“detección del gen dbat por el método de dot blot en el
TRANSCRIPT
ASESORES: INTERNO: C. M. B. DONAJÍ ARIADNA RAMÍREZ LÓPEZ EXTERNO: DRA. ZOILA ROSA FLORES BUSTAMANTE EVALUADOR: M. EN C. MIGUEL ÁNGEL ONTIVEROS TORRES
PROTOCOLO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: INGENIERO FARMACÉUTICO
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
TÍTULO DEL TRABAJO:
“Detección del gen dbat por el método de dot blot en el hongo Bjerkandera adusta aislado de Taxus
globosa”
PRESENTA: MARTHA GABRIELA MARTÍNEZ BARBOSA
México, D. F a 25 de noviembre de 2011
Agradecimientos
Sin duda, agradezco a mi madre Martha Barbosa Morales y a mi padre Gabriel Martínez
Primitivo que siempre me han dado su apoyo incondicional y a quienes debo una meta
más en mi vida, por todo su trabajo, cariño y paciencia para darme una formación
académica y humana. A mis hermanos Carolina, Gabriel y Esaú, que la vida no sería igual
sin ellos.
A mis amigos de UPIBI por todos los buenos y estresantes momentos que compartimos
juntos. ¡Gracias por reír en todo momento conmigo!
Agradezco al Dr. Luis Bernardo Flores Cotera por haberme aceptado en su maravilloso
grupo de trabajo, en especial al Químico Fernando Maldonado por brindarme sus
conocimientos y amistad desde mi llegada al laboratorio, sin dejar de mencionar a Johan,
David, Erika y Cipriano quienes hicieron más agradable mi estancia. A la M. en C. Anahí
Martínez Cárdenas por compartir sus conocimientos y dedicarme parte de su tiempo
durante el desarrollo de mi proyecto de investigación.
A mi asesora externa, Dra. Zoila Flores Bustamante y a mi asesora interna, C. a M en B.
Donají Ramírez López por su tiempo dedicado a dirigir mi trabajo.
DETECCIÓN DEL GEN dbat POR EL MÉTODO DE
DOT BLOT EN EL HONGO BJERKANDERA ADUSTA AISLADO DE TAXUS GLOBOSA
Martha Gabriela Martínez Barbosa, Dr. Luis Bernardo Flores Cotera*
Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Laboratorio 48 Metabolismo Secundario. Av Instituto Politécnico Nacional No. 2508, Col. San Pedro Zacatenco 07360 México, DF. [email protected], Tel: (55) 5747 3800, ext.
Palabras clave: Hongo endófito, Taxol, Taxus globosa, dot blot, gen dbat y Bjerkandera adusta.
Introducción. Taxus es un género de árbol distribuido a lo largo de Asia, Norte y Centro América y Europa; su importancia radica en la producción de metabolitos secundarios del grupo diterpeno (1), con propiedades anticancerígenas, denominados Taxanos, destacando el Taxol, que ha llegado a ser exitoso en quimioterapias contra una variedad de cáncer. Originalmente el Taxol fue extraído de la corteza de Taxus brevifolia (1), sin embargo se daba muerte al árbol, surgiendo así la obtención de Taxol a partir de semisíntesis química, síntesis química y cultivos vegetales celulares, pero con la desventaja de obtener producciones con bajos rendimientos (2). Esto ha provocado estudios enfocados a microorganismos endófitos aislados del tejido de Taxus productores de Taxol (3). En la presente investigación se trabajó con el hongo Bjerkandera adusta, aislado del tejo mexicano o Taxus globosa, identificado y sometido a pruebas de inmunoensayo y HPLC/MS-MS por el grupo de trabajo. Estas pruebas arrojaron resultados positivos en la producción de Taxol utilizando el estimulador 5-azacitidina (10 µM). Se sabe que en los últimos pasos de la ruta biosintética de Taxol participa la enzima DBAT, lo que da pie a realizar una prueba más para evidenciar que esta cepa es productora de Taxol y tener como objetivo la detección del gen dbat en el hongo B. adusta, aislada de T. globosa utilizando el método de dot blot. Metodología. Se cultivó el hongo B. adusta en medio M1D2X (modificada de Strobel, 1996) y se estimuló con 5-azacitidna (10 µM) a las 48 h de cultivo. La extracción de ARN se logró con el uso de TRIzol® a los 8, 10 y 12 días de cultivo con y sin 5-azacitidina. El ARN extraído se analizó en gel de agarosa desnaturalizante 1.4%. El método de dot blot consistió en fijar ARN sobre una membrana de nylon H+, la membrana fue sometida a soluciones SDS 10% (NaCl 5M y NaOH 10N), desnaturalizante (NaOH0.5N y NaCl 1.5M), neutralizante (NaCl1.5M y Tris-HCl0.5M a pH 7.4), SSC 10X (NaCl y Citrato de sodio) y expuesta a luz UV. La prehibridación sin sonda (48°C/90 min), la hibridación con la sonda del gen dbat de T. globosa (48°C/16 h). Se realizaron lavados de severidad SSC 2 X/SDS 0.1% y SSC 0.5 X/SDS 0.1% a 50°C, la membrana se colocó
en solución de bloqueo (leche Svelty® polvo y buffer de ácido maleico), se incubó con anti-digoxigenina, después en buffer de detección (0.1 M Tris-HCl, o.1M NaCl a pH 9.5 a 20°C) por último se incubó a oscuridad con sustrato NBT/BCIP. Resultados y discusión. Dentro de los resultados del análisis de dot blot del gen dbat (Fig. 1), tenemos señales positivas de hibridación en los días de cultivo 10 (sitios 5 y 6 control y sitios 7 y 8 con 5-azacitidina), 12 (sitios 9 y 10 control y sitios 11 y 12 con 5-azacitidina), en los controles; clona con gen dbat (sitio 14 y 15) y en el ARN de árbol (sitio 13), sin embargo las muestras del día 8 (sitios 1-4) no hibridaron por una posible degradación del ARN.
