departamento de ingeniería civil e industrial
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Departamento de Ingeniería Civil e Industrial
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Acta de Correcciones al Proyecto de Grado Biología
Fecha: 17 de febrero del 2017 Autores: Yisveire Andrea Fontal González Nombre del Proyecto de Grado: PLAN DE MANEJO Y CONSTRUCCIÓN DEL
CÓDIGO DE BARRAS DE ADN DE LA ESPECIE Gustavia speciosa (Kunth) DC.
(LECYTHIDACEAE) EN LA RESERVA LA HONDONADA, MUNICIPIO DE
YOTOCO
Director:
Como indica el artículo 2.27 de las Directrices de Trabajo de Grado, he verificado
que los estudiantes indicados arriba han implementado todas las correcciones
que los Jurados del Proyecto de Grado definieron que se efectuaran, como consta
en el Acta de Calificación correspondiente.
________________________________________
Firma del Director del Proyecto de Grado
Santiago de Cali, 17 de febrero de 2017 Mauricio Quimbaya Ph.D. Director del Programa de Biología Facultad de Ingeniería Pontificia Universidad Javeriana Cali REFERENCIA: Trabajo de Grado de la estudiante Yisveire Andrea Fontal González del programa de Biología. Cordial saludo. Presento a usted el trabajo de grado terminado de la estudiante Yisveire Andrea Fontal González código 200000075710 quien trabajó bajo mi dirección el proyecto de grado “Plan de manejo y construcción del código de barras de ADN de la especie Gustavia
speciosa (Kunth) DC. (Lecythidaceae) en la Reserva La Hondonada, municipio de Yotoco”. En servicio, Nhora Helena Ospina Calderón MgSc Biología-Ecología UNAL Biología PUJ.
PLAN DE MANEJO Y CONSTRUCCIÓN DEL CÓDIGO DE BARRAS DE ADN DE
LA ESPECIE Gustavia speciosa (Kunth) DC. (LECYTHIDACEAE) EN LA RESERVA
LA HONDONADA, MUNICIPIO DE YOTOCO
YISVEIRE ANDREA FONTAL GONZÁLEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA CALI
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
TRABAJO DE GRADO
CALI
2016
2
Trabajo de Grado
Plan de Manejo y Construcción del Código de Barras de ADN de la especie Gustavia
speciosa (Kunth) DC. (Lecythidaceae) en La Reserva La Hondonada, Municipio de
Yotoco
Yisveire Andrea Fontal González
Directora
Nhora Helena Ospina Calderón MgSc
Codirectora
Nicola Sian Flanagan PhD
Pontificia Universidad Javeriana Cali
Programa de Biología
Trabajo de Grado
Cali
2016
3
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a mi directora Nhora Helena Ospina y codirectora Nicola Sian Flanagan por su
apoyo y confianza en la dirección de esta tesis.
Al Sr. Álvaro José Botero García, Erwin García Ayala, familia García Ayala propietario de la
Reserva La Hondonada por permitirme el acceso.
A Maylin Gonzalez directora del laboratorio de Genética de la Conservación del Instituto de
Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt por consentir el uso de sus
instalaciones, al igual que su ayuda en la implementación de los protocolos de extracción del
ADN.
Agradezco al Dr. Gil Fonthal por su valiosa ayuda en la redacción y estructuración del
documento.
4
CONTENIDO
LISTA DE TABLAS……………………………………………………………………………..6
LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………………………….7
LISTA DE ANEXOS……………………………………………………………………………..8
RESUMEN………………………………………………………………………………………..9
ABSTRACT .................................................................................................................................. 10
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 11
2. MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 15
2.1. Dinámica poblacional: tabla de vida .............................................................................. 16
2.2. Distribución geográfica potencial (MAXENT).............................................................. 17
2.3. Código de barras de ADN .............................................................................................. 19
2.4. Planes de manejo ............................................................................................................ 21
2.5.1. Descripción. ............................................................................................................ 22
2.5.2. Distribución geográfica. .......................................................................................... 24
2.5.3. Estado de conservación. .......................................................................................... 25
3. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN ................................................................................... 27
3.1. Planteamiento del problema ........................................................................................... 27
3.2. Formulación del problema ............................................................................................. 28
4. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 29
4.1. Objetivo general ............................................................................................................. 29
4.2. Objetivos específicos...................................................................................................... 29
5. METODOLOGÍA .................................................................................................................. 30
5.1. Área de estudio ............................................................................................................... 30
5.2. Fases de investigación .................................................................................................... 31
5.2.1. Objetivo 1................................................................................................................ 31
5.2.2. Objetivo 2................................................................................................................ 35
5.2.3. Objetivo 3................................................................................................................ 37
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................... 44
6.1. Dinámica poblacional de Gustavia speciosa .................................................................. 44
6.1.1. Distribución de tallos por clases diamétricas. ......................................................... 44
6.1.2. Clases de tamaño de la población. .......................................................................... 45
5
6.1.3. DAP: fertilidad e infertilidad. ................................................................................. 47
6.1.4. Tabla de vida. .......................................................................................................... 49
6.2. Distribución geográfica .................................................................................................. 53
6.3. Código de barras de la vida de Gustavia speciosa ......................................................... 57
6.3.1. Extracción de ADN. ................................................................................................ 57
6.3.2. Amplificación por PCR........................................................................................... 59
