DETECCIÓN DE METABOLITOS DE DROGAS DE ABUSO POR CROMATOGRAFÍA DE GASES

ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Ernesto Bernal MoralesErnesto Bernal MoralesP.G.J. del Estado de MéxicoP.G.J. del Estado de México

DEFINICIÓN DE DROGA DE ABUSO

“Bajo el nombre genérico de drogas de abuso se pueden incluir una larguísima lista de sustancias químicas de diverso origen que pueden ser susceptibles de consumo con fines no terapéuticos”

Gisbert Calabuig “Medicina Legal y Toxiologia Ed. Masson Barcelona 2001

CLASIFICACIÓN DE DROGAS DE ABUSO

Alcohol etílicoOpiáceos InhalantesCocaínaAnfetaminas y sustancias afinesOtros estimulantes (Café, Khat, etc.)Derivados de la Cannabis SativaAlucinógenos (PCP, LSD, etc.)Hipnóticos y ansiolíticosTabaco

EFECTOS FARMACOLÓGICOS

Compuestos psicoactivos Estimulantes (cocaína, anfetaminas) Depresores (alcohol etílico) Narcóticos (opiáceos) Alucinógenos (Cannabis sativa, PCP, LSD)

ÁREAS DE APLICACIÓN DE LA TOXICOLOGÍA FORENSE Y EL ANÁLISIS DE DROGAS

Medico Legal Postmortem – Causa y modo de la muerte Identificar personas que manejan bajo la

influencia de drogas (DUI y DUID) Correccionales, fianza, etc.

Laboral Programas públicos y privados para la detección

de drogas en empleados Deporte

Juegos Olímpicos, Tour de France, etc.

FUNCIONES DE LA TOXICOLOGÍA FORENSE

Identificación de un agente lesivoSustancias que produzcan una

alteración psíquica pasajera o permanente

Intoxicación como circunstancia calificadora de un delito

Intoxicación como delito Intoxicación como estado peligroso

INVESTIGACIÓN TOXICOLÓGICA

Es el conjunto de procesos analíticos que tienen por objeto el aislamiento, identificación y determinación cualitativa o cuantitativa de los tóxicos tanto en vivo como en el cadáver, con el fin de permitir el diagnostico de intoxicación y el esclarecimiento de los hechos.

RECOMENDACIONES PATA LA INVESTIGACIÓN TOXICOLÓGICA FORENSE (ORFILA)

Todo los analistas deben de tener experiencia en Toxicología.

El analista debe de recibir la historia completa del caso con toda la información disponible.

Todas las evidencias correctamente etiquetadas y selladas en recipiente limpios deben ser remitidas y analizadas.

Todas las pruebas analíticas deben ser aplicadas.

Los reactivos tendrán que ser puros y tendrán que correrse siempre blancos.

El análisis debe de hacerse por duplicado.

PASOS DE LA INVESTIGACIÓN TOXICOLÓGICA Información Toma de Muestra Procesamiento de la

muestra Aislamiento,

Concentración Hidrólisis, digestión,

desproteinizacion, etc. Diferenciación y

detección Identificación

Comparación datos encontrados con bases de datos de referencia

Cuantificación Interpretación de los

resultados

INFORMACIÓN QUE DEBE SER ENVIADA AL ANALISTA FORENSE

Nombre, edad, sexo, peso, nacionalidad, ocupación Historia Clínica (Drogas prescritas, adicciones,

sospechas) ¿Cuando fue vista por ultima vez la víctima?¿Donde

fue encontrada? Si estaba enferma ¿Desde cuando? Datos sobre tratamiento medico, análisis previos

hechos Síntomas Declaración de testigo de los hechos y Testigos de

identidad. Descripción de la escena del crimen Necropsia

“Clarke´s Analysis of Drugs and Poisons”, ed. AC Moffat, MD Osselton, B. Widdop Pharmaceutical Press London (2004).

CLASIFICACIÓN DE TÓXICOS

“Clarke´s Analysis of Drugs and Poisons”, ed. AC Moffat, MD Osselton, B. Widdop Pharmaceutical Press London (2004).

ANÁLISIS DE DROGAS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

El análisis es posible en todas las muestras biológicas

Diferentes muestras biológicas dan diferente información

Interrelación entre las muestras Ventanas de Detección

ESPECÍMENES PARA BÚSQUEDA DE DROGAS

Vivos Sangre* Orina Fluido Oral Pelo Sudor Aliento

Muertos Sangre Orina Humor Vítreo Tejidos

Muestra Cantidad ComentariosSOFT/AAFS

Tox.Rev.2005,24 (1): 63-71

Sangre total

Periférica

10 ml 2 x 5 ml (sellada)* Vena Femoralc/preservativo

Corazón 25 ml 10 – 30 ml Ventrículo derecho o vena cava inferior.S/ Preservativo

Orina Toda 5 ml (sellada) C/preservativo

20 – 50 ml S/preservativo

Contenido Gástrico

Todo 25 – 50 ml S/preservativo

Humor vítreo Todo Ambos ojos (sellado)

C/preservativo

Bilis Toda 10 ml C/preservativo

Vísceras Hígado 50 g 10 – 20 g Lóbulo derecho (Hígado), s/formol, en recipientes de vidrio por separado.