Figura 1. Membrana de nylon H+ de dot blot del gen
dbat en B. adusta. Conclusiones y perspectivas. La señal positiva de hibridación del ARN de la cepa B. adusta con la sonda del gen dbat de T. globosa, sugiere que éste gen se encuentra entre los transcritos del hongo. Las señales fueron tenues pero consistentes en la respuesta de hibridación. Los resultados de este trabajo dan apertura a continuar con la síntesis de cDNA a partir del RNA del hongo B. adusta y obtener el gen dbat completo. Referencias. 1. Heinig Uwe, Jennewein Stefan, 2009. “Taxol: A complex diterpenoid natural product with an evolutionarily obscure origin”. African Journal of Biotechnology 8:1370-1385. 2. Walker Kevin, Croteau Rodney, 2001 “Taxol biosynthetic genes” Phytochemistry 58:1–7. 3. Sun Pei-Xin, Zheng Cheng-Jian, Li Wen-Chao, Jin Gui-Lin, Huang Fang, Qin Lu-Ping, 2011 “Trichodermanin A, a novel diterpenoid from endophytic fungus culture” J Nat Med 65:381–384
Contenido
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 3
1.1. Taxanos ................................................................................................................................. 3
1.2. Taxol o Paclitaxel ................................................................................................................... 3
1.3. Tejo mexicano (Taxus globosa). ............................................................................................ 5
1.4. Formas de obtención de Taxol .............................................................................................. 6
1.4.1. Corteza de Taxus globosa .............................................................................................. 6
1.4.2. Semisíntesis ................................................................................................................... 7
1.4.3. Cultivos celulares de Taxus ........................................................................................... 7
1.4.4. Síntesis química ............................................................................................................. 7
1.4.5. Microorganismos ........................................................................................................... 8
1.5. Biosíntesis del Taxol ............................................................................................................ 11
1.5.1. 10-deacetilbacatin III-10-O-acetil transferasa (dbat) .................................................. 12
1.6. Mecanismo de acción del Taxol. ......................................................................................... 13
1.7. Métodos de hibridación ...................................................................................................... 14
1.7.1. Sonda de hibridación ................................................................................................... 15
2. JUSTIFICACIÓN............................................................................................................................. 19
3. OBJETIVO ..................................................................................................................................... 19
4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................ 21
4.1. MATERIALES ........................................................................................................................ 21
4.1.1. Hongo endófito ........................................................................................................... 21
4.1.2. Medio de cultivo .......................................................................................................... 21
4.1.3. Kit de extracción de ADN ............................................................................................. 22
4.1.4. Soluciones para extracción de ADN con la técnica de Cenis 1992. ............................. 22
4.1.5. Electroforesis de ADN ................................................................................................. 22
4.1.6. Extracción de ARN ....................................................................................................... 22
4.1.7. Gel de agarosa desnaturalizante 1.4% ........................................................................ 22
4.1.8. Electroforesis de ARN .................................................................................................. 23
4.1.9. Soluciones de Dot-Blot ................................................................................................ 23
4.1.9.1. Sonda ....................................................................................................................... 23
4.1.9.2. Membrana ............................................................................................................... 23
1
4.2. METODOS ............................................................................................................................ 24
4.2.1. Medio de cultivo M1D2X (Modificada de Strobel, 1996) ............................................ 24
4.2.2. Cultivo de hogos .......................................................................................................... 24
4.2.2.1. Inducción de cultivos ............................................................................................... 24
4.2.3. Extracción de ADN ....................................................................................................... 25
4.2.4. Electroforesis de ADN ................................................................................................. 25
4.2.5. Purificación de ADN en gel .......................................................................................... 25
4.2.6. PCR .............................................................................................................................. 26
4.2.7. Extracción de RNA ....................................................................................................... 26
4.2.8. Preparación de gel desnaturalizante 1.4% .................................................................. 26
4.2.9. Electroforesis de ARN .................................................................................................. 27
4.2.10. Dot blot ........................................................................................................................ 27
4.2.10.1. Fijación y desnaturalización del DNA. ..................................................................... 27
4.2.10.2. Prehibridación e hibridación. .................................................................................. 27
4.2.10.3. Lavados .................................................................................................................... 28
4.2.10.4. Revelado .................................................................................................................. 28
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................................................... 30
5.1. RESULTADOS ....................................................................................................................... 30
5.2. DISCUSIÓN ........................................................................................................................... 32
6. CONCLUSIÓN Y PERSPECTIVAS .................................................................................................... 35
6.1. CONCLUSIÓN ....................................................................................................................... 35
6.2. PERSPECTIVAS ..................................................................................................................... 35
7. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................... 37
2
INTRODUCCIÓN
3
1. INTRODUCCIÓN
Un estudio muy importante de las plantas se centra en las sustancias que ejercen una
acción farmacológica sobre los seres vivos, con la posibilidad de ser utilizados en
tratamientos para combatir un gran número de enfermedades. Alrededor de 400000
especies de plantas en el mundo son fuente de diferentes y numerosos metabolitos
secundarios los cuales son utilizados en la industria farmacéutica, agroquímica, alimenticia,
de sabores, aromas, colorantes, bioplaguicidas, aditivos, textiles, (Jian-Jiang y col, 2005)
entre otras de aquí la importancia y el deseo de extraerlos y caracterizarlos. Un ejemplo de
estos son los terpenos; que están presentes de manera abundante en las plantas, y
pertenecen a un grupo de productos naturales funcional y estructuralmente diverso.
Existen numerosas publicaciones donde se asegura que estos productos cuentan con
propiedades anticancerígenas (Suárez S, 2009), destacando el Taxol, obtenido
originalmente de árboles del genero Taxus, y ha llegado a ser un fármaco exitoso en los
tratamientos contra una variedad de cáncer. En general, los terpenos son extraídos de su
fuente original debido a que sus estructuras son extremadamente complejas, lo cual hace
muy difícil y económicamente no viable su síntesis química. Sin embargo el problema con
la extracción de Taxol de su fuente original, Taxus, es que generalmente produce pocas
cantidades de esta valiosa molécula. Esto ha provocado la búsqueda de nuevas
alternativas para su producción, dirigiéndonos a las fermentaciones con microorganismos
endófitos, aislados del tejido de Taxus, con la seguridad de obtener a este anticancerígeno
de manera rápida, ilimitada y económica.
1.1. TAXANOS
Los taxanos son un grupo de diterpenos complejos que cuentan con propiedades
anticancerígenas, destacando de entre ellos al Taxol, que ha llegado a ser un fármaco en
los más exitosos tratamientos contra una variedad de cáncer.
1.2. TAXOL O PACLITAXEL
Taxol o también conocido con su nombre genérico de Paclitaxel (Heinig U. y col, 2009) es
un valiosos diterpeno tricíclico polioxigenado, tiene una función amida, por lo que en
ocasiones se considera como un pseudoalcaloide, ha mostrado actividad antifúngica
(Young y col., 1992; Elmer y col., 1994), propiedades antiinflamatorias y anticancerígenas.
4
Este compuesto fue aislado en 1967 a partir de la corteza de Taxus brevifolia (tejo del
Pacífico) dentro de un proyecto entre el National Cancer Institute y el Departamento de
agricultura de los Estados Unidos (Heinig y col, 2009) e identificado por primera vez por
Wani y colaboradores en 1971, sin embargo su desarrollo clínico tardó debido a su
toxicidad y dificultades en su formulación, pero principalmente a la escasez de este
compuesto (Soto M, 2002). El Taxol (figura 1) destaca de los demás por su potencial en el
tratamiento de cáncer avanzado de ovario, carcinoma de mama metastásico tras el fracaso
de la quimioterapia, sarcoma de Kaposi relacionado al SIDA y cáncer de pulmón para
pacientes que no son candidatos a una cirugía y/o radioterapia (Diccionario Farmacéutico,
2008).
Figura 1. Estructura química del Taxol.
La estructura química del Taxol posee un núcleo taxánico esterificado en la posición del C-
13 con una cadena lateral de fenilisoserina en su molécula, tiene un cuarto anillo en forma
de anillo “oxetano” que une los carbonos de las posiciones 4 y 5. Estas dos cualidades son
necesarias para su actividad biológica. El núcleo taxánico consiste en cuatro anillos, el A
(sistema de 6 carbonos), el B (sistema de 8 carbonos), el C (sistema de 6 carbonos) y el D
(anillo de oxanato). Dentro de sus características, el Taxol cuenta con un peso molecular
de 853.906 g/mol; su fórmula condensada es C47H51O14N (Ghuo y col., 2005), nombre de
IUPAC [2aR-[2aα; 4b, 4aβ; 6β,9α(αR*; βS*); 11α; 12α; 12aα; 12bα]]- β(benzoilamina)-α-
ácido hidroxibenzenepropanoico 6,12b-bis- (acetiloxi)-12-(benzoiloxi)-
2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12bdodecahidro- 4,11-dihidroxi-4a,8,13,13 tetrametil-5-oxo-
7,11- metano-1H-ciclodeca[3,4]benzo[1,2-b]oxeto-9-il éster y se compone de Carbono
66.11%; Hidrógeno 6.02%; Nitrógeno 1.64%; Oxígeno 26.23% (Aguilar Ramírez, 2007).
En forma comercial se puede encontrar en polvo cristalino amorfo e higroscópico de blanco
a blanco opaco insoluble en agua pero soluble en solventes orgánicos y con punto de
fusión de 213 a 216°C (Suárez S. Roberto, 2009).
5
Estos compuestos han sido reportados en el follaje y en la corteza de varias especies de
Taxus; T. brevifolia, T. wallichinan, T. baccata, T. canadensis, T. cuspidata, y T.
yunnanesis. En México se encuentra una de las especies de estos árboles productores de
taxanos llamado Taxus globosa o también conocido como tejo mexicano.