6.3.3. Secuencias. .............................................................................................................. 63
7. CONCLUSIÓN ..................................................................................................................... 70
8. RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 72
8.1. Lineamientos de manejo................................................................................................. 74
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 76
ANEXOS ...................................................................................................................................... 84
6
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Tabla de vida de Gustavia speciosa en la Reserva La Hondonada.................................49
Tabla 2. Resultados de los alineamientos realizados en Geneious................................................66
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Gustavia speciosa A. Hojas, B. Corteza, C. Flor y D. Fruto…………………………..24
Figura 2. Distribución de tallos por clases diamétricas de los individuos adultos………………44
Figura 3. Estructura poblacional por clases de tamaño…………………………………………..46
Figura 4. DAP vs. Individuos adultos. 10 cm umbral (Gentry, 1982) y 4cm umbral propuesto...48
Figura 5. Curva de sobrevivencia para las clases de tamaño de Gustavia speciosa……………..50
Figura 6. Proyección a 5 años de la sobrevivencia de la población……………………………...51
Figura 7. Mapa de distribución geográfica potencial de G. speciosa en el Valle del Cauca…….54
Figura 8. Mapa de distribución de los ecosistemas del Valle del Cauca por Biomas……………55
Figura 9. Prueba de Jackknife para las variables ambientales…………………………………...56
Figura 10. Extracción de ADN de G. speciosa con el kit DNEasy®…………………………….58
Figura 11. Amplificación del locus rbcL para G. speciosa………………………………………59
Figura 12. Primera amplificación del locus matK para G.speciosa……………………………...60
Figura 13. Segunda amplificación del locus matK para G. speciosa…………………………….61
Figura 14. Amplificación del locus trnH-psbA para G. speciosa………………………………..62
Figura 15. Purificación del producto de la PCR del locus rbcL…………………………………63
Figura 16. Purificación del producto de la PCR del locus matK………………………………...64
Figura 17. Purificación del producto de la PCR del locus trnH-psbA…………………………...65
8
LISTA DE ANEXOS
Anexo A. Secuencias obtenidas en formato FASTA.....................................................................83
Anexo B. Variables ambientales utilizadas en MAXENT.............................................................88
9
RESUMEN
Las especies maderables en Colombia de importancia comercial se encuentran en un estado
grave de amenaza, debido a la tala y el tráfico ilegal de madera. Por esta razón, los profesionales
de la conservación están realizando proyectos que lleven a la preservación en el tiempo de estas
especies a partir de planes de manejo y estrategias de conservación de dichas especies. Este
estudio tiene como objetivo evaluar el estado de conservación de la especie de árbol maderable
perteneciente a la familia Lecythidaceae, Gustavia speciosa, en la Reserva La Hondonada. Para
esto se evaluó la dinámica de la población de este árbol, mediante la construcción de tablas de
vida considerando las variables de estructura y distribución, la cual dio como resultado que la
población se encuentra en detrimento. La distribución fue estimada usando el modelo de
distribución geográfica de MAXENT (máxima entropía). La mayor concentración de la especie
se encuentra al norte del Valle del Cauca, localizada en los ecosistemas de Bosque Medio
Húmedo en Montaña Fluvio-Gravitacional (BOMHUMH) y Bosque Cálido Seco en Planicie
Aluvial (BOCSERA). La variable ambiental que más afecta a la distribución de esta especie es la
temperatura. A partir del uso de herramientas moleculares se elaboró el código de barras de ADN
para esta especie para ser depositado en BOLD, con el fin de contribuir con esta herramienta a
combatir el tráfico ilegal de una manera más rápida y efectiva. Se establecieron los lineamientos
para la conservación de la especie.
Palabras claves: Especies maderables, estado de conservación, dinámica poblacional, tabla de
vida, MAXENT, BOLD.
10
ABSTRACT
Timber species in Colombia of commercial importance are in a serious state of threat due to
logging and illegal wood trafficking. For this reason, conservation professionals are carrying out
projects that lead to the preservation in time of these species from management plans and
conservation strategies of these species. This study aims to evaluate the conservation status of
the wood tree species belonging to the family Lecythidaceae, Gustavia speciosa, in La
Hondonada Reserve. For this, the dynamics of the population of this tree was evaluated by the
construction of life tables considering the variables of structure and distribution, which resulted
in the population being at a disadvantage. The distribution was estimated using the MAXENT
geographic distribution model (maximum entropy). The highest concentration of the species is
located north of the Valle del Cauca, in the Humid Middle Forest in Fluvio-Gravitational
Mountain (BOMHUMH) and Dry Warm Forest in Alluvial Plain (BOCSERA). The
environmental variable that most affects the distribution of this species is the temperature. From
the use of molecular tools, the DNA barcode was developed for this species to be deposited in
BOLD, in order to contribute with this tool to combat illegal traffic in a faster and more effective
way. The guidelines for the conservation of the species were established.
Key words: Timber species, conservation status, population dynamics, life table, MAXENT,
BOLD.
11
1. INTRODUCCIÓN
La región de los Andes en Colombia se encuentra dividida en las tres vertientes de la cordillera
de Los Andes (Occidental, Central y Oriental). Colombia presenta dos importantes hotspots de
biodiversidad siendo estos los Andes tropicales y la región del Choco-Darien haciendo de este
uno de los países megadiversos a nivel mundial (Myers et al., 2000). Según el Ministerio de
Ambiente y Desarrollo Sostenible, Colombia cuenta con una cobertura boscosa del 52.2% de su
área continental (Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible, 2016). De estos bosques se
han derivado servicios ecosistémicos por muchos años, en especial la obtención de recursos
maderables a partir de la tala de árboles, pero a menudo sin tener en cuenta la reglamentación
vigente para hacer de esta actividad una práctica sostenible (Cárdenas et al., 2015). La región
andina colombiana reporta el 24% de la deforestación a nivel nacional (IDEAM, 2015). Es por
esto que en la actualidad las distintas especies de árboles maderables que han sido explotadas
para diversos usos se encuentran en el Libro Rojo de Plantas de Colombia (Especies maderables
amenazadas) bajo algunas de las categorías de amenaza dadas por la IUCN (International Union
for Conservation of Nature; Cárdenas & Salinas, 2007).
