desarrollo de aptámeros para su uso en recuperación de

TRABAJO ESCRITO CORRESPONDIENTE A LA OPCIÓN DE TITULACIÓN: CURRICULAR

EN LA MODALIDAD DE:

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

DESARROLLO DE APTÁMEROS PARA SU USO EN

RECUPERACIÓN DE PROTEÍNAS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

INGENIERO BIOTECNÓLOGO

PRESENTA:

ROSAS RODRÍGUEZ BELEN ESTEFANÍA

México, D. F. 21 julio de 2015

DIRIGIDA POR: DR. EDGAR SALGADO MANJARREZ.

NOMBRE DIRECTOR(ES)

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

1 Desarrollo de aptámeros para su uso en recuperación de proteínas

D

Desarrollo de aptámeros para su uso en recuperación

de proteínas

INFORME TÉCNICO

BELEN ROSAS


Contenido

Resumen ......................................................................................................................................... 5

1 Introducción ............................................................................................................................. 6

2 Justificación ........................................................................................................................... 15

3 Objetivos ................................................................................................................................ 16

3.1 Objetivo general ............................................................................................................. 16

3.2 Objetivos particulares ..................................................................................................... 16

3.3 Alcances ......................................................................................................................... 16

4 Metodología ........................................................................................................................... 17

4.1 Construcción del plásmido de expresión con dos etiquetas de recuperación para su

transformación por el método SLIC .......................................................................................... 17

4.2 Configuración del inserto de DNA codificante al péptido con dos etiquetas de

purificación ................................................................................................................................ 18

4.3 Diseño de oligonucleótidos específicos para amplificar el inserto con dos etiquetas de

recuperación .............................................................................................................................. 18

4.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). .............................................................. 18

4.4.1 Purificación del inserto utilizado PureLink PCR purification kit ............................. 19

4.4.2 Concentración de producto de PCR utilizando membranas de ultrafiltración

(Amicon Ultra centrifugal filter units) ..................................................................................... 20

4.5 Cepas bacterianas ......................................................................................................... 20

4.6 Medio de cultivo ............................................................................................................. 20

4.7 Preparación de células de Escherichia coli Calcio competentes .................................. 20

4.8 Transformación de Escherichia coli por choque térmico .............................................. 21

4.9 Extracción de ADN plasmídico de Escherichia coli por lisis alcalina ............................ 22

4.10 Extracción y purificación de DNA plasmídico de Escherichia coli por minipreps ......... 22

4.11 Clonación por el método SLIC (Clonación Independiente de Secuencia y Ligación) .. 24

4.11.1 Digestión del plásmido con enzimas de restricción ............................................... 24

4.11.2 Precipitación de DNA plasmídico con acetato de sodio. ....................................... 24

4.11.3 Clonación independiente de secuencia y ligación (SLIC), reacción de alineación 25

4.11.4 Selección de células transformadas ....................................................................... 25

5 Resultados ............................................................................................................................. 26

5.1 Amplificación del inserto construido .............................................................................. 26

5.2 Transformación de E. coli por choque térmico .............................................................. 26

5.3 Caracterización molecular del plásmido pET28 b (+) ................................................... 27


5.4 Producto de extracción por miniprep ............................................................................. 27

5.5 Vector digerido con SacI y XhoI para SLIC. .................................................................. 28

5.6 Producto de SLIC ........................................................................................................... 28

6 Discusión ............................................................................................................................... 29

7 Conclusiones ......................................................................................................................... 33

8 Referencias ............................................................................................................................ 34

Anexo A ......................................................................................................................................... 36

Anexo B ......................................................................................................................................... 37


Índice de tablas

Tabla 1. Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de DNA de las etiquetas de recuperación y

el sitio de corte a proteasas. ......................................................................................................... 18

Tabla 2. Composición de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificación de inserto.

....................................................................................................................................................... 19

Tabla 3. Tratamientos para transformación de E. coli por choque térmico. ................................ 21

Tabla 4. Reacciones de digestión para el plásmido pET28b (+) ................................................. 24

Tabla 5. Concentración de DNA producto de PCR. ..................................................................... 27

Índice de figuras

Figura 1. Esquematización del método de clonación Gateway ® [14]. ....................................... 11

Figura 2. Esquematización del método de clonación Gibson. ..................................................... 11

Figura 3. Esquematización del método Clonación Independiente de Secuencia y Ligación

(SLIC). ........................................................................................................................................... 12

Figura 4. Esquematización de proceso de desarrollo de aptámeros FluMag-SELEX [18]. ........ 14

Figura 5. Mapa circular del plásmido pET-28b (+). Secuencia obtenida desde [22]. ................. 17

Figura 6. Electroforesis en agarosa para análisis de producto de PCR. El primer carril contiene

el marcador de peso molecular de 50 kb (invitrigen), C- control negartivo, M1-M5 ensayos de

PCR. .............................................................................................................................................. 26

Figura 7. . Tratamientos de transformación genética en E. coli .................................................. 26

Figura 8. Separación de bandas del producto de miniprep mediante electroforesis en agarosa.

....................................................................................................................................................... 27

Figura 9. Doble digestión con EcoRV y XhoI del producto de extracción de DNA plasmídico por

lisis alcalina. .................................................................................................................................. 27

Figura 10. Producto de reacción de digestión doble con SacI y XhoI. ........................................ 28

Figura 11. Esquema de las regiones codificantes contenidas en el inserto clonado en pET-28b

(+). Incluida la región estimada digerida por T4 polimerasa con actividad exonucleasa de 3’ a 5’

....................................................................................................................................................... 29

Figura 12. Esquematización de los extremos del inserto después de digerir con T4 polimerasa.

....................................................................................................................................................... 29

Figura 13. Caracterización molecular del vector pET28 b (+) mediante análisis de restricción

con EcoRV y XhoI. ........................................................................................................................ 30

Figura 14. Esquematización del vector pET28b (+)- inserto de 5465 bp. ................................... 31

Figura 15. Esquematización del marco de lectura en la región 110-330 del vector de expresión

pET28b (+)-inserto. ....................................................................................................................... 32

Figura 16. Uso de codones en E. coli. [21] .................................................................................. 36

Figura 17. Análisis de restricción del plásmido pET28b (+) con las enzimas HindIII y EcoRV

para la digestión doble (carriles pares) y con HindII para la digestión sencilla (carriles nones),

marcador de peso 1 kb. ................................................................................................................ 37


Resumen

El presente proyecto de investigación propone un método de desarrollo de aptameros

hacia la etiqueta de recuperación Nanotag9 fusionada a la etiqueta 6xHis, a su vez entre

estas dos etiquetas de recuperación se encuentra un sitio de corte para enteroquinasa

la cual escindirá el péptido para posibilitar una selección negativa. La producción del

péptido se pretende realizar mediante la técnica de recombinación genética denominada

Secuencia y Ligación Independiente de Clonación SLIC utilizado el vector expresión

pET28b (+), el cual permite una alta producción del péptido recombinante al poseer el

promotor T7. Dada esta característica, la expresión del vector se realiza en Escherichia

coli BL21 (DE3), la cual produce la polimerasa T7. En el presente trabajo se presenta la

configuración de una cadena molde, que con cebadores específicamente diseñados para

amplificar la secuencia de nucleótidos codificante para el péptido con las características

mencionadas y se describe la metodología que se siguió para la construcción del vector

de expresión por SLIC.


