0141 BIOQUMICA EXPERIMENTAL Seccin 3. ACTIVIDAD ENZIMTICA

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3. ACTIVIDAD ENZIMTICA

PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA LACTATO DESHIDROGENASA DE MSCULO ESQUELTICO DE BOVINO.

Objetivos

- Conocer las caractersticas generales de las enzimas como catalizadores biolgicos. - Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un mtodo

espectrofotomtrico. - Relacionar los distintos parmetros asociados a la medicin de la actividad enzimtica que

permiten seguir y evaluar la purificacin de una enzima (actividad especfica, rendimiento y enriquecimiento).

Introduccin Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reaccin y no se consumen o modifican durante sta. Sin su presencia, muchas de las reacciones bioqumicas celulares no podran proceder a la velocidad requerida. El incremento en la velocidad de la reaccin se encuentra entre 106 a 1012 veces con respecto a la reaccin en ausencia del catalizador. Otra propiedad de las enzimas es su alto grado de especificidad; solamente catalizan la reaccin en la que participa un sustrato (especificidad absoluta) o un grupo de sustratos con ciertas caractersticas qumicas y geomtricas comunes (especificidad de grupo). La enzima, al ser una protena, tiene una estructura geomtrica caracterstica y la porcin de la enzima que especficamente une o reacciona con el sustrato se denomina centro cataltico o sitio activo. Para muchas enzimas sus residuos de aminocidos son suficientes para efectuar la catlisis, para otras es necesario que exista un cofactor, ya que en ausencia de ste no se cataliza la reaccin. El cofactor es un in metlico como el Fe2+, Zn2+, Mo2+. Para otras reacciones se necesita una coenzima, es decir una molcula orgnica con caractersticas no proteicas, que generalmente se sintetiza a partir de vitaminas. La coenzima funciona como un cosustrato cuando se une transitoriamente al sitio activo de la enzima, de tal forma que se libera al medio durante cada ciclo cataltico. ste es el caso de las deshidrogenasas que trabajan con el NAD+, como la enzima que nos ocupar en sta seccin experimental. Cuando la coenzima se une fuertemente a la enzima, ya sea por medio de enlaces covalentes o interacciones no covalentes, se le da el nombre de grupo prosttico. Diseo de un ensayo enzimtico Durante el aislamiento y purificacin de una enzima, es necesario realizar un ensayo para determinar la cantidad y pureza de la enzima, as como evaluar las caractersticas cinticas de la enzima. Para el diseo de un ensayo enzimtico se requiere conocer la reaccin que se analiza, es decir: A) cuales son las especies que se requieren (sustrato, la o las coenzimas, el o los cofactores, entre otros); B) la estequiometra completa, y C) los efectos del pH, temperatura y fuerza inica sobre la actividad de la enzima. Adicionalmente a lo anterior, debe de estar disponible un mtodo para identificar y monitorear cualquier cambio fsico, qumico o biolgico que ocurre durante la conversin del sustrato a producto. Se pueden utilizar distintas tcnicas para determinar los cambios en las concentraciones de sustrato o producto como la espectrofotometra, la fluorometra, la titulacin cido-base y el conteo radiactivo. La eleccin de alguna de ellas depende esencialmente de las caractersticas estructurales del sustrato y/o producto, as como de la qumica de la reaccin.

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Si un ensayo enzimtico involucra el seguimiento de la concentracin del sustrato o producto durante un intervalo de tiempo, el ensayo se denomina cintico. Por otro lado, cuando se realiza la determinacin de la concentracin del sustrato o producto a un solo tiempo, se denomina ensayo a tiempo fijo. En lo posible se recomienda realizar ensayos temporales de reaccin, ya que cualquier desviacin de la linealidad puede detectarse inmediatamente. Los cambios en la linealidad de la reaccin pueden deberse a una o varias causas, el decremento en la concentracin de sustrato, la desnaturalizacin de la enzima y a la inhibicin causada por el producto de la reaccin. Pero, hay que aclarar que la velocidad inicial de una reaccin ocurre en los primeros minutos de la reaccin, una relacin lineal que se mantiene cuando el consumo de sustrato no va ms all del 5% de la concentracin inicial. Por tanto, cuando se realiza un estudio sobre la actividad enzimtica, es fundamental que las velocidades que se obtengan sean las iniciales. Lactato deshidrogenasa de mamfero. El nombre cientfico de la lactato deshidrogenasa o LDH es L-lactato: NAD+ oxidoreductasa (EC 1.1.1.27). Es una enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneracin del ATP. La actividad de la LDH es alta durante la actividad fsica intensa, cuando la tensin de oxgeno disminuye y la demanda de ATP es alta. Bajo condiciones aerobias, la enzima cataliza de manera reversible la conversin de lactato a piruvato (Figura 3.1). Pero lo contrario ocurre cuando disminuye el O2 celular o bien el pH es cercano a 7.0, entonces el piruvato es convertido a lactato con la concomitante conversin de NADH a NAD+. La regeneracin del NAD+ permite que el flujo de la va glucoltica contine. La actividad de la enzima decrece en el sentido de Piruvato Lactato cuando la demanda de energa cesa o hasta que los niveles de lactato llegan a ser altos e intolerables.