1.3. TEJO MEXICANO (TAXUS GLOBOSA).
Taxus es un género taxonómico de la familia Taxaceae (Zavala y col, 2001), los individuos
de este género son árboles dioicos que se reproducen por semillas y habitan en zonas
templadas y frías del planeta con suelos húmedos cerca de arroyos. De sus ramas largas y
horizontales crecen las inferiores a escasa distancia del suelo (Suárez, 2009), se producen
rebrotes del tallo, lo que puede ser un potencial de propagación vegetativa (Vital, 2008),
son árboles de tipo perennifolio, esto quiere decir que cuentan con un lento crecimiento,
tardando aproximadamente 100 años en alcanzar una altura de 6 a10 m y un diámetro de
30 a 50 cm (Suárez, 2009). Al igual que otras especies de este género es de carácter
venenoso tanto en el follaje como en el fruto, excepto en el arilo, que es atractivo y
comestible para la aves (Zavala y col, 2001).
Este género está distribuido a lo largo de Asia, Norte y Centro América y Europa (Heinig
Uwe, 2009), se sabe que su distribución es más amplia en Europa y Asia que en América.
Entre las especies registradas se encuentra T. baccata (tejo Europeo), T. brevifolia (tejo del
Pacífico), T. canadensis (tejo Canadiense), T. cuspidata (tejo Japonés), T. chinesis (tejo de
China), T. floridana (tejo de Florida, Estados Unidos) y T. wallichiana (tejo del Himalaya),
además de la especie mexicana T. globosa (tejo Mexicano) (Baloglu y col, 1999) (Figura
2). El tejo mexicano se distribuye desde la parte central de Nuevo León y Tamaulipas
pasando por la cuenca del Golfo y eje Neovolcánico hasta el sur de Honduras en
Centroamérica, ubicándose en los estados de Hidalgo, Querétaro, Nuevo León, Oaxaca,
San Luis Potosí, Tamaulipas y Veracruz en México (Zavala y col, 2001). Se encuentra de
manera escasa y el hábitat es de difícil acceso, pues se trata de terrenos escarpados que
son terrenos difíciles de atravesar por estar llenos de rocas, cortes y pendientes muy
pronunciadas, generalmente en fondos de cañadas, pero son agradables para los
visitantes con fines de esparcimiento (Zavala, 2001). La especie fue descrita por
Schelectendal en 1938, pero no existen documentos sobre ello (Soto, 2009). Esta especie
está incluida dentro de un listado de especies raras sujetas a protección por la SEMARNAT
en México (NOM-ECOL-059-2001) (Vital, 2008) debido a que sus poblaciones se
encuentran reducidas y en peligro de desaparecer.
6
Figura 2. Vista de la corteza externa de un ejemplar de T. globosa
en el Parque Nacional El Chico, Hidalgo, México (Zavala y col, 2001).
Figura 3. Ramillas de Taxus globosa del Parque Nacional El Chico, Hidalgo, México.
Durante la época de fructificación (estructura femenina a) y polinización (estructura masculina b)
(Zavala y col, 2001).
1.4. FORMAS DE OBTENCIÓN DE TAXOL
1.4.1. Corteza de Taxus globosa
Inicialmente el Taxol se obtenía a partir de la corteza de árboles de tejo, pero no era la
mejor alternativa debido a que el descortezamiento mataba a la planta. La concentración
de Taxol en la corteza del árbol es extremadamente baja, de un árbol de 100 años de edad
era posible aislar 300 mg de Taxol, para un tratamiento se requieren de 3 g de este
compuesto y, 1 g de Taxol tiene un costo aproximado de $25,000.00 (Soto y col., 2000).
Debido a que el tratamiento de un solo paciente con cáncer requiere de una cantidad
a b
7
mucho mayor de Taxol al obtenido en un solo árbol, se han buscado nuevas alternativas
para la producción, ya que de otro modo la gran demanda del fármaco acabaría con la
especie en poco tiempo. Además, esto justifica el esfuerzo para mejorar los procesos de
producción existentes de este importante producto natural.
1.4.2. Semisíntesis.
Se han empleado varias estrategias para lograr la síntesis total de Taxol y semisíntesis, así
como cultivos celulares de Taxus para su producción. Actualmente la producción comercial
de Taxol, depende de la semisíntesis y de cultivos celulares de Taxus (Heinig y col., 2009).
La semisíntesis se lleva a cabo a partir de precursores de Taxol aislados de hojas árboles
Taxus. Se ha producido Taxol a partir de Bacatina III y la 10-Diacetilbacatina ambos
precursores naturales de Taxol. Éstos se convierten en Taxol mediante el acoplamiento de
cadenas laterales previamente sintetizadas (Aguilar R, 2007). Aunque los procedimientos
de semisíntesis son eficientes, la purificación de los precursores del tejido de la planta
requiere un esfuerzo sustancial en la separación del intermediario deseado a partir de
compuestos fenólicos abundantes, lípidos y otros contaminantes de la planta.
1.4.3. Cultivos celulares de Taxus
El aislamiento de Taxol y otros taxanos a partir de cultivos celulares de Taxus requiere
menos pasos q la purificación de tejido intacto debido a que las cantidades de sustancias
que interfieren son más bajas. Sin embargo, el rendimiento de los taxanos obtenidos en
cultivos celulares es demasiado bajo para ser comercialmente viable.
1.4.4. Síntesis química
Otro método de obtención es la síntesis total, sin embargo se requieren más de 30 etapas
de reacción química para llegar al Taxol, resultando un método ineficiente por sus bajos
rendimientos y altos gastos económicos.
8
1.4.5. Microorganismos
Otra de las alternativas para obtener Taxol son los procesos de fermentación con
microorganismos productores de este agente antitumoral. Se han reportado hongos
endófitos de Taxus como productores de Taxol. Estos microorganismos se han
considerado una fuente potencial para obtener Taxol de forma más rápida, económica e
ilimitada. Este grupo de microorganismos viven dentro de tejidos vegetales durante una
parte de su ciclo de vida o permanentemente, sin causarles daño (Pei-Xin y col, 2011).
Los microorganismos que producen Taxol incluyen un grupo diverso de hongos endófitos
aislados de diferentes especies del genero Taxus, en la tabla 1 se muestran algunos
ejemplos de estos hongos con su respectiva concentración reportada en la producción de
Taxol. En la tabla 2 se muestran algunos hongos aislados de T. globosa del Parque
Nacional El Chico, Hidalgo, los cuales fueron analizados por inmunoensayo para medir la
producción de Taxol. Otra evidencia para confirmar que estos hongos son productores de
Taxol, es la utilización de la técnica de dot blot para la detección de genes involucrados en
la biosíntesis de Taxol. Para fines de este trabajo se utilizó la cepa CHTAE39 Bjerkandera
adusta para la detección del gen dbat. Este hongo endofítico (Figura 4) fue aislado de
hojas de T. globosa de la zona Dos Aguas del Parque Nacional El Chico en el estado de
Hidalgo. Dentro de las características morfológicas, la cepa CHTAE39 cuenta con una
apariencia harinosa de color crema con pigmento no difusible, de micelio no aéreo y de
pigmento negro al reverso. Crece en medio PDA (agar papa dextrosa) a una temperatura
de 22 °C con una velocidad de crecimiento de 15.3 mm/día, en la figura 7 se muestra la
cepa con 14 días de edad. Además produce clamidosporas de forma cilíndrica y de una
ornamentación lisa.
9
Figura 4. Bejerkandera adusta
Tabla 1. Hongos endofíticos reportados productores de Taxol.
Microorganismo
Fuente
Concentración de
Taxol en cultivo
ng/L-1
días-1
Referencia
Taxomyces
andreanae
Taxus brevifolia 24-50 / 21 Stierle y col, 1993
Fusarium
subglutinans
Taxus brevifolia 130 / 21 Lee, J y col, 1995
Pestalotiopsis
microspora
Taxus wallichiana 60,000-70,000 / 14-21 Strobel, G y col., 1996
Pestalotiopsis
microspora
Taxus cuspidata 268 / 21 Strobel y col, 1996; Grothaus y col, 1993
Alternaria. Sp Taxus cuspidata 157 /21 Strobel y col., 1996
Taxodium distichum Bald Cypress 50-1487 / 21 Jia-Yao Li y col., 1996
Pestalotia
heterocornis
Suelo 31,000 / 5-7 Noh MJ, y col, 1999
Mucor rouxianus sp Taxus chinensis 30,000 / 20 Miao y col,2007
Cladosporium
cladosporioides
Taxus media 800,000 / 10 Zhang y col, 2009
10
Tabla 2. Concentración de Taxol medido por inmunoensayo de hongos endofíticos aislado de
T.globosa.