1 Introducción

Los avances en la tecnología de fermentaciones han dado como resultado la producción

de proteínas con un alto rendimiento y con gran importancia económica, biofarmacéutica

y médica. Consecuentemente, existe la necesidad de desarrollo de metodologías que

faciliten la purificación de tales proteínas en ausencia de contaminación (proteínas

superfluas o endotoxinas).

De acuerdo con Musante L. y colaboradores [1] , existen aproximadamente 200 bio

fármacos a base de proteínas recombinantes que han sido aprobados, hasta ahora, para

fines terapéuticos y de diagnóstico humano, y otros 350 que se encuentran actualmente

en etapas finales de pruebas clínicas. Como un ejemplo de este logro están los 30

diferentes anticuerpos monoclonales terapéuticos y 3 fragmentos de anticuerpos que han

sido aprobados por la FDA de Estados Unidos hasta 2012 [2] [3] [4].

Con lo anteriormente mencionado, si se toma en cuenta que las cantidades requeridas

para los distintos usos están en el orden de miligramos y que las productividades

alcanzadas a nivel industrial varían en el orden de decenas de gramos por litro, es claro

que se necesita asegurar mediante estrategias eficaces y costo-eficientes, una alta

pureza en las proteínas recombinantes, puesto que la etapa corriente abajo

(downstream) (que incluye la purificación) actualmente representa entre el 45 y el 92%

del costo total de la manufactura de proteínas recombinantes [5].

En cuanto a métodos de purificación de proteínas recombinantes, existen varios métodos

que se utilizan en la actualidad tanto a nivel industrial como para fines académicos

(investigación, desarrollo de nuevos fármacos, etc.). Estos métodos van desde la

cromatografía de intercambio iónico o de afinidad hasta sistemas de partición acuosa en

dos fases, cromatografía en membrana y filtración tangencial.

En lo que respecta a sistemas en membranas, estos involucran el colocar una barrera

entre un sistema líquido-líquido o líquido-vapor. Su uso es popular en la industria

biotecnológica para purificación o concentración de proteínas ya que ofrece las ventajas

de tener un costo pertinente y relativa facilidad de escalamiento a comparación de los

métodos cromatográficos [1], si bien no presentan el poder de resolución de estos

últimos. Su funcionalidad depende en gran parte del tamaño de los solutos que se deseen

concentrar, lo que lo hace un método eficaz para moléculas de gran tamaño tales como

los anticuerpos monoclonales, sin embargo no es competente para solutos de pequeño

tamaño [6].

Otro de los sistemas que han surgido para la recuperación de proteínas recombinantes

es la partición acuosa en sistemas de dos o tres fases, el cual consiste en mezclar dos

o tres soluciones acuosas, tal como lo menciona S. Jain y colaboradores [7] con

componentes estructuralmente diferentes bajo ciertos criterios de concentración, estos

compuestos suelen ser sales, polímeros o polímeros con una sal. Generalmente en

procesos corriente abajo, la fase resultante consiste mayormente de agua, haciendo a


este método compatible con sistemas de producción de proteínas. En este sistema se

han logrado purificar anticuerpos monoclonales, un factor de crecimiento similar a la

insulina (IGF) e insulina de acuerdo con A. M. Azevedo [8], sin embargo las purezas

alcanzadas con este tipo de sistemas, no son tan buenas comparadas con otros métodos

y el uso ciertos solventes puede afectar la actividad de algunas proteínas.

También existen métodos que tienen su fundamento en el uso de campos eléctricos,

acústicos o magnéticos, que aprovechan las propiedades de ferromagnetismo,

paramagnetismo y diamagnetismo de las células para la separación de proteínas. Por

ejemplo la electroforesis de flujo libre, que tiene la ventaja de poder separar muestras de

extractos crudos e inyección continua de mezcla, sin embargo al igual que el resto de los

métodos con este fundamento de separación, presenta la gran desventaja de su extrema

dificultad de escalamiento [1].

Por último, tenemos los distintos tipos de cromatografía, cuyo fundamento varía en cada

tipo. Por ejemplo, la cromatografía de intercambio iónico, que se basa en el

aprovechamiento de las propiedades anfotéricas de las proteínas para que éstas se unan

a una soporte (resina) bajo ciertas condiciones de pH, de modo que prácticamente

cualquier proteínas puede unirse a una resina de intercambio iónico dependiendo del pH

de la solución, lo cual no es conveniente para purificación de anticuerpos monoclonales

o de proteínas etiquetadas además de que, si la resina presenta un amplio rango de

condiciones de elución se dificulta la recuperación . Otro ejemplo es la cromatografía de

exclusión, en la que se separan moléculas en un gel permeable de acuerdo a su volumen

hidrodinámico. En el caso de las proteínas, éstas interactúan con la fase estacionaria

mediante interacciones hidrofóbicas y electrostáticas presentando un tiempo de

retención mayor las moléculas grandes en comparación con las pequeñas permitiendo

así la separación de estas. También tenemos la cromatografía de afinidad, la cual es una

de las estrategias más eficientes para la purificación de proteínas recombinantes debido

a los altos rendimientos de recuperación que presenta y a la alta pureza que logra [9].

Las interacciones en este tipo de cromatografía se dan vía bioespecífica (interacciones

que se dan en los anticuerpos) y no bioespecíficas (interacciones por iones metálicos

inmovilizados) [10]. En esta operación, la muestra que contiene la proteína, es unida a

un ligando bajo condiciones favorables para esta unión. Después, el material no ligado

es lavado de la columna y la elución de la proteína pura es lograda usando un ligando

que compita con dicho producto o mediante un cambio de pH, fuerza iónica o polaridad.

Uso de etiquetas en la purificación de proteínas heterólogas

Las etiquetas de afinidad pueden ser definidas como secuencias de aminoácidos

exógenos con una alta afinidad por ligandos químicos o biológicos. Uno de los principales

grupos de etiquetas de afinidad consisten de un péptido o de una proteína que se une a

un ligando pequeño a su vez ligado a un soporte sólido (por ejemplo his-tag que se une

a metales inmovilizados). Otro grupo incluye a las etiquetas que se unen a una proteína

pareja inmovilizada tales como un anticuerpo o la purificación de anticuerpos usando

cromatografía de afinidad de proteínas.


Debido al reciente y rápido crecimiento del campo de la proteómica, el uso de proteínas

recombinantes ha aumentado notablemente los últimos años. Los híbridos

recombinantes que contienen un polipéptido de fusión, denominadas etiquetas de fusión

que facilitan la purificación de polipéptidos diana son ampliamente usados. A pesar de

que existen muchas ventajas al utilizar proteínas de afinidad para facilitar la purificación

y detección de proteínas recombinantes, es difícil escoger un sistema de purificación

específico para la proteína de interés.

