrollo de la raíz sean mínimas, lo cual se consigue mediante un
nuevo remojo. Una etapa final de remojo a 40 ºC se puede llevar a cabo para matar la
raíz.
La malta se moldura antes de mezclarla con agua. Antes eran frecuentes los molinos de
4 rodillos y rendían un buen extracto a partir de las maltas modificadas. Pero el
aumento del uso de maltas no también modificadas de la clase Lager y la necesidad de
una elaboración rápida ha llevado a la aparición de equipos con 6 rodillos. Se puede
aplicar una molienda en seco o en húmedo. (Varnam, 1997)
2.12 MICROBIOLOGIA DE LA MALTA2.12 MICROBIOLOGIA DE LA MALTA
La elaboración de la malta y la cerveza es un proceso similar en el cual se utilizan las
mismas materias primas y el mismo procedimiento en donde la diferencia consiste el
proceso de caramelización para la bebida de malta y la fermentación y maduración para
la cerveza. Teniendo en cuenta lo anterior, estos productos se ven afectados por los
mismos grupos microbianos durante el proceso de elaboración.
Las variaciones en las bebidas de malta o en los tipos de cerveza suelen estar
relacionadas con: el contenido alcohólico, la concentración de malta y de lúpulo
utilizados, la duración del envejecimiento, los sólidos totales existentes inicialmente
(que relaciona los carbohidratos fermentescibles existentes inicialmente con los que
quedan después de la fermentación) y la temperatura de fermentación. (Frazier, 1993)
Los microorganismos alteran la cerveza mediante la producción de sustancias que
causan olores y sabores desagradables o que producen turbidez. Entre los
microorganismos nocivos para la cerveza se encuentran levaduras elípticas capaces de
fermentarla pertenecientes al género Saccharomyces, Lactobacilos y también
bacterias productoras de ácido acético. Junto a estos microorganismos la cerveza
puede contaminarse durante su fabricación con levaduras, bacterias y mohos que no
plantean problemas importantes por que en las condiciones anaeróbicas de la cerveza,
a valores de pH comprendidos entre 4.0 y 4.5 y ante un contenido de alcohol superior
al 3% no se desarrollan o su desarrollo es insignificante. (Muller, 1981)
2.12.1 LEVADURAS2.12.1 LEVADURAS
La alteración producida por las levaduras varía de acuerdo con la levadura implicada en
la alteración, pero es corriente la aparición de una turbidez basta, exceso de gas,
exceso de acidez y aparición de malos aromas. Algunas levaduras salvajes producen
altos niveles de ácidos grasos, desde el C4 al C10, tales como el isobutirato y el
isovalerato, mientras que muchas especies no cultivadas de Saccharomyces
contienen el gen POF1 y generan malos aromas fenólicos por la descarboxilación de
los ácidos hidroxicianámicos, como el ferúlico y el p-cumárico.
En la alteración de la cerveza se ha implicado un amplio espectro de levaduras
procedentes del ambiente, entre las que hay diversas especies de Saccharomyces,
la mayoría de las cuales se clasifican en la actualidad bajo la misma denominación de
Saccharomyces ce rev i s i ae . Otras levaduras salvajes comunes son Pichia
membranae f a c i ens , Hansenu la anaerob ia , Mycoderma ce rev i s i ae y
algunas especies de Toluropsis . (Varnam, 1997).
- H a n s e n u l a s pH a n s e n u l a s p
Figura 8. Figura 8. H a n s e n u l a a n o m a l a .H a n s e n u l a a n o m a l a . FuenteFuente : : http:// www.itis-molinari.mi.it/documents/pea/hansenulaphoto.htm
Es una levadura ascosporógena que presenta células ovales, alargadas o esféricas y
con frecuencia un pseudomicelio. Se reproduce por gemación multipolar y de forma
sexual. En este último caso las esporas en forma de sombrero se producen en el
interior del asca. Comúnmente se encuentra en los cítricos, uvas y productos
derivados. (Jay, 1994)
Esta levadura origina turbidez , sedimentos y velos y sus productos metabólicos sobre
todo alcohol etílico y CO2, originados en la fermentación de los azúcares son también
tan perjudiciales como la formación de velos y ácido acético. Puede presentarse en las
distintas fases de elaboración de la bebida de malta, aunque frecuentemente es
responsable de fermentaciones durante el almacenamiento y la manipulación de la
bebida. Se presenta tanto en la cebada como en el azúcar que puede ser una buena
fuente para su crecimiento. Este microorganismo por ser osmofílico, presenta
fermentaciones que a veces dan lugar a la explosión de los envases como
consecuencia del CO2 originado. (Muller, 1981)
2.12.2 BACTERIAS2.12.2 BACTERIAS
- L a c t o b a c i l l u s s p .L a c t o b a c i l l u s s p .
Figura 9. Figura 9. L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u mL a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m Fuente:Fuente: http:// www.microbiologyatlas.kvl.dk/biologi/english/showmorf.asp?articleid=6
Son células largas, a veces bacilos cortos o cocobacilos en cadena, movilidad no
común, no esporulados, Gram positivos, pueden presentar cuerpos bipolares,
granulaciones internas, metabolismo fermentativo, microaerofílico, catalasa negativo,
temperatura óptima de 30-40 ºC, pH 5.5 a 6.2, raramente producen pigmentos.
(Frazier, 1993)
Técnicas taxonómicas que fueron muy utilizadas durante la década de los años 80´S
han sido aplicadas a este género dando como resultado que algunas de las especies
que figuraban en algunas de las especies de Bergey`s Manual han sido transferidas a
otros géneros. Con base a los datos de la secuencia de RNAr de 16s, han sido puestas
de manifiesto tres agrupaciones distintas desde el punto de vista filogenético con una
agrupación que encierra el grupo de Leuconos toc pa ramesente ro ides . Si bien
los que se encuentran en los alimentos son típicamente microaerófilos, existen
algunas cepas anaerobias estrictas en especial las heces del hombre y la panza.
Característicamente se encuentran en la mayoría de las hortalizas, si es que no se
encuentran en todas ellas, junto con algunas de las demás bacterias acidolácticas. Su
presencia en los productos lácteos es corriente. (Jay, 1994)
2.12.3 MOHOS2.12.3 MOHOS
La formación de esporas es la forma más común de reproducción de los mohos,
formándose cantidades enormes de ellas que son arrastradas por el viento. Por ello en
las industrias alimentarias se debe tener un estricto control de aseo para evitar
problemas de contaminación por mohos. Las esporas son más difíciles de destruir que
el micelio y aguantan bien la sequedad y altas temperaturas (30-50 ºC) durante largos
periodos de tiempo. Tienen un metabolismo clásico a base de intercambiar nutrientes y
productos de desecho a través de la membrana citoplasmática que es semipermeable,
están ampliamente distribuidos en la naturaleza, en cítricos, frutas, quesos y otros
comestibles, en el aire y el suelo. Son contaminantes frecuentes en el ambiente.
Algunas especies producen ácidos orgánicos como cítrico, fumárico, oxálico y
glucónico. Son de gran importancia en algunos procesos en la industria cervecera, de
quesos y antibióticos. (Wainwright, 1995)
-- P e n i c i l l i u m s p P e n i c i l l i u m s p
Figura 10. Figura 10. P e n i c i l l i u m s p .P e n i c i l l i u m s p . Fuente:Fuente: http://
www.jade.botany.utoronto.ca/researchlabs/mallochlab/malloch/moulds/penycillium
Es un moho que posee más de 200 especies de las cuales 60 son micotoxigénicas.
Estas toxinas pueden causar graves intoxicaciones en el hombre, muchas son aisladas
de cereales especialmente de avena, trigo y maíz así como de quesos y frutas cítricas.
Las toxinas que producen son Islanditoxinas, Luteoeskinina, Acrotoxina, Patulina y
Rugulsina, estas toxinas son termorresistentes.
2.13 CONSERVACION DE BEBIDAS DE MALTA2.13 CONSERVACION DE BEBIDAS DE MALTA
La máxima seguridad microbiológica se obtiene con la pasteurización de las botellas,
en este proceso se abarca los microorganismos de infecciones secundarias. (Roger,
1998)
Una vez envasado el producto se debe pasteurizar para su conservación. A pesar que
durante todo el proceso el producto ha estado en contacto con tuberías, mangueras ,
tanques debidamente limpios y desinfectados, y además las botellas y tanquetas en
donde se recibe han pasado por procesos de desinfección y esterilización adecuados;
es necesario realizar este procedimiento para garantizar una conservación durante
periodos de tiempo relativamente largos, según el tiempo de vida útil de esta bebida en
cada una de los envases. (Hough, 1990)
La pasteurización de las botellas constituye también para las bebidas el recargo
térmico más fuerte. Así, las temperaturas más altas, a través de los tiempos de
calentado, conservación y refrigeración de retorno, actúan sobre las bebidas en un
periodo bastante prolongado. (Roger, 1998)
2.13.1 PASTEURIZACION TUNEL2.13.1 PASTEURIZACION TUNEL
Figura 11. Pasteurizador túnelFigura 11. Pasteurizador túnel Fuente: Las autoras.Fuente: Las autoras.
Este procedimiento pasteuriza el envase y su contenido y asegura la fiabilidad del
producto. (Ashurts, 1999)
Las botellas llenadas y tapadas son transportadas a través del túnel en un
transportador. A medida que los envases pasan a lo largo del túnel son rociados con
agua a diferentes temperaturas para efectuar el calentamiento y el enfriamiento. El
agua es un medio transmisor de calor conveniente. Tiene buenas propiedades de
transferencia de calor y su temperatura es fácil de controlar. Esta última propiedad
reduce el índice de ruptura de botellas durante el choque térmico. (EBC, 1995)
Las temperaturas del agua se controlan cuidadosamente y el recorrido del túnel se
divide en tres zonas. Inicialmente las pulverizaciones aumentan lentamente la
temperatura del envase hacia el primer tercio del túnel, luego los finos chorros de agua
alcanzan la temperatura de pasteurización y el tercio final es la zona de enfriamiento
donde las pulverizaciones son de agua progresivamente mas fría hasta que el envase
emerge ya enfriado. (Ashurts, 1999)
Una característica de la pasteurizadora túnel es que está dividida en una serie de
zonas, cada una de las cuales opera a una temperatura diferente. Por lo tanto, los
envases entrantes son calentados progresivamente hasta que se logre la temperatura
de conservación deseada y en donde la mayor parte del tratamiento calorífico toma
lugar. Del mismo modo, los envases pueden ser enfriados progresivamente de la
temperatura de permanencia hasta la temperatura de descarga requerida.
El túnel está dividido en secciones, cada sección está compuesta de un tanque de agua
que forma la base, una bomba de circulación y un sistema de distribución del agua. El
agua se mantiene a nivel constante en los tanques mediante la admisión de agua
generalmente por medio de una válvula de flotador simple. Cualquier exceso de agua
es drenando por derramamiento. Los tanques están interconectados por medio de
tuberías de equilibrio. Aunque normalmente no hay circulación a través de estas
tuberías, estas actúan como regulación de suministro o sobrecirculación en cualquier
disfunción de los tanques. (EBC, 1995)
Una variante de este procedimiento es el llenado en caliente, en el que la bebida es
precalentada por pasteurización rápida se envasa a temperatura lo suficientemente alta
para lograr la pasteurización y el cierre sin otro aporte de calor. Después de un tiempo
el envase se enfría lo más rápidamente posible. (Ashurts, 1995)
2.14 BIOLUMINISCENCIA2.14 BIOLUMINISCENCIA
2.14.1 BREVE HISTORIA DE LA BIOLUMINISCENCIA2.14.1 BREVE HISTORIA DE LA BIOLUMINISCENCIA
La utilización de la enzima luciferasa, producida naturalmente por las luciérnagas, para
cuantificar niveles de ATP, fue descrita por primera vez en la década de los 50'S, pero
la sensibilidad suficiente para detectar niveles muy bajos de ATP no se alcanzo hasta el
año 1975. El ATP es la molécula utilizada por todos los organismos vivientes, como
fuente de energía metabólica. Por esta razón la detección de ATP se puede utilizar
como un indicativo de la presencia de un organismo viviente.
El funcionamiento de el equipo de Detección Rápida para Contaminación Microbiana se
basa en la técnica de bioluminiscencia, la cual utiliza luciferasa proveniente de las
luciérnagas para detectar la presencia de microorganismos vivos.
La tecnología basada en Bioluminiscencia de ATP proporciona resultados rápidos y
sensibles a través de una operación sencilla. Bioluminiscencia es la luz de origen
biológico emitida al reaccionar: un sustrato (Luciferin), una enzima (aislada de
luciérnagas, Luciferasa) y ATP (Adenosin-Trifosfato), molécula de intercambio
energético de las células vivas (animal, vegetal, bacterias, levaduras y mohos) y
mediante un luminómetro se mide la cantidad de fotones emitidos por la reacción que
es proporcional a la cantidad de ATP presente. Esta técnica se desarrolló para
determinar ATP en superficies evidenciando la presencia de microorganismos o
residuos de materia orgánica. (IDEXX, 1995)
2.14.2 ADENOSIN TRIFOSFATO2.14.2 ADENOSIN TRIFOSFATO
El ser vivo es una estructura bien delimitada respecto de su entorno, capaz de
intercambiar con él materia y energía, de autorregenerarse y autorreplicarse (Macarulla,
1991)
La célula microbiana es fundamentalmente un sistema físico - químico. Su elevada
actividad metabólica se debe en gran parte al flujo de energía química, como se pone
de manifiesto por la elevada tasa de división celular y catabolismo y aunque
permanecen en forma microscópica puede concluirse que su tamaño no es de por sí
una desventaja en la naturaleza. (Sherris, 1993) (Zinsser, 1994)
2.14.2.1 METABOLISMO CELULAR2.14.2.1 METABOLISMO CELULAR
La actividad mas simple en la vida del organismo implica un gran número de complejas
reacciones bioquímicas, la suma de todas ellas se denomina metabolismo. (Stainer,
1984 ) (Tortora, 1993)
Como las reacciones químicas liberan o absorben energía el metabolismo se puede
entender como un balance de energía. De acuerdo con esto la actividad metabólica se
puede dividir en dos clases de reacciones químicas: catabólicas (degradativas) y
reacciones anabólicas (sintéticas). Las reacciones que combinan sustancias sencillas
para producir moléculas más complejas son conocidas en conjunto como anabolismo y
las reacciones químicas que degradan los componentes orgánicos complejos
convirtiéndolos en otros simples se conocen en conjunto como catabolismo. (Tortora,
1993)
Muchas de las reacciones de la biosíntesis requieren de una activación de sus
reaccionantes hasta situarlos en un estado de más energía, por ello, una parte
importante del metabolismo de cualquier organismo implica la movilización de energía
química para producir la biosíntesis. (Stainer, 1984)
El acoplamiento entre reacciones consumidoras de energía y reacciones productoras de
energía se consigue a través del ATP, el cual almacena la energía derivada de las
reacciones catabólicas y posteriormente la libera para permitir reacciones anabólicas.