Microorganismo Nombre de cepa Concentración
de Taxol ng L-1
Fusarium
lateritium
CHTAM05 20
Pestalotiopsis
sp.
CHTAM32 80
Acremonium sp. SGLMF37 150
Fusarium sp. CHTAM72 42
Bejerkandera
adusta
CHTAE39
Figura 5. Fusarium lateritium
Figura 6. Pestalotiopsis sp.
11
Figura 7. Acremonium sp.
1.5. BIOSÍNTESIS DEL TAXOL
La clave para mejorar el suministro de Taxol y otros taxanos clínicamente útiles, es el
esclarecimiento detallado de la ruta de biosíntesis de taxanos, que ha sido objeto de
intensa investigación. Muchos de los genes y las enzimas para la biosíntesis de taxanos en
Taxus han sido identificados, aunque siguen existiendo algunos que no han sido
identificados (Heinig y col, 2009).
La ruta biosintética del Taxol en Taxus, requiere de un poco más de 19 pasos enzimáticos,
a partir de su precursor, el diterpeno geranil-geranil-difosfato (GGDP) (Figura 2).
Investigaciones en microorganismos se han enfocado en tres enzimas; taxadien sintasa
(TXS), 10-deacetilbacatina III-10- O-acetil transferasa (DBAT) y fenilpropanoil transferasa
(BAPT). Estas enzimas participan en pasos claves para obtener la estructura compleja del
Taxol y otros taxanos, por lo que han servido como marcadores moleculares para la
búsqueda de microorganismos endófitos productores de Taxol [Ruíz-Salas, 2010]. Los
genes que codifican estas enzimas son taxadiensintasa (txs), fenilpropanoil transferasa
(bapt) y 10-deacetilbacatin III-10-O-acetil transferasa (dbat). Sin embargo, para fines de
este trabajo el gen dbat será detectado en un hongo endófito aislados de Taxus globosa.
12
Figura 8. Esquema propuesto para la biosíntesis de Taxol en T. brevifolia (Walker y col, 2001).
1.5.1. 10-deacetilbacatin III-10-O-acetil transferasa (dbat)
El gen dbat codifica una enzima que lleva su mismo nombre (DBAT), esta enzima cataliza
la formación bacatina III, uno de los últimos diterpenos intermediarios de la ruta biosintética
del Taxol (Walker y col, 1999). DBAT cataliza la transferencia de un grupo acetilo al
carbono 10 del precursor 10 deacetilbacatina III, para obtener como producto bacatina III.
La secuencia nucleotídica de esta enzima es de 1516 pb, contiene dos exones y un intrón.
El marco de lectura abierto es de 1320 pb y codifica para 440 residuos de aminoácidos
(49.52 kDa). Tiene una secuencia altamente conservada dada por la triada catalítica
HXXXDG (Salas Ruiz, 2010).
Figura 9. Catalización por DBAT de 10-deacetilbacatina III a Bacatina III.
Falmesil difosfato
Isopentil difosfato
Isopentil difosfato Taxa-4(5), 11(12) dieno Taxa-4(20), 11(12)-dieno-5α-ol
Taxa-4(20), 11(12)-dieno-5α-il-acetato Taxadieno-5α, 10β-diol monoacetato 2-benzoiltaxano
10 deacetilbacatina III Bacatina III β-fenilalaninbacatin III
Taxol
10 deacetilbacatina III Bacatina III
13
1.6. MECANISMO DE ACCIÓN DEL TAXOL.
El Taxol, debido a su actividad anticancerígena, se clasifica dentro del grupo de los
fármacos antimitóticos, estos fármacos son los responsables de afectar la dinámica de los
microtúbulos y de unirse a tubulina, alterando el buen funcionamiento de los husos
mitóticos. El huso mitótico está formado por microtúbulos, que son tubos formados por la
combinación de dos tipos de proteínas: α-tubulina y β-tubulina (figura 10). Estas proteínas
forman heterodímeros αβ, capaces de agruparse en polímeros (microtúbulos) en presencia
de otras proteínas denominadas MAPs (proteínas asociadas a microtúbulos), de GTP y de
Mg2. Los microtúbulos poseen dos extremos, en uno de ellos, identificado con un signo (–),
es donde se inicia la nucleación y en el otro (+) el microtúbulo va creciendo. Una vez
iniciado el crecimiento del microtúbulo, éste adopta un aspecto cilíndrico, de unos 25 nm
de diámetro, con 13 protofilamentos que forman el microtúbulo. Los microtúbulos son
estrucutras dinámicas, lo que significa que se pueden alargar añadiéndose más
heterodímeros (tubulina- GTP) en el extremo (+); pero también pueden acortarse (si el
GTP se hidroliza) y liberarse heterodímeros (tubulina- GDP) del extremo (–). Durante la
interfase, los microtúbulos forman una red desde el centro por todo el citoplasma, pero al
comenzar la mitosis, los microtúbulos se disgregan para poder formar el huso mitótico. En
este momento, los microfilamentos se encuentran en un estado poco habitual de rápido
ensamblaje y desensamblaje, lo cual explica la extrema sensibilidad del huso a distintos
compuestos que se unen a la tubulina.
El Taxol se une a la β-tubulina, y con ello favorece la formación de largos polímeros,
incluso en presencia de GDP, la estabilización de los microtúbulos provoca la pérdida de
función del huso, la consiguiente parada del ciclo celular en la transición metafase/anafase
y, finalmente, la muerte celular.
A pesar de que este compuesto ataca a las células tumorales, la toxicidad del Taxol se
manifiesta en diferentes órganos, aparatos y sistemas. Los efectos secundarios más
importantes son la mielosupresión, que provoca la disminución o anulación de la función de
la medula ósea para producir las células de la sangre, lo que trae como consecuencia la
anemia (disminución de los glóbulos rojos y/o hemoglobina), trombocitopenia (disminución
de plaquetas) y leucopenia (disminución de los glóbulos blancos o leucocitos) y daño
neurológico, que trae como secuelas por mencionar algunas, la pérdida de memoria, fatiga,
inestabilidad al caminar y pérdida de sensibilidad. El daño provocado depende de la
duración del tratamiento y la dosis de Taxol administrado.
14
El Taxol es metabolizado en el hígado y la excreción biliar es su principal vía de
eliminación, a través del citocromo P-450; y de las isoenzimas CYP2C8 y CYP3A4
(Diccionario Farmacéutico, 2008).
Figura 10. Mecanismo de acción del Taxol en las células.
1.7. MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN
La hibridación de ácidos nucleicos se puede definir como una reacción mediante la cual se
unen dos cadenas complementarias de procedencia diferente, para formar un ácido
nucleico de doble cadena.
Todos los ensayos de hibridación se basan en la mezcla de hebras sencillas de ácido
nucleico muestra o diana, no marcado, con una sonda de secuencia conocida, marcada,
bajo condiciones experimentales que permitan el apareamiento entre bases
complementarias. Si la sonda o la muestra son de doble hebra, deben ser previamente
desnaturalizados, generalmente por calor o por tratamiento alcalino. Una vez mezcladas se
permite la renaturalización en la cual, se pueden formar híbridos sonda:diana. Además se
dispone de un método para detectar los híbridos formados, que viene determinado por el
tipo de marcaje empleado en la sonda.
Los ensayos de hibridación se pueden dividir en tres grupos:
15
Hibridación de fase líquida Dot blot
Hibridación es soporte sólido Southern blot
Hibridación in situ Northern blot
En general, las técnicas de hibridación pueden aplicarse tanto en extractos de ácidos
nucleicos obtenidos de las células a partir de cultivos, como en preparaciones con muy
distintas variantes en las que los ácidos nucleicos se mantienen en su lugar de origen; este
es el caso del tercer grupo de hibridación conocido con el nombre de in situ.
El método de hibridación de fase líquida utiliza una muestra de ADN o ARN en disolución,
se realiza su hibridación con la sonda; y al estar ambas disueltas, todas las moléculas son
igualmente accesibles, por lo que la técnica es más cuantitativa que la hibridación en
soporte sólido.