Figura 3.1. Reaccin que cataliza la lactato deshidrogenasa. La reduccin del piruvato para formar lactato es reversible y dependiente de la presencia de una coenzima. La LDH es un tetrmero de subunidades con un peso molecular de 35 kDa cada una. Hay dos tipos de subunidades, la H que predomina en el corazn y la M que predomina en el msculo y el hgado. Las subunidades se pueden asociar formando 5 tipos de tetrmeros con estequiometras distintas: H4, H3M1, H2M2, H1M3 y M4. Todos estos tienen actividad de LDH, pero tienen diferentes afinidades por el lactato o el piruvato. Las enzimas que catalizan la misma reaccin pero difieren en su estructura son llamadas isoenzimas. En la prctica se determinar la actividad de la LDH de msculo esqueltico de bovino, enzima que contiene casi exclusivamente subunidades M, esto es la isoenzima M4. En est parte del protocolo se medir a diferentes tiempos la reaccin en el sentido de Piruvato Lactato, utilizando como fuente de enzima las fracciones que fueron obtenidas durante el protocolo de purificacin de la LDH de la seccin II del manual. El ensayo de actividad est basado en la deteccin del cambio de absorcin del NADH y el NAD+. El NADH es una molcula que absorbe a 340 nm, mientras que el NAD+ no. Entonces, la actividad de la enzima en las muestras se detectar como una disminucin en la absorbancia a 340 nm, debido a que en la reaccin el NADH es convertido a su forma oxidada, el NAD+.

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Material biolgico. Fraccin 1 Fraccin 2 Fraccin 3 Fraccin PA Fraccin PB Material y equipo Celdas de plstico Tubos de microfuga Parafilm 1 Recipiente para hielo 1 Micropipeta de 200-1000 L 1 Micropipeta de 20-200 L 1 Micropipeta de 2-10 L 1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta 1 caja de puntas de 200 L para micropipeta 1 Vrtex Espectrofotmetro (por grupo) Reactivos 1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0 10 mM Piruvato de sodio 4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo, puede usarse el amortiguador de fosfatos para su disolucin. Verificar que la absorbancia a 340 nm sea mayor de 1.0, si no es as volver a pesar y medir. Desarrollo experimental. Curvas temporales de actividad de lactato deshidrogenasa. Se sugiere que todos los equipos midan primero la curva temporal de actividad a la fraccin 3, que es la fraccin que usarn para obtener los parmetros cinticos de la enzima. Para obtener las curvas de actividad determinarn la dilucin ptima de enzima para realizar los ensayos. Una vez que concluyan con esa fraccin y dependiendo del tiempo que hayan consumido de la sesin, realizar posteriormente las curvas temporales de actividad a la fraccin 1 y/o la fraccin purificada A o B. Las mezclas de reaccin se realizarn directamente en las celdas de plstico. Se usar agua para ajustar a 0 el espectrofotmetro.

1. Descongelar la protena y mantenerla a 4C en un recipiente con hielo. Hacer una primera dilucin de la fraccin 3, se recomienda 1:10.

2. Se etiquetan 5 celdas. 3. A cada una de las celdas se les aadirn los siguientes componentes:

515 L 100 mM Amortiguador de fosfatos 29.3 L 10 mM Piruvato 210.7 L H2O

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4. Todas las celdas se mantienen en el hielo. Despus adicionar a una de la celdas 50 L de 4 mM NADH e inmediatamente agregar 10 L de la muestra de enzima diluida.

5. Se tapa la celda con parafilm y se agita por inversin dos veces y se lee inmediatamente la absorbancia a una longitud de onda de 340 nm. Consideraciones: si la absorbancia inicial es menor de 0.4 es posible que la actividad de la enzima sea muy alta, por lo que se recomienda repetir el ensayo en una de las celdas ya preparadas y hacer una dilucin mayor de la enzima, si no hay cambio en la absorbancia entonces diluir menos la muestra.

6. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.1). El ensayo de actividad se realizar a temperatura ambiente, por lo que una vez adicionada la enzima hay que mantener la celda dentro del espectrofotmetro.

Tabla 3.1. Lecturas de absorbancia de las fracciones obtenidas de la purificacin de protenas

Tiempo (min) F3 Dilucin

F__ Dilucin

F___ Dilucin

F____ Dilucin

F____ Dilucin

0.5

1.0 1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0