(Tortora, 1993) (Macarulla, 1991).
2.14.2.2 IMPORTANCIA DEL ATP EN EL ME2.14.2.2 IMPORTANCIA DEL ATP EN EL METABOLISMO CELULARTABOLISMO CELULAR
El ATP es la principal molécula de energía química, su papel primario es “atrapar” una
proporción de la energía libre que queda disponible a través de las reacciones
catabólicas y “ conducir” reacciones biosintéticas al fosforilar y de este modo activar,
metabolitos intermediarios de la biosíntesis algunos de los cuales contienen enlaces
de alta energía. (Stainer, 1984) (Tortora, 1993)
Debido a su capacidad de reaccionar con los demás compuestos de alta energía de las
células, el ATP se ha designado acertadamente como la “moneda” del metabolismo
energético celular. La célula microbiana se puede considerar como la “carga” de enlaces
fosfato de alta energía que posee el sistema ATP-ADP-AMP. (Rose, 1987)
El ATP libera gran cantidad de energía utilizable cuando pierde su grupo fosfato
terminal PP, para convertirse en ADP. Esta reacción puede representarse de la siguiente
manera :
ATP ADP + P P + ENERGIA
Como el suministro de ATP esta limitado en cualquier momento determinado existe un
mecanismo para romperlo: la adición de un grupo fosfato al ADP proporciona más ATP.
Como se requiere energía para generar ATP la reacción puede representarse así:
ADP + PP + ENERGÍA ATP
La energía necesaria para unir el grupo fosfato al ADP es suministrada por las diversas
reacciones degradativas de la célula particularmente la degradación de la glucosa.
(Tortora, 1993)
El ATP se encuentra en todos los tipos de células. En las células intactas, dicha
molécula está muy cargada; a pH 7.0 todos los grupos fosfato están completamente
ionizados. El ATP se halla en las células principalmente formando un complejo con el
Mg2+. (Rose, 1987) (Zinsser, 1994)
2.14.2.3 MODELOS NUTRICIONALES DE LOS ORGANISMOS2.14.2.3 MODELOS NUTRICIONALES DE LOS ORGANISMOS
Dado que todas las células requieren los mismos elementos estructurales, aquellos
que no puedan ser producidos por una célula determinada deben obtenerse
preformados a partir del medio ambiente. Estos requerimientos nutricionales en los
microorganismos varían de una especia a otra y proporcionan una importante base
práctica para su identificación en el laboratorio. (Sherris, 1993)
Los tipos nutricionales en los organismos se pueden diferenciar teniendo en cuenta la
fuente de energía y la fuente principal del carbono. Atendiendo la fuente de energía se
pueden clasificar generalmente a los organismos como fotótrofos o quimiotrófos. Los
fotótrofos utilizan la luz como fuente principal de energía, mientras que los
quimiotrófos dependen de la oxido reducción de compuestos orgánicos o inorgánicos
para la obtención de energía. Como fuente principal de carbono los autótrofos (que se
autoalimentan) utilizan Dióxido de Carbono y los heterótrofos (que se alimentan de
otros) requieren una fuente de carbono orgánico. Combinando las fuentes de energía y
de carbono llegamos a la siguiente clasificación nutricional de los organismos:
fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimiautótrofos y quimioheterótrofos. (Tortora,
1993)
Tipo nutr ic ionalT ipo nutr ic ional Fuente de Fuente de
energíaenergía Fuente de Fuente de carbonocarbono
E jemplosE jemplos
Fotoautótrofo Luz CO2 Bacterias fotosintéticas (bacterias verdes y rojas del azufre; algunas pueden crecer quimiotróficamente)
Fotoheterótrofo Luz Compuestos orgánicos
Bacterias verdes y rojas no del azufre ( algunas bacterias rojas no del azufre pueden crecer quimiotróficamente)
Quimioautótrofos Compuestos
inorgánicos
CO2 Bacterias de hidrógeno, del azufre, del hierro y nitrificantes.
Quimioheterótrofos
Compuestos orgánicos
Compuestos orgánicos
La mayoría de las bacterias, todos los hongos, protozoos y animales.
TablTabla. 7. Clasificación nutricional de los organismosa. 7. Clasificación nutricional de los organismos Fuente: Tortora, 1993Fuente: Tortora, 1993
2.14.2.4 DETERMINACION DEL ATP2.14.2.4 DETERMINACION DEL ATP
El trifosfato de adenosina (ATP) se encuentra en todas las células vivas y es el agente
universal de la transferencia de energía libre desde las reacciones catabólica a las
reacciones anabólicas. Varios organismos vivos muy diferentes han desarrollado un
mecanismo para producir luz gracias a la actividad de unos enzimas conocidos como
luc i ferasas sobre sustratos conocidos como luc i fer inas . Estas reacciones
enzimáticas requieren la presencia de ATP y de iones de magnesio y producen un fotón
de luz a expensas de la hidrólisis de una molécula de ATP mediante una serie de
reacciones intermedias. La molécula de ATP facilita la formación de un complejo
enzima-sustrato que es oxidado por el oxígeno molecular a un estado excitado
electrónicamente. El estado excitado de la molécula vuelve al estado básico de baja
energía con la liberación de un fotón de energía y se disocia para liberar de nuevo el
enzima luciferasa. Estas reacciones se resumen a continuación:
LUCIFERINA + LUCIFERASA + ATP
LUCIFERINA – LUCIFERASA – AMP + PP +02
OXILUCIFERINA – LUCIFERASA – AMP + H20
OXILUCIFERASA + LUCIFERASA +AMP + h µ (560nm)
Aunque el método da resultados muy buenos con cultivos puros, cuando se aplica a
los alimentos es esencial garantizar que el ATP no microbiano, que estará presente en
los alimentos en cantidades mayores que las correspondientes al ATP microbiano, ha
sido destruido o que se ha evitado que los microorganismos perjudiquen a los
componentes del alimento. El ATP no microbiano se puede separar de modo selectivo
tratando la muestra con un ATPasa después de romper las células somáticas de origen
vegetal o animal con un agente tensoactivo suave. El próximo paso consiste en
destruir la actividad de la ATPasa y después extraer el ATP de los microorganismos
utilizando un agente tensoactivo más potente.
En la actualidad existen aparatos en los que una muestra obtenida del material con una
esponja de hilas puede ser analizada directamente para determinar el ATP
proporcionando una medida prácticamente inmediata de la contaminación. En estos
casos, no es necesario establecer la diferencia entre ATP microbiano y ATP no
microbiano ya que la presencia de ambos en gran cantidad indicaría una higiene
escasa. Esta rapidez y esta sencillez hacen de la determinación del ATP la prueba más
claramente microbiológica que puede ser aplicada en el control sistemático de los
puntos críticos de control como parte integrante de la técnica HACCP para garantizar
la calidad de los alimentos. (Adams, 1997)
2.14.32.14.3 SISTEMA DE BIOLUMINISCENCIA SISTEMA DE BIOLUMINISCENCIA
Los organismos mas conocidos con la propiedad de emitir luz por poseer las enzimas
llamadas luciferasas son la luciérnaga de Norte América Phot inus pyral is y las
bacterias marinas que pertenecen a los géneros Vibr io y Photobacter ium. Las
bacterias luminiscentes, contienen cuando más del dos al cinco porciento de la
proteína soluble luciferasa. Esta enzima tiene un peso molecular aproximado de 60.000
Daltons y es relativamente rica en aminoácidos. (Rose, 1997)
El proceso de emisión de luz esta ligado a la cadena respiratoria, la luciferasa junto con
la molécula emisora, denominada luciferina esta dentro de una estructura envuelta por
una membrana. (Rose, 1997)
La luciferasa utilizada en esta técnica tiene su origen en Phot inus pyra l is , la cual
es sumamente susceptible al ATP. (Brovko, 1994)
El sistema detector de bioluminiscencia por ATP consiste en un luminómetro y
dispositivo de hisopo. Este sistema detecta residuos alimenticios midiendo el ATP .
Este valor obtenido puede emplearse para controlar y elevar al máximo la eficacia de
los procedimientos de limpieza en lugares donde se procesan alimentos. El ensayo
utiliza la enzima luciferasa (procedente de las luciérnagas), la cual es sumamente
susceptible al ATP. El ATP se encuentra en la mayoría de los residuos alimenticios y en
todas las células de bacterias, levaduras y mohos.
Cuando el dispositivo de hisopo se utiliza para obtener una muestra y luego se activa,
este emite luz en cantidades proporcionales a la cantidad de ATP contenida en la
muestra. El luminómetro mide la luz emitida por un dispositivo de hisopo. Luego
convierte la emisión de luz en una “zona” numérica, la cual es mostrada y almacenada
por el luminómetro..
Figura 12. Equipo y Dispositivo de HisopoFigura 12. Equipo y Dispositivo de Hisopo Fuente: Biocontrol, 2000.Fuente: Biocontrol, 2000.
En el siguiente diagrama se muestran en orden, los pasos que sigue el sistema de
bioluminiscencia para detectar residuos alimentarios midiendo el nivel de ATP que se
encuentra en la muestra. La luz emitida es proporcional al ATP, el cual es proporcional
a la cantidad de residuo.
DETECCION DE RESIDUO CONTAMINANTEDETECCION DE RESIDUO CONTAMINANTE
Material Biológico Recolección de muestra Material Biológico Recolección de muestra
ATP Procesamiento de la muestra ATP Procesamiento de la muestra
Luciferina/Luciferasa Sistema de reactivosLuciferina/Luciferasa Sistema de reactivos
LUZ Reacción LUZ Reacción
FotFot ones de recuento Mediciónones de recuento Medición
LUZ = ATP = RESIDUOLUZ = ATP = RESIDUO
2.14.3.1 ZONAS DE LIMPIEZA2.14.3.1 ZONAS DE LIMPIEZA
Los resultados mostrados por el luminómetro se indican en zonas de limpieza, desde
la zona 1.0 hasta la zona 7.5. Cada zona es 10 veces mayor que la zona anterior, en
una escala logarítmica de base 10. Así pues, la emisión de luz de la zona 5.5 es 10
veces mayor que la de la zona 4.5, 100 veces mayor que la de la zona 3.5 y 1000 veces
mayor que la de la zona 2.5.
Las superficies limpiadas a fondo que usualmente se encuentran en las plantas
procesadoras de alimentos producen resultados inferiores a la zona 2.5. Los valores
entre 2.6 y la zona 3.0 indican alerta y deberán seguirse atentamente con el fin de que
con el tiempo, estas superficies no lleguen a la zona sucia. Las superficies que
exceden la zona 3.0 se consideran sucias. Se recomienda limpiar nuevamente los
lugares sucios y si el resultado subsiguiente no revela una disminución de la suciedad,
convendría estudiar el proceso de limpieza.
2.14.3.2 SENSIBILIDAD DEL EQUIPO2.14.3.2 SENSIBILIDAD DEL EQUIPO
La sensibilidad del equipo para ATP es 3x10-14 moles, o 15 picogramos. La medición de
muestras reales demuestra que el sistema es sensible hasta un nivel inferior a 0.03
microlitros de jugo de naranja, inferior a 0.30 miligramos de pescado procesado,
inferior a 6 UFC de levadura activa e inferior a 30.000 UFC de Bac i l lus cereus.
2.14.3.3 DISEÑO BASICO DEL EQUIPO2.14.3.3 DISEÑO BASICO DEL EQUIPO
El luminómetro consiste en una cámara exterior que protege a la máquina del medio
ambiente y una cámara interna donde tiene lugar la medición de la luz:
- Tubo guía del hisopo: El orificio cilíndrico en el que se introduce el dispositivo de
hisopo.
- TFM (Tubo Foto Multiplicador): Recolecta la luz directamente del dispositivo de
hisopo y la luz reflejada en el espejo. De ahí la luz se convierte en una señal
electrónica.
- Espejo: Concentra la luz hacia el TFM.
- Obturador: Una compuerta mecánica que protege el TFM de la luz ambiental normal
cuando no está puesta la tapa del dispositivo. El obturador se abre cuando el
dispositivo de hisopo oprime la palanca del obturador hacia abajo cuando se
introduce en el aparato y se cierra la tapa.
- Detector de temperatura: Estima la temperatura de la reacción y ajusta los
resultados automáticamente al mejor índice de reacción.
Figura 13. Diseño del Equipo.Figura 13. Diseño del Equipo.
Fuente: Biocontrol, 2000. Fuente: Biocontrol, 2000.
2.14.3.4 VENTAJAS DE LA BIOLUMINISCENCIA FRENTE A METODOS 2.14.3.4 VENTAJAS DE LA BIOLUMINISCENCIA FRENTE A METODOS
TRADICIONALESTRADICIONALES
ü Resultados listos en 11 segundos.
ü Medición exacta de la cantidad de ATP.
ü Sensible para detección de ATP microbiano y no microbiano.
ü No hay que agregar soluciones.
ü Fácil manejo y transporte.
ü No requiere mezclas .
ü Permite análisis de datos, generación de informes y elaboración de gráficas.
(Biocontrol, 2000)
2.15 METODOS P2.15 METODOS PARA RECUENTOS DE MICROORGANISMOSARA RECUENTOS DE MICROORGANISMOS
Varios métodos de enumeración de microorganismos son utilizados en microbiología.