En un análisis de las causas de deforestación en Colombia se incluyen las siguientes: (1) La
minería ilegal que se encuentra fundamentalmente en la región del pacífico colombiano y en el
departamento de Antioquia; (2) La conversión a áreas agropecuarias representada en el cultivo
de pastos principalmente en el Suroriente del país; (3) La tala ilegal extendida en casi todo el
territorio nacional, exceptuando la costa norte colombiana; (4) Los incendios forestales naturales
o intencionales también extendidos en gran parte del territorio nacional (IDEAM, 2015) y (5)
12 Deforestación asociada a cultivos ilícitos según la Oficina de las Naciones Unidas Contra la
Droga y el Delito (ONUDC), en Colombia para el año 2015 se encontraban alrededor de 96000
ha cultivadas con plantas de coca en casi todo el territorio nacional exceptuando los
departamentos de Caldas, La Guajira y Cundinamarca (ONUDC, 2016).
Las recurrentes presiones antropogénicas por parte de la industria maderera están llevando a las
especies maderables a una significativa reducción en su población, especialmente la práctica de
la tala selectiva. Sin embargo, no solo la tala afecta la integridad de estas especies sino también
los errores sistemáticos como el uso de nombres comunes por parte de las madereras para
clasificar ciertas especies, ha generado parámetros de cosecha erróneos que ponen en riesgo la
permanencia en el tiempo de ciertas especies (Riba-Hernández et al., 2014). Lo anterior se debe
a que los nombres comunes abarcan a más de una especie que pueden o no ser del mismo género.
Para esto al evaluar la dinámica poblacional de las especies se obtienen las características propias
de estas, permitiendo plantear los parámetros para la tala selectiva y corregir los errores de
sinonimia en el nombre que garantiza la correcta identificación de las especies (Riba-Hernández
et al., 2014).
La historia de vida y la dinámica poblacional de una especie son dos conceptos ecológicos
fundamentales a la hora de aplicar acciones de conservación, ya que permiten tener un
conocimiento basto sobre la especie con la cual se está trabajando. Cuando se trata de árboles, en
especial de especies maderables que tienen un alto valor comercial, estos conceptos son de vital
importancia debido a la sobreexplotación, la cual podría llevar a la extinción de estas especies si
no se hace nada al respecto (Riba-Hernández et al., 2014). Por esta razón, los profesionales de la
conservación están realizando proyectos que lleven a la preservación en el tiempo de estas
especies a partir de planes de manejo y estrategias de conservación (Cárdenas et al., 2015).
13
Este estudio tuvo como objetivo evaluar el estado de conservación de la especie de árbol
maderable Gustavia speciosa, en la Reserva de la Sociedad Civil La Hondonada, municipio de
Yotoco, departamento del Valle del Cauca. En este trabajo se evaluó la dinámica de la población
de G. speciosa, mediante la construcción de tablas de vida lo que permitió analizar el estado de
la población, considerando las variables de estructura y distribución. Las tablas de vida reflejan
la estructura de las poblaciones y hacen posible simular su dinámica en el tiempo (Begon et al.,
1996).
Para establecer la distribución de G. speciosa en el departamento del Valle del Cauca se empleó
el modelo de distribución geográfica de MAXENT (máxima entropía). Este modelo permite
obtener la ubicación geográfica potencial de las poblaciones naturales de la especie de interés por
medio de unos parámetros de presencia – ausencia y parámetros climáticos (Phillips et al., 2004).
A pesar de que las herramientas de la ecología permiten obtener información significativa de la
especie de estudio, las herramientas moleculares aportan resolución y precisión de la
información.
Por consiguiente el uso de herramientas moleculares como el código de barras de ADN, está
siendo ampliamente utilizada para detectar la presencia de especies en peligro de extinción o
esquivas, entender la interacción entre especies, monitoreo de comercio ilegal de subproductos
de origen animal y vegetal y la identificación fiable y rápida de especie exóticas en el campo de
la bioseguridad (Valentini et al., 2009). Con la aplicación de estas tecnologías es posible la
identificación de especies utilizando solo un fragmento del individuo, que en el caso de plantas
que no tengan todas las estructuras reproductivas sería muy difícil de lograr a partir de su
14 morfología externa. Estos códigos vienen siendo de gran ayuda, principalmente para combatir el
tráfico ilegal de especies maderables (Cárdenas et al., 2015). En Colombia la tala y el tráfico
ilegal de maderas alcanzan un 42% de la producción total de ésta, convirtiendo a la tala y el
tráfico ilegal en un problema creciente que pone en peligro la supervivencia de varias especies,
en especial las de alto valor comercial (Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo
Territorial, 2009).
Para el aislamiento del código de barras de ADN de la especie de estudio de este trabajo se hizo
uso de la combinación de los loci rbcl- matK, además, adicionalmente a estos loci se utilizó los
loci ITS y trnH-psbA para agregar más precisión a la herramienta molecular (CBOL Plant
Working Group, 2009; Yao et al., 2010).
