Desarrollo de metodologías para la

determinación de drogas veterinarias y

residuos de pesticidas en productos

cárnicos mediante HPLC y GC-MS/MS

Souza, Rodrigo; Muela, Agustina; Fernández, Paula;

Heinzen, Horacio; Cesio, María Verónica; Pareja, Lucia

lpareja@fq.edu.uy

Grupo de Análisis de Compuestos Traza (GACT)

• Cátedra de

Farmacognosia y

Productos Naturales

• Departamento de

Química del litoral

• Centro Universitario

Regional Este

Introducción

• Uruguay es uno de los

mayores productores y

consumidores de

productos ganaderos en el

mundo.

• Presenta un consumo

interno de

aproximadamente 180 mil

toneladas de carne y una

exportación de 256 mil

toneladas.

https://www.inac.uy/innovaportal/file/1283/1/exportacion-producto-adelanto-bol-digital.pdf

Introducción

•El ganado es alimentado con agua, pasturas y ración que

puede contener residuos de plaguicidas.

•A su vez el uso de drogas veterinarias es una práctica muy

extendida para evitar enfermedades.

•El uso de estos productos fitosanitarios puede resultar en la

presencia de los mismos en tejidos y órganos.

•La presencia de los mismos en riñón es un riesgo al

consumidor y un indicador de exposición del animal a dichos

contaminantes.

Objetivo

“Desarrollo y validación de una metodología

para el análisis de 76 pesticidas y 24 drogas

veterinarias en productos cárnicos”

Experimental

Selección de compuestos

• Se seleccionaron compuestos en base a los criterios

establecidos en el Plan Nacional de Residuos Biológicos

(Uruguay), Codex Alimentarius y Unión Europea.

• Se escogieron distintas familias de compuestos (insecticidas,

herbicidas, acaricidas, fungicidas y antibióticos).

Inse

ctic

idas

AcephateAcetamipridAzinphos MethylBeta CyfluthrinBifenthrinBuprofezinCarbarylCarbofuranChlorpyrifosChlorpyrifos methylClothianidinCypermethrinDimethoateEmamectin-BenzoateEthionFenthionFenvalerateFipronilLambda-CyhalothrinHexythiazoxImidaclopridMalathion/MalaoxonMetidathionMethiocarbMethomylMethoxyfenozidep,p-DDEp,p-DDTSpinosadChlorantraniliprolePermethrinPirimifos methylPropoxur

Inse

ct. Tebufenozide

ThiaclopridThiametoxamTriflumuron

AbamectinAlbendazoleAzaperolClembuterolCoumaphosDiclofenacEprinomectinFenbendazoleFlunixinIvermectinMoxidectinNitroxinilParacetamolSalbutamolTriclabendazoleClorsulonClosantelOxyclonazide

PropanilBentazoneDicambaHaloxyfop methylMCPATrifluralinFluazifop

Fun

gic

idas Azoxystrobin

BoscalidCarbendazimDifenoconazoleEpoxiconazoleFenhexamidFlusilazoleFlutriafolKresoxim methylIsoprothiolaneMebendazoleMepanipyrimMetconazolePyraclostrobinTetraconazoleTrifloxystrobinPropiconazoleTitriconazole

ChloramphenicolFlorfenicolNitrofurantoinAmoxicilinDanofloxacinMonensinEnrofloxacinStreptomycin

Otr

os

He

rbic

idas

An

tib

ioti

cos

Condiciones Cromatográficas LC-MS/MS

Volumen de inyección: 5μL

Voltaje de fuente (IS): 5000/-4500 V (+/-)

Temperatura de la fuente (T): 400 ºC,

Curtain Gas (CUR): 20 psi

Collision Gas (CAD): Medio (N2)

Ion Source Gas (GS1, GS2): 50 psi

t (min) % A (H2O 0,1% Ac.Form) % B (ACN)

0 50 50

1 50 50

3 0 100

7 0 100

8 50 50

12 50 50

t (min)% A (H2O 0,1% Ac.Form,

5 mM Form.Amonio)

% B (MeOH 0,1% Ac.Form, 5

mM Form.Amonio)

0 98 2

1 98 2

12 0 100

16 0 100

21 98 2

26 98 2

ESI +

Columna: Agilent Zorbax Eclipse XDB, C-18

4000-QTRAP-MS/MS

ESI -

Condiciones Cromatográficas GC-MS/MS

GCMS TQ8040 Shimadzu

Rtx-5MS capilar

Columna

1 μL, splitless

Volumen de

inyección 240 °C inyector,

300 °C interfase

Temp.

He a 14 mL/min

Gas

RateTemp Final

(°C).