Riñón

Cerebro

Pelo Mechón ancho de un lápiz

Región occipital. Desde la base, indicar punta

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE DIFERENTES MUESTRAS

Muestra Ventajas DesventajasSangre (Total /Suero/plasma)

Detecta Droga, análisis cuantitativo

Volumen reducido, bajas concentraciones, droga padre y metabolitos

Orina Volumen elevado, altas concentraciones

No siempre disponible, metabolitos,análisis cuantitativo no siempre útil

Contenido Gástrico

Altas concentraciones

Muestra variable, No siempre útil

Pelo y uñas Siempre disponible Requiere alta sensibilidad, exposición de semanas a meses

Humor Vítreo

Putrefacción limitada

Volumen limitado

Vísceras Altas concentraciones

Análisis cuantitativo difícil de interpretar, interferencias

DIFICULTAD DEL ANÁLISIS QUÍMICO DE ESPECIMENES BIOLÓGICOS

º de Fluidez Muestra

- Líquido Líquido Cefalorraquídeo

Lagrimas

Saliva

Orina

Bilis

Mixto Plasma

Suero

Sangre

Sólidos Cerebro

Corazón, riñón, hígado

Pulmón, músculo

+ Hueso

APROXIMACIONES AL ANÁLISIS TOXICOLÓGICO

Enfocado A una droga en particular

Limitado A una familia de Drogas

Comprensivo Una gran cantidad de drogas

MÉTODOS PARA EL ANÁLISIS DE DROGAS DE ABUSO

Presuntivas

Inmunoensayos enzimaticos (EIA)

Inmunoensayo por fluorescencia polarizada (FPIA)

Radioinmunoanálisis (RIA)

Cromatografía de capa fina (CCF)

Confirmación

Cromatografía de líquidos – espectrometria de masas (CL-EM)

Cromatografía de gases - Espectrometría de masas (CG-EM)

Electroforesis Capilar- Espectrometria de masas (EC-EM)

MÉTODOS PRESUNTIVOS

Análisis inicial “Screening” Identificar muestras negativas

Selectivos a familias de drogas Sensibles Rápidos Barato

Negativo es negativo Positivo necesita confirmarse

InmunoensayosInmunoensayos Cromatografía en capa finaCromatografía en capa fina

INMUNOENSAYOS

Radioinmunoensayo (RIA) Inmunoensayo enzimático

(EMIT, CEDIA) Inmunoensayo por

Polarización de la fluorescencia (FPIA)

Interacción cinética de microparticulas en solución (KIMS)

Ensayo por enzima unida a inmunoabsorbente (ELISA)

INMUNOENSAYOS – PRINCIPIO -

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS INMUNOENSAYOS

EIA FPIA RIA LAI

Instrumentación Si Si Si No

Estabilidad de los reactivos

Meses Meses 3-4 semanas

años

Costo de los reactivos

++ ++ + +++

Automatización Si Si Si No

Pruebas/ 8 horas

100-400

250-300

200-400 200-350

ANÁLISIS TOXICOLÓGICO – PRUEBAS PRESUNTIVAS -

Equipo Viva Twin P.G.J.E.M.

PROCESO DE LA MUESTRA PARA INMUNOENSAYOS Orina

Centrifugar la muestra Sangre

DesproteinizacionDisolventes

Metanol Acetona Cloroformo Acetonitrilo

Acido sulfosalicilico N,N Dimetilformamida

Humor vítreo Centrifugación Dilución

ANÁLISIS TOXICOLÓGICO

- PRUEBA CONFIRMATIVA - Un segundo análisis,

empleando generalmente una técnica con un principio químico diferente a la prueba presuntiva. Técnica cromatografica

acoplada a una espectrometríaCG/EM, CL/EM

Identifica sustancias Sensibilidad Generalmente, cuantitativa Mas confiable (Validez Legal)

CROMATOGRAFÍA

Definición Es un método de separación basado en la

diferente distribución de los componentes de una muestra entre una fase móvil y una fase estacionaria.

Adsorción: basado en diferencias en la afinidad entre una fase móvil y la fase estacionaria.

Partición: Diferencias en la solubilidad entre una fase liquida estacionaria y una fase móvil líquida o gaseosa.