Su objetivo es determinar el número aproximado de microorganismos presentes en una
muestra. Algunos métodos miden el número de células, otros la masa total de la
población (aunque estos dos parámetros no son siempre equivalentes debido a que el
promedio de peso seco de la célula varía en las distintas etapas de la historia del
cultivo) y otros miden sus productos metabólicos. (Jay, 1994) (Jawetz, 1995) (Luna,
1991) (Tortora, 1993)
Las medidas de población pueden calcularse en términos de concentración celular
(número de células por unidad de volumen) o de concentración de la biomasa (peso
seco de las células por unidad de cultivo). (Jawetz, 1995)
Debido a que las poblaciones bacteriana suelen ser muy grandes la mayoría de los
métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de
muestras muy pequeñas, después se determina mediante cálculos el tamaño de la
población total. (Tortora, 1993)
2.15.1 RECUENTO EN PLACA2.15.1 RECUENTO EN PLACA
Este método mide el número de células viables (célula viable se define como la que es
capaz de dividirse y formar una progenie) y la forma usual para realizar una cuenta de
viabilidad es la determinación de la cantidad de células en la muestra, capaces de
formar colonias sobre un medio adecuado de cultivo. En esta técnica se asume que el
inoculo original es homogéneo y que no existen agregados de células. (Brock, 1997)
(Tortora, 1993)
Hay dos maneras de realizar este conteo:
- Recuento en profundidad o vaciado en placa
- Recuento en superficie o siembra en placa por extensión
En el recuento en profundidad o vaciado en placa se coloca una caja petri estéril,
alícuotas de 0.1- 1 ml de muestra e inmediatamente se verte de 10 a 15 ml de agar
fundido (45-50 ºC, temperatura en la cual no se pierde viabilidad) se mezcla, se deja
solidificar y se incuba, para luego hacer el recuento de colonias. Este método se basa
en el hecho que las células microbianas mezcladas con el agar van a desarrollar
colonias separadas y visibles. Para células microbianas mezcladas con el agar van a
desarrollar colonias separadas y visibles. Para el recuento en superficie o siembra en
placa por extensión se utiliza la superficie endurecida y seca de un medio de cultivo
que previamente ha sido vertido en placas y con la ayuda de varillas dobladas de vidrio
estéril (palos de hockey) el inoculo con el cual se va a sembrar la placa que tiene un
volumen de 0.1 ml, se distribuye cuidadosa y uniformemente sobre toda la superficie
del agar, se incuba hasta la aparición de colonias y luego se realiza el conteo. Este es el
método de elección cuando las características de una determinada colonia son
importantes para su identificación presuntiva. (Jay, 1994) (Luna, 1991) (Brock, 1997)
Cuando se realiza el recuento en placa es importante que el número de colonias que se
desarrollan no sea demasiado grande , ya que algunas células que se encuentran
hacinadas pueden no formar colonias, dándose así un error en el conteo. También es
esencial que el número de colonias desarrolladas no sea demasiado pequeño, pues el
valor estadístico del recuento será muy bajo. El de mayor significación estadística, es
el recuento realizado solo a aquellas placas que contienen para bacterias entre 30-300
UFC, para levaduras entre 20-200 UFC y para mohos entre 10-100 UFC. Para
asegurarse que el número de colonias desarrolladas se encuentran entre estos rangos,
por lo general a la muestra original se le hacen varias diluciones seriadas. (Tortora,
1993)
El número de colonias obtenidas en una siembra, no solo depende del tamaño del
inoculo, sino del medio de cultivo utilizado, del tiempo y la temperatura de incubación.
El resultado se expresa como el Número de Unidades Formadoras de Colonia con
preferencia a cantidad de células viables, dado que una de ellas puede contener una o
mas células. (Brock, 1997)
2.16 VALIDACION DE METODOS ANALITICOS PARA EL CONTROL DE 2.16 VALIDACION DE METODOS ANALITICOS PARA EL CONTROL DE
ALIMENTOSALIMENTOS
La validez de los datos microbiológicos depende de los métodos usados y del
laboratorio que realiza el análisis. Errores en la detección de los microorganismos
pueden ser la causa de falsos resultados positivos, por la detección de
microorganismos no buscados y de falsos resultados negativos si los
microorganismos que se buscan están presentes pero no son detectados. En las
pruebas cuantitativas, los errores pueden dar lugar a una sobre o subestimación de la
verdadera incidencia del microorganismo buscado. (Doyle, 2001)
Para realizar una validación hay que tener en cuenta:
ü El método validado debe ser tanto práctico como apto para su uso.
ü La confiabilidad de un método se determina mediante alguna forma de
procedimiento de validación.
ü El método validado ideal es el que se ha desarrollado a través de un estudio
colaborativo de acuerdo a los protocolos internacionales armonizados para el
diseño. Por lo general requiere un diseño de estudio que incluya un mínimo de 5
materiales de ensayo, la participación de 8 laboratorios que informen datos válidos
y con mayor frecuencia incluye muestras repetidas a ciegas.
ü Otra opción sería un protocolo de validación de dos laboratorios (por ejemplo,
similar al Protocolo Internacional de Métodos "Peer Verified" de AOAC), y la opción
final sería un protocolo de validación de un solo laboratorio. Con cualquiera de los
esquemas de validación alternativos, la Consulta alienta vigorosamente que el
trabajo de validación sea desarrollado de acuerdo con los cinco principios que se
detallan a continuación:
1. Que los laboratorios que llevan a cabo validación de métodos trabajen bajo un
sistema de calidad adecuado basado en principios internacionalmente reconocidos.
2. Que los laboratorios tengan en funcionamiento un mecanismo de evaluación
periódica, independiente, llevado a cabo por terceros, sobre su sistema de calidad y
trabajo de validación, desarrollado, por ejemplo, por un organismo de acreditación,
una autoridad de GLP, o uno o más laboratorios colaboradores. Alternativamente, el
laboratorio que lleva a cabo la validación debe presentar el trabajo de validación
para "peer review" para que sea evaluado por una organización profesional
adecuada. Dicha evaluación y revisión independiente, ayuda a garantizar la
transferibilidad del método validado del laboratorio originante a otros laboratorios:
1. Que el método analítico sea evaluado de acuerdo con los criterios a mencionar,
usando las definiciones adoptadas por la Comisión .
2. El trabajo de validación debe ser documentado cuidadosamente en un informe
de validación en el cual se establezca de forma inequívoca con qué fines
(matrices y niveles del compuesto analizado) se ha hallado que el método
funciona en forma satisfactoria.
3. Evidencia de transferibilidad
Los criterios generales para la validación de un método analítico para el control de
alimentos a tener en cuenta son:
1. Especificidad: Relacionar al menos aquellas sustancias que podrían originar una
señal interferente cuando se usa el principio de medición. Los detalles sobre
especificidad deben indicar cuantitativamente el grado hasta el cual el método
puede distinguir entre el compuesto de interés y la sustancias intervinientes en las
condiciones experimentales.
2. Exactitud: Proximidad de concordancia entre el valor real de la concentración de
una sustancia analizada y el resultado promedio que se obtiene aplicando el
procedimiento experimental muchas veces a un grupo homogéneo de muestras.
3. Precisión: Proximidad de concordancias entre los resultados independientes de las
pruebas obtenidas a partir de muestras homogéneas analizadas en condiciones
estipuladas de uso. La repetibilidad y reproducibilidad pueden estimarse mejor
cuando la validación se lleva acabo como un estudio colaborativo, sin embargo
cuando no lo hay, el laboratorio debe obtener un estimado de la repetibilidad del
método y la reproducibilidad intra-laboratorio a partir de datos procedentes de ese
laboratorio.
4. Límite de cuantificación: Es el contenido mínimo medido sobre el cual es posible
una determinación del compuesto analizado con un grado específico de exactitud y
repetibilidad (reproducibilidad dentro del laboratorio).
5. Sensibilidad: Consiste en el cambio en la respuesta analítica dividido por el
correspondiente cambio en la concentración de una curva estándar, es decir la
pendiente de la curva de calibración analítica. Se habla de método sensible cuando
un pequeño cambio en la concentración de los compuestos analizados provoca un
gran cambio en la medición analítica. A pesar de que la respuesta analítica puede
variar con la magnitud de la concentración del compuesto, por lo general es
constante sobre un rango razonable de concentraciones.
6. Practicabilidad y aplicabilidad en condiciones normales: se refiere a la facilidad con
la cual los expertos en análisis pueden aplicar el método. (FAO/IAEA, 1997)
3. JUSTIFICACION3. JUSTIFICACION
Dada la naturaleza competitiva hoy en día, ninguna industria puede dejar de lado las
cuestiones de mejoramiento de la eficacia en la producción y en la distribución. En
muchos casos la deficiencia está dada por la lentitud de los ensayos microbiológicos
tradicionales que requieren de 10 a 15 días. Es por esto, que para obtener buenos
resultados en un tiempo más corto la industria productora en estudio se ve en la
necesidad de implantar una metodología rápida y sensible que permita un buen control
microbiológico del producto a fin de asegurar una óptima calidad en sus productos
terminados. Los sabores a evaluar en producto terminado de refrescos y bebidas de
malta presentan características diferentes y por tanto una carga microbiana variable de
acuerdo a las condiciones del producto.
Debido a la alta exigencia microbiológica la empresa en estudio se ve motivada en
implementar la técnica de bioluminiscencia la cual lleva cerca de 4 años en el mercado
siendo su principal uso el análisis de superficies y el control de contaminación de
aguas, a fin de observar su sensibilidad y especificidad de detección de contaminación
en sus productos (bebida de malta y refrescos).
4. OBJETIVOS4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL4.1 OBJETIVO GENERAL
Comparar los resultados obtenidos entre los métodos de Bioluminiscencia y Recuento
Estándar en Placa en producto alterado de bebida de malta y refrescos pasteurizados
para detectar de una manera rápida contaminación.
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Estandarizar la técnica de Bioluminiscencia con base al Recuento Estándar en
Placa.
2. Determinar la sensibilidad y especificidad del método de Bioluminiscencia
comparado con la sensibilidad y especificidad del recuento Estándar en Placa.
3. Determinar la equivalencia de las Unidades Relativas de Luz con respecto a las
Unidades Formadoras de Colonia.
5. MATERIALES Y METODOS5. MATERIALES Y METODOS
El presente trabajo se realizó en una industria procesadora de refrescos y bebida de
malta pasteurizados, en el laboratorio de Investigación y Desarrollo, en el periodo
comprendido entre Julio de 1999 y agosto de 2001.
5.15.1 MUESTREOMUESTREO
5.1.15.1.1 PRUEBA PILOTOPRUEBA PILOTO
Inicialmente se realizó una prueba piloto la cual permitió tener un tamaño de muestra
apto para obtener unos datos finales satisfactorios.
El tamaño de muestra para esta prueba fue de 30 bolsas al azar de cada producto
terminado (refrescos de mora, mango, naranja , durazno ) con un volumen por bolsa de
200 ml y 30 botellas al azar de bebida de malta con un volumen de 100 ml.
Se hizo a cada bolsa de refresco y a cada botella de bebida de malta una inducción de
contaminación previamente estandarizada (Número de colonias existentes en el
inoculo) a fin de realizar diferentes recuentos microbiológicos como son :
• Recuento de mesófilos aerobios en agar SPC
• Recuento de levaduras y mohos en agar PDA
Paralelo a la siembra microbiológica se tomó las Unidades Relativas de Luz (URL) para
datos correspondientes.
5.2 ANALISIS MICROBIOLÓGICO5.2 ANALISIS MICROBIOLÓGICO
5.2.1 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS5.2.1 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
5.2.1.1 PRUEBA PILOTO5.2.1.1 PRUEBA PILOTO
Para realizar la prueba piloto para refrescos y bebidas de malta se realizó un pool de
microorganismos específicos así:
MICROORGANISMMICROORGANISM
OO
REFRESCOREFRESCO BEB IDA DE MALTABEB IDA DE MALTA MEDIO DE MEDIO DE
CULT IVOCULT IVO
Bacterias Bacil lus
l icheniformis
Lactobaci l lus sp 30 ml de peptona al
0.1%
Mohos Penici l l ium sp Penici l l ium sp 30 ml de caldo jugo
de tomate
Levaduras Rhodotoru la sp Hansenula sp 30 ml de caldo jugo
de tomate.
Tabla 8. Microorganismos para ensayos en refrescos y bebida de malta.Tabla 8. Microorganismos para ensayos en refrescos y bebida de malta. Fuente: Las autoras.Fuente: Las autoras.
Los microorganismos utilizados a lo largo de esta investigación fueron seleccionados
de acuerdo a anteriores trabajos de caracterización microbiológica realizada en los
productos en estudio por la empresa. (Barrios, 1999), (García, 2001) (Pérez, 2001)
Para determinar la población existente en cada uno de los pool (UFC) se realizaron
diluciones seriadas a fin de conocer la ideal para cada uno de los rangos de los
microorganismos a trabajar (bacterias 30-300 UFC, mohos 15-150 UFC y levaduras
20-200 UFC). Posteriormente se realizó la técnica de crioconservación (ver numeraver numera l l
5.3) 5.3) de cada uno de los microorganismos.
Posteriormente se tomaron las 30 muestras de producto correspondientes y se les
tomó las URL al igual que se realizó el recuento microbiológico sin inocular con el
propósito de descartar cualquier contaminación antes de agregar el inoculo.
Después asépticamente en cabina de flujo laminar se dispuso a agregar el inoculo
conocido de microorganismos (bacterias, mohos y levaduras) por separado a cada una
de las 30 muestras del refresco seleccionado (30 muestras de refresco de mora, 30 de
mango, 30 de durazno y 30 de naranja). El mismo procedimiento se realizó para la
bebida de malta.
Seguido de esto se tomaron las URL para cada una de las muestras inoculadas y se
procedió a realizar las respectivas siembras microbiológicas relacionadas a
continuación:
MICROORGANISMOMICROORGANISMO TECNICATECNICA AGARAGAR TEMP °CTEMP °C TIEMPOTIEMPO
Mesófilos Profundidad Plate Count 37°C 24-48 h
Mohos y Levaduras Profundidad PDA 25°C 3-5 días
Tabla 9. Análisis microbiológico de refrescos de fruta.Tabla 9. Análisis microbiológico de refrescos de fruta. Fuente: Las autorasFuente: Las autoras ..
MICROORGANISMOMICROORGANISMO TECNICATECNICA AGARAGAR TEMP °CTEMP °C TIEMPOTIEMPO
Mesófilos Profundidad SDA 37°C 24-48 h
Mohos y Levaduras Profundidad PDA 25°C 3-5 días
Tabla 10. Análisis microbiológico de bebida de malta.Tabla 10. Análisis microbiológico de bebida de malta. Fuente: Las autoras.Fuente: Las autoras.
5.2.1.25.2.1.2 PRUEBA FINALPRUEBA FINAL
A partir del tamaño muestral deducido por análisis estadístico de la prueba piloto, se
realizaron pruebas paralelas de bioluminiscencia y recuento en placa a los productos
en estudio induciendo contaminación con el mismo inoculo utilizado en la prueba
inicial (piloto) y realizando los siguientes recuentos de contaminación en placa a lo
largo de doce horas con un intervalo de 2 horas para cada medición:
MICROORGANISMOMICROORGANISMO TECNICATECNICA AGARAGAR TEMP °CTEMP °C TIEMPOTIEMPO
Mesófilos Profundidad Plate Count 37°C 24-48 h
Mohos y Levaduras Profundidad PDA 25°C 3-5 días
Tabla 11. Análisis microbiológico de refrescos.Tabla 11. Análisis microbiológico de refrescos. Fuente: Las autoras.Fuente: Las autoras.