Entre los métodos más usados para purificación de proteínas están, el sistema Arg-tag,

péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, DsbA, c-myc-tag, glutationa

S-transferasa, FLAG-tag, HAT-Tag, His-Tag, proteína de unión a maltosa, Nus A, S-tag,

Step-tag y tioredoxin [11]. Las características de los sistemas mencionados tienen en

común que, su purificación se da en un solo paso, tienen un efecto mínimo en la

estructura terciaria y actividad biológica de las proteínas, remoción fácil y específica para

producir una proteína nativa, ensayo fácil y preciso de la proteína recombinante durante

la purificación y aplicable a un gran número de proteínas. A continuación se describirá

de manera general algunos de ellos.

1. Poliarginina-tag (Arg-tag)

Este sistema consiste de 5 ó 6 residuos de argininas, el cual es aplicado como una

etiqueta en el carbono terminal. Este sistema ha dado resultados de pureza de proteínas

de hasta el 99% y rendimientos de 44% [11]. Las proteínas etiquetadas con Arg-tag,

pueden ser purificadas mediante resinas de intercambio catiónico (por ejemplo SP-

Sephadex), esto gracias al establecimiento de interacciones electrostáticas con las

cargas opuestas. Después de haberse unido las proteínas, éstas se eluyen con NaCl a

un pH alcalino.

2. Polihistidina-tag (His-tag)

Otro método ampliamente utilizado consiste en utilizar cromatografía de afinidad de

metales pesados (IMAC por sus siglas en inglés), en el cual se hace uso de la interacción

entre un ion metálico de transición, ya sea cobalto, níquel, cobre o zinc, inmovilizados en

una matriz y sobre cadenas laterales de aminoácidos específicos.

La histidina es el aminoácido que presenta la interacción más fuerte con las matrices de

iones inmovilizados, puesto que forman enlaces coordinados con el metal de transición

inmovilizado. La elución de péptidos contenedores de secuencias de poli histidina puede

realizarse fácilmente añadiendo imidazol o ajustando el pH del buffer de la columna.

Estas etiquetas de afinidad son comúnmente puestas tanto en el N- o el C- terminal de

la proteína recombinante y su colocación óptima depende de la proteína de interés. La

purificación con etiquetas de poli-histidina se ha realizado exitosamente en sistemas de

expresión bacterianos, de levaduras, células animales y células de insectos infectadas

con baculovirus.


3. Flag-tag

Este sistema utiliza un péptido corto, hidrofílico de 8 aminoácidos el cual es fusionado

con la proteína de interés. El péptido FLAG se une al anticuerpo M1. Esta etiqueta puede

ser colocada en el C- o N- terminal de la proteína. Las condiciones del sistema de

purificación son no desnaturalizantes y por lo tanto permiten la purificación de proteínas

activas. El complejo puede ser disociado mediante agentes quelantes tales como el

EDTA o mediantes reducciones transitorias de pH.

El rango de pureza de las proteínas purificadas con esta etiqueta es de 90%. En general,

las proteínas pequeñas pueden ser detectadas con anticuerpos monoclonales

específicos. Para mejorar esta detección se desarrolló un sistema llamado 3x Flag (tres

epitopos tándem hidrofilicos) con el cual, una cadena de 22 aminoácidos pueden ser

detectados por 10 fmol de la proteína de fusión expresada.

La etiqueta FLAG-tag puede ser removida mediante tratamiento con enteroquinasa, la

cual es específica para los 5 aminoácidos C-terminales de la secuencia del péptido.

4. Strep-tag

La etiqueta estrep-tag fue originalmente seleccionada de una biblioteca genética

aleatoria como un péptido de ocho aminoácidos (WRHPQFGG) el cual se une

específicamente a núcleos de estreptavidina, una versión de proteína bacteriana

proteolíticamente truncada. Su extraordinaria afinidad (kd = 10-14) se debe a un pequeño

grupo llamada D-biotina, junto con su estabilidad intrínseca y baja interacción no

específica, es un reactivo bastante útil tanto para detección como separación de

macromoléculas biotiniladas u otros compuestos de interés. La unión a estreptavidina

que presenta esta etiqueta es reversible, por lo tanto, se presta para su aplicación en

purificación con columnas de estreptavidina inmovilizada si ésta se fusiona a una

proteína de interés [12].

5. C-myc-tag

El epítope c-myc-tag, está formado por una secuencia de once aminoácidos, puede ser

expresado en distintos contextos de proteínas ya que confiere reconocimiento a

inmunoglobulina 9E10. Esta etiqueta se usa exitosamente en westernblot,

inmunoprecipitación y citometría de flujo. Es entonces, útil para el monitoreo de la

expresión de proteínas recombinantes en bacterias [11]. Las proteínas fusionadas a esta

etiqueta pueden ser purificadas por afinidad uniéndose al anticuerpo monoclonal 9E10 a

agarosa sulfon-activada. Esto puede resultar costoso para ser utilizada en purificación a

gran escala por lo que se aplica muy raramente, en lugar de eso es utilizada ampliamente

en sistemas de detección.

6. NanoTag9

Es un péptido que contiene 9 aminoácidos de unión a estreptavidina (DVEAWLGAR)

reportado por primera vez en 2003. Éste posee afinidad nanomolar por la estreptavidina


y presenta una constante de disociación (kd) de 17 nM. Esta etiqueta tiene la principal

ventaja de brindar elución específica a condiciones suaves con el buffer de lavado

apropiado más biotina, la cual permite la elución de la proteína de fusión unida de la

columna de estreptavidina en estado normal. Al ser ésta una etiqueta de pequeño

tamaño, generalmente no interfiere con las funciones biológicas de la proteína diana y

por lo tanto no necesita ser removida vía proteólisis [13].

Técnicas de clonación genética

El análisis funcional de los genes y su secuencias codificantes (marcos abiertos

codificantes) típicamente requieren ser expresadas al igual que las proteínas

recombinantes requieren ser purificadas, los anticuerpos recombinantes requieren ser

producidos, lo fenotipos ser examinados y los metabolitos ser localizados

intracelularmente, etcétera. Para cada paso de éstas caracterizaciones se requieren

subclonaciones en uno varios vectores especializados que le impartan ciertas funciones

especializadas al segmento clonado, lo que conlleva la necesidad de la existencia de

métodos de clonación y subclonación más eficientes y con alta fidelidad de reacción de

clonación independientemente de la función del vector usado y del hospedero [14]. A

continuación, se describen algunos de los métodos que ofrecen tales características.

Clonación por el método Gateway ®

Esta tecnología está basada en reacciones de tipo recombinación sitio específica que

median la integración y escisión del bacteriófago lambda. Esto eventos ocurren mediante

recombinación en secuencias especificas agregadas en el DNA del fago y en el

cromosoma de una bacteria llamado attP (proveniente del fago) y attB (proveniente de la

bacteria). Cada uno de estos sitios está compuesto de una secuencia de nucleótidos de

7 pares de bases referida como secuencia núcleo (O) y por dos brazos flanqueados

llamados P y P’ y B y B’. El proceso de recombinación comienza cuando varias moléculas

de la integrasa codificadas por el fago y el factor del huésped de integración bacteriana

(IHF) se unen fuertemente al par de bases de 232 de attP. Este complejo es apareado

entonces con la secuencia de 21 bp de attB en el cromosoma bacteriano. Mellas de DNA

escalonada se producen en los extremos de la secuencia central de ambas secuencias

attP y attB seguido por un intercambio de cadenas entre ellas. Debido que existen las

regiones cortas de 7 pares de bases de secuencias homólogas, una unión pequeña

heteroduplex es formada. Una vez formada esta unión la secuencia de DNA del fago está

flanqueada por dos sitios híbridos att llamados attL y attR (izquierdo y derecho

respectivamente). Esta reacción es llamada BP [15].