En el método en soporte sólido es necesario trasferir el extracto de ácidos nucleicos, ADN
o ARN, a un soporte sobre el que realiza la hibridación; generalmente se utilizan como
soportes membranas de materiales diversos (nailon, nitrocelulosa, etc.). El método permite
procesar varias muestras simultáneamente y facilita el control de la hibridación, aunque es
más lento, el proceso puede llegar a ser más eficiente. Si la transferencia a la membrana
se hace directamente a partir de la extracción, la técnica se denomina Dot blot y
únicamente informa de la presencia o ausencia de una determinada secuencia. Si
previamente a la transferencia se hace una separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis, la técnica se denomina Southern blot si el ácido nucleico es ADN y Northern
blot si es ARN. Estas dos últimas técnicas, nos permiten además, conocer el tamaño de la
secuencia diana en cuestión, en el caso de la hibridación para ARN permite demostrar la
expresión de genes.
1.7.1. Sonda de hibridación
Con los conocimientos que existen de los genomas de los organismos, cada vez es más
sencillo generar pequeños fragmentos de DNA (oligonucleótidos) que sean
complementarios de regiones que nos interesan, de esta forma, si se produce la
hibridación entre el oligonucleótido y el DNA presente en la muestra, se puede concluir que
16
el gen está presente en esa muestra problema. A estos fragmentos de DNA se les
denomina sondas.
Las sondas se pueden clasificar según varios criterios (Tabla 3): longitud o tamaño de las
secuencia diana, método de marcaje y detección, tamaño de la sonda, método de
preparación, etc.
Tabla 3. Clasificación de sondas de hibridación.
Tipo de
sonda
Convencionales Sintéticas
Material de
partida
ADN de doble hebra ARN ADN de doble
hebra
Nucleótidos
Método de
obtención
Clonación
celular
clásica
Clonación
acelular
(PCR)
PCR con
transcriptasa
inversa
Clonación celular
en vector seguida
de transcripción
Síntesis
química
Naturaleza
de la
sonda
formada
Fragmentos de ADN
Fragmento de ARN
Oligonucleótido
El empleo de sondas de ADN o ARN como herramientas para localizar secuencias diana
por ensayos de hibridación requiere obligatoriamente un proceso de marcaje de la sonda,
que permita su detección. La molécula o grupo marcador puede tener diversa naturaleza,
siempre y cuando se pueda detectar su presencia de forma directa o indirecta; los
marcadores más utilizados son isótopos radioactivos, fluorocromos y enzimas. El marcaje
debe ser estable bajo diversas condiciones de temperatura, detergentes, disolventes, etc.,
y no afectar a la reacción de hibridación. Los grupos más comúnmente usados son la
biotina y la digoxigenina (figura 11). Ambos son fácilmente conjugables a los nucleótidos y
se unen con gran afinidad, respectivamente, a proteínas y a anticuerpos anti-digoxigenina.
Se dispone comercialmente de dNTPs ya unidos tanto a biotina como a digoxigenina.
17
Figura 11. La sonda es marcada con digoxigenina, porterirmente es reconocida por el anticuerpo
anti-digoxigenina que a su vez está ligado a una enzima, que posteriormente se asociará a un
sustrato.
18
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVO
19
2. JUSTIFICACIÓN
El incremento de casos con cáncer en la sociedad internacional, pero sobretodo en la
sociedad mexicana, ha provocado la búsqueda de nuevas alternativas en la producción de
Taxol, siendo así la fermentación a partir de hongos endófitos aislados de árboles del
genero Taxus, una opción que puede permitir mejores rendimientos en su producción que
los métodos ya existentes, con bajo impacto ambiental evitando el descortezamiento de
Taxus y una distribución mucho más económica de este anticancerígeno. La existencia de
estos microorganismos endófitos productores de Taxol ha sido revelada en diversas
publicaciones, siendo los hongos aislados de Taxus globosa (Tejo mexicano) los menos
estudiados, lo cual da pie a evidenciar y comprobar que la cepa HE39 Bjerkandera adusta,
aislada, identificada y sometida a pruebas de inmunoensayo y HPLC/MS-MS previamente
por el equipo de trabajo, es capaz de producir Taxol de manera rápida e ilimitada, a partir
de la detección con el método de dot blot del gen dbat, involucrado en la codificación de la
enzima catalizadora DBAT, dentro de la ruta biosintética de Taxol.
3. OBJETIVO
Detectar el gen dbat involucrado en la síntesis de Taxol en un hongo aislado de Taxus
globosa con el método de Dot-Blot.
20
MATERIALES Y METODOLOGÍA
21
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIALES
3.1.1. Hongo endófito
Cepa CHTAE39 Bjerkandera adusta, aislada de Taxus globosa de la zona Dos Aguas del
Parque Nacional El Chico en el estado de Hidalgo, previamente aislada por el equipo de
trabajo del laboratorio 48 de Metabolismo Secundario ubicado en el departamento de
Biotecnología y Bioingeniería del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados, México
D.F.
3.1.2. Medio de cultivo M1D2X El medido utilizado para cultivar la cepa fue el M1D2X (modificada de Strobel, 1996) y se
prepararon 8 matraces con 100 mL cada uno. Los reactivos y sus cantidades se muestran
en la tabla 4.
Tabla 4. Reactivos utilizados para preparar 800 mL de medio M1D2X
REACTIVO CANTIDAD PROVEEDOR
Glucosa 1.6 g J. T. Baker
Fructosa 4.8 g SIGMA
Sacarosa 9.6 g J. T. Baker
MgSO4 0.6 g J. T. Baker
Extracto de levadura 0.8 g BD
SOLUCIONES
Buffer de fosfatos pH 6.8 (17.42 g de K2HPO4 en 49.7 mL de agua + 13.6 g de
KH2PO4 en 50.3 mL)
1.6 mL J. T. Baker
ZnSO4 1000X (0.25 g aforar a 100 mL con agua destilada)
1.6 mL J. T. Baker
MnSO4 1000X (0.067 g aforar a 100 mL con agua destilada)
1.6 mL J. T. Baker
FeCl3 1000X (0.2 g aforar a 100 mL con agua destilada)
1.6 mL J. T. Baker
(Ca(NO3))2 50X (3.25 g aforar a 100 mL con agua destilada) esterilizar
aparte
16 mL J. T. Baker
Benzoato/Acetato 50X (5 g de Acetato de sodio + 0.25 g de benzoato de sodio)
esterilizar a parte
32 mL J. T. Baker
22
Fenilalanina Esterilizar por filtración
3.2 mL J. T. Baker
3.1.3. Kit de extracción de ADN
La extracción de ADN genómico de los hongos y de tejido de T. globosa se realizó con el
kit DNeasy Plant Mini (Qiagen).
3.1.4. Soluciones para extracción de ADN con la técnica de Cenis 1992.
Para llevar a cabo la extracción de ADN con la técnica de Cenis 1992, fue necesario
preparar Buffer TE (1/10:10 mM Tris-HCl, pH 7.5 y 1 mM EDTA pH 8.0), una solución de
lisis (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA y 0.5% SDS), Acetato de Sodio
(3 M pH 5.2), Alcohol 100% y Alcohol 70%.
3.1.5. Electroforesis de ADN
Para analizar el ADN extraído de las cepas y productos de PCR se utilizó TAE 1X (Trizma
base, ácido acético glacial y EDTA 0.5M a pH de 8.0) y agarosa 1% (Agarosa ultraporo y
TAE 1X)
3.1.6. Extracción de ARN
En el procedimiento de extracción de ARN a partir del micelio del hongo fue necesario el
uso de cloroformo, alcohol isopropilico, etanol 75%, agua libre de RNasa y agente TRizol®.
3.1.7. Gel de agarosa desnaturalizante 1.4%
Para preparar el gel necesario en la electroforesis de ARN fue necesario agarosa, MOPS
10X, formaldehído y agua.