MICROORGANISMOMICROORGANISMO TECNICATECNICA AGARAGAR TEMP °CTEMP °C TIEMPOTIEMPO
Mesófilos Profundidad SDA 37°C 24-48 h
Mohos y Levaduras Profundidad PDA 25°C 3-5 días
Tabla 12. Análisis microbiológico Tabla 12. Análisis microbiológico de bebida de malta.de bebida de malta. Fuente: Las autoras.Fuente: Las autoras.
Para la técnica de bioluminiscencia se midieron las Unidades Relativas de Luz (URL)
correspondientes al grado de contaminación inducido en los diferentes productos
(bebida de malta y jugos).
Se realizaron las respectivas replicas de acuerdo a los resultados dados por el análisis
estadístico.
5.35.3 CRIOCONSERVACIÓN CRIOCONSERVACIÓN
Una vez identificados y caracterizados los microorganismos a partir de la utilización de
pruebas rápidas de identificación API para bacterias y levaduras y Método de la cinta
para Mohos , se realizó una crioconservación con el fin de tener el inoculo puro y con
una concentración constante, para posteriormente ser utilizado en las pruebas a
realizar.
1. Se suspendió una colonia aislada de cada microorganismo en 30 ml de caldo de
cultivo específico.
2. se mezclaron 30 ml del caldo de cultivo estéril con glicerol al 60% con 30 ml de
caldo de cultivo + el inoculó y se agitó por 2 minutos.
3. De la suspensión anterior se agregó 1 ml a cada tubo Eppendorf (60 tubos)
4. Se llevó a un congelador a –35°C.
Entonces:
(30 ml de caldo + glicerol) +( 30 ml de caldo + inoculo)= 60 ml x 60 / 99% pureza del
glicerol = Cantidad de glicerol a agregar. (Amador, 1994)
Para controlar el método de crioconservación en bacterias se realizaron recuentos en
placa cada dos meses observando la morfología y el número de colonias en el medio
de cultivo especifico y microscópicamente observando la ausencia de
microorganismos contaminantes.
Para las Levaduras se realizaron pruebas de viabilidad y vitalidad para ver la capacidad
de reproducción de la misma así como también recuentos en placa observando la
morfología, el color de la levadura, y el número de UFC.
Para los Mohos se realizo el método de la cinta para observar su morfología y al
mismo tiempo ver contaminación por otros microorganismos y recuento en placa para
ver el número de UFC.
5.4 ANALISIS ESTADÍSTICO5.4 ANALISIS ESTADÍSTICO
El modelo utilizado en este estudio es de tipo experimental caracterizado por la
introducción y manipulación del factor causal o de riesgo para la determinación
posterior del efecto. Para esa manipulación se organizó la muestra en dos grupos: Uno
es el grupo de estudio o experimental y el otro es el grupo control. En el primero se
aplicó la variable independiente o sea el factor de riesgo, para luego medir el efecto o
variable dependiente, solo se mide el efecto. La base del estudio está en comparar este
efecto en ambos grupos. (Pineda, 1997).
66 RESULTADOS Y DISCUSIONRESULTADOS Y DISCUSION
6.16.1 COMPORTAMIEN COMPORTAMIENTO MICROBIOLOGICO A TRAVES DEL TIEMPOTO MICROBIOLOGICO A TRAVES DEL TIEMPO
Las siguientes gráficas muestran los resultados obtenidos a partir del comportamiento
de los microorganismos a través del tiempo en los productos en estudio,
representadas en las unidades correspondientes a cada técnica: Unidades Formadoras
de Colonia (UFC) y Unidades Relativas de Luz (URL).
• ESTADISTICAESTADISTICA
Prueba t para B:Prueba t para B: Modelo de regresión simple.
γγ = = αα + + ββ x + e x + e
Donde:
γγ = = Valor típico de una de las poblaciones
αα y ββ = Coeficientes de regresión de la población. Geométricamente representan la
ordenada al origen y la pendiente de la recta.
ee = = Término de error.
HipótesisHipótesis
Ho: El promedio obtenido de los recuentos a través del tiempo son iguales.
Hi: El promedio obtenido de los recuentos a través del tiempo es diferente.
Si p < 0.05 se rechaza la Ho
Si p > 0.05 se acepta la Ho
ù Gráfica 1 y 2. Refresco de naranja + Gráfica 1 y 2. Refresco de naranja + B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s (UFC) (UFC) Y Y
(URL). (URL).
y = 14 + 0.05x y = 6.66 + 0.06x p = 0.06 p = 0.01 Ho = acepta Ho = rechaza
ù Gráfica 3 y 4. Refresco de naranja + Gráfica 3 y 4. Refresco de naranja + R h o d o t o r u l a s p R h o d o t o r u l a s p (UFC) Y (URL)(UFC) Y (URL)
N +B
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO (HORAS)
UF
CN + B
6
6,2
6,4
6,6
6,8
7
7,2
7,4
0 2 4 6 8 10 12TIEMPO (HORAS)
UR
L
N + L
6,2
6,36,4
6,56,66,7
6,8
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO (HORAS)
UR
L
N + L
0
10
20
30
40
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO (HORAS)
UFC
y = 31.3 + 0.30x y = 6.38 + 0.02x p = 0.48 p = 0.02 Ho = Acepta Ho = Rechaza
ù Gráfica 5 y 6 . Refresco de naranja + Gráfica 5 y 6 . Refresco de naranja + P e n i c i l l i u m s pP e n i c i l l i u m s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 26.2 + 0.25x y = 6.94 + 0.01x p = 0.15 p = 0.008 Ho = Acepta Ho = Rechaza
ù Gráfica 7 y 8. Refresco de mora + Gráfica 7 y 8. Refresco de mora + B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s (UFC) Y (UFC) Y
(URL)(URL)
M + B
2,62,652,7
2,752,8
2,852,9
2,95
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
URL
N + M
13141516171819
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
N + M
6,86,856,9
6,957
7,057,1
7,15
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPOU
RL
y = 16.2 + 0.10x y = 2.72 + 0.01x p = 0.92 p = 0.09 Ho = Acepta Ho = Acepta
ù Gráfica 9 y 10. Refresco de mora + Gráfica 9 y 10. Refresco de mora + R h o d o t o r u l a s pR h o d o t o r u l a s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 30.2 + (-1.57x ) y = 2.7 + 0x p = 0.04 p = error Ho = Rechaza Ho = Acepta ù Gráfica 11 y 12. Refresco de mora + Gráfica 11 y 12. Refresco de mora + P e n i c i l l i u m s pP e n i c i l l i u m s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
M + B
13
14
15
16
17
18
19
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
M + L
0
1
2
3
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
M + M
1515,5
1616,5
1717,5
1818,5
0 2 4 6 8 10 12
UFC
M + M
2,6
2,7
2,8
2,9
3
3,1
3,2
0 2 4 6 8 10 12
UR
L
M + L
0
10
20
30
40
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
y = 16.8 + 0.08x y = 2.87 + 0.01x p = 0.26 p = 2.38 Ho = Acepta Ho = Acepta
ù Gráfica 13 y 14. Refresco de mango + Gráfica 13 y 14. Refresco de mango + B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s (UFC) Y (UFC) Y
(URL)(URL)
y = 21 + (-0.17x) y = 5.39 + 0.06x p = 0.28 p = 0.02 Ho = Acepta Ho = Rechaza ù Gráfica 15 y 16. Refresco de mango + Gráfica 15 y 16. Refresco de mango + R h o d o t o r u l a s pR h o d o t o r u l a s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
M + B
4,64,8
55,25,45,65,8
66,26,4
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
URL
MN + L
05
101520253035
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
MN + L
55,1
5,2
5,35,4
5,5
5,6
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
M + B
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
y = 29.4 + (-1.35x) y = 5.27 + 0.01x p = 0.01 p = 0.13 Ho = rechaza Ho = Acepta
Gráfica 17 y 18. Refresco de mango + Gráfica 17 y 18. Refresco de mango + P e n i c i l l i u m s pP e n i c i l l i u m s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 28.07 + 0.82x y = 5.68 + 0.03x p = 0.06 p = 0.06 Ho = Acepta Ho = Acepta
ù Gráfica 19 y 20. Refresco de durazno + Gráfica 19 y 20. Refresco de durazno + B a c iB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i sl l u s l i c h e n i f o r m i s (UFC) (UFC)
D + B
0
10
20
30
40
50
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
D + B
5
5,25,4
5,65,8
66,2
6,4
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
MN + M
05
101520253035
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
MN + M
0
10
20
30
40
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
URL
Y (URL)Y (URL)
y = 41.3 + (- 2.03x) y = 5.46 + 0.06x p = 0.009 p = 0.0004 Ho = Rechaza Ho = Rechaza
ù Gráfica 21 y 22. Refresco de durazno + Gráfica 21 y 22. Refresco de durazno + R h o d o t o r u l a s pR h o d o t o r u l a s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 19.8 + (-0.98x) y = 5.63 + 0.02x p = 0.01 p = 0.03 Ho = Rechaza Ho = Rechaza
ù Gráfica 23 y 24. Refresco de durazno + Gráfica 23 y 24. Refresco de durazno + P e n i c i l l i u m s pP e n i c i l l i u m s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 84.8 + (-0.44x) y = 28.07 + (-0.82x) p = 0.17 p = 0.06 Ho = Acepta Ho = Acepta
D + L
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
D + L
5,45,55,65,75,85,9
66,1
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
D + M
70
75
80
85
90
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
D + M
0
123456
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
ù GrGráfica 25 y 26. Bebida de malta + áfica 25 y 26. Bebida de malta + L a c t o b a c i l l u s s pL a c t o b a c i l l u s s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
y = 23.75 + 0.66x y = 2.14 + 0.001x p = 0.0007 p = 0.89 Ho = Rechaza Ho = Acepta
ù Gráfica 27 y 28. Bebida de malta + Gráfica 27 y 28. Bebida de malta + H a n s e n u l a s pH a n s e n u l a s p (UFC) Y (URL) (UFC) Y (URL)
BM + B
0
10
20
30
40
0 2 4 6 8 10 12TIEMPO
UFC
BM + B
1,8
1,9
2
2,1
2,2
2,3
2,4
0 2 4 6 8 10 12TIEMPO
UR
L
BM + L
05
10
15
2025
3035
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
BM + L
3
3,1
3,2
3,3
3,4
3,5
3,6
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
y = 29.9 + (-1.39x) y = 3.22 + 0.021x p = 0.01 p = 0.02 Ho = Rechaza Ho = Rechaza
ù Gráfica 29 y 30. Bebida de malta + Gráfica 29 y 30. Bebida de malta + P e n i c i l l i u m s p P e n i c i l l i u m s p (UFC) Y (URL)(UFC) Y (URL)
y = 70.2 + (-0.35x) y = 2.61 +(-0.001x) p = 0.71 p = 0.88 Ho = Acepta Ho = Acepta
BM + M
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UFC
BM + M
2,2
2,3
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
UR
L
6.2 PRUEBA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA 6.2 PRUEBA PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA
TÉCNICA DE BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA TÉCNICA DE BIOLUMINISCENCIA FRENTE AL RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA
PARA REFRESCOS DE FRUTA Y BEBIDAS DE MALTAPARA REFRESCOS DE FRUTA Y BEBIDAS DE MALTA
• ESTADÍSTICAESTADÍSTICA
La sensibilidad de un método puede definirse como la proporción de los
microorganismos buscados que pueden desarrollarse en las condiciones de la prueba y
mostrar reacciones características. (Doyle, 2001)
SensibilidadSensibilidad = Positivos verdaderos (PV)
Positivos verdaderos (PV)+ Falsos negativos (FN)
La especificidad se refleja en la proporción de microorganismos no buscados que
muestran dichas reacciones. (Doyle, 2001)
EspecificidadEspecificidad = Negativos verdaderos (NV)
Negativos verdaderos (NV) + Falsos negativos (FP)
vv REFRESCO DE NARANJA CON BACTERIAREFRESCO DE NARANJA CON BACTERIA
Refresco + Bact. Refresco – Bact
Mayor de 6.5 (+) 65 1
< 6.5 (-) 5 9
80
65 S = = 0.92 x 100 = 92%
65 + 5 9 E = = 0.9 x 100 = 90% 9 + 1
vv REFRESCO DE NARANJA CON LEVADURAREFRESCO DE NARANJA CON LEVADURA
Refresco +Lev. Refresco – Lev
Mayor de 6.3(+) 62 1
< 6.3 (-) 8 9
80
62 S = = 0.88 x 100 = 88% 62 + 8
9 E = = 0.9 x 100 = 90% 9 + 1
vv REFRESCO DE NARANJA CON MOHOREFRESCO DE NARANJA CON MOHO
Refresco + Moho Refresco – Moho
Mayor de 7.0(+) 112 2
< 7.0 (-) 70 24
208
112
S = = 0.61 x 100 = 61% 112 + 70
24 E = = 0.92 x 100 = 92% 24 + 2
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede decir que existe una probabilidad del
81.25% para hallar bacterias y de un 77.25% para hallar levaduras en un total de 80
muestras; mientras que la probabilidad para hallar mohos es del 53.8% en 208
muestras analizadas en refresco de naranja.
vv REFRESCO DE MORA CON BACTERIAREFRESCO DE MORA CON BACTERIA
Refresco + Bact. Refresco – Bact
Mayor de 2.7 (+) 50 3
< 2.6 (-) 20 7
80
50 S = = 0.71 x 100 = 71% 50 + 20
7 E = = 0.7 x 100 = 70% 7 + 3
vv REFREREFRESCO DE MORA CON LEVADURASCO DE MORA CON LEVADURA
Refresco + Lev.. Refresco – Lev.
Mayor de 2.6 (+) 80 2
< 2.6 (-) 4 10
96
80 S = = 0.95 x 100 = 95% 80 + 4
10 E = = 0.83 x 100 = 83% 10 + 2
vv REFRESCO DE MORA CON MOHOREFRESCO DE MORA CON MOHO
Refresco + Moho Refresco – Moho
Mayor de 2.7 (+) 199 4
< 2.7 (-) 22 31
256
199 S = = 0.9 x 100 = 90% 199 + 22
31 E = = 0.88 x 100 = 88% 31 + 4
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede decir que existe una probabilidad del
65.5% para hallar bacterias en 80 muestras, de un 83.3% para hallar levaduras en un
total de 96 muestras y que la probabilidad para hallar mohos es del 77.7% en 256
muestras analizadas en refresco de mora.
vv REFRESCOREFRESCO DE MANGO CON BACTERIA DE MANGO CON BACTERIA
Refresco + Bact. Refresco – Bact
Mayor de 5.6 (+) 56 1
< 5.6 (-) 14 9
80
56 S = = 0.8 x 100 = 80% 56+ 14
9 E = = 0.9 x 100 = 90% 9 + 1
vv REFRESCO DE MANGO CON LEVADURAREFRESCO DE MANGO CON LEVADURA
Refresco + Lev. Refresco – Lev.