Para lograr la clonación mediante este sistema, lo que se hace es flanquear una

secuencia de DNA con estas secuencias híbridas en los extremos 5’ y 3’ utilizando

cebadores específicos para amplificar por PCR. Este producto de PCR flanqueado se

mezcla con plásmidos especiales llamados vectores donantes de Gateway y un mix de

enzimas llamado BP clonasa. Este mix de enzimas cataliza la recombinación del inserto


con la secuencia de attB del inserto con la attP del vector. El la Figura 1 se esquematiza

de manera general este método.

. Clonación por el método Gibson

En general este método de ensamblaje de uno o múltiples fragmentos de DNA

superpuestos mediante acción de una 5’ exonucleasa, la cual es una DNA polimerasa

(T5) y una DNA ligasa. En primer lugar se digieren fragmentos de DNA para generar

extremos sobresalientes de simple cadena específicamente alineados y posteriormente

unidos covalentemente [16].

1. Una T5 exonucleasa remueve nucleótidos en los extremos 5’ de DNA de doble

cadena, éste se alinea con sus complementarios de cadena simple sobresalientes

con otro fragmento adyacente de DNA.

2. Una Phusion DNA polimerasa rellena los espacios vacíos mientras que una Taq

DNA ligasa sella las muescas entre estos.

3. La T5 polimerasa en inactivada con temperatura al incubarse a 50°C.

Figura 1. Esquematización del método de clonación Gateway ® [14].

Figura 2. Esquematización del método de clonación Gibson.


Clonación Independiente de Secuencia y Ligación de (SLIC)

Este método a diferencia de otros, se basa en

la recombinación homóloga in vitro. Para los

dos tipos de recombinación que se conocen

en E. coli (RecA dependiente y RecA

independiente) es posible emplear de manera

in vitro el método SLIC. Este método mimetiza

la recombinación homóloga que se observa in

vivo mediante el uso de T4 DNA polimerasa la

cual tiene actividad exonucleasa en ausencia

de dNTPs para generar extremos

sobresalientes de simple cadena tanto en

inserto como en vector de manera in vitro. El

tamaño de éstos extremos generados es

controlado por el tiempo en que se efectúa el

tratamiento con la exonucleasa.

Un gen diana se amplifica utilizando PCR con

cebadores especialmente diseñados, que

contengan las secuencias homólogas a las del

vector que se va a utilizar. Esto genera

productos de PCR con secuencias adicionales

a SLIC. El método en general se menciona a

continuación (Figura 3).

1. Se producen terminales de simple cadena después de ser tratados con T4

DNA polimerasa.

2. El plásmido que se va a usar para clonación es digerido (sencillas o

doblemente) con enzimas.

3. O se amplifican usando cebadores diseñados para generar productos de

PCR con terminales que compartan homología con las terminales del

producto de PCR del gen diana.

4. El tratamiento con T4 DNA polimerasa es usado para generar extremos

sobresalientes o cohesivos de simple cadena, usados para alinear con el

producto de PCR del gen diana.

5. Se mezclan las muestras de DNA

6. En buffer de ligación o unión se posibilita la formación e plásmidos

recombinantes con muescas.

7. Las cuales son reparadas por enzimas de E. coli después de transferirse

a células competentes.

Figura 3. Esquematización del método Clonación Independiente de Secuencia y Ligación (SLIC).


Desarrollo de aptámeros

La identificación de secuencias poco comunes de nucleótidos con propiedades únicas a

partir de una amplia librería se oligonucleótidos de secuencia aleatoria, fue descrita por

primera vez en 1990 y el proceso es conocido como SELEX. Ésta técnica consiste en

realizar un mapeo de una amplia librería de oligonucleótidos mediante un proceso

iterativo in vitro de selección y amplificación. El proceso en general se describe a

continuación [17].

1. El proceso comienza con la obtención de una librería aleatoria obtenida por

síntesis química combinatoria de DNA. Cada miembro de esta librería en un

oligomero lineal de secuencia única. Teóricamente, una librería que contiene

regiones de 40 oligonucleótidos aleatorios, es representada por 1.2 ×1024

secuencias individuales (420). Sin embargo en la práctica las secuencias

individuales obtenidas son del orden de 1014 - 1015.

2. Para el proceso de mapeo, se incuba con molécula de interés en el buffer

apropiado a una temperatura dada. Durante este paso, una fracción muy pequeña

de secuencias individuales tiene a interactuar con la molécula diana y éstas son

separadas del resto de la librería, usualmente se utilizan filtros de nitrocelulosa

para proteínas que son retenidas en ésta, mientras que las moléculas diana de

menor tamaño se inmovilizan en un soporte para generar una matriz de afinidad,

de forma que las secuencias que no interactúen con soporte sólido sean

fácilmente lavadas.

3. La población de secuencias unidas a la molécula diana se aíslan y amplifican para

obtener una biblioteca enriquecida para ser utilizada en la siguiente ronda de

selección.

4. Una vez que se llega a la saturación después de varias rondas de

selección/amplificación (usualmente de 8-15 rondas), la librería enriquecida es

clonada y secuenciada para obtener la información de cada miembro. La mayoría

de estas secuencias individuales (>90%) de la librería enriquecida son buenos

candidatos a aptámeros que se unirán a la molécula diana seleccionada.

Una de las modificaciones a éste método es el de FluMag-SELEX, descrito en el año

2005 [18]. Este método combina la metodología de SELEX con un el uso de etiquetas

fluorescentes en el DNA y con la tecnología de separación por magnetismo. En

general, el procedimiento es el siguiente y se ilustra en la Figura 4.

1. El proceso inicia con el uso de una biblioteca combinatoria de DNA de simple

cadena, la cual consiste de oligonucleótidos con una región central aleatorizada

de 60 nucleótidos flanqueados con dos regiones específicas. Estos se incuban

con una matriz magnética la cual contiene una molécula diana inmovilizada en

ella.

2. Los oligonucleótidos no unidos son lavados y los unidos a la matriz, son eluidos

de la molécula diana mediante tratamiento con temperatura.

3. Los oligonucleótidos se amplifican por PCR utilizando cebadores específicos.


4. Las secuencias relevantes de ssDNA es subsecuentemente purificado de los

productos de PCR dando como resultado una biblioteca enriquecida que sirve

para utilizarse en la siguiente ronda de selección con la molécula diana. El

etiquetado con fluoresceína (F) de los oligonucleótidos seleccionados después de

la primera ronda de SELEX permite su cuantificación en rondas futuras y entonces

es posible monitorear el enriquecimiento de aptámeros blanco-específicos.

5. En la última ronda los aptámeros seleccionados se clonan y caracterizan mediante

secuenciación.

Figura 4. Esquematización de proceso de desarrollo de aptámeros FluMag-SELEX [18].