23
3.1.8. Electroforesis de ARN
Para preparar la muestra de ARN extraído fue necesario formaldehído, formamida, MOPS
10X, bromuro de etídio y buffer de carga naranja G (6X).
3.1.9. Soluciones de Dot-Blot
Para llevar a cabo Dot-Blot fue necesario preparar una solución de SDS 10% estéril (NaCl
5 M y NaOH 10 N), solución desnaturalizante estéril (NaOH 0.5 N y NaCl 1.5 M), solución
neutralizante estéril (NaCl1.5M y Tris-HCl0.5M a pH 7.4), solución SSC 10X estéril (NaCl y
Citrato de sodio), regulador Dig Easy Hib, solución 2X SSC 0.1% SDS, solución 0.5X SSC
0.1% SDS, buffer de lavado estéril (ácido maleico 0.1 M, NaCl 0.5 M, pH 7.5 a 20°C, 0.3%
V/V de tween 20), buffer de ácido maleico (100 mM de ácido maleico y 150 mM de NaCl a
un pH de 7.5), solución de bloqueo 1X (leche svelty polvo y buffer de ácido maleico),
solución de anticuerpo (4 µL de Anti-digoxigenin-AP y 20 mL de solución de bloqueo),
buffer de detección estéril (0.1 M Tris-HCl, o.1M Nal a pH 9.5 a 20°C) y sustrato coloidal
(200 µL NBT/BCIP y 10 mL de buffer de detección).
3.1.9.1. Sonda
La sonda fue elaborada por Ruiz-Salas (2010) mediante PCR, usando una clona que
contenía el gen dbat de Taxus globosa.
3.1.9.2. Membrana
La membrana utilizada como soporte de dot blot fue de nylon cargada positivamente
(Hybond-N+)
24
3.2. METODOS
3.2.1. Medio de cultivo M1D2X (Modificada de Strobel, 1996)
Para preparar 800 mL del medio de cultivo se disolvieron los reactivos en 600 mL de agua
destilada, se adicionaron las cuatro primeras soluciones (Tabla 4), y se aforó a 764.8 mL
con agua destilada. Se restaron 40 mL del medio y se repartieron entre 8 tubos destinados
para el inóculo de cada matraz. Con el medio sobrante se le adicionó a cada matraz de
250 mL un volumen de 90.6 mL de medio. En un matraz a parte se mezcló la solución de
acetato/benzoato con el nitrato de calcio. Se esterilizó a 121°C por 15 min, posteriormente
se mezcló la solución de acetato/benzoato/nitrato de calcio con la fenilalanina previamente
esterilizada por filtración. A cada matraz con medio estéril se le adicionó 4.4 de esta última
mezcla.
3.2.2. Cultivo de hogos
La cepa CHTAE39 se sembró en agar papa dextrosa y se incubó 8 días a una
temperatura de 22°C. Estos cultivos fueron utilizados para extraer ADN y ARN, también
para inocular matraces con medio de cultivo M1D2X (modificada de Strobel, 1996). Para
inocular los matraces se recogió micelio y se colocó en tubos de ensayo que contenían 10
perlitas y 5 mL de medio estéril, posteriormente se aplicó vortex para macerar el micelio
contenido en los tubos. El producto obtenido se adicionó a cada matraz que contenía 95
mL de medio y se colocaron en incubación a una temperatura de 22°C y 120 rpm. Se
realizaron dos cultivos, uno inducido y otro sin inducir (control) para cada día de extracción,
que fueron a los ocho, diez y doce días de incubación.
3.2.2.1. Inducción de cultivos
Los cultivos en matraces fueron inducidos a las 48 horas de incubación con 0.4 mL de una
solución de 5-azacitidina a 10 µM de concentración. La solución fue esterilizada por
filtración antes de adicionarla a los cultivos.
25
3.2.3. Extracción de ADN Para la extracción de ADN se llevaron a cabo dos técnicas, la primera fue utilizando
DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) y la segunda técnica fue Cenis 1992;
a) Para realizar la primera, se cultivó la cepa, se recogió el micelio para ser liofilizado.
Después del proceso de liofilización, se macero el micelio con ayuda de mini pistilos
estériles y se pesaron aproximadamente 20 mg de cada muestra para proceder con el
protocolo de extracción de ADN que el proveedor otorga con el kit.
b) Para realizar la técnica de Cenis, se cultivó de igual manera la cepa y se recogió el
micelio. La técnica de Cenis no requiere del micelio liofilizado, se comenzó con el lavado
del micelio adicionando a cada muestra 500 µL de buffer TE seguido de una centrifugación
a 10000 rpm por 5 minutos, después se decantó el sobrenadante. Se adicionaron 300 µL
de solución de lisis y se maceró el micelio con mini pistilos estériles. Se adicionaron 200 µL
de Acetato de Sodio para después aplicarles vortex e incubar por 20 minutos a -20°C,
pasado el tiempo las muestras se centrifugaron a 10000 rpm por 10 minutos. Se recuperó
el sobrenadante y se adicionó alcohol al 100% en la misma cantidad de sobrenadante
recuperado para después mantener las muestras a -20 °C por 45 minutos, se prosiguió con
centrifugación a 10000 rpm por 10 minutos, se decantó el sobrenadante y se lavaron las
pastillas con 500 µL de alcohol al 70%. Se llevaron a centrifugación por 5 minutos a 10000
rpm, se decantó el sobrenadante, se dejaron secar las pastillas y por último se
resuspendieron con 20 µL de TE.
Para la extracción de ADN de tejido de Tejo se utilizaron las hojas de Taxus globosa y el
procedimiento de extracción fue llevado a cabo con DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen).
3.2.4. Electroforesis de ADN
Para determinar la calidad del ADN extraído, una alícuota de 2 µL de cada muestra se
analizó en gel de agarosa 1% mediante la aplicación de un voltaje de 120 V durante 20
minutos, el gel se tiñó con bromuro de etídio y se observó en un transluminador de UV.
3.2.5. Purificación de ADN en gel
Después de observar el gel en el transluminador se cortaron las bandas de cada muestra
para purificar el ADN contenido en el gel de agarosa, siguiendo el manual del fabricante
QIAquick Gel Extraction Kit.
26
3.2.6. PCR
Para preparar muestras de 12.5 µL se adicionaron en tubos eppendorff 7.53 µL de agua
estéril, 1.25 µL de buffer 10X, 0.5 µL de dNTP’s, 0.625 µL de oligo F, 0.625 µL de oligo R,
1.0 µL de MgCl2, 0.125 µL de BSA, 0.075 µL de DNA polimerasa y 0.5 µL de ADN
purificado, después de cada adición se fueron mezclando perfectamente las muestras.
Las condiciones de amplificación del gen dbap fue de un ciclo de 94°C por 5 minutos para
desnaturalizar, 35 ciclos de 94°C por 50 segundos, 56°C por 40 segundos y 72°C por 1.5
minutos para amplificación y un ciclo de 72°C por 10 minutos, con rampa de calentamiento
de 2°C por segundo y de enfriamiento de 1.5°C por segundo.
3.2.7. Extracción de ARN
Se decantó el medio de cultivo de la cepa CHTAE39 inducida y su control en el día ocho,
diez y doce de incubación. Se colocaron 300 mg de peso fresco de micelio de las cepas en
tubos eppendorf y se maceró con pistilos estériles, posteriormente se agregó 1 mL de
TRizol® y 0.2 mL de cloroformo, se continuó macerando hasta obtener una mezcla
homogénea. Se centrifugó durante 10 min a 10000 rpm y se recuperaron 400 µL de la fase
acuosa, posteriormente se agregó isopropanol, en una cantidad igual a la de la fase
acuosa recuperada, se homogenizó y se dejó incubar a temperatura ambiente por 10 min.
Pasado el tiempo de incubación se centrifugó durante 10 min a 10000 rpm, se decantó el
sobrenadante obtenido y el pellet se lavó con 1 mL de etanol 75%. Nuevamente, se
centrifugó durante 10 min a 10000 rpm, se decantó el sobrenadante para dejar secar el
pellet y resuspenderlo en 30 µL de agua estéril libre de ARNasa. Se adicionó ADNasa al
producto obtenido de ARN y se dejó en incubación por media hora a 37°C, después se
llevó a cabo una reextracción de ARN con el mismo procedimiento de la primera
extracción, sin embargo se utilizó la mitad del volumen de cada reactivo.