La importancia de este estudio se fundamenta en los vacíos de información sobre la conservación
de esta especie. Es por esto que mediante las herramientas ecológicas y las técnicas moleculares,
los resultados de este estudio son aportes fundamentales para formular el plan de manejo para la
especie Gustavia speciosa y que permita tomar decisiones adecuadas en pro de la persistencia de
las poblaciones naturales de esta especie, además, de la creación del código de barras de ADN, el
cual fue depositado en la base de datos Barcode of Life Data Systems (BOLD).
15
2. MARCO TEÓRICO
Los factores responsables de los patrones de la biodiversidad en todas las regiones han sido
examinados como el estudio de las islas. Este estudio permitió proponer la teoría de la
biogeografía de islas por MacArthur y Wilson (1997). Esta teoría plantea que la riqueza, es decir,
el número de especies, se ve influenciado por la función de la colonización y la especiación in
situ, las cuales aumentan la riqueza en las islas, mientras que la extinción le resta al número de
especies en las islas. Por otro lado el área geográfica de las islas y el aislamiento son dos factores
importantes que afectan el número de especies en las islas; esto se debe a que las islas más
grandes tienen más especiación in situ que las islas pequeñas, ya que estas presentan mayor
diversidad de tipos de habitas, lo que facilita la llegada de más especies por la oferta de recursos;
mientras que las islas más pequeñas y aisladas tienen una menor riqueza y las especies se
encuentran estrechamente relacionadas debido a que son colonizadas con poca frecuencia
(Simberloff, 1974; Helmus et al., 2014).
Según esta teoría se obtiene que el número de especies en el tiempo geológico es constante,
mientras que la evolución actúa gradualmente con el tiempo geológico para aumentar el
equilibrio del número de especies en las islas (Simberloff, 1974). Entonces, teniendo en cuenta lo
anterior se propone que esta teoría es aplicable no solo a islas oceánicas sino que es una teoría
universal de la biogeografía, esto es debido a que los hábitats naturales continuos se están viendo
interrumpidos por la acción del hombre. Por ende se piensa en los diferentes fragmentos de
bosques como las islas y la matriz que los rodea (pastizales, cultivos, etc) como el mar que las
separa. Por lo tanto se obtiene que estos fragmentos de bosque trabajan bajo los mismos
parámetros que las islas y su condición de aislamiento aumenta con el tiempo y las acciones
16 antropogénicas. A partir de lo anterior nace el concepto de fragmentación del hábitat, donde se
parte de la teoría de la biogeografía de islas aplicada al continente y se concluye que en los
fragmentos pequeños la riqueza se ve empobrecida, mientras que en los fragmentos más grandes
se observa menos perdida de dicha riqueza (Haila, 2002).
Por lo anterior el concepto de la fragmentación del hábitat se ha convertido en un tema muy
importante para la biología de la conservación en el antropoceno. Aunque los efectos de la
fragmentación del hábitat se definen por lo general como perdida de hábitat y ruptura de la
continuidad del hábitat, en realidad los efectos varían entre los diferentes organismos, tipos de
hábitat y regiones geográficas. Es por esto que los esfuerzos de conservación de las especies en
ambientes fragmentados deben realizarse partiendo de las necesidades únicas de cada especie y
de su interconexión con el paisaje (Wilcox & Murphy, 1985; Fahrig, 2003).
2.1. Dinámica poblacional: tabla de vida
Las estrategias de conservación requieren el uso de instrumentos de ecología de poblaciones para
su desarrollo, el uso de estos instrumentos es muy útil y juegan un papel fundamental en la
conservación de la biodiversidad. Las tablas de vida permiten simular la dinámica de las
poblaciones en el tiempo a partir de información primaria, recolectada en campo para generar
evaluaciones y lineamientos más acordes a la conservación de las especies. Estas tablas
convierten los datos en probabilidades de persistencia de esa especie en el tiempo (Begon et al.,
1996; Ahumada, 2001; López-Gallego, 2015
17 Para evaluar el estado de conservación de una especie se utilizan componentes de la ecología de
poblaciones tales como la estimación de la dinámica poblacional, la cual se define como el
cambio en el tiempo de una población en relación a su abundancia (total número de individuos
de la población) y estructura (proporciones de los estadios del desarrollo). Para poder medir la
dinámica de una población se debe primero obtener la abundancia y la estructura de la misma
(López-Gallego, 2015), para después usar modelos matemáticos que permitan analizar la
persistencia de una población en el tiempo, como la construcción de una tabla de vida. La tabla
de vida permite conocer la mortalidad y supervivencia de una población por medio de la
esquematización de la mortalidad específica para cada edad. Estas tablas arrojan indicadores
demográficos (sobrevivencia, mortalidad, mortalidad específica, fecundidad total, fecundidad
neta, entre otros), los cuales son cruciales para caracterizar la viabilidad de una población (Begon
et al., 1996; Ahumada, 2001; Smith & Smith, 2007). Las tablas de vida pueden dividirse en
clases de edades, en fases o clases de tamaño. Para las plantas de larga vida una clasificación
basada en las etapas de desarrollo o clases de tamaño es más apropiada, debido a que en esta los
individuos de la misma edad pueden estar en estado reproductivos o hacer crecimiento
vegetativo y no reproducirse o pueden no hacer ninguno (Begon et al., 2006). Por lo tanto en este
trabajo se utilizó la clasificación por etapas de desarrollo, ya que G. speciosa presenta un ciclo
de vida largo y son árboles muy longevos (Prance y Mori, 1979).