2 Justificación

La dificultad en la separación de proteínas (recombinantes o no) derivadas de procesos

biotecnológicos, conlleva la necesidad de diseñar nuevos métodos u optimizar los ya

existentes para lograr su purificación a bajo costo y con una alta eficiencia. Los

aptámeros, son oligonucleótidos capaces de reconocer alguna molécula diana con alta

afinidad y especificidad, por lo que pueden ser utilizados para la captura o detección de

moléculas en todos los métodos basados en reconocimiento molecular, incluida la

cromatografía de afinidad.

Aunque las etiquetas de separación han sido utilizadas en la purificación, las matrices

que las adsorben no son tan afines a ellas como los anticuerpos o los aptámeros, de ahí

el interés de mejorar la separación mejorando la matriz que adsorbe a las proteínas

etiquetadas.


3 Objetivos

3.1 Objetivo general

Desarrollar aptámeros hacia la etiqueta de purificación Nanotag9 para su uso en

la recuperación de proteínas.

3.2 Objetivos particulares

Concepción de un inserto con dos etiquetas de recuperación (Nanotag9 e His-

tag) para su expresión en el plásmido pET-28 b (+)

Producción de un péptido con dos etiquetas de recuperación (Nanotag9 e His-

tag) y un sitio a corte para proteasas (enteroquinasa).

Desarrollo de un aptámero de ADN hacia una etiqueta de recuperación usando

el péptido con dos etiquetas.

Determinación de la afinidad del aptámero hacia cada etiqueta.

Producción de proteínas con etiquetas (Tags) de recuperación.

Purificación de proteínas etiquetadas.

Recuperación de una proteína usando el aptámero hacia la etiqueta.

3.3 Alcances

El alcance del presente informe abarca la concepción de un inserto con los etiquetas de

recuperación Nanotag9 e His-tag para su expresión en el plásmido pET-28 b (+) y la

producción de un péptido con dos etiquetas de recuperación (Nanotag9 e His-tag) y un

sitio a corte para proteasas (enteroquinasa).


4 Metodología

4.1 Construcción del plásmido de expresión con dos etiquetas de recuperación

para su transformación por el método SLIC

El plásmido seleccionado para la producción del péptido con 2 etiquetas de recuperación

es el pET-28 b (+) con 5368 pb, el cual tiene la característica de tener alto nivel de

expresión en bacterias dotadas de T7 polimerasa, tiene un promotor T7 y resistencia a

antibiótico Kanamicina. El mapa de dicho plásmido se ilustra en la Figura 5.

Figura 5. Mapa circular del plásmido pET-28b (+). Secuencia obtenida desde [22].


4.2 Configuración del inserto de DNA codificante al péptido con dos etiquetas

de purificación

Las etiquetas seleccionadas para la configuración del inserto para purificación de

proteínas se presentan en la tabla 1 con sus respectivas secuencias de aminoácidos y

secuencia de DNA, ésta última se optimizó para la cepa BL21 de E. coli basándonos en

el uso de codones de la misma (Ver anexo A).

Tabla 1. Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de DNA de las etiquetas de recuperación y el sitio de corte a proteasas.

Etiqueta Secuencia de aminoácidos

Secuencia de DNA para codones de E. coli BL21

Referencia

6X His-tag HHHHHH CATCATCATCATCATCAT [1]

NanoTag9 DVEAWLGAR GATGTGGAAGCGTGGCTGGGCGCGC

GT [13]

Enteroquinasa

DYKDDDDK GATTATAAAGATGATGATGATAAA [3]

La secuencia de la cadena molde, incluyendo codón de inicio y paro (5’-GACAGCAAAT

TCCGAATTCG AGCTCATG – GATGTGGAAGCGTGGCTGGGCGCGCGT –

GATTATAAAGATGATGATGATAAA – CATCATCATCATCATCAT – TAGCTC –

GAGCACCACC ACCACCACCACT-3) se obtuvo de Integrated DNA technologies, E.UA.

4.3 Diseño de oligonucleótidos específicos para amplificar el inserto con dos

etiquetas de recuperación

La secuencia codificante para el péptido con dos etiquetas fue preparado utilizando los

oligonucleótidos cebadores para la amplificación del inserto que se utilizaron fueron; para

el delantero o forward: 5’-GACAGCAAATTCCGAATTCGAGCT-3’ y para el reverso o

reverse: 5’-AGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCG-3’.

4.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La reacción en cadena de la polimerasa se realizó utilizando la secuencia molde de DNA

(5’GAC AGC AAA TTC CGA ATT CGA GCT CAT GGA TGT GGA AGC GTG GCT GGG

CGC GGT GAT TAT AAA GAT GAT GAT GAT AAA CAT CAT CAT CAT CAT CAT TAG

CTC GAG CAC CAC CAC CAC CAC CAC T-3’), la cual fue obtenida de Integrated DNA

technologies (E.U.A.), de igual manera los cebadores (primers) diseñados (Forward; 5’-


GAC AGC AAA TTC CGA ATT GAG CTC-3’, Reverse; 5’- AGT GGT GGT GGT GGT

GGT G-3’) específicamente para amplificar esta secuencia fueron solicitados al mismo

proveedor.

En dos tubos distintos de polipropileno de 200 μL se adicionaron los reactivos de la tabla

2 cuyas concentraciones finales son las recomendadas por el proveedor [19].

Tabla 2. Composición de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificación de inserto.

Mezcla de reacción Control Negativo Composición final

Buffer 10X 5 μL 5 1X

dNTP’s 1 μL 1 200 uM

P1 1 μL 1 0.2 uM

P2 1 μL 1 0.2 uM

DNA molde 1 μL ----- 10 ng

Red taq 2.5 μL 2.5 0.05 unidades/μL

Agua esteril miliQ

38.5 39.5

Volumen total 50 50

La mezcla de reacción, se realizó por cuatruplicado y se colocaron en termociclador con

el siguiente programa: 94°C por 45 segundos; 30 ciclos de 94°C por 45 segundos, 54°C

por 45 segundos, y 72°C por 1 minuto. Finalmente 10 min a 72°C después de los 30

ciclos.

Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 1.5 % a 90V durante 1 hora

45 minutos utilizando como marcador de peso molecular 50 bp ladder de invitrogen.

4.4.1 Purificación del inserto utilizado PureLink PCR purification kit

La purificación del inserto se realizó utilizando el kit de purificación de productos de PCR

PureLink ™ de Invitrogen (Alemania) siguiendo las instrucciones del proveedor. Esto es,

se agregaron 4 volúmenes de Buffer de unión B3 con isopropanol a un volumen de

producto de PCR (50 μL), se mezcló perfectamente. Esta mezcla se colocó en la columna

PureLink ® Spin unida a un tubo de recolección (ambos incluidos en el kit) para

posteriormente centrifugarse a 10,000 x g durante un minuto a temperatura ambiente. Se

descartó el permeado (separando la columna del tubo de recolección) y se colocó la

columna de vuelta al tubo de recolección. Para el lavado de la columna se adicionaron a

ésta 650 μL de buffer de lavado con etanol y se centrifugaron a temperatura ambiente

durante un minuto a 10,000 x g. Se desechó el permeado del tubo de recolección y se

colocó la columna de vuelta al éste. Posteriormente se eliminó cualquier residuo del


buffer de lavado centrifugando la columna a máxima velocidad (13,400 x g) durante 3

minutos. Para la elución, se colocó la columna PureLink ® en un tubo para elución limpio

de 1.7 mL incluido en el kit y se adicionaron 50 μL de Buffer de elución (10 mM Tris-HCl,

pH 8.5) en el centro de la columna, ésta se incubó durante un minuto a temperatura

ambiente y finalmente se centrifugó a máxima velocidad (13,400 x g) durante 2 minutos.

