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DESARROLLO DE UN MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A

ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM PARA LA DETECCIÓN DE ESCOPOLAMINA Y CONFIRMACIÓN

DE BENZODIACEPINAS EN MUESTRAS DE ORINA

Servicio de Bioquímica Clínica Laboratorio de Medicina Hospital Universitario Central de Asturias

Eduardo Martínez Morillo, Paula Lafuente Ganuza, Belén Prieto García, Francisco V. Álvarez Menéndez

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

CG-MS/MS Hospital Universitario Central de Asturias 2

Introducción

La escopolamina (burundanga) es un alcaloide tropánico obtenido de plantas solanáceas (estramonio)

A dosis ↑: efectos en el SNC Dolor de cabeza Desorientación, mareo Agitación, alucinaciones Delirio y confusión.

La escopolamina ha sido asociada a casos de abusos sexuales por sumisión química

Disponer de un método de referencia que permita identificar su presencia en casos sospechosos de intoxicación puede ser de utilidad

Pueden presentar falsos positivos (por sertralina, AINES, etc)

Indicaciones en medicina: Prevención de la cinetosis Premedicación en anestesia Espasmos del tracto gastrointestinal

Los inmunoensayos son los métodos de cribado habitualmente usados para la detección de benzodiacepinas en orina en casos de intoxicaciones, o para la monitorización de pacientes psiquiátricos

Los métodos de referencia pueden ser necesarios para confirmar los resultados positivos


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Desarrollar dos métodos de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en tándem (GC-MS/MS) para la detección de escopolamina y para la confirmación de benzodiacepinas en muestras

de orina.

Objetivo

CG-MS/MS Hospital Universitario Central de Asturias


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Material y Métodos

Se inyectan 2 µL de muestra en el GC-MS/MS

Escopolamina

Cromatógrafo de gases (456-GC) acoplado a un espectrómetro de masas de triple

cuadrupolo (Scion TQ, Bruker)

Columna capilar Rxi®-5Sil MS (RESTEK) - escopolamina Columna capilar BR-5ms - benzodiacepinas

Extracción sólido-líquido cartuchos Bond Elut Certify, Agilent

- Lavado del cartucho con agua, ácido acético 1M y metanol - Elución con 2 mL de diclorometano-isopropanol-amoniaco (78/20/2)

Evaporación del disolvente en corriente de nitrógeno

+50 µL BSTFA-TMCS 1% (agente derivatizante)

Incubación a 70ºC durante 20 min

+150 µL de acetato de etilo

2 mL de orina con escopolamina (Sigma-Aldrich) + 100 µL de PI (Proadifen, 100 µg/mL) + 1 mL de tampón fosfato (0.1M, pH=6).



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Material y Métodos

Incubación 1 mL orina 3 horas a 65ºC con β-glucuronidasa

Se inyectan 2 µL de muestra en el GC-MS/MS

Extracción sólido-líquido cartuchos Bond Elut Certify, Agilent

- Lavado del cartucho con agua, tampón acetato (pH=4.0) y metanol - Elución con 2 mL de metanol-amoniaco (98/2)

Evaporación del disolvente

+50 µL BSTFA-TMCS 1% (agente derivatizante)

Incubación a 70ºC durante 20 min

+150 µL de acetato de etilo

Benzodiacepinas




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Material y Métodos

1. Full Scan Identificación de compuestos en librería NIST MS Search 2.0

y selección de los iones precursores más característicos

2. Product Ion Selección de fragmentos y energías de colisión (EC)

3. MRM

Selección de las 4-5 transiciones más intensas y específicas

Optimización del método en tres pasos Análisis de muestras en modo:




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Resultados y discusión

Gradiente de temperaturas (ºC) del horno para la separación de la escopolamina

Espectro de masas obtenido para una solución patrón de

escopolamina 10 µg/ml (A) y comparación con el espectro disponible en la

librería NIST MS Search 2.0 (B)

Tª del inyector: 250ºC Gas portador: He a flujo constante: 1 ml/min Tiempo total de análisis: 35 min (tabla 1)

Análisis de escopolamina en modo MRM (polaridad positiva)

Tiempo de retención Proadifen (PI): 21.52 min Tiempo de retención Escopolamina: 22.11 min



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Fragmentos con mayor intensidad: iones 154, 138, 120 y 94

Patrón de fragmentación del ión 375 (Precursor)

Análisis en modo “product ion” y selección de fragmentos iónicos para ser filtrados en el tercer cuadrupolo




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Transiciones utilizadas para la identificación de la escopolamina y del proadifen

Transiciones e intensidades relativas del método MRM

Evaluación de sensibilidad. Pico cromatográfico en 6 muestras de orina con 0, 150, 300, 500, 1000 y 2000 ng/ml de escopolamina

La escopolamina fue detectada en todas las muestras salvo en la primera (blanco de muestra)



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Características del método MRM para benzodiacepinas:

Calibradores Preciset DAT Plus I, Cobas®, Roche Material de control LiquichekTM Qualitative Urine

Toxicology (Bio-Rad)

Se confirmó que este método es capaz de identificar nordiazepam (≥150 ng/mL) y oxazepam (≥300 ng/mL) a concentraciones ≤ los puntos de corte utilizados en

los métodos de cribado CG-MS/MS

Hospital Universitario Central de Asturias


Conclusión

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La CG-MS/MS es una metodología que proporciona mejores prestaciones analíticas que la tradicional GC-MS

El análisis en modo “MRM” es más específico que el análisis en modo “SIM” y más

sensible que el análisis en modo “Full Scan”

Es una metodología de referencia de alto rendimiento para la confirmación de benzodiacepinas e identificación de escopolamina en muestras de orina



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