2.2. Distribución geográfica potencial (MAXENT)
18 Existen herramientas que permiten contribuir a la solución de la problemática de la conservación,
tales como los modelos de distribución geográfica que ayudan a establecer las áreas de
distribución potencial de especies o comunidades (Ferrier & Guisan, 2006; Sua et al., 2009). Los
modelos de distribución geográfica están siendo también utilizados para aportar información
sobra la ubicación geográfica de las poblaciones naturales de las especies, en el caso particular
de este trabajo se utilizara el modelo de distribución geográfica de máxima entropía MAXENT
debido a su precisión y confiabilidad (Phillips et al., 2004; Ferrier & Guisan, 2006).
En el caso de la conservación in situ de una especie focal es recomendado el uso de modelos de
distribución geográfica de especies individuales, ya que es necesario ubicar a las poblaciones
naturales de la especie focal para posteriormente tomar las decisiones de conservación
adecuadas. El uso de estos modelos predictivos ha permitido obtener información más confiable
de la distribución y con un porcentaje de probabilidad más alto de encontrar la especie, que
utilizando métodos de parcelas y luego extrapolar las extensiones de la población. Un ejemplo de
aplicación de esta técnica es el estudio de Sua et al., (2009) al evaluar la distribución de la Flor
de Inírida de Invierno (Guacamaya superba) y comparar los resultados obtenidos por el modelo
con la información obtenida de la extrapolación.
MAXENT contribuye a resolver el problema de la falta de información que existe en las
colecciones de herbario y los museos de historia natural sobre los “fracasos” de observar la
especie. Es decir, cuando no existe información sobre localidades donde la especie se haya
reportado como ausente. Sólo existe información de las localidades donde la especie ésta
presente. Debido a esto, la técnica está siendo utilizada para establecer la distribución potencial
de especies focales, dado que se basa en la región geográfica de interés (X), un conjunto de
19 muestras con una distribución conocida dentro de X y un conjunto de características ambientales
de X (e.g., precipitación, elevación, etc.) (Phillips et al., 2004).
2.3. Código de barras de ADN
El uso de las herramientas moleculares también está tomando importancia en la conservación
debido a que el tráfico ilegal de especies se ha convertido en un mercado negro muy apetecido
dentro de las sociedades (Cárdenas et al., 2015). Por eso, para combatir con mayor rapidez y
eficacia este mercado, se ha implementado el uso de herramientas moleculares como el código
de barras de ADN para las especies. Este código facilita su identificación por parte de las
autoridades competentes haciendo más fácil controlar el contrabando (Cárdenas et al., 2015).
En el 2003 se dio el auge del código de barras de ADN y a partir de ahí se crea el Consorcio para
el Código de Barras de la Vida (CBOL). Esta es una iniciativa internacional para el desarrollo
del código de barras de ADN, cuyo enfoque es fomentar estándares globales y coordinar la
investigación en los códigos de barra de ADN (Valentini et al., 2009). En el 2010 se crea en
Colombia la red iBOL Colombia, cuyo objetivo es generar el código de barras de ADN para la
biodiversidad colombiana como una forma de apoyar el intercambio de conocimientos, fortalecer
las colaboraciones nacionales e internacionales y crear una herramienta para la gestión ambiental
(Gonzalez & Paz, 2013).
20 El código de barras es una región de ADN normalizado que sirve como una huella o etiqueta
para la identificación de especies de una manera más rápida y precisa (Hebert et al., 2003;
Valentini et al., 2009). Los locus fueron escogidos basados en los 3 criterios para la selección de
locus propuestos por el CBOL (Consortium for the Barcode of Life). (1) Universalidad: los locus
deben poder ser secuenciados rutinariamente en las plantas terrestres, (2) Calidad y cobertura de
la secuencia: los locus deben ser susceptibles a la producción de secuencias bidireccionales con
pocas o ninguna bases ambiguas y (3) Discriminación: los locus deben permitir distinguir a la
mayoría de las especies (CBOL Plant Working Group, 2009).
Para plantas, ha habido varias propuestas sobre los loci potenciales para el código de barras de
ADN tales como el CBOL Plant Working Group (CBOL Plant Working Group, 2009) que
proponen la combinación de dos locus de los genes del genoma del cloroplasto, el gen rbcL
(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxigenase large chain) y una porción del gen matK
(Maturase K). Aunque estos dos locus han funcionado en la construcción del código de barra de
ADN en plantas, otros investigadores han propuesto que adicionalmente se haga uso de la región
ITS (Internal transcribed spacer ) y la región espaciadora intergénica no codificante trnH-psbA ,
las cuales son regiones que posee unas características valiosas que lo hacen útil para la
construcción de códigos de barra de DNA, tales como la disponibilidad de regiones conservadas
para el diseño de primers universales, una variabilidad significativa para distinguir especies
incluso estrechamente relacionadas y facilidad para su amplificación a través de una amplia
gama de taxones (Kress et al., 2005; Kress y Erickson, 2007;Yao et al., 2010). Para el caso de la
familia Lecythidaceae, González et al., (2009) evaluaron por medio de un estudio el éxito de
varios locus entre ellos rbcL y matK en la construcción del código de barras de ADN en árboles
21 de la amazonia, demostrando que estos dos locus presentan un porcentaje alto de éxito en la
construcción de código de barras de ADN de varias especies de esta familia.