El permeado, que contiene el producto de PCR purificado, se conservó a -20° C.

4.4.2 Concentración de producto de PCR utilizando membranas de ultrafiltración

(Amicon Ultra centrifugal filter units)

Para la concentración de los productos de PCR, se juntaron dos reacciones en un solo

tubo para tener un volumen de 100 μL en cada tubo. Este volumen se transfirió a un

ultrafiltro de 10 KDa y se llevó a un volumen de 500 μL con agua estéril miliQ, la

membrana se colocó en el tubo de recolección incluido en el kit y se centrifugó a 13,400

x g durante 10 minutos. Se desechó el permeado y el retenido se resuspende con agua

estéril miliQ hasta un volumen de 400 μL y se centrifugó nuevamente a 13,400 x g durante

10 minutos. Posteriormente el ultrafiltro se colocó invertido en un tubo nuevo para

microcentrífuga y se centrifugó ahora a 1,000 x g durante 2 minutos. La concentración

de DNA en cada tubo se midió por espectrofotometría en Nanodrop 2000.

4.5 Cepas bacterianas

Escherichia coli TOP10: F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG

recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ-

Escherichia coli BL21 (DE3) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB

-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7

gene 1 ind1 sam7 nin5]). Contiene la polimerasa T7 necesaria para la fuerte expresión

del péptido recombinante.

4.6 Medio de cultivo

Para cultivo de las cepas de Escherichia coli TOP10 y BL21 (DE3) se utilizó medio Luria

Bertani (Lennox) (Sigma Aldrich, E.U.A.) en polvo, de aquí en adelante mencionado LB,

el cual tiene 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 5 g/L de NaCl. Éste se

reconstituyó utilizando 1 litro de agua por cada 20 g de medio en polvo.

4.7 Preparación de células de Escherichia coli Calcio competentes

Se prepararon por separado células de Escherichia coli calcio competentes de las cepas

BL21 y TOP10 siguiendo la metodología descrita por ____ . Se inoculó un tubo

conteniendo 25 mL de caldo LB con una colonia de Escherichia coli proveniente de una


caja fresca de medio LB con agar al 0.8% w/v, se incubó a 37°C durante toda la noche

en incubadora rotatoria. Posteriormente se tomó un mililitro de éste tubo para inocular un

matraz con 100 mL del mismo medio y se incubó con agitación durante al menos 4 hrs a

37°C. El cultivo anterior se colocó en hielo durante 30 minutos y posteriormente se

transfirió a dos tubos falcon de 50 mL los cuales se centrifugaron a 6000 rpm durante 10

minutos a 4°C, se decantó el sobrenadante. La pastilla se resuspendió en medio volumen

de CaCl2 0.1 M a 4°C (20 mL la primera, 10 mL la segunda y 7.5 mL la tercera vez) y se

centrifuga a las mismas condiciones. Se deja reposar en hielo durante 15 minutos. La

resuspención con CaCl2 y centrifugación se repitió 3 veces para finalmente resuspender

la pastilla en un mililitro de una solución de CaCl2 0.1 M y glicerol al 15%. Se almacenaron

alícuotas de 100 μL a -70°C.

4.8 Transformación de Escherichia coli por choque térmico

Partiendo de células de Escherichia coli TOP10 calcio competentes se realizaron 3

diferentes tratamientos en tubos de polipropileno de 1.5 mL los cuales se mencionan en

la tabla 3. Una vez preparadas estas alícuotas éstas se mantienen a 4°C durante 15

minutos, posteriormente fueron colocadas en thermoblock a 43°C durante 2 minutos e

inmediatamente después se colocaron en refrigeración (4°C) durante 2 min. En

condiciones de esterilidad se adicionaron 300 μL de medio LB. Se incubaron los 4 tubos

a 37°C con agitación durante 45 minutos.

Tabla 3. Tratamientos para transformación de E. coli por choque térmico.

Tubo 1 50 μL células Ca2+

cometentes

2 μL de pET-28 b1 Alícuota 1


cometentes

2 μL de pET-28 b Alícuota 2


cometentes

--- Control -

Después de la incubación los tubos se centrifugaron a 13,400 g durante 1 min, se decantó

el sobrenadante, el resto se esparció en placas Petri con medio LB 0.8 % y Kanamicina

a una concentración de 30 μg/mL y finalmente se incubaron durante al menos 14 horas

a 37°C. Adicionalmente, el remanente de cada tubo se esparció en caja Petri con medio

LB sin antibiótico para comprobar su viabilidad y ésta se incubó a las mismas

condiciones.

1 El plásmido pET-28b (+) fue obtenido del laboratorio de biotecnología molecular posgrado, UPIBI, IPN. Ver anexo B.


4.9 Extracción de ADN plasmídico de Escherichia coli por lisis alcalina

Para extraer DNA plasmídico se inoculó una colonia de E. coli TOP10 (Laboratorio de

Biotecnología Molecular Posgrado, UPIBI-IPN) procedente de la caja Petri con la

Alícuota 1 en tubos de medio LB líquido con Kanamicina a 30 g/L durante toda una noche

a 37°C con agitación vigorosa y posteriormente se tomaron alícuotas de 1.5 mL para

centrifugarse a 13,400 g durante 5 minutos. La pastilla obtenida en el fondo del tubo se

re suspendió en 100 μL de Solución de lisis I (Glucosa 50 mM, Tris-HCl pH 8, EDTA 10

mM) fría y posteriormente se agregaron 200 μL de solución de lisis II (NaOH 0.2 M y SDS

1%), se mezcló por inversión 5 veces y se guardó en hielo en refrigeración 8 minutos.

Después se adicionaron 150 μL de solución de lisis II (60 mL de acetato de potasio 5M,

11.5 mL de ácido acético glacial y 28.5 mL de agua destilada) y se centrifugó a 13,400 g

durante 8 minutos. El sobrenadante resultante se transfiere a tubos limpios de

polipropileno y la pastilla se desecha.

Para precipitar el DNA plasmídico se agregaron 2 volúmenes de etanol absoluto, se

mantiene en hielo 3 minutos. Posteriormente se centrifugó 13,400 g por 5 minutos y el

sobrenadante se desechó. Hecho lo anterior, se adicionó 1 mL de etanol al 70% y volvió

a centrifugar a 13,400 g por 5 minutos, el sobrenadante se desechó. Los tubos con el

precipitado se dejan secar invertidos sobre papel durante 30 minutos. Una vez seca la

pastilla se re suspendió en 40 μL de agua destilada miliQ. Se almacenó a -20°C.

4.10 Extracción y purificación de DNA plasmídico de Escherichia coli por

minipreps

La extracción y purificación de DNA plasmídico de Escherichia coli se realizó utilizando

el kit de Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, E.U.A.). Se

inoculó una sola colonia transformada en tubos con 5 mL con medio LB y kanamicina a

una concentración de 30 μg/mL durante toda la noche a 37°C en incubadora rotatoria.