3.2.8. Preparación de gel desnaturalizante 1.4%
El gel desnaturalizante se preparó al momento de la electroforesis, para preparar 30 mL
del gel se utilizaron 0.35 g de agarosa disuelta con calor en 25 mL de agua destilada,
aparte se realizó una mezcla de 1.75 mL de formaldehido con 3 mL de MOPS 10X y se
llevó a baño maría hasta que alcanzara una temperatura de 50°C y poder adicionarla a la
agarosa.
27
3.2.9. Electroforesis de ARN
Para cargar los posos del gel desnaturalizante fue necesario hacer una mezcla, para el
caso de una muestra; 2 µL de ARN, 3.75 µL formamida, 1.38 µL formaldehido y 0.38 µL de
MOPS, posteriormente se llevó a baño maría a una temperatura de 60°C durante 15 min.
Finalmente se cargó la muestra con 3 µL de naranja G y 0.1 µL de bromuro de etídio.
3.2.10. Dot blot
3.2.10.1. Fijación y desnaturalización
Sobre una membrana de Nylon H+ se colocó una cantidad de 10 µg de ADN genómico o de
ARN de la cepa, 5 µg de la clona (testigo positivo 1) y 5 µg de ADN genómico o ARN de
Taxus globosa (testigo positivo 2), la membrana fue manipulada con pinzas para no ser
maltratada. Las muestras se dejaron secar a temperatura ambiente dentro de la campana
de flujo laminar; posteriormente, la membrana se colocó en cada una de las siguientes
soluciones; SDS al 10% manteniéndola durante 3 min, después la membrana fue colocada
en una solución desnaturalizante durante 5 min a temperatura ambiente, pasado el tiempo
se colocó en la solución neutralizante durante 5 min y por último en la solución de SSC 10
X durante 5 min. Para la fijación del ADN o ARN, la membrana fue expuesta a luz UV por 3
min, se lavó con agua destilada y se dejó secaren campana de flujo laminar.
3.2.10.2. Prehibridación e hibridación.
La prehibridación se realizó colocando la membrana de nylon en un tubo de hibridación, se
agregaron 10 mL de Dig Easy Hib sin sonda, previamente precalentado a 50°C y se colocó
en el horno de hibridación durante 90 min a una temperatura de 48°C. Una vez pasado
este tiempo, el regulador se eliminó por decantación, posteriormente se adicionaron 10 ml
de Dig Easy Hib con sonda a 50°C y se incubó 16 horas a 48°C con agitación suave en el
horno de hibridación.
28
3.2.10.3. Lavados Pasado el tiempo de hibridación la membrana fue lavada en dos ocasiones a condiciones
de baja astringencia usando la solución 2X SSC/0.1% SDS, a una agitación de 180 rpm
durante 5 min y a temperatura ambiente, la solución se eliminó por decantación.
Posteriormente se llevó a cabo el lavado de alta astringencia en dos ocasiones con
solución 0.5X SSC/0.1% SDS, con 180 rpm de agitación durante 15 min a una temperatura
de 50°C y se eliminó la solución por decantación. Se sumergió la membrana en buffer de
lavado a 140 rpm de agitación por 5 min a temperatura ambiente, después se colocó la
membrana en 20mL de solución de bloqueo 1X a una agitación de 100 rpm durante 30 min
a temperatura ambiente. Seguido de esto se hicieron dos lavados de 15min cada uno con
solución de lavado a una agitación de 140 rpm a temperatura ambiente. Se incubó la
membrana en la solución con anticuerpo y a una agitación de 60 rpm durante 45 min a
temperatura ambiente. Posteriormente se realizaron dos lavados de 15min cada uno con
solución de lavado a 140 rpm de agitación a temperatura ambiente.
3.2.10.4. Revelado
Se cubrió la membrana con 25 mL de regulador de detección durante 5 min a temperatura
ambiente y sin agitación, se eliminó esta solución por decantación. La membrana se incubo
en la obscuridad con 10 mL de sustrato NBT/BCIP (cloruro de tetrazolio nitro-azul/ sal p-
toluidina de 5 bromo-4-cloro-3’-indolilfosfato). El revelado se controló cada 5 min, una vez
observada la coloración la reacción se detuvo con agua destilada estéril y finalmente se
dejó secar la membrana.
29
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
30
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. RESULTADOS
Los cultivos de la cepa CHTAE39 (Figura 12) en medio M1D2X con y sin 5-azacitidina a los
seis, ocho, diez y doce días de cultivo. Se puede apreciar ligeramente una mayor cantidad
de pellets en los matraces que contenían el cultivo con 5-azacitidina.
a) b)
c) d)
Figura 12. Fotografías del cultivo de Bjerkandera adusta; a) seis días (control izquierda. y 5-
azacitidina derecha), b) ocho días (control izquierda. y 5-azacitidina derecha), c) diez días (control
derecha. y 5-azacitidina izquierda) y d) 12 días (control izquierda. y 5-azacitidina derecha) de cultivo.
El análisis de los transcritos en gel de agarosa desnaturalizante se muestran en la figura
13, en los carriles 1, 2 y 3 se aprecia un barrido del ARN, extraído de los cultivos control en
los días ocho, diez y doce respectivamente. En los carriles 4 y 5 se muestran bandas de
ARN extraído en el día ocho, en los carriles 6 y 7 las del día diez y en los carriles 8 y 9 las
del día doce.
31
Figura 13. Electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante del transcrito de B. adusta.
En los resultados del análisis de dot blot del gen dbat (Figura 14), se apreciaron señales
positivas de hibridación en los días de cultivo 10 (sitios 5 y 6 control y sitios 7 y 8 con 5-
azacitidina), en los del día 12 (sitios 9 y 10 control y sitios 11 y 12 con 5-azacitidina), en los
controles; clona con gen dbat (sitio 14 y 15) y en el ARN de árbol (sitio 13), sin embargo las
muestras del día 8 (sitios 1-4) no hibridaron por una posible degradación del ARN.
Figura 14. Membrana de nylon H+
de dot blot del gen dbat en B. adusta.
Banda ARN 28 S Banda ARN 18 S Banda ARN 5 S
Barrido de ARN
degradado
32
Tabla 4. Resultados de dot blot con el gen dbat en B. adusta.
Numero en la membrana Muestra de ARN (10 µL) Señal de hibridación
1 8 días control -
2 8 días control -
3 8 días 10 µM -
4 8 días 10 µM -
5 10 días control +
6 10 días control +
7 10 días 10 µM +
8 10 días 10 µM +
9 12 días control +
10 12 días control +
11 12 días 10 µM +
12 12 días 10 µM +
13 Taxus globosa +++
14 Clona dbat +++
15 Clona dbat +++
+++ Representa una mayor intensidad de coloración violeta.
+ Representa una tenue coloración violeta.
- Representa un resultado negativo de hibridación.
4.2. DISCUSIÓN
En el presente trabajo de investigación se extrajo ADN y ARN, y se realizó la detección del
gen dbat usando la técnica de dot blot en el hongo endófito Bjerkandera adusta
(CHTAE39), previamente aislado de Taxus globosa e identificado por el grupo de trabajo.
Cabe resaltar que dentro del grupo, el extracto de esta cepa fue sometido a pruebas de
inmunoensayo y HPLC/MS-MS, las cuales arrojaron resultados positivos en la producción
de Taxol, destacando el uso a diferentes concentraciones de 5-azacitidina, reportado como
un estimulador de metabolismos (Martínez-Cárdenas, 2011). Debido a estos antecedentes,
se decidió estimular los cultivos del hongo con 10 µM de 5-azacitidina, la concentración
que indujo una mayor producción de Taxol en las pruebas anteriores y con un cultivo
control que no contenía 5-azacitidina. Se prosiguió con el trabajo y se detectaron las
señales, tenues pero consistentes, de hibridación con la sonda del gen dbat y el ARN del
33
hongo, tanto en los cultivos con 5-azacitidina como en los cultivos control. Sin embargo no
se percibieron señales positivas con las muestras de ADN debido a las bajas
concentraciones extraídas, a pesar del uso del kit DNeasy Plant Mini (Qiagen) y de la
técnica de Cenis y del intento de amplificación del gen dbat a partir del ADN extraido.