2.4. Planes de manejo
Motivados por el valor intrínseco de la diversidad biológica, su reducción por la actividad
humana, la falta de información y conocimiento, la importancia del recurso biológico en las
comunidades, la necesidad de inversión para la conservación del recurso biológico y su uso
sostenible , en el año 1994, mediante la Ley 165, Colombia acepta el Convenio sobre Diversidad
Biológica (CDB) de las Naciones Unidas de 1992, por medio del cual se deja expresado en el
artículo 8 que se conservará in situ la diversidad biológica dentro o fuera de áreas protegidas
(CDB, 1992). Por lo tanto, para procurar cumplir con ello y mantener la biodiversidad, en
Colombia se han realizado planes de manejo para la Conservación de especies maderables
amenazadas cómo, el Abarco, Caoba, Cedro, Palorosa y Canelo de los Andaquíes (Cárdenas et
al., 2015); acompañados de iniciativas como la Estrategia Nacional para la Conservación de
Plantas (García et al., 2010).
Los planes de manejo para la conservación han resultado ser una herramienta imprescindible
para el mantenimiento de la biodiversidad, ya que con ellos se evalúa el estado de la diversidad
biológica y el impacto de las prácticas antropogénicas o de los fenómenos naturales. Estos planes
se pueden realizar como planes de manejo para reservas naturales, parques, etc., o como planes
de manejo para especies focales, ya sea que la especie de interés sea una especie representativa,
amenazada, de importancia para uso sostenible o que amenace la biodiversidad nativa (e.g.,
22 especie invasora). Además, los planes de manejo proponen un plan de monitoreo que examine el
funcionamiento de las acciones implementadas para cumplir las metas de conservación (López-
Gallego, 2015).
2.5. Gustavia speciosa (Kunth) DC. (Lecythidaceae)
2.5.1. Descripción.
Gustavia speciosa pertenece a la familia Lecythidaceae cuya distribución se encuentra dentro de
los bosques húmedos tropicales y comprende 11 géneros, con alrededor de 180 especies. Entre
las características distinguibles de esta familia se encuentran: (1) Árboles de pequeños a grandes;
(2) Hojas alternas, simples, estipuladas o con estipulaciones diminutas; (3) Plantas maderables
con corteza fibrosa y olor a linaza; (4) Flores actinomorfas o zigomorfas con numerosos
estambres y ovario inferior, pétalos generalmente presentes, estambres numerosos; (5) Frutos
dehiscentes e indehiscentes, bayas fibrosas, drupas secas o capsulas leñosas circuncísiles con una
a muchas semillas y (6) semillas con o sin cotiledones (Zappi, 2009; Prance y Mori, 1979). El
género Gustavia se caracteriza por: (1) árboles de tamaño pequeño a mediano hasta 30 m de
altura; (2) crece como un solo tronco dominante o en varios tallos; (3) las hojas crecen en grupos
al final de cada rama; (4) las hojas pecioladas o sésiles, glabras, borde entero o aserrado y
relativamente pequeñas a muy grandes; (5) flores llamativas y simétricas con el cáliz entero o
con 4 a 6 lóbulos y de 6 a 8 pétalos y (7) frutos como bayas algunas veces leñosos, liberando las
23 semillas por delicuescencia del pericarpio, en algunas especies son dehiscentes (Prance y Mori,
1979). Esta especie se caracteriza además por: (1) árboles de tamaño mediano hasta 20 m de
altura; (2) tallos de 40cm de diámetro; (3) laminas foliares u hojas estrechamente elípticas a
lanceoladas con 16 a 21 pares de nervios laterales, glabras y cactáceas (Fig. 1A); (4) corteza casi
lisa de gris a marrón grisáceo (Fig. 1B); (5) Flores por los general con un cáliz de 4 redondeado,
lóbulos triangulares o irregularmente incisos, con 6 a 8 pétalos de color blanco y un androceo
amarillo claro ; (6) paredes del ovario puberales a tomentosa oxidada (Fig. 1C); (7) Frutos
globosos, con el cáliz persistente sólo como un borde irregular y sin lóbulos distinguibles con
dos o más semillas(Fig. 1D). Esta especie tiene por nombre común en Colombia “Chupo”
(Prance y Mori, 1979).
A
B
24
C
D
Figura 1. Gustavia speciosa A. Hojas, B. Corteza, C. Flor y D. Fruto. Fuente: Nhora Ospina
Calderón.
La época de floración suele ser en los meses de febrero, mayo, junio, julio, agosto y diciembre,
mientras que la época de producción de frutos es en los meses de julio, septiembre y noviembre
(Prance y Mori, 1979). Dentro de los sinónimos de G. speciosa se encuentra Pirigara speciosa
Kunth, Japarandiba speciosa (Kunth) Kuntze y Gustavia speciosa subsp. speciosa (Prance y
Mori, 1979).
Tipo: Humboldt y Bonpland, 1881(holotipo, P; isotipo, F neg. No. 38306, GH, foto, P).
Colombia. Tolima: Cerca a Mariquita, alt 450 ft, sin fecha (fl) (Prance y Mori, 1979).
2.5.2. Distribución geográfica.
25
El género Gustavia se distribuye en Centro y Sur América desde el suroccidente de Costa Rica
hasta el nororiente de Bolivia. Existe 27 especies de este género que se ubican en el norte y al
occidente de los Andes y en los Valles Interandinos, como Gustavia speciosa, la cual es nativa
de los Valles Interandinos de Colombia y Ecuador (Prance y Mori, 1979).
2.5.3. Estado de conservación.
Como anteriormente se ha mencionado, existen muchas especies de árboles maderables que se
encuentran amenazadas como consecuencia de la tala excesiva de los bosques. Según el libro
rojo de plantas de Colombia, después de las Lauraceae (30 especies en riesgo), la familia
Lecythidaceae tiene el mayor número de especies en algún grado de amenaza (27 especies en
riesgo; Cárdenas & Salinas, 2007). Las especies de esta familia de árboles maderables son muy
apetecidas por su madera resistente, por lo que resultan fácilmente comerciables y, por ende,
sobreexplotadas. Adicionalmente, las especies de esta familia son de importancia ecológica en
los bosques neotropicales de tierras bajas. No obstante, son pocos los estudios de campo que se
han realizado sobre estas, lo que trae como consecuencia que existan muchos vacíos de
información de la biología de esta familia (Prance y Mori, 1979).