Posteriormente se centrifugó el cultivo en tubos de polipropileno de 1.5 mL en micro

centrífuga a 13,400 x g durante 5 minutos hasta obtener pellet y se desechó el

sobrenadante.

El pellet se resuspendió vigorosamente en 250 μL de solución de resuspención de

células (Cell resuspension solution) para después agregarse 250 μL de solución de lisis

celular (Cell Lysis Solution). La mezcla anterior se homogeneizó por inversión 4 veces y

se incubó durante 5 minutos. Posteriormente se agregaron 10 μL de solución de alcalin

proteasas (Alkaline Protease Solution), se mezcló por inversión 4 veces y se incubó

durante 5 minutos a temperatura ambiente. Una vez hecho esto, se agregaron 350 μL de

solución de neutralización y se mezcla por inversión 4 veces. Para finalizar la lisis, se

centrifugó la mezcla a máxima velocidad durante 10 minutos a temperatura ambiente.


El sobrenadante se decanta en una columna (incluida en el kit), la cual se coloca en un

tubo de recolección. Dicho tubo con la columna, se centrifugó a 13,400 x g durante 1

minuto a temperatura ambiente y se desechó el permeado. Este paso se realizó por

duplicado.

Para el lavado de la columna, se utilizaron 750 μL de solución de lavado y se centrifugó

a máxima velocidad durante un minuto. Se desechó el permeado y la columna se

reinsertó en el tubo de recolección. El lavado se repitió utilizando 250 μL de solución de

lavado. Se centrifugó el tubo durante 2 minutos a temperatura ambiente.

La columna se transfirió a un tubo estéril de polipropileno de 1.5 mL y se adicionaron 40

μL de agua estéril. El tubo con la columna se centrifugó a máxima velocidad durante un

minuto. Este paso se realizó por duplicado. El tubo con el material eluído se almacenó a

-20 °C.


4.11 Clonación por el método SLIC (Clonación Independiente de Secuencia y

Ligación)

4.11.1 Digestión del plásmido con enzimas de restricción

Se realizaron tres reacciones de restricción. En la primera se utilizaron las enzimas XhoI

y EcoRV, en la segunda XhoI y SacI y en la tercera XhoI. Para cada reacción se

prepararon las mezclas mencionadas en la Tabla 4 y se separaron las bandas mediante

electroforesis en agarosa al 0.7% a 90 V durante 1 hora 20 minutos utilizando el marcador

de peso molecular de 1kb plus HyperLadder ™ (Bioline, E.U.A.). La reacción de

restricción con SacI y XhoI se realizó por triplicado.

Tabla 4. Reacciones de digestión para el plásmido pET28b (+)

Compuesto Reacción XhoI y

EcoRV

XhoI y SacI XhoI

Buffer 2 μL 5 μL 2 μL

Enzima 1 0.5 μL 0.5 μL 0.5 μL

Enzima 2 0.5 μL 0.5 μL ---

DNA

plasmídico 3 μL 5 μL 3 μL

Agua 14 μL 9 μL 14 μL

Total 20 μL 20 μL 20 μL

4.11.2 Precipitación de DNA plasmídico con acetato de sodio.

Para purificar el DNA plásmidico digerido con XhoI y SacI, se utilizó el método descrito

por..... De precipitación con acetato de sodio. Partiendo de un volumen de 55 uL de

producto de digestión se adicionó un décimo de volumen de acetato de sodio al 3M pH

5.2 (5.5 uL). Se agregaron 2.5 volúmenes de de etanol absoluto y se incubó el tubo

durante 30 minutos a 4°C. Posteriormente se centrifugó el tubo a máxima velocidad

durante 10 minutos y se retiró el sobrenadante con ayuda de una pipeta, se lavó la pastilla

con un volumen de 200 μL de etanol al 70%. Se centrifugó el tubo nuevamente a las

mismas condiciones y se retiró el sobrenadante del tubo con ayuda de una pipeta para

finalmente dejar secar el tubo durante 30 minutos. El precipitado o pastilla se resuspendió

en un volumen menor a la mitad del inicial (20 uL) con agua estéril miliQ durante 12 hrs

a 4°C.


4.11.3 Clonación independiente de secuencia y ligación (SLIC), reacción de alineación

Para la reacción de SLIC se preparó una mezcla con 2 μL de vector digerido con 4 μL de

inserto puro, 1 μL de Buffer 2 NEB (New England Biolabs, E.U.A), 0.5 μL de BSA

(Albúmina de Suero Bovino) y 2 μL de agua estéril miliQ, para una reacción de 20 μL por

duplicado, por último se agregó 0.5 μL de T4 DNA polimerasa a cada tubo. Se mezclaron

perfectamente los componentes y se incubó a 24°C durante 2:30 minutos e

inmediatamente se colocó en hielo, un tubo durante 3 minutos y el otro durante 15

minutos. El producto de esta mezcla se transformó inmediatamente con células

competentes de E. coli BL21.

4.11.4 Selección de células transformadas

Para la selección de células transformadas se sembró en cajas Petri con medio LB con

kanamicina 30 μg/mL alícuotas de 150 μL de producto de transformación y se incubó

durante al menos 12 horas a 37°C.


5 Resultados

5.1 Amplificación del inserto construido

El inserto configurado contiene una

secuencia de 125 nucleótidos (se

esquematiza en la Figura 11), dicha

secuencia al ser amplificada generó el

producto de PCR mostrado en la Figura 6.

En cada reacción de 50 μL se obtienen las

concentraciones de DNA indicadas en la

Tabla 5 después de la purificación y

concentración por membranas de

ultrafiltración.

5.2 Transformación de E. coli por

choque térmico

Para los tres tratamientos de

transformación realizados se obtuvieron

cultivos en placa con la siguientes

características; Tubo 1 (pET28 b + células

Ca++ competentes): crecimiento >100 UFC

(Figura 7 A), Tubo 2 (Agua + células Ca++

competentes): sin crecimiento (Figura 5 B),

Tubo 3 (células Ca++ competentes): sin crecimiento (Figura 7 B). En la figura 7 C se

observa que las células cultivadas en medio LB sin antibiótico de selección presentan

crecimiento en los 3 tratamientos.

.

Figura 6. Electroforesis en agarosa para análisis de producto de PCR. El primer carril contiene el marcador de peso molecular de 50 kb (invitrigen), C- control negartivo, M1-M5 ensayos de PCR.

Figura 7. . Tratamientos de transformación genética en E. coli


Tabla 5. Concentración de DNA producto de PCR.

5.3 Caracterización molecular del plásmido pET28 b (+)

Para comprobar que el material introducido en las células de E. coli calcio competentes

corresponde ciertamente al plásmido pET28 b (+), se realiza un gel de electroforesis en

agarosa al 0.7 % con el producto de lisis alcalina digerido con el fin de liberar un

fragmento único de tamaño conocido. En este caso, se obtiene un patrón de bandeo en

el tubo 1 en el cual, un fragmento se encuentra aproximadamente en 5000 bp y otro entre

1500 y 2000 bp (Figura 9). En el tubo 2 (T2) se observa un patrón parecido mucho más

tenue.