Mayor de 5.1 (+) 67 3
< 5.1 (-) 3 7
80
67 S = = 0.95 x 100 = 95% 67 + 3
7 E = = 0.7 x 100 = 70% 7 + 3
vv REFRESCO DE MANGO CON MOHOREFRESCO DE MANGO CON MOHO
Refresco + Moho Refresco – Moho
Mayor de 6.1 (+) 74 2
< 6.1 (-) 143 29
248
74 S = = 0.34 x 100 = 34% 74 + 143
29 E = = 0.93 x 100 = 93% 29 + 2
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede decir que existe una probabilidad del
70% para hallar bacterias y de un 83.75% para hallar levaduras en un total de 80
muestras; mientras que la probabilidad para hallar mohos es del 29.83% en 248
muestras analizadas en refresco de mango.
vv REFRESCO DE DURAZNO CON BACTERIAREFRESCO DE DURAZNO CON BACTERIA
Refresco + Bact. Refresco – Bact.
Mayor de 5.4 (+) 65 1
< 5.4 (-) 5 9
80
65 S = = 0.92 x 100 = 92% 65 + 5
9 E = = 0.9 x 100 = 90% 9 + 1
vv REFRESCO DE DURAZNO CON LEVADURAREFRESCO DE DURAZNO CON LEVADURA
Refresco + Lev. Refresco – Lev.
Mayor de 5.5 (+) 67 1
< 5.5 (-) 3 9
80
67 S = = 0.95 x 100 = 95%
67 + 3
9 E = = 0.9 x 100 = 90% 9 + 1
vv REFRESCO DE DURAZNO CON MOHOREFRESCO DE DURAZNO CON MOHO
Refresco + Moho Refresco – Moho
Mayor de 5.1 (+) 31 2
< 5.1 (-) 39 8
80
31 S = = 0.44 x 100 = 44% 31 + 39
8 E = = 0.8 x 100 = 80% 8 + 2
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede decir que existe una probabilidad del
81.25% para hallar bacterias, de un 87.75% para hallar levaduras y que la probabilidad
para hallar mohos es del 38.75 % en 80 muestras analizadas en refresco de durazno.
vv BEBIDA DE MALTA CON BACTERIABEBIDA DE MALTA CON BACTERIA
Malta + Bact. Malta – Bact
Mayor de 2.4
(+)
13 2
< 2.4 (-) 48 7
80
13 S = = 0.2 x 100 = 20% 13 + 48
7 E = = 0.77 x 100 = 77% 7 + 2
vv BEBIDA DE MALTA CON LEVADURABEBIDA DE MALTA CON LEVADURA
Refresco + Lev. Refresco – Lev.
Mayor de 3.1 (+) 68 2
< 3.1 (-) 2 8
80
68 S = = 0.97 x 100 = 97% 68 + 2
8 E = = 0.8 x 100 = 80% 8 + 2
vv BEBIDA DE MALTA CON MOHOBEBIDA DE MALTA CON MOHO
Refresco + Moho Refresco – Moho
Mayor de 2.4 (+) 58 4
<2.4 (-) 12 6
80
58 S = = 0.82 x 100 = 82% 58 +12
6 E = = 0.6 x 100 = 60% 6 + 4
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede decir que existe una probabilidad del
16.25% para hallar bacterias, de un 85% para hallar levaduras y que la probabilidad
para hallar mohos es del 72.5 % en 80 muestras analizadas en bebida de malta.
PRODUCTO + PRODUCTO + MICROORGANISMOMICROORGANISMO
PROBABILIDAD DE PROBABILIDAD DE HALLAZGO PARA URL (%)HALLAZGO PARA URL (%)
Refresco naranja + Bacteria 81.25 Refresco naranja + Levadura 77.25 Refresco naranja + Moho 53.8 Refresco mora + Bacteria 65.5 Refresco mora + Levadura 83.3 Refresco mora + Moho 77.7 Refresco mango + Bacteria 70 Refresco mango + Levadura 83.75 Refresco mango + Moho 29.83 Refresco durazno + Bacteria 81.25 Refresco durazno + Levadura 87.75 Refresco durazno + Moho 38.75 Bebida de malta + Bacteria 16.25 Bebida de malta + Levadura 85 Bebida de malta + Moho 72.5
Tabla 13. Probabilidad de hallazgo de microorganismos para laTabla 13. Probabilidad de hallazgo de microorganismos para la Técnica de Técnica de BioluminiscenciaBioluminiscencia
Los resultados obtenidos ( ver tablas de curvas de crecimiento) aplicando la técnica de
Recuento Estándar en Placa permiten conocer la sensibilidad y especificidad de la
técnica debido a que todos los recuentos para los diferentes microorganismos fueron
positivos. Este resultado pudo ser originado a partir del medio de cultivo especifico
utilizado para cada tipo de microorganismo el cual proporciona los nutrientes y las
condiciones requeridas para su óptimo desarrollo. Sin embargo, la población
inicialmente inoculada se vio afectada por diferentes factores tales como pH,
conservantes, saborizantes, estabilizantes y propiedades típicas de las frutas y de las
bebidas de malta que provocaron tanto la disminución como el aumento de la
población microbiana a lo largo del tiempo. Otra posible explicación a este fenómeno
(disminución y aumento de la población) puede ser que los microorganismos lleguen a
la fase críptica (conocida como la fase en donde en ausencia o disminución de
nutrientes, el microorganismo comienza a esporular para sobrevivir), originándose un
cambio en la curva de crecimiento.
Teniendo en cuenta las variaciones presentadas en la población los recuentos
obtenidos fueron:
PRODUCTO + PRODUCTO +
MICROORGANISMOMICROORGANISMO
RECUENTO ESTANDARRECUENTO ESTANDAR EN EN
PLACA (UFC/ml )PLACA (UFC/ml )
Refresco naranja + Bacteria 8 – 23
Refresco naranja + Levadura 19 – 53
Refresco naranja + Moho 10 – 91
Refresco mora + Bacteria 3 – 26
Refresco mora + Levadura 7 – 26
Refresco mora + Moho 2 – 38
Refresco mango + Bacteria 4 – 31
Refresco mango + Levadura 8 – 37
Refresco mango + Moho 1 – 100
Refresco durazno + Bacteria 6 – 120
Refresco durazno + Levadura 7 – 26
Refresco durazno + Moho 57 – 106
Rango Tota lRango Tota l 1 1 –– 120 120
Bebida de malta + Bacteria 20 – 39
Bebida de malta + Levadura 8 – 37
Bebida de malta + Moho 39 – 108
Rango tota lRango tota l 8 8 –– 108 108
Tabla 14. Rangos de UFC de productos en estudio Tabla 14. Rangos de UFC de productos en estudio
En esta tabla se expresan los rangos obtenidos a partir de las curvas de crecimiento
realizadas a lo largo del estudio. Las unidades utilizadas para estimar estos rangos
están dadas en Unidades Formadoras de Colonia por mililitro.
6.3 LÍMITES DE CONFIANZA PARA LA MEDIA DE UNA POBLACIÓN 6.3 LÍMITES DE CONFIANZA PARA LA MEDIA DE UNA POBLACIÓN
REPRESENTADA EN UFC Y URLREPRESENTADA EN UFC Y URL
La manera más informativa de cuantificar el error aleatorio es construir intervalos
(límites) de confianza de acuerdo a los resultados de la prueba. Los intervalos de
confianza permiten al lector observar el intervalo de valores compatible con los
resultados obtenidos, pudiéndolo comparar con el de otras pruebas. (Stephen, 1990)
Con base en el conocimiento adquirido acerca de la distribución normal, en general, se
sabe aún más sobre la distribución X X para este caso. Por ejemplo, se sabe que sin
importar donde se localiza, aproximadamente el 95% de los valores de X X que
constituyen la distribución, están a +/- 2 desviaciones estándar respecto a la media de
modo que el intervalo contiene aproximadamente el 95% de los valores posibles de X. X.
(Daniel, 1996)
Aplicando la siguiente formula se obtuvieron los siguientes resultados:
µµ = = X +/X +/-- t x s t x s NN Producto + microorganismoProducto + microorganismo URL/100microlitrosURL/100microlitros UFC/mlUFC/ml
Refresco naranja + Bacteria 6.66 < µ < 7.23 14.2 < µ < .19.8
Refresco naranja + Levadura 6.30 < µ < 6.69 29.2 < µ < 36.9
Refresco naranja + Moho 6.83 < µ < 7.26 26.0 < µ < 29.3
Refresco mora + Bacteria 2.55 < µ < 3.04 15.7 < µ < 17.9
Refresco mora + Levadura 2.12 < µ < 3.38 12.6 < µ < 29.0
Refresco mora + Moho 2.80 < µ < 3.19 16.7 < µ < 18.1
Refresco mango + Bacteria 5.57 < µ < 6.02 18.4 < µ < 21.5
Refresco mango + Levadura 5.20 < µ < 5.59 14.8 < µ < 27.5
Refresco mango + Moho 5.60 < µ < 6.08 18.5 < µ < 27.6
Refresco durazno + Bacteria 5.60 < µ < 6.06 19.7 < µ < 38.3
Refresco durazno + Levadura 5.56 < µ < 5.94 9.37 < µ < 18.6
Refresco durazno + Moho 5.30 < µ < 5.45 79.0 < µ < 85.2
Bebida Malta + Bacteria 1.99 < µ < 2.40 24.9 < µ < 30.5
Bebida Malta + Levadura 3.26 < µ < 3.63 15.1 < µ < 27.9
Bebida Malta + Moho 2.40 < µ < 2.79 59.7 < µ < 76.5
Tabla 15. Limites de confianza para la media de la población en estudio.Tabla 15. Limites de confianza para la media de la población en estudio.
Los datos expresados en Unidades Relativas de Luz (URL) y Unidades formadoras de
Colonia (UFC) muestran los rangos obtenidos a partir de análisis estadístico realizado,
dando como resultado la equivalencia de unidades UFC con las URL. Esta tabla se
relaciona con datos obtenidos en el numeral 6.2 en donde se establecen las
probabilidades para la confiabilidad de la técnica de bioluminiscencia y su equivalencia
en UFC. Ejemplo: Si tomamos una muestra de refresco de mango alterado y la
analizamos en el luminómetro y nos da como resultado 5.6 URL podemos decir que
existe un 70% de probabilidad que la contaminación sea originada por bacterias o del
29.8% que sea originada por mohos. Esto viene establecido de acuerdo a las URL
obtenidas y clasificadas en la tabla anterior
6.4 TABLAS DE RESULTADOS CURVAS DE CRECIMIENTO6.4 TABLAS DE RESULTADOS CURVAS DE CRECIMIENTO
DATOS DE LOS RECUENTOS EN PLACA Y UNIDADES RELATIVAS DE LUZ DATOS DE LOS RECUENTOS EN PLACA Y UNIDADES RELATIVAS DE LUZ OBTENIDOS DE LAS CURVAS DE CRECIMIEOBTENIDOS DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO.NTO. Los datos presentados a continuación son el resultado de las curvas de crecimiento
realizadas para cada producto en estudio a lo largo de 12 horas con un intervalo de
toma de muestra de dos horas. Las tablas se resumen a continuación así:
- RSI: Refresco sin inocular. Es el que no tiene el microorganismo .
- URL: Unidades Relativas de Luz. Unidades en las que mide el ATP presente el
luminómetro.
- UFC: Unidades Formadoras de Colonia. Unidades para el Recuento en Placa.
- R ó BM + B: Refresco ó bebida de Malta + Bacteria.
- R ó BM + L: Refresco ó Bebida de Malta + Levadura.
- R ó BM + M: Refresco ó Bebida de Malta + Moho.
- Rango: Numero entre el cual oscila el crecimiento del microorganismo expresado
en UFC y URL.