El Libro Rojo de Plantas Fanerógamas de Colombia, Calderón et al., (2002) plantea que las
especies de la familia Lecythidaceae se encuentran principalmente afectadas por la
sobreexplotación y la tala indiscriminada lo que ha ocasionado un descenso en las poblaciones de
26 estas especies, llevando a 34% de las 75 especies registradas en Colombia a ubicarse en alguna
categoría de amenaza. Gustavia speciosa se encuentra bajo la categoría de Casi Amenazada (NT)
de la (IUCN).
27
3. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
3.1. Planteamiento del problema
La problemática de este estudio radica en las continuas presiones generadas por el hombre que
han ido con el paso del tiempo afectando los ecosistemas, lo que ha generado cambios en el
paisaje como pérdida de hábitat y fragmentación. Debido a esto las especies se ven sometidas a
continuas perturbaciones que disminuyen las poblaciones hasta llegar en muchos casos a la
extinción de las mismas. Para el caso particular de este estudio, las talas ilegales y la
sobreexplotación de los recursos por parte de las industrias han llevado a que las especies
maderables con mayor valor económico se vean amenazadas en la actualidad. La disminución en
las poblaciones de esta especie juegan un papel importante en el mantenimiento del equilibrio
ecosistémico del bosque subandino, ya que es una especie que crece y se mantiene en los
bosques en estado maduro, es decir, bosques donde las poblaciones de especies ya se han
establecido y las presiones antropogénicas no deberían estar interrumpiendo el flujo de energía.
Es por esto que la conservación de esta especie indica no solo una preservación en el tiempo de
la misma, sino también una preservación de las especies asociadas.
La problemática que aquí se plantea fue resuelta por medio de herramientas de la ecología de
poblaciones y técnicas moleculares que al integrarse permiten obtener resultados más
aproximados a la realidad de la historia de vida de dicha especie y así poder sugerir las acciones
de conservación hacia las necesidades específicas de G. speciosa. Con el tiempo si estas acciones
de conservación no se proponen y no se ejecutan, la población de dicha especie probablemente se
verá disminuida. Adicionalmente, si se tiene en cuenta que los ecosistemas funcionan como una
28 serie de redes interconectadas, entonces la disminución afectaría el equilibrio ecosistémico, que
es necesario para que los servicios ecosistémicos se mantengan. Por lo anterior, en el presente
trabajo se evaluó el estado de conservación de la población de la especie Gustavia speciosa en la
Reserva de la Sociedad Civil La Hondonada, municipio de Yotoco, departamento del Valle del
Cauca. El desarrollo de este trabajo de investigación aportará a la creación posterior de un plan
de manejo que permita tomar decisiones adecuadas en pro de la persistencia de las poblaciones
naturales de esta especie.
3.2. Formulación del problema
¿Cuál es el estado de conservación de la población de la especie Gustavia speciosa, en la
Reserva Natural de la sociedad civil La Hondonada, municipio de Yotoco?
29
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Evaluar el estado de conservación de la población de la especie Gustavia speciosa, en la Reserva
Natural de la sociedad civil La Hondonada, municipio de Yotoco.
4.2. Objetivos específicos
• Estimar la dinámica poblacional de la especie Gustavia speciosa en la Reserva La
Hondonada, municipio de Yotoco.
• Establecer la distribución potencial de la especie Gustavia speciosa para el departamento
del Valle del Cauca.
• Desarrollar y depositar el código de barras de ADN para la especie Gustavia speciosa en
la base de datos The Barcode of Life Data Systems (BOLD).
30
5. METODOLOGÍA
5.1. Área de estudio
El departamento del Valle del Cauca se encuentra entre la Cordillera Occidental y la Cordillera
Central de los Andes de Colombia, específicamente en el valle geográfico del Río Cauca, al sur-
occidente del país. Este departamento cuenta con 42 municipios, entre ellos el municipio de
Yotoco, cuya porción central está ubicada geográficamente a 3º 51’ 47’’ N y 76º 23’ 48’’ W.
Yotoco presenta una altitud de 972 msnm y una extensión de 873 km2 (Gobernación del valle
del Cauca, 2012).
La Reserva Natural La Hondonada pertenece a la Red de Reservas de la Sociedad Civil, se
encuentra ubicada en el departamento del Valle del Cauca, municipio de Yotoco, corregimiento
El dorado, vereda Muñecos. La parte central de la Reserva se localiza en las siguientes
coordenadas 3° 49’ 36’’ N 76° 26’ 21.5’’ W, sobre la vertiente oriental de la Cordillera
Occidental. Su temperatura media anual es de 23,7 ºC, con una precipitación anual de 1207 mm,
presenta una humedad relativa media del 76% y por su elevación a 1250 msnm se caracteriza por
un piso térmico templado (IDEAM, 2005). Se compone de 50 ha de bosque, dividido en dos
remanentes de bosque subandino, rodeados por cultivos de café, banano, plátano y extensiones
de potrero dedicados a la ganadería.