5.4 Producto de extracción por miniprep

Una vez confirmado que el material genético extraído por lisis alcalina corresponde al

material insertado mediante transformación por choque térmico, es posible realizar

extracción y purificación a pequeña escala, de la cual se separaron las bandas mediante

electroforesis, de esto se obtuvo una banda de mayor intensidad en 3000 bp, una de

menor intensidad en 8000 y una tenue banda por arriba de las 12,007 bp.

Tubos con producto de PCR Concentración (ng/μL)

M2 + M3 431.7

M4 + M5 298. 6

Figura 9. Doble digestión con EcoRV y XhoI del producto de extracción de DNA plasmídico por lisis alcalina.

Figura 8. Separación de bandas del producto de miniprep mediante electroforesis en agarosa.


5.5 Vector digerido con SacI y XhoI para SLIC.

Al separar las bandas del producto de reacción de doble

digestión en gel de agarosa 0.7%, se obtiene una banda

linearizada entre 6000 y 5000 bp (Figura 10).

5.6 Producto de SLIC

Con la metodología descrita en el presente trabajo para SLIC,

a las 12 horas de incubación, no se observó crecimiento en el

cultivo de selección con kanamicina a concentración de 30

μg/mL.

Figura 10. Producto de reacción de digestión doble con SacI y XhoI.


6 Discusión

La configuración del inserto para expresión en el vector pET-28b (+) (Figura 11) contiene

una región de 25 nucleótidos, la cual se estima será digerida por la T4 polimerasa de

modo que se generaran extremos cohesivos (Figura 12). En seguida se encuentra el

codón de inicio de la traducción (ATG) seguida la secuencia de específica de

oligonucleótidos (DVEAWLGAR) denominada NanoTag9, contiguamente se tiene una

secuencia de unión a enteroquinasa que permitirá la escisión del péptido. Por último se

encuentra la secuencia de la etiqueta 6xHis y otra región de 25 nucleótidos que se estima

en promedio digiere la T4 DNA polimerasa [20].

Figura 11. Esquema de las regiones codificantes contenidas en el inserto clonado en pET-28b (+). Incluida la región estimada digerida por T4 polimerasa con actividad exonucleasa de 3’ a 5’

Figura 12. Esquematización de los extremos del inserto después de digerir con T4 polimerasa.

Esta configuración se realizó con la finalidad de que sea posible realizar una selección

negativa durante las rondas de selección en el proceso de desarrollo de aptámeros.

La generación de extremos cohesivos (Figura 12) tanto en el inserto como en el vector

de expresión es necesaria para lograr ligación por homología de secuencias, la cual es

el fundamento del método de recombinación genética SLIC.


El número de nucleótidos digeridos por la T4 DNA polimerasa tiene dependencia directa

con el tiempo de reacción. Aproximadamente para digerir un promedio de 20 bases, el

tiempo de reacción necesario es de 20 minutos [20], esto genera longitudes homólogas

tanto en el vector de expresión como en el inserto.

La amplificación de la cadena molde del inserto genera un doble cadena de DNA

mediante PCR. La electroforesis en agarosa (Figura 6) sugiere que dicha doble cadena

es del tamaño esperado de 125 bp, el cual se planteó en la configuración de éste (Figura

11). Mientras que en la caracterización molecular del vector de expresión realizada

mediante un análisis de restricción de los productos de extracción de DNA plasmídico,

tenemos que al digerir el vector circular en los sitios únicos de restricción, EcoRV y XhoI

(Figura 9) se espera liberar un fragmento de éste vector de 1414 bp y otro de 3954 bp.

Nótese que en la Figura 13 B, se visualiza que los fragmentos separados presentan un

tamaño aproximado al esperado (Figura 13 A), por lo que es recomendable secuenciar

el vector para asegurar que sus características son las esperadas.

Para el vector linearizado mediante digestión con SacI y XhoI para la reacción de SLIC,

se aprecia en la separación de bandas mediante electroforesis en agarosa, un fragmento

entre 6000 y 5000 bp (Figura 10), lo cual coincide con lo esperado, puesto que el vector

tiene un tamaño de 5368 bp.

En lo que respecta a la clonación por SLIC, al no

observarse crecimiento en un periodo mayor a 12

horas, es posible que el tiempo de digestión con

polimerasa T4 necesario para lograr la generación de

extremos cohesivos en promedio de 25 bp y con esto

lograr una recombinación por homología de

secuencias haya sido insuficiente con los

tratamientos probados o en su defecto, éste pudo

haber resultado excesivo de forma que el inserto fue

digerido de tal manera que se perdió la homología de

secuencias y por consecuencia no se dio la

recombinación. Para futuros experimentos podrían

evaluarse varios tiempos de digestión en un rango de

1 a 30 minutos, probando tiempos intermedios entre

este intervalo.

.

Figura 13. Caracterización molecular del vector pET28 b (+) mediante análisis de restricción con EcoRV y XhoI.


Pruebas in sillico para verificación del marco de lectura del inserto

Se utilizó el software de biología molecular SnapGene ®, con el cual fue posible simular

la clonación en pET 28b (+) del inserto NanoTag9-enteroquinasa cut-6xHisTag. En la

Figura 14 se muestra un esquema del vector esperado con inserto en el sentido del

promotor T7.

Este software proporciona un análisis del marco de lectura, lo que nos indica si el péptido

insertado, al ser traducido tendrá la secuencia de aminoácidos diseñada en la

metodología, misma que dará pauta al desarrollo de aptámeros mediante rondas de

selección positiva y negativa.

Figura 14. Esquematización del vector pET28b (+)- inserto de 5465 bp.


Nótese en la Figura 15 que el inserto (NanoTag9-enteroquinasa cut-6xHisTag) está

colocado en sentido del promotor T7 y éste se encuentra en marco, sin codones de paro

entre las secuencias de cada elemento del inserto, además la secuencia de aminoácidos

coincide con la planteada en la metodología (Tabla 1).

Figura 15. Esquematización del marco de lectura en la región 110-330 del vector de expresión pET28b (+)-inserto.


7 Conclusiones

La amplificación del inserto indica un peso ~125 pb, el cual es el tamaño esperado de

acuerdo a la configuración planteada. La caracterización del vector de expresión del

péptido NanoTag9-enteroquinasa cut-6xHisTag pET28b (+) indica la necesidad de

secuenciar la ligación final entre estos dos con fines de comprobación de que la inserción

fue realizada correctamente. Las pruebas in sillico de ésta ligación sugieren que la

expresión del péptido antes mencionado será traducido dentro del marco de lectura,

mientras que experimentalmente, resta replantear la metodología seguida para lograr la

Clonación Independiente de Secuencia y Ligación probando varios tiempos digestión con

polimerasa T4, además de realizar pruebas moleculares con el vector resultante de SLIC

pET28b (+) - péptido NanoTag9-enteroquinasa cut-6xHisTag tales como análisis de

restricción y secuenciación.


8 Referencias

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Anexo A

Figura 16. Uso de codones en E. coli. [21]


Anexo B

Figura 17. Análisis de restricción del plásmido pET28b (+) con las enzimas HindIII y EcoRV para la digestión doble (carriles pares) y con HindII para la digestión sencilla (carriles nones), marcador de peso 1 kb.

250

500

750

1000

1500

2000

10000

1 2 3 4 5 6 7 8

desarrollo de aptámeros para su uso en recuperación de

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