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO B a c i l l u s l i c h e n iB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s f o r m i s Sobre refresco de naranja UHT(10)Sobre refresco de naranja UHT(10)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,5 6,7 7,1 7,3 7,5 7,4 7 0 UFCUFC 17 8 9 13 18 20 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,6 6,8 7,1 7,2 7,4 7,2 7,3 0 UFCUFC 8 8 16 14 11 15 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,5 6,6 6,6 7,2 7,3 7,4 7,2 0 UFCUFC 14 17 16 18 21 15 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,6 6,7 7,1 7,2 7,3 7,4 7,3 0 UFCUFC 13 15 13 14 17 21 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,5 6,6 7,2 7,4 7 7,1 7,2 0 UFCUFC 16 18 13 18 16 21 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,6 6,6 7,1 7,3 7,4 7,3 7,3 0 UFCUFC 12 18 16 18 16 22 21
R S I R S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,7 6,8 7,1 7,2 7,3 7,4 7,1 0 UFCUFC 12 15 18 10 15 17 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,6 6,5 7,1 7,2 7,3 7,3 7,1 0 UFCUFC 12 21 14 14 18 20 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,7 6,8 7,1 7,2 7,3 7,1 7,1 0 UFCUFC 14 14 17 14 13 18 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,5 URLURL 6,5 6,6 7,1 7,2 7,3 7,1 7,2 0 UFCUFC 16 15 12 18 16 20 13
R S IR S I R + BR + B R + BR + B
URLURL URUR LL UFCUFC
6,5 6,5 14 - 21 6,5-7,4=8-23UFC 6,6 8 - 18 <6,5= O UFC 6,7 8 - 15
6,8 8 - 15
7,1 9 - 23
7,2 10 - 23
7,3 13 - 23
7,4 11 - 21
RangoRango 6,56,5 --7,47,4 8 8 -- 23 23
CURVAS DE CRECIMIENTOCURVAS DE CRECIMIENTO B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s Sobre refrSobre refresco de mora UHT(10)esco de mora UHT(10)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,6 2,8 2,8 2,7 2,8 2,7 2,7 0 UFCUFC 9 24 3 19 17 10 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 2,7 2,8 2,8 2,8 2,9 2,8 2,9 0 UFCUFC 22 15 24 12 14 15 17
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,7 2,9 2,8 2,9 2,8 2,8 0 UFCUFC 12 10 13 17 15 18 11
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 2,7 2,8 2,7 2,8 2,9 2,9 2,7 0 UFCUFC 21 16 13 11 26 21 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,6 2,8 2,8 2,8 2,9 2,9 2,8 0 UFCUFC 25 21 20 17 12 21 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,7 2,8 2,8 2,8 2,7 2,8 0 UFCUFC 15 17 16 17 10 18 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,6 2,7 2,8 2,7 2,9 2,9 2,8 0 UFCUFC 21 18 19 25 15 22 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 2,7 2,8 2,8 2,8 2,9 2,9 0 UFCUFC 13 18 19 14 17 15 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 2,8 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 2,8 0 UFCUFC 19 16 20 20 18 21 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,7 2,8 2,8 2,8 2,9 2,9 0 UFCUFC 22 11 18 22 15 18 22
R S IR S I R + BR + B R + BR + B
URLURL URLURL UFCUFC
2,7-2,8 2,7 9-25 2,7-2,9=3-26 UFC
2,8 3-24 <2.7= 0 UFC
2,9 13-26
RangoRango 2,72,7 --2,92,9 33 --2626
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s Sobre refresco de mango UHT(10)Sobre refresco de mango UHT(10)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 11 22 5,5 URL 5,4 5,4 5,7 5 6 6,2 6,3 0 UFC 18 21 19 15 15 18 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URL 5,3 5,5 5,7 5,8 6 6,1 6,2 0 UFC 15 20 4 20 11 16 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URL 5,7 5,8 5,9 6 6,1 6 6,3 0 UFC 24 21 16 15 18 18 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URL 5,6 5,9 6 6 6,1 6,2 6,2 0 UFC 19 24 25 21 31 28 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URL 5,5 5,7 5,9 6 6,1 6,2 6,2 0 UFC 25 15 28 25 28 30 24
R S IR S I HORAS 0 2 4 6 8 10 12 5,65,6 URLURL 5,45,4 5,55,5 5,65,6 5,85,8 66 6,26,2 6,36,3 0 UFC 24 22 15 17 14 19 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URL 5,3 5,5 5,7 5,8 6 6,1 6,2 0 UFC 29 15 18 24 14 16 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URL 5,7 5,8 5,9 6 6,1 6,2 6,3 0 UFC 17 26 21 25 14 19 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URL 5,6 5,9 5,9 6 6,1 6,1 6 0 UFC 30 18 28 25 10 18 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URL 5,6 5,7 5,9 6 6,2 6,1 6,2 0 UFC 19 27 22 12 15 11 21
R S IR S I R + BR + B R + BR + B URLURL URLURL UFCUFC
5,5-5,6 5,3 15 -29 5,4 18 - 24 5,5 15 - 25 5,3 15 - 19 5,7 4 - 24 5,8 15 - 26 5,9 16 - 28 6 11 - 25 6.1 10 - 31 6.2 15 - 30 5.3-6.3 = 4 –31 UFC
6.3 20 - 21 <5.5=0 UFC
RangoRango 5.35.3 --6.36.3 4 4 -- 31 31
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO
B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s Sobre refresco de durazno UHT(10)Sobre refresco de durazno UHT(10)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,4 5,4 5,6 5,8 6 6,1 6 0 UFCUFC 27 19 14 14 18 20 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,4 5,5 5,7 5,9 6,1 6,2 6,3 0 UFCUFC 30 19 16 14 15 18 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,5 5,6 5,8 6 6,1 6,3 6,2 0 UFCUFC 22 17 30 16 12 20 22
R S R S II HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,6 5,7 5,9 6 6,1 6,3 6,2 0 UFCUFC 108 119 113 96 22 28 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,5 5,6 5,8 6 6,1 6 6,2 0 UFCUFC 24 21 22 32 6 30 25
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,5 5,5 5,7 5,9 6,1 6,3 6,3 0 UFCUFC 18 18 20 13 22 24 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,4 5,4 5,6 5,8 6 6,2 6,3 0 UFCUFC 29 22 21 17 16 18 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,5 5,5 5,7 5,9 6 6,1 6,2 0 UFCUFC 28 22 15 12 27 20 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,5 5,6 5,8 6 6,1 6,3 6,3 0 UFCUFC 120 74 114 26 33 31 28
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,6 5,7 5,9 6 6,1 6,2 6,2
0 UFCUFC 25 19 29 8 6 10 12
R S IR S I R + BR + B R + B R + B URLURL URLURL UFCUFC
5,3-5,4 5,4 19 - 30 5,5 18 - 120 5,6 14 - 108 5,7 15 - 119 5,8 14 - 114 5,9 12 - 113 6 8 - 96 6,1 6 - 33 6,2 10 - 25 6,3 19 - 31 5,4-6,3=6-120 UFC
RangoRango 5,45,4 --6,36,3 66 --120120 <5.3=0 UFC
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO R h o d o t o r u l a s p . R h o d o t o r u l a s p . Sobre refresco de naranja UHT(5)Sobre refresco de naranja UHT(5)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,3 URLURL 6,5 6,6 6,4 6,6 6,8 6,7 6,6 0 UFCUFC 42 32 30 22 53 48 45
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,3 URLURL 6,5 6,6 6,5 6,7 6,7 6,7 6,6 0 UFCUFC 35 24 44 23 46 40 41
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,2 6,3 6,4 6,6 6,7 6,7 6,6 0 UFCUFC 36 39 30 33 29 34 32
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,2 6,3 6,4 6,6 6,6 6,7 6,5 0 UFCUFC 29 33 19 15 30 26 24
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,4 6,5 6,4 6,6 6,8 6,8 6,6 0 UFCUFC 49 35 35 23 35 32 30
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,4 URLURL 6,6 6,6 6,6 6,6 6,7 6,6 6,7 0 UFCUFC 38 30 30 28 37 35 36
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,2 6,3 6,4 6,7 6,8 6,6 6,6 0 UFCUFC 38 35 30 49 26 30 34
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,3 6,3 6,4 6,6 6,6 6,6 6,4 0 UFCUFC 27 34 18 30 43 38 39
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,3 URLURL 6,5 6,6 6,4 6,6 6,8 6,6 6,6 0 UFCUFC 42 37 31 33 43 38 36
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,3 UFCUFC 6,6 6,4 6,6 6,7 6,7 6,6 6,7 0 UFCUFC 39 32 39 29 36 35 38
R S I R + L R S I R + L R + LR + L
URLURL URLURL UFCUFC
6,1-6,3 6,2 29 - 38
6,3 33 - 39 6,2-6,8=19-53 UFC
6,4 19 - 49 <6,3=0 UFC
6,5 24 - 44
6,6 22 - 45
6,7 23 - 49
6,8 26 - 53
RangoRango 6,26,2 --6,86,8 1919 -- 53 53
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO R h o d o t o r u l a . s p . R h o d o t o r u l a . s p . Sobre refresco de mora UHT(1Sobre refresco de mora UHT(12)2)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 31 18 21 16 10 15 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,6 2,7 2,7 0 UFCUFC 32 27 21 17 11 14 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 47 33 15 12 14 18 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,6 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 38 28 13 19 12 18 16
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,7 2,6 2,7 2,8 2,7 2,8 0 UFCUFC 33 20 12 21 6 14 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 30 20 22 19 16 18 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212
2,6 URLURL 2,7 2,6 2,7 2,7 2,7 2,7 2,8 0 UFCUFC 40 28 14 16 17 16 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 43 34 12 7 23 21 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 41 43 19 21 16 18 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 27 28 25 13 14 16 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,8 2,7 2,7 2,8 0 UFCUFC 44 37 16 9 17 10 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 UFCUFC 36 36 15 18 19 14 10
R S I R + L R S I R + L R + L R + L
URLURL URLURL UFCUFC 2,6 2,7 7 - 47 2,7-2,8=7-26 UFC
2,8 6 - 19 <2,6=0 UFC RangoRango 2,72,7 --2,82,8 7 7 -- 26 26
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO R h o d o t o r u l a . s p . R h o d o t o r u l a . s p . Sobre refresco de mango UHT(6)Sobre refresco de mango UHT(6)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,2 5,3 5,3 5,4 5,5 5,4 5,5 0 UFCUFC 29 22 15 19 22 18 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,3 5,4 5,2 5,4 5,6 5,2 5,4 0 UFCUFC 33 22 15 17 18 20 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,3 5,4 5,4 5,5 5,6 5,3 5,5 0 UFCUFC 37 24 14 8 9 10 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,2 URLURL 5,4 5,4 5,3 5,2 5,4 5,2 5,2 0 UFCUFC 32 30 25 16 13 9 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,3 5,4 5,3 5,4 5,6 5,3 5,5
0 UFCUFC 36 34 20 21 21 20 18 R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,2 5,3 5,2 5,3 5,4 5,1 5,3 0 UFCUFC 35 28 16 22 17 18 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,3 5,4 5,4 5,5 5,7 5,4 5,6 0 UFCUFC 26 31 26 12 11 15 9
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,2 URLURL 5,2 5,3 5,3 5,3 5,4 5,1 5,4 0 UFCUFC 37 32 32 23 16 20 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 5,1 5,3 5,3 5,4 5,5 5,6 5,5 0 UFCUFC 28 37 18 30 21 25 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,2 URLURL 5,3 5,4 5,4 5,5 5,7 5,6 5,7 0 UFCUFC 36 32 19 15 14 18 20
R S IR S I R + LR + L R + LR + L URLURL URLURL UFCUFC 5,1 5,2 12-29 5,2-5,6=8-47 UFC
5,3 13-37 <5,1=0 UFC 5,4 9-32 5,5 8-22 5,6 9-21
RangoRango 5,25,2 --5,65,6 8-37
CURVAS DECURVAS DE CRECIMIENTO CRECIMIENTO R h o d o t o r u l a s p . R h o d o t o r u l a s p . Sobre refresco de durazno UHT(10)Sobre refresco de durazno UHT(10)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,7 5,8 5,7 5,7 5,8 6 5,8 0 UFCUFC 18 20 8 8 13 11 9
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,7 5,8 5,8 5,9 5,9 6,1 5,9 0 UFCUFC 18 20 12 7 8 10 8
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,6 5,7 5,6 5,7 5,8 6 5,6 0 UFCUFC 17 17 17 8 7 9 11
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,6 5,4 5,8 5,8 5,8 6 5,7 0 UFCUFC 25 19 12 13 7 12 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,5 5,7 5,6 5,7 5,8 5,9 5,7 0 UFCUFC 20 20 10 10 12 11 10
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URLURL 5,7 5,8 5,8 5,9 5,9 6,1 5,8 0 UFCUFC 14 18 15 13 9 12 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,7 5,8 5,9 5,8 5,9 6 5,9 0 UFCUFC 22 26 16 13 9 8 10
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,7 5,8 5,9 5,8 5,9 5,7 5,9 0 UFCUFC 18 21 16 9 10 12 14
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,4 5,7 5,7 5,7 5,8 5,7 5,8 0 UFCUFC 21 19 14 7 16 14 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,6 5,7 5,7 5,7 5,8 5,7 5,8 0 UFCUFC 22 23 16 14 10 14 11
R S I R S I R + L R + L R + LR + L URLURL URLURL UFCUFC
5,4-5,5 5,6 10 - 25 5,7 7 - 22 5,6-5,9=7-26 5,8 7 - 26 <5.5=0 UFC 5,9 7 - 16
RangoRango 5,65,6 --5,95,9 7 7 -- 26 26
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO P e n i c i l l i u m s p . P e n i c i l l i u m s p . Sobre refresco de naranja UHT (26)Sobre refresco de naranja UHT (26)
RR S I S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,6 URLURL 6,6 6,6 7 7,1 7,1 6,9 6,9 0 UFCUFC 73 87 63 64 78 43 88
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212
6,6 URLURL 6,7 6,7 6,9 7 7 7 6,9 0 UFCUFC 81 98 58 65 78 54 91
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,7 URLURL 6,9 7 7,1 6,9 6,8 7,1 7,1 0 UFCUFC 25 15 15 25 14 21 13
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 7 URLURL 7,1 7 6,6 7 6,9 7,1 7,1 0 UFCUFC 14 29 29 19 16 32 24
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 7 URLURL 7,1 7 6,6 7 6,9 7,1 7,1 0 UFCUFC 15 26 17 17 20 21 24
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,6 URLURL 6,7 6,7 7 6,9 6,9 6,7 6,6 0 UFCUFC 17 18 18 14 10 11 16
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,6 URLURL 6,7 6,7 7 6,9 6,9 6,7 6,6 0 UFCUFC 20 19 22 19 19 20 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,6 URLURL 6,6 6,6 6,5 6,6 7,1 6,9 7 0 UFCUFC 10 15 17 16 13 18 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,6 URLURL 6,6 6,6 6,5 6,5 6,1 6,9 7 0 UFCUFC 22 16 20 17 17 15 16
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 7 URLURL 7,1 7,1 7,2 7,2 7 6,8 6,9 0 UFCUFC 18 15 24 11 65 85 79
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 7 URLURL 7,1 7 7,3 7,1 6,9 6,9 7 0 UFCUFC 13 16 16 13 16 15 17
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 7 URLURL 7,1 7,2 7,2 7,3 7,4 7,4 7,4 0 UFCUFC 23 27 24 25 20 18 17
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,9 URLURL 7,2 7,1 7,3 7,2 7,3 7,2 7,2 0 UFCUFC 21 24 31 20 21 22 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 7 URLURL 7,1 7,1 7,3 7,3 7,4 7,2 7,2 0 UFCUFC 27 28 35 26 33 30 31
R S IR S I HORHOR ASAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,9 URLURL 7,1 7,2 7,2 7,3 7,1 7,4 7,2 0 UFCUFC 30 48 48 48 50 43 40
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 7,1 URLURL 7,1 7,1 7,1 7,2 7,3 7,4 7,4 0 UFCUFC 17 22 16 13 31 22 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,9 URLURL 7 7 7 7 7,2 7,5 7,4 0 UFCUFC 15 15 15 16 20 22 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,8 URLURL 6,9 7,3 7,2 7,4 7,4 7,1 7,3 0 UFCUFC 21 24 17 23 22 22 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212
6,7 URLURL 6,9 7,3 7,1 7,4 7,4 7 7,1 0 UFCUFC 19 20 21 22 22 22 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,6 URLURL 6,9 7,2 7,2 7,4 7,3 7,1 7,2 0 UFCUFC 21 22 20 20 20 17 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,8 URLURL 6,9 7,3 7,2 7,4 7,4 7,1 7,2 0 UFCUFC 25 28 19 18 20 20 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,7 URLURL 6,9 7,3 7,1 7,4 7,4 7 7,2 0 UFCUFC 20 19 20 22 21 18 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,6 URLURL 6,9 7,2 7,2 7,4 7,3 7,1 7,1 0 UFCUFC 20 20 23 20 20 18 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 7,1 URLURL 7,1 7,2 7,2 7,3 7,1 7,4 7,2 0 UFCUFC 32 50 48 48 56 48 51