El método de dot blot utilizando ARN fue una prueba cualitativa, que indicó la presencia del
gen dbat tanto en presencia como en ausencia de 5-azacitidina después de los 10 días de
cultivo. Debido a que esta prueba es cualitativa, no permitió apreciar el beneficio de la 5-
azacitidina, como estimulante del metabolismo secundario. Este trabajo sugiere que B.
adusta, asociado a T. globosa, es un hongo endófito productor de Taxol, ya que contiene
en su genoma el gen dbat, codificador de la enzima DBAT, importante catalizadora en la
biosíntesis del Taxol. Se han reportado numerosos hongos capaces de producir este
compuesto, sin embargo, son escasos los reportes de hongos en los que se ha encontrado
alguno de los genes que codifican para alguna de las enzimas de la ruta biosintética de
taxanos. Zhang Peng y colaboradores reportaron en el 2008 quince hongos endófitos
aislados de T. media y T. yunnanesis, que contenían 200 pb del gen dbat, los cuales
fueron examinados con PCR. Existe otro reporte de Miao Z. y colaboradores (2009) donde
aseguran que el hongo Mucor rouxianus sp aislado de T. chinesis produce el precursor
bacatina III detectado en HPLC-ESI-MS pero sin realizar un análisis para detectar el gen
dbat.
34
CONCLUSIÓN Y PERPECTIVAS
35
5. CONCLUSIÓN Y PERSPECTIVAS
5.1. CONCLUSIÓN
La señal positiva de hibridación del ARN de la cepa B. adusta (CHTAE39) con la sonda del
gen dbat de T. globosa, sugiere que éste gen se encuentra entre los transcritos del hongo,
a pesar de ser una respuesta tenue en coloración, es consiste la hibridación.
Esta investigación podría ser la primera que reporta al hongo endófito B. adusta aislado de
T. globosa .como portador del gen dbat.
La hibridación se pudo llevar a cabo con la presencia del estimulador 5-azacitidina y si
este.
El método de dot blot nos ofrece un análisis cualitativo que nos permite apreciar la
presencia o ausencia del transcrito del gen dbat.
5.2. PERSPECTIVAS
La detección del gen dbat en el transcrito del hongo B. adusta, da pie a continuar con el
trabajo experimental y obtener el gen completo, esto puede ser posible a partir de la
síntesis de cDNA teniendo como cadena base el ARN extraído de la cepa. Posteriormente
amplificar y secuenciar el producto y de esta forma compararlo con el gen dbat del Taxus
globosa y así asegurar que el hongo endófito B. adusta es un microorganismo productor
potencial de Taxol.
Un método para poder cuantificar el transcrito del gen dbat extraído es la PCR en tiempo
real, el cual es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa utilizada para
amplificar y simultáneamente cuantificar el producto. Para ello emplea del mismo modo
que la PCR convencional un molde de ARN, cebadores del gen dbat, dNTPs y ADN
polimerasa, a dicha mezcla se le adiciona un marcador, en un termociclador que cuente
con sensores para medir fluorescencia, esto permite medir la taza de generación.
36
}
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
37
6. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
Aguilar Ramírez Areli Azucena, 2007. “Selección de microorganismos endofíticos
asociados al tejo mexicano capaces de producir Taxol”, Informe técnico UPIBI-IPN,
México, D.F.
Aspectos farmacogenéticos en el tratamiento de cáncer de mama con Tamoxifeno,
recuperado el 13 de octubre de 2011, de books.google.com.mx:www.google.com
Baloglu Erkan, Kingston David, 1999. “Review, The Taxane Diterpenoids”, J, Nat. Prod.
62:1448-1472.
Cao Rong, Zhang Yonghui, Mann Francis M, Huang Cancan, Mukkamala Dushyant,
Hudock Michael P, Mead Matthew E, Prisic Sladjana, Wang Ke, Lin Fu-Yang, Chang
Ting-Kai, Peters Reuben J, Oldfield Eric, 2010. “Diterpene cyclases and the nature of
the isoprene fold”, Proteins 78:2417–2432.
Centelles Josep J, Imperial Santiago, 2010. “Paclitaxel; descubrimiento, propiedades y
uso clínico”, Fitoterapia 29(4):69-75.
Engels Benedikt, Dahmb Pia, Jennewein Stefan, 2008. “Metabolic engineering of
taxadiene biosynthesis in yeast as a first step towards Taxol (Paclitaxel) production”,
Metabolic Engineering 10:201– 206.
Heinig Uwe, Jennewein Stefan, 2009. “Review Taxol: A complex diterpenoid natural
product with an evolutionarily obscure origin”, African Journal of Biotechnology 8 (8):
1370-1385.
Martínez-Cárdenas Anahí, 2011. “The effect of 5-azacitidine on Taxol production by
Bjerkandera adusta, a fungus isolated from Taxus globosa”, 4th Congress of European
Microbiologist, Suiza.
Miao Z, Wang Y, Yu X, Guo B, Tang K, 2009. “A New Endophytic Taxane Production
Fungus from Taxus Chinensis”, Applied Biochemistry and Microbiology 45 (1):81–86.
38
Ramos-Lobato N. A, Soto-Hernández M, Zavala-Chávez F, Rodríguez-González M. T,
2002. “Taxoides en el follaje del tejo mexicano (Taxus globosa Schelecht.)”, Chapingo
Serie Horticultura 9(1): 29-38.
Ruíz-Salas Jorge Luis, 2010. “Búsqueda de genes involucrados en la síntesis de
taxanos en bacterias aisladas de Taxus globosa”, Tesis de Maestría. CINVESTAV,
México D.F.
Soto M, Sanjurjo M, González Ma. T, Cruz D, Giral F, 2000. “El tejo mexicano (Taxus
globosa Sch.). Potencial en su aprovechamiento en Taxol”, Ciencia Ergo Sum 7:277-
279.
Suárez Sánchez Roberto Arturo, 2009. “Estudio de la biodiversidad de hongos
endofíticos asociados al Taxus globosa y su potencial para producir Taxol”, Tesis de
Maestría, CINVESTAV Hidalgo, México.
Sun Pei-Xin, Zheng Cheng-Jian, Li Wen-Chao, Jin Gui-Lin, Huang Fang, Qin Lu-Ping,
2011. “Trichodermanin A, a novel diterpenoid from endophytic fungus culture”, J Nat
Med 65:381–384.
Vital Beraud Cecilia de la Paz, 2008. “Aislamiento de bacterias asociadas a Taxus
globosa y análisis de su capacidad para producir Taxol”, Tesis de Maestría,
CINVESTAV México, D.F.
Walker Kevin, Croteau Rodney, 2001. “Taxol biosynthetic genes”, Phytochemistry 58:1-
7.
Wheeler Alenka Lovy, Long Robert M, Ketchum Raymond, Rithner Christopher,
Williams Robert, Croteau Rodney, 2001. “Taxol Biosynthesis: Differential
Transformations of Taxadien-5a-ol and Its Acetate Ester by Cytochrome P450
Hydroxylases from Taxus Suspension Cells”, Archives of Biochemistry and Biophysics
390 (2):265–278.
Zavala-Chávez F, Soto-Hernández M, Rodríguez-González Ma. T, 2001. “El romerillo
(Taxus globosa schlecht.): biología, dificultades y perspectivas de su uso”, Chapingo
Serie Horticultura 7(1): 77-94.
39
Zhan Peng, Zhou Peng-peng, Jiang Chen, Yu Hui, Yu Long-Jiang, 2008. “Screening of
Taxol-producing fungi based on PCR amplification from Taxus”, Biotechnol Lett.
Zhong Jian-Jiang, Yue Cai-Jun, 2005. “Plant Cells: Secondary Metabolite Heterogeneity
and Its Manipulation”, Adv Biochem Engin/Biotechnol 100: 53–88.