Tiempo de

espera (min)

- 80.0 2.00

20.00 180.0 0.00

5.00 300.0 3.00

• Tiempo total: 34 min

Extracto de riñón envenenado a 50 μg/kg

SRM 1 y SRM 2 de abamectina

Tiempos de retención 2 transiciones (SRM)Relación de

SRM2/SRM1

Criterios de identificación

Métodos evaluados

5 g de muestra

15 mL AcOEt, 1,5 g de NaCl, 4 g de MgSO4

Freeze out 24 hs, 60 mg de C18, 100 mg de

Al2O3, 600 mg de MgSO4

5 g de muestra/5 mLH2O

15 mL AcOEt, 1,5 g de NaCl, 4 g de MgSO4

Freeze out 24 hs, 60 mg de C18, 100 mg de

Al2O3, 600 mg de MgSO4

5 g de muestra/5 mLH2O

10 mL ACN, 1 g de NaCl, 4 g de MgSO4, 1 g de Na3C6H5O, 0,5 g de

Na2C6H5O7.6H2O

60 mg de C18, 600 mg de MgSO4

Análisis instrumental

• Porcentaje de recuperación de la muestra fortificada

Veracidad

• Repetitividad y ReproducibilidadPrecisión

• LOQ, nivel de concentración más bajo con porcentaje de recuperación 70-120% y RSD < 20%

LOQ

• Análisis de residuales y coeficiente de regresión, en solvente y matriz.

Linealidad

• Comparación de las pendientes de las curvas en solvente y matriz

Efecto matriz

Document No.SANTE/11813/2017;http://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/guidance_documents/docs/qualcontrol_en.pdf.

Resultados

Veracidad y precisión

• De los métodos evaluados el previamente validado por

nuestro grupo para leche mostró los mejores resultados.

• Se evaluó la veracidad y (repetitividad y reproducibilidad) a

5, 20 y 50 µg/kg.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

% R

ecupera

ció

n

Compuesto

5 μg/kg 20 μg/kg 50 μg/kg

70%

120%

14%

29%57%

LOQ, Linealidad y Efecto Matriz

LC-MS/MS

• 72 compuestos presentaron un limite de cuantificación de

5 μg/kg, con un rango lineal de 1-100 μg/kg.

• Sólo 2 compuestos presentaron limites más altos a 20

μg/kg, con un rango lineal de 10-100 μg/kg

% EM < 20

% EM > 50

20 < %EM< 50

y = 3003.4x + 3494.5R² = 0.9993

y = 4574.7x + 9818.6R² = 0.9989

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

0 20 40 60 80 100 120 140

Áre

a

Concentración

LOQ, Linealidad y Efecto Matriz

GC-MS/MS

• 23 compuestos presentaron un limite de cuantificación de 5

μg/kg, con un rango lineal de 1-100 μg/kg.

• 3 compuestos presentaron limites más altos a 20 μg/kg, con

un rango lineal de 10-100 μg/kg.

8%

37%55%

% EM < 20

% EM > 50

20 < %EM< 50y = 650.79x - 576.42

R² = 0.9997

y = 980.8059x - 121.1005R² = 1.0000

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0 20 40 60 80 100 120

Áre

a

concentracion

Otras Matrices: Método Final

Hígado

Análisis intrumental

HPLC-MS/MS GC-MS

Extracción5 g muestra + 15 mLAcOEtSalting out MgSO4 + NaCl

Clean-up 2

60 mg C-18, 100 mg Al2O3,

600 mg MgSO4

Clean-up 1

Freeze-out (12 hs)

Músculo

+ 5 mL H2O

0

20

40

60

80

100

120

140

% R

ec &

RSD

Compuesto

10 µg/kg 100 µg/kg 250 µg/kg

Hígado: GC-MS y LC-MS/MS

% Recuperación y RSD a 10, 100 and 250 µg/kg

70%

120%

0

20

40

60

80

100

120

140

% R

ec &

RSD

Compuesto

10 µg/kg 100 µg/kg 250 µg/kg

Músculo: GC-MS y LC-MS/MS

% Recuperación y RSD a 10, 100 and 250 µg/kg

•LOQs en LC-MS/MS fueron 5 y 10 µg/kg, menores a los LMRs

establecidos por la UE y Codex Alimentarius.

•Para GC-MS los LOQs fueron en general 10 µg/kg (5-fold

concentration).

Hígado y Músculo

•La linealidad fue correcta en ambos instrumentos para mbas

matrices; evaluadas mediante el coeficiente de

determinación y el cálculo de residuals (BCC).

y = 35045x + 511651R² = 0.9987

y = 31820x + 249277R² = 0.9989

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

35000000

40000000

0 500 1000 1500

Are

a

Concentración (μg/kg )

Solvent Liver

Hígado: GC-MS & LC-MS/MS

90%

6%4%

Linealidad y EM

% EM < 20

% EM > 5020 < %EM< 50

y = 13085x + 294582R² = 0.9973

y = 13912x + 320274R² = 0.9969

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

0 200 400 600 800 1000 1200

Are

a

Concentración (μg/kg)

Solvent Muscle

Músculo: GC-MS & LC-MS/MS

85%

9%6%

Efecto Matriz

% EM < 20

% EM > 5020 < %EM< 50

Muestras reales: Ivermectina en hígado

Rt=18,07 min

Concentración: < MRL UE (100 µg/kg)

Conclusiones y trabajo a futuro

• Se validó una metodología para el análisis simultáneo de

pesticidas y drogas veterinarias en riñón.

• Se logró introducir en el alcance del método las

avermectinas.

• Compuestos de elevada polaridad como los herbicidas

ácidos se pueden analizar con el mismo método.

Perspectivas

• Evaluar un mayor número de muestras comerciales con

el fin de generar información que contribuya a evaluar

la inocuidad de los productos cárnicos de nuestro país.

• Aumentar el alcance del método a más drogas

veterinarias.

Agradecimientos

Gracias