“Principles on Forensic Toxicology” Barry Levine AACC Press (2004)

CROMATOGRAFÍA – HISTORIA -

1903 -1906 Tswett 1929 Lederer 1938 -1939 Ismailov

y Shraiber (CCF) 1941 – 1952 Martin,

Synge and James (CG)

1950 M.J.E. Golay 1960 CL 1960 CG- EM

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN Y SISTEMAS DE FASES

Extracción líquido líquido (ELL) L/L Extracción en fase sólida (EFS) L/S Cromatografía en capa fina L/S Cromatografía en columna L/S Cromatografía de Líquidos L/L Cromatografía de Gases L/L y

L/S

CROMATOGRAFO DE GASES

Sustancias térmicamente estables y volátiles

QUE PROPORCIONA LA CROMATOGRAFÍA DE GASES?

SEPARACION Diferencia analitos entre ellos y

entre los componentes de la matriz

PARAMETRO DE RETENCION Determinado por las diferencias

de afinidad del analito por la fase estacionaria y la fase móvilParámetro cualitativo

RESPUESTA DEL DETECTOR Señales del detector son

proporcionales a la concentración de la sustancia Parámetro cuantitativo

32

H2

Aire

REF

Conductividad térmicaEl par de filamentos se calienta cuando la muestra diluye el gas portador

Ionización de llamaLa combustión produce partículas cargadas que el colector convierte en una corriente

Captura electrónicaLa pérdida de electrones lentos por absorción de la muestra disminuye la corriente en la celda

Analizador

Ion

FuenteEM

H2

H2

O2

PMT Fotométrico de llamaUn filtro óptico selecciona longitudes de onda específicas de compuestos de P o S

Termoiónico NPLos compuestos de N o P aumentan la corriente en el plasma de la sal metálica vaporizada

Detector selectivo de masasLa muestra ionizada es medida en un analizador de masas

DETECTORES CG

FPD(S)

NPD(P)

NPD(N)

ECD

FID

TCD

MSD

(SIM) (SCAN)

1 ng en 1 ul líquido (sg = 1) es concentración 1 ppm

El detector selectivo de masas es:Específico y universal

10-15

fg10-12

pg10-9

ng10-6

ug10-3

mg

COMPARACIÓN ENTRE DETECTORES DE GC

DETECCIÓN MULTIDIMENSIONAL

Espectrometría de masas Analitos son transformados en iones cargados o

fragmentos los cuales son subsecuentemente separados de acuerdo a su radio masa /carga y sus abundancias son medidas

Proporciona información acerca de la estructura molecular del analito

Identificación de los analitos (comparación con bases de datos)

PROCESO

Dodecano: C12H26

20 40 60 80 100 120 140 160 180

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Abundancia

29

43

55

57

71

85

98 113128 141 159

170

m/z->

Espectro medio de dodecano por EVALDEMO.D

M

<--[C H ]+

+.13

<--[C H ]11

<--[C H ]4

+

+(Pico base)

(Precursor)

9

5

6

UN ESPECTRO DE MASAS TÍPICO

Ion molecular (ion precursor): pérdida de un electrón

Pico base: ion más abundante en el espectro

Preparación de la muestraDisgregar la materia orgánica (sólidas)Hidrólisis (proteína, glucuronidos)Extracción con una fase orgánica

EXTRACCIÓN DE DROGAS DE MUESTRAS BIOLÓGICAS

Matrices Líquidas Extracción líquido-líquido Extracción en fase sólida

(discos, cartuchos) Microextracción en fase

sólida

Muestras sólidas Extracción líquido-sólida

(soxhlet, bligh & Dyer) Dispersión de la matriz

en fase sólida (MSPD) Extracción de Fluidos

supercrítico (SFE) Extracción acelerada de

disolvente (ASE) Extracción asistida por

microondas (MAE)

ERRORES EN EL ANALISIS DE COMPUESTOS ORGANICOS

METABOLISMO

FACTORES QUE DETERMINAN LA DETECTABILIDAD DE LAS DROGAS

Tipo de droga Dosis consumida Frecuencia de uso Espécimen biológico utilizado Diferencias individuales en metabolismo Momento de recolección vs consumo Sensibilidad del método

Chiang y Hawks, 1986

LIMITACIONES –ANÁLISIS DE DROGAS-

Drogas detectables pero debajo del nivel de corte (Negativo)

No pueden indicar la cantidad de droga consumida

No puede indicar cuando se consumió No puede indicar la fuente de la droga

LIMITACIONES – ANÁLISIS DE DROGAS -

Muchos inmunoensayos no detectan algunos opiáceos sintéticos o semisinteticos (oxicodona, metadona, etc)

No existen inmunoensayos para muchas drogas

Algunas drogas requieren de inmunoensayos específicos

•Lic. Mario Alberto Carrasco Alcántara Director del Instituto de Servicios Periciales de la P.G.J.E.M.•Q. Moisés Saldívar Rodarte Jefe del Laboratorio de Química del Instituto de Servicios Periciales de la P.G.J.E.M.