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 7 URLURL 7,1 7,2 7,2 7,3 7,4 7,4 7,2 0 UFCUFC 25 22 25 29 21 23 26
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,9 URLURL 7,1 7,3 7,4 7,3 7,4 7,4 7,3 0 UFCUFC 24 23 26 26 24 25 27
R S I R + M R S I R + M R + M R + M URLURL URLURL UFCUFC
6,6-7,0 6,6 15-87 6,7 11-81 6,8 14-85
6,6-7,5=10-91UFC <7,0=0UFC
6,9 10-91 7 13-65 7,1 13-78 7,2 11-56 7,3 16-35 7,4 17-48 7,5 22
RangoRango 6,6-7,5 10 10 -- 91 91
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO P e n i c i l l i u m s p . P e n i c i l l i u m s p . Sobre refresco de mora UHT(31)Sobre refresco de mora UHT(31)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 3,2 3,3 3,2 2,8 2,8 3 2,8 0 UFCUFC 11 21 11 28 32 16 22
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 3,2 3,3 3,2 2,8 2,8 3 3 0 UFCUFC 14 30 13 14 23 25 21
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 3 3,1 3,2 3 3,1 3 2,7 0 UFCUFC 16 24 18 16 22 24 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 11 00 1212 2,7 URLURL 2,9 3 3,2 3,2 3,3 3,1 3,2 0 UFCUFC 10 7 9 11 13 16 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,7 2,8 0 UFCUFC 18 6 12 14 13 16 14
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,7 2,8 0 UFCUFC 10 9 18 11 9 10 10
R S R S II HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 3 3 3 2,8 2,8 2,8 0 UFCUFC 29 22 12 16 13 10 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,9 3 3,2 3 3,3 3,1 3,2 0 UFCUFC 6 7 11 17 14 18 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,9 2,9 3 3 2,9 2,7 2,9 0 UFCUFC 8 6 2 5 4 15 15
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 3,1 3 3,1 3,1 3,1 3 0 UFCUFC 26 29 28 23 23 25 24
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 2,8 3 2,9 3 3 2,9 0 UFCUFC 24 27 26 25 23 24 24
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 3 3,1 3,1 3 3,1 3 0 UFCUFC 21 32 24 26 38 30 34
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 3 2,8 2,9 3,1 3 3,1 0 UFCUFC 8 14 14 15 10 6 9
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 2,9 2,9 3 3,1 3,3 3,2 0 UFCUFC 16 18 18 25 13 7 11
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 3 3,1 3,2 3,3 3,3 3,2
0 UU FCFC 12 13 14 15 9 14 15 R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,9 3,1 3,1 3,2 3,2 3,3 0 UFCUFC 15 20 20 22 25 18 24
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2 URLURL 2,7 2,9 3 3,1 3,2 3,1 3,2 0 UFCUFC 11 17 17 15 13 8 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,9 3,1 3,1 3,2 3 3,3 0 UFCUFC 20 18 14 21 22 10 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 3 3,1 3,2 3,1 2,8 3 0 UFCUFC 8 9 12 17 18 12 16
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,9 2,9 3,1 3,2 3 2,8 2,9 0 UFCUFC 15 19 12 20 18 10 12
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 3 3,2 3,1 2,9 2,7 2,8 0 UFCUFC 19 20 13 17 16 10 14
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,7 2,5 2,5 2,6 2,7 2,9 0 UFCUFC 22 20 28 17 16 16 11
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 3 3 2,9 3 2,8 2,9 0 UFCUFC 18 25 23 17 16 16 11
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 2,8 3,1 2,9 3 3 2,9 0 UFCUFC 23 25 26 26 28 27 25
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 3,1 3 3,1 3,1 3,1 3 0 UFCUFC 9 24 30 26 22 24 25
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 3 3,1 3,1 3 3,1 3,1 0 UFCUFC 21 16 30 24 23 25 25
R R S IS I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 3 2,8 2,9 3,1 3,2 3,3 0 UFCUFC 18 8 10 15 11 13 25
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,8 2,9 2,9 3 3,1 3,3 3,3 0 UFCUFC 16 19 17 17 13 18 25
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,8 2,8 2,8 3,2 3,3 3,3 3,2 0 UFCUFC 7 13 13 12 10 20 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,7 2,9 3,1 3,1 3,2 3,1 3,2 0 UFCUFC 25 18 18 21 20 17 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,9 3 3,1 3,1 3 3,1 0 UFCUFC 10 16 18 18 15 17 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,7 2,9 3,1 3,1 3,2 3 3
0 UFCUFC 21 22 17 20 19 17 18
R S IR S I R + MR + M R + MR + M URLURL URLURL UFCUFC
2,6-2,7 2,7 6-29 2.7-3,3= HASTA 38 UFC 2,8 7-32 < 2.7= 0 UFC 2,9 4-25 3 2-38 3,1 6-30 3,2 9-29 3,3 7-30
RangoRango 2,72,7 --3,33,3 22 --3838
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO P e n i c i l l i u m s p . P e n i c i l l i u m s p . Sobre refresco de mango UHT(31)Sobre refresco de mango UHT(31)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,4 5,3 5,3 5,3 5,5 5,5 5,5 0 UFCUFC 67 83 64 79 45 91 86
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,6 5,4 5,3 5,3 5,6 5,5 5,4 0 UFCUFC 41 100 68 86 66 75 62
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URLURL 6 6 5,8 5,8 5,8 5,7 5,7 0 UFCUFC 19 19 16 28 13 20 20
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,6 URLURL 6 6 5,8 5,8 5,8 5,8 5,9 0 UFCUFC 19 20 21 18 14 27 17
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,5 5,8 5,9 5,4 5,7 5,8 5,7 0 UFCUFC 10 20 21 17 33 37 40
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,7 5,8 6 6,1 5,9 5,8 5,9 0 UFCUFC 10 12 18 22 16 15 16
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,7 5,8 6 6,1 5,9 5,8 5,9 0 UFCUFC 11 15 15 10 9 13 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,9 URLURL 5,9 5,9 6,1 6,1 6,3 6 6,1 0 UFCUFC 12 9 18 15 21 10 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,9 URLURL 5,9 5,9 6,1 6,1 6,3 6 6,1 0 UFCUFC 13 18 15 20 21 11 15
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,1 6,1 6,1 6,1 6,2 6 6,1 0 UFCUFC 7 6 1 4 7 1 1
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212
5,9 URLURL 5,9 5,9 6,1 6,2 6 6,1 6,1 0 UFCUFC 46 32 28 36 28 4 25
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,1 6,1 6,2 6,1 6,2 6 6,1 0 UFCUFC 10 7 10 6 1 1 3
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,9 URLURL 5,9 5,9 6,1 6,2 6 6,1 6,1 0 UFCUFC 38 42 29 41 3 7 32
R S IR S I HOHO RASRAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,2 URLURL 6,2 6 6,3 6,3 6,4 6,4 6,3 0 UFCUFC 38 29 18 23 22 23 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,1 6 6,2 6,3 6,4 6,4 6,2 0 UFCUFC 17 29 26 23 29 24 28
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,2 6,1 6,3 6,3 6,2 6,3 6,2 0 UFCUFC 26 17 31 22 23 22 23
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,2 6 6,3 6,3 6,4 6,4 6,3 0 UFCUFC 14 18 18 18 18 18 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,1 URLURL 6,1 6 6,2 6,3 6,4 6,4 6,4 0 UFCUFC 19 21 30 17 24 21 24
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 6,2 URLURL 6,1 6,1 6,3 6,3 6,2 6,3 6,3 0 UFCUFC 22 28 27 22 30 23 26
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,4 6,1 6 6,1 6,3 6,3 6,1 0 UFCUFC 12 23 18 14 12 18 16
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,5 5,7 6 6,2 6,3 6,1 6,2 0 UFCUFC 24 20 19 18 18 14 19
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,6 5,9 6,1 6,2 6,3 6,1 6,2 0 UFCUFC 15 14 20 16 12 11 14
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,4 6,1 6 6,1 6,3 6,3 6,1 0 UFCUFC 15 19 16 11 17 22 16
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,4 URLURL 5,5 5,7 6 6,2 6,3 6,2 6,2 0 UFCUFC 19 19 15 17 15 16 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,5 URLURL 5,6 5,9 6,1 6,1 6,3 6,1 6,3 0 UFCUFC 15 21 16 18 19 7 14
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,5 6,1 6,4 6,4 6,3 6,1 6,2 0 UFCUFC 15 19 26 17 21 14 18
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,5 6,1 6,4 6,4 6,1 6,1 6,2 0 UFCUFC 11 12 18 19 15 12 14
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212
5,3 URLURL 5,4 6 6,3 6,3 6,1 6 6,1 0 UFCUFC 13 14 14 13 11 5 6
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,5 6,1 6,4 6,4 6,3 6,1 6,2 0 UFCUFC 21 27 21 23 18 10 15
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,5 6,1 6,4 6,4 6,1 6,1 6,2 0 UFCUFC 10 12 18 14 20 10 14
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,3 URLURL 5,4 6 6,3 6,3 6,1 6 6,1 0 UFCUFC 9 10 9 12 11 4 8
R S IR S I R + MR + M R + MR + M URLURL URLURL UFCUFC
5,3-6,1 5,3 68 - 83 5,3-6,4=1-100 UFC 5,4 9 - 100 <6,1=0 UFC 5,5 10 - 91 5,6 41 - 66 5,7 10 - 40 5,8 12 - 37 5,9 9 - 46 6 1 - 28 6,1 1 - 32 6,2 1 - 88 6,3 9 - 36 6,4 18 - 24
RangoRango 5,35,3 --6,46,4 11 --100100
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO P e n i c i l l i u m s p P e n i c i l l i u m s p sobre refresco de sobre refresco de durazno (10)durazno (10)
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5 URLURL 4,9 5 5,2 5,2 5,3 4,2 4,6 0 UFCUFC 78 98 86 84 85 92 96
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 4,2 5 5,2 5,2 5,3 3,5 5 0 UFCUFC 93 81 86 77 69 92 85
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,2 URLURL 4,3 5,1 5,2 5,2 5,3 4,5 4,9 0 UFCUFC 84 66 89 102 66 64 68
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 4,5 5,1 5,2 5,2 5,3 4,1 5,1 0 UFCUFC 74 89 57 79 94 70 84
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5 URLURL 4,4 5,1 5,2 5,2 5,3 4 4,9 0 UFCUFC 106 84 83 90 102 67 74
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212
5 URLURL 4,9 5,1 5,2 5,2 5,3 4,6 5,1 0 UFCUFC 75 80 78 83 83 70 86
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,2 URLURL 4,2 5 5,1 5,2 5,2 4,4 4,7 0 UFCUFC 82 79 75 85 67 97 79
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 4,3 5,1 5,2 5,2 5,3 4,5 5 0 UFCUFC 92 85 70 82 57 70 74
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5 URLURL 4,6 5,2 5,3 5,3 5,3 4,2 5 0 UFCUFC 85 101 93 82 93 69 80
R S IR S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 5,1 URLURL 4,4 5,1 5,2 5,2 5,4 4,5 5,2 0 UFCUFC 85 84 83 90 102 67 90
R S I R + M R S I R + M R + MR + M URLURL URLURL UFCUFC
5,0-5,1 5 66-98 5,0-5,8=57-106 UFC 5,1 57-102 <5,1= 0 UFC 5,2 67-102 5,3 64-106 5,4 57-92 5,5 97-96 5,6 74-92 5,7 79-85 5,8 84-86
RangoRango 5,05,0 --5,85,8 5757 --106106
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO L a c t o b a c i lL a c t o b a c i l l u s s p l u s s p sobre Bebida de Malta (10)sobre Bebida de Malta (10)
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,2 URLURL 2,4 2,5 2,2 2,3 2,1 2,2 2,4 0 UFCUFC 26 24 32 25 24 28 30
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,4 URLURL 2,6 2,6 2,1 2,3 2 2,1 2,2 0 UFCUFC 28 21 25 35 33 32 34
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,2 URLURL 2,6 2,3 1,8 1,9 2,2 2 2,1 0 UFCUFC 28 28 32 34 28 30 31
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,6 URLURL 2,6 2,5 1,9 2,2 2,4 2,3 2,3 0 UFCUFC 28 29 23 34 26 24 27
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212
2,3 URLURL 2,6 2,5 2,2 2,3 2,1 2,2 2,3 0 UFCUFC 26 32 26 31 20 25 26
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,2 URLURL 2,4 2,5 2,3 2,3 2,4 2,3 2,4 0 UFCUFC 26 26 25 31 32 30 34
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,2 URLURL 2,4 2,5 2,1 2,1 2 2,2 2,2 0 UFCUFC 26 28 21 21 31 27 29
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,4 URLURL 2,5 2,6 1,8 1,9 2,2 2,1 2,3 0 UFCUFC 31 26 25 29 35 30 31
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,5 URLURL 2,5 2,4 1,8 1,9 2,4 2,3 2,4 0 UFCUFC 25 26 24 20 38 35 34
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,3 URLURL 2,4 2,5 2,2 2,1 2,1 2,3 2,2 0 UFCUFC 24 29 27 28 39 35 32
BM S IBM S I BM + BBM + B BM + BBM + B URLURL URLURL UFCUFC
2,2-2,4 1,8 24 1.8-2.6=20-39UFC 1,9 23 - 34 <2,4= 0 UFC 2 30 - 33 2,1 20 - 32 2,2 26 - 34 2,3 24 - 39 2,4 24 - 38 2,5 25 - 37 2,6 26 - 28
RangoRango 1.81.8 -- 2.6 2.6 2020 --3939
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO H a n s e n u l a s p . H a n s e n u l a s p . Sobre Bebida de Malta(10)Sobre Bebida de Malta(10)
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 3,1 URLURL 3,1 3,3 3,3 3,4 3,5 3,4 3,5 0 UFCUFC 29 22 15 19 22 18 20
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 3,1 URLURL 3,1 2,9 3,3 3 3,6 3,5 3,4 0 UFCUFC 33 22 15 17 18 20 19
BBM S IM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 3,1 URLURL 3,3 3,4 3,4 3,5 3,6 3,6 3,5 0 UFCUFC 37 24 14 8 9 10 12
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 3,2 URLURL 3,4 2,9 3,3 3,2 3,3 3,4 3,2 0 UFCUFC 32 30 25 16 13 9 12
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 3,1 URLURL 3,3 3,4 2,8 3,4 3,6 3,5 3,5 0 UU FCFC 36 34 20 21 21 20 18
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 3 URLURL 2,9 3,3 3,2 3,3 3,4 3,4 3,3 0 UFCUFC 35 28 16 22 17 18 20
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 3,1 URLURL 3,3 3,4 3,4 3,5 3,7 3,6 3,6 0 UFCUFC 26 31 26 12 11 15 9
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 3,2 URLURL 3,2 3,3 3,3 3,3 3,4 3,4 3,4 0 UFCUFC 37 32 32 23 16 20 21
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 3,1 URLURL 3,2 3,3 3,3 3,4 3,5 3,6 3,5 0 UFCUFC 28 37 18 30 21 25 19
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 3,1 URLURL 3,3 3,4 3,4 3,5 3,7 3,6 3,7 0 UFCUFC 36 32 19 15 14 18 20
BM S I BM + L BM S I BM + L BM + LBM + L URLURL URLURL UFCUFC 3,1 3,2 12-37 3,2-3,7=8-37 UFC
3,3 13-37 <3,1=0 UFC 3,4 9-34 3,5 8-22 3,6 9-25 3,7 11-20
RangoRango 3,23,2 --3,73,7 88 --3737
CURVAS DE CRECIMIENTO CURVAS DE CRECIMIENTO P eP e n i c i l l i u m s p n i c i l l i u m s p sobre Bebida de Malta (10)sobre Bebida de Malta (10)
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,4 URLURL 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,6 2,7 0 UFCUFC 75 67 81 83 70 65 68
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212
2,5 URLURL 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,5 2,6 0 UFCUFC 54 77 71 81 71 66 72
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,4 URLURL 2,4 2,7 2,7 2,7 2,7 2,4 2,5 0 UFCUFC 66 60 55 87 63 64 70
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,7 URLURL 2,5 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,6 0 UFCUFC 77 70 72 90 63 61 74
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,8 URLURL 2,8 2,8 2,8 2,8 2,8 2,6 2,7 0 UFCUFC 58 83 93 91 71 66 74
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 3 URLURL 2,8 2,8 2,8 2,9 2,8 2,5 2,7 0 UFCUFC 79 76 95 108 74 68 65
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,4 URLURL 2,4 2,5 2,7 2,7 2,7 2,3 2,3 0 UFCUFC 53 55 72 94 46 49 52
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,4 URLURL 2,4 2,6 2,7 2,7 2,7 2,3 2,5 0 UFCUFC 84 61 63 90 39 59 64
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,4 URLURL 2,4 2,5 2,6 2,5 2,5 2,4 2,6 0 UFCUFC 67 58 71 94 46 49 68
BM S IBM S I HORASHORAS 00 22 44 66 88 1010 1212 2,4 URLURL 2,4 2,5 2,6 2,5 2,5 2,4 2,4 0 UFCUFC 69 58 48 49 65 52 70
BM S IBM S I BM + MBM + M BM + MBM + M URLURL URLURL UFCUFC 2,4 2,3 49-52 2,3-2,9= 39- 108 UFC
2,4 52-84 <2.4= 0 UFC 2,5 39-90 2,6 48-81 2,7 41-94 2,8 58-95 2,9 108
RangoRango 2,32,3 --2,92,9 3939 --108108
7.7. CONCLUSIONESCONCLUSIONES
1.1. La metodología empleada durante el estudio muestra una alta confiabilidad del
mismo, puesto que permitió la ejecución de los objetivos propuestos.
2.2. El análisis de regresión aplicado a la técnica de Recuento Estándar en Placa
demostró que para los refrescos de fruta el 66.6% de las UFC acepta la Ho lo que
indica que no hay una variación significativa en la población existente a través del
tiempo al igual que en la bebida de malta cuyo porcentaje es el mismo.
3.3. El análisis de regresión aplicado a la técnica de Bioluminiscencia demostró que
para los refrescos de fruta el 50% de las URL acepta la Ho lo que indica que no hay
variación significativa en la población existente a través del tiempo y para la bebida
de malta es de un 66.6% aceptando la Ho.
4.4. De acuerdo a los resultados obtenidos a partir de las pruebas de sensibilidad y
especificidad aplicadas a las dos técnicas en estudio se pudo comprobar que la
técnica de Recuento Estándar en Placa es más sensible y específica que la de
Bioluminiscencia debido a las condiciones óptimas que esta brinda para su
crecimiento y cuantificación.
5.5. Por medio de un análisis de intervalos de confianza se pudo precisar el factor de
correlación de UFC y URL.
6.6. El método de Bioluminiscencia permite obtener resultados en un corto periodo de
tiempo, sin embargo, no especifica cuantitativamente la población microbiana
existente en una muestra determinada debido al ATP no microbiano presente en la
muestra..
7.7. El método de Recuento Estándar en Placa garantiza la obtención de resultados
microbiológicamente confiables de una manera más económica pero con un
periodo de tiempo más prolongado que la técnica de Bioluminiscencia.
8.8. Para la validación de un método analítico es preciso cumplir con los protocolos
internacionales con el fin de asegurar resultados confiables que permitan la
aplicabilidad de la técnica a nivel de la industria alimentaria.
8.8. RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES
ð Para ampliar el nivel de confianza de los resultados obtenidos en ésta investigación
se propone hacer un estudio colaborativo, de acuerdo a las normas de la FAO.
ð Para estudios posteriores se propone utilizar un instrumento de mayor sensibilidad
y especificidad que permita cuantificar la carga microbiana presente en la muestra a
analizar de modo que se evite estimar rangos tan amplios que no diferencien
alteraciones mínimas en el producto.
ð Tener en cuenta, para diseños de tipo experimental en donde se manipula la
muestra en estudio, conocer sus características tales como componentes y
microorganismos que la afectan de manera que los resultados in v i tro sean reales
como los resultados in vivo .
ANEXOSANEXOS
ANEXO 1: MEDIOS DE CULTIVOANEXO 1: MEDIOS DE CULTIVO
i Agar Plate Count (agar Agar Plate Count (agar -- peptona de caseína peptona de caseína –– glucosa glucosa -- extracto de extracto de
levadura)levadura)
Medio de cultivo exento de sustancias inhibidoras y de indicadores, concebido
esencialmente para la determinación del número total de gérmenes en leche,
productos lácteos, aguas y otros materiales.
Composición (g/L): peptona de caseína 5.0, extracto de levadura 2.5, D(+) glucosa 1.0,
agar-agar 14.0.
Preparación: Disolver 22.5 g/L y esterilizar en autoclave.
i Agar PDA (Potato Dextrosa Agar)Agar PDA (Potato Dextrosa Agar)
Para el cultivo, aislamiento y determinación del número de gérmenes de levaduras y
mohos, a partir de alimentos y otros materiales.
Composición (g/L): infusión de patata (a partir de 200g de patata) 4.0, D(+) glucosa
20.0, agar-agar 15.0.
Preparación: Disolver 39 g/L y esterilizar en autoclave.
i Agar SDA (Schwarz Diferencial Agar)Agar SDA (Schwarz Diferencial Agar)
Medio de cultivo específico para la identificación simultanea de microorganismos
aerobios y anaerobios en cervecería. Este medio contiene CaCO3 importante para la
identificación de microorganismos productores de ácido y verde de bromocresol para
el desarrollo del color característico de ciertas colonias de microorganismos.
Al medio se le adiciona Cicloheximida (Actidiona) para inhibir el crecimiento de
levaduras.
Composición (g/L): jugo de tomate sólido 20, leche peptonizada 20, extracto de
levadura 10, glucosa 10, pantoteanato de calcio 2, ácido cítrico monohidrato 1.1,
carbonato de calcio 5.0, K2HPO4 0.5, KH2PO4 0.5, MgSO4 0.2, MnSO4 0.01, FeSO4 0.01,
NaCl 0.01, Tween 80 0.5, verde de bromocresol 0.022, agar-agar 15.
Preparación: pesar 83 g/L, disolver (sin dejar hervir el medio), agregar la actidiona
necesaria en una concentración del 1% al medio que se va a utilizar en anaerobiosis.
Esterilizar en autoclave por 10 minutos a 121 ºC y 15 Lb de presión.
i Caldo Jugo de TomateCaldo Jugo de Tomate
Para el enriquecimiento de levaduras y mohos.
Composición (g/L): jugo de tomate 20, extracto de levadura 10, bactodextrosa 10,
fosfato de dipotasio 0.5, fosfato monopotásico 0.5, sulfato de magnesio 0.2, cloruro
de sodio 0.01, sulfato ferroso 0.01, sulfato de magnesio 0.01.
Preparación: Pesar 41.23 g/L, disolver y llevar al autoclave por 15 minutos a 121 ºC y
15 libras de presión.
i Agua de Peptona UAgua de Peptona Universal (Tamponada)niversal (Tamponada)
Para el enriquecimiento previo no selectivo de bacterias, especialmente de
Enterobacteriaceas patógenas a partir de alimentos y otros materiales.
Composición (g/L):peptona 10.0, cloruro sódico 5.0, tampón de fosfato 10.0.
Preparación: disolver 25.0 g/L y esterilizar en autoclave.
ANEXO 2: BIOQUIMICASANEXO 2: BIOQUIMICAS
i API 50CHBAPI 50CHB
El medio API 50CHB tiene como función la identificación del género Baci l lus y esta
listo para el uso y permite realizar el estudio de fermentación de 49 azúcares de la
galería API 50CH. El microorganismo a estudiar se pone en suspensión en el medio y
después se inocula en cada tubo de la galería. Durante la incubación el catabolismo de
los glúcidos produce ácidos orgánicos que hacen virar el indicador de pH. Los
resultados obtenidos constituyen el perfil bioquímico de la cepa y sirvan para su
identificación o biotipaje.
Normalmente, los resultados obtenidos son suficientes para identificar las bacterias. A
menudo es necesario utilizar los caracteres morfológicos. Los resultados obtenidos en
la galería API 20E son necesarios para la identificación de bacilos con el software
BioMéreux.
i API 20EAPI 20E
API 20E consta de 20 microtubos conteniendo sustratos deshidratados. Estos test se
inoculan con una suspensión bacteriana la cual hidrata el medio. Durante la
incubación, se producen cambios de color espontáneos o revelados por adición de
reactivos.
Los resultados de las reacciones se hacen de acuerdo con la tabla de lectura y la
identificación mediante el API 20E Index o el programa informático para la
identificación de Enterobacterias.
i API 20C AUXAPI 20C AUX
Es un sistema de identificación de levaduras más corrientemente aislada en
microbiología clínica.
La galería API 20C AUX se compone de 20 cúpulas que contienen sustratos
deshidratados que permiten realizar 19 test de asimilación. Las cúpulas son inoculadas
con un medio mínimo semisólido y las levaduras se reproducen solo si son capaces de
utilizar el sustrato correspondiente.
La lectura de estas reacciones se hace por comparación con un control de crecimiento
y la identificación se obtiene mediante el catálogo analítico o un programa informático
de identificación.
i API 50CHL MEDIUMAPI 50CHL MEDIUM
Destinado a la identificación del género Lactobaci l lus y microorganismos próximos,
esta listo al empleo y permite realizar el estudio de fermentación de los 49 azúcares de
la galería API 50CH. El microorganismo por estudiar se pone en suspensión en el medio
y luego se inocula en cada tubo de la galería. Durante la incubación el catabolismo de
los glúcidos produce ácidos orgánicos que hacen virar el indicador del pH. Los
resultados obtenidos constituyen el perfil bioquímico de la cepa y sirven para su
identificación o su biotipaje.
i METODO DE LA CINTAMETODO DE LA CINTA
Es un método rápido para observar microscópicamente los mohos sin alterar el arreglo
de sus conidias .
1. Se coloca 1 gota de azul de lactofenol sobre una lamina.
2. Se cortan 3 cm de cinta transparente.
3. Se coloca la parte pegajosa de la cinta sobre una colonia crecida y se hace presión.
4. Se coloca la cinta sobre la gota de azul de lactofenol evitando la formación de
burbujas.
5. Se observa la preparación al microscopio con objetivo 40X.(Arango, 1998)
ANEXO 3: UTILIZACION DEL LUMINOMETROANEXO 3: UTILIZACION DEL LUMINOMETRO
i Almacenamiento: los dispositivos de hisopo (swab) deben refrigerarse a una
temperatura de 2 a 7 ºC. Los hisopos que no se utilicen deben ser retornados a las
bolsas de papel metálico con cierre y colocados nuevamente bajo refrigeración. Los
hisopos pueden ser utilizados directamente del refrigerador y pueden conservarse a
temperatura ambiente hasta 25 ºC, mientras se estén utilizando. Estos dispositivos
pueden conservarse a temperaturas de hasta 35 ºC por un periodo máximo de 1
hora.
i Procedimiento de la prueba:
- Paso 1: con ayuda de la micropipeta tome 100 microlitros de la muestra a analizar.
Retire la parte superior del dispositivo de hisopo (compuesta por bombilla e
hisopo). La punta del hisopo tiene que estar húmeda (agente humectante que libera
el ATP de la muestra) e introduzca la muestra tomada.
- Paso 2: reintroduzca el hisopo en el dispositivo, girándolo para que quede sellado.
El dispositivo sin activar permanece estable durante 1 hora para la mayoría de los
productos después de tomar la muestra.
- Paso 3: para activar el dispositivo, manténgalo en posición vertical. Tomando el
hisopo en la parte superior con una mano presione la parte inferior del dispositivo
firmemente tan rápido como sea posible, forzando el hisopo para romper la
película selladora.
- Paso 4: Doble la bombilla hacia un lado para romper la válvula interior. Al romperse
esta se escuchará un sonido característico. Presione la bombilla varias veces para
vaciar la cámara de todo tamponador visible. El tamponador se escurrirá a través
del tubo del hisopo y eliminará la muestra de la punta del hisopo dentro de la
cámara de lectura. La solución tamponadora elimina el ATP de la punta del hisopo,
neutraliza y diluye los químicos que interfieren y reconstituye los reactivos de
luciferasa.
- Paso 5: agite el hisopo como si fuera un termómetro para disolver el granulo de
luciferin-luciferasa (reacción bioluminiscente) y mezclarlo con el líquido. Los
gránulos desecantes permanecerán intactos y serán visibles en la parte inferior del
dispositivo.
- Paso 6: introduzca el hisopo de inmediato en el luminómetro y lea el resultado. Los
resultados deben leerse a más tardar 1 minuto después de la activación.
NOTA: Todo valor inferior a una lectura de zona de 1.0 indica que el hisopo no ha sido
introducido correctamente en el luminómetro, vuelva a insertarlo y no espere más de 1
minuto para leer el resultado.
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