El bosque subandino se extiende desde los 1000 a 2400 m de altitud. Su temperatura media va
desde los 23 a 16 ºC. Su precipitación anual está entre los 4000 a 1000 mm. Está compuesto por
31 árboles de diferentes tamaños, los de mayor tamaño alcanzan los 30 a 40 m de altura y sus raíces
presentan grandes estribos tabulares en la base; presencia de lianas y epifitas leñosas; especies
arbóreas con hojas menores y palmas grandes. Sin embargo contiene menor número de especies
con estas características que el bosque neotropical inferior (Cuatrecasas, 1958).
5.2. Fases de investigación
5.2.1. Objetivo 1: Estimar la dinámica poblacional de la especie Gustavia speciosa
en la Reserva La Hondonada, municipio de Yotoco.
5.2.1.1. Recolección de datos en campo.
Para medir la abundancia y estructura de la población de G. speciosa dentro de los dos
remanentes de bosque de la Reserva, se utilizó el método para muestrear plantas leñosas
propuesto por Gentry, (1982). Este método se enfoca en un área de 0.1 ha, donde se muestrean
todos los individuos cuyo tallo tenga un diámetro a la altura del pecho (DAP) mayor o igual a 10
cm. Se realizaron 10 transectos de 50 x 2 m distribuidos al azar dentro de los dos remanentes de
bosque, distanciados uno del otro 100 m, con el fin de que no se intercepten. Cada transecto se
medió con una cuerda de 50 m marcada cada 5 m, y se midió un metro a cada lado de la cuerda.
Se hicieron conteos de todos los individuos pertenecientes a la especie G. speciosa. A cada
individuo adulto, definido como aquel que se encuentra en etapa reproductiva (Gentry, 1982), se
32 le tomaron las siguientes medidas: CAP (Circunferencia a la altura del pecho) con una cinta
métrica para posteriormente convertirla en el DAP, para esto fue necesario utilizar la formula
DAP= CAP/� ; su altura y diámetro de copa se midieron con ayuda de un medidor laser de
distancia marca Bosch y binoculares de 30 x 50 mm y se contaron el número de frutos de cada
individuo fértil que se encontrara dentro del transecto (Villareal et al., 2006).
5.2.1.2. Análisis de datos.
Se realizó una tabla con la información recolectada en campo. Esta tabla contiene los siguientes
campos: (1) Fecha; (2) No. del transecto; (3) No. árbol o latizo; (4) CAP (Circunferencia a la
altura del pecho); (5) DAP (Diámetro a la altura del pecho) en centímetros; (6) Altura del Fuste
(AF) en metros, desde la base del tronco hasta la base de la copa; (7) Altura total (AT) en metros,
desde la base del tronco hasta el ápice de la copa; (8) Diámetro mayor de la copa en metros; (9)
Diámetro menor de la copa en metros; (10) Estado fenológico; (11) Estado fitosanitario; (12) No.
de plántulas y (13) Cantidad de semillas (Villareal et al., 2006).
5.2.1.2.1. Distribución de tallos por clases diamétricas y clase de tamaño.
Para la distribución de tallos por clases diamétricas se utilizó la fórmula de Sturges, la cual
indico cuál es el intervalo de clases que se debe tomar para realizar una distribución de
frecuencias (Sturges, 1926).
33
� = �
���. �� � , R (Rango) = Valor máximo – valor mínimo; N= Frecuencia total.
Para cada transecto se realizaron las medidas de las clases de tamaño para la especie G. speciosa.
Para esto se tuvo en cuenta la medida del DAP para obtener las clases de tamaño de los
individuos de la población. Por lo tanto las clases de tamaño fueron agrupadas de la siguiente
manera: plántulas, latizos (individuos ya lignificados con DAP < 4 cm) y adultos (individuos
con DAP ≥ 4 cm). Este valor de DAP se obtuvo teniendo en cuenta la definición de adulto
propuesta por Gentry, (1982), el cual el autor toma el valor de 10 cm de DAP. Sin embargo, en
este estudio se encontraron individuos que estaban en etapa reproductiva con DAP de hasta 4 cm.
5.2.1.2.2. Dinámica poblacional: Tabla de vida.
Para estimar la dinámica poblacional de la especie G. speciosa se construyó una tabla de vida
con los siguientes índices (Gibson, 2002; Begon et al., 2006):
1. Estado (x): Intervalos por clases de tamaño.
2. ax: Indica el número de individuos vivos al comenzar cada etapa de la vida (x).
3. lx: Sobrevivencia, probabilidad de un individuo de sobrevivir a la edad x:
lx = l0(ax/a0)
Donde l0 es el número de sobrevivientes de la clase inicial y a0 es el número de individuos
en la clase inicial.
34
4. dx: Mortalidad, es la proporción del total de individuos que mueren en cada etapa x:
dx = lx-lx+1
5. qx: Tasa de mortalidad:
qx = dx/lx
6. Fx: Fecundidad total, es el número total de semillas producidas en cada etapa.
7. mx: Tasa de natalidad, es el número promedio de semillas producidas por los individuos
que sobreviven en cada etapa:
mx = Fx/ax
8. Para poder obtener la contribución neta de una generación a la siguiente, se calcula la tasa
reproductiva neta (R0) como:
R0 = ∑ lxmx
, que indica el alcance total en el que la población ha aumento o disminuido. Si R0 = 1,
indica que la población no va a crecer debido a que los individuos solo se están
reemplazando a sí mismos. Si R0> 1, la población crecerá en la siguiente generación y si
R0 < 1, la población disminuirá en la siguiente generación (Ahumada, 2001).
9. T: Tiempo generacional, es la longitud media de tiempo entre el nacimiento de un
individuo y el nacimiento de uno de sus propios hijos, la cual se representa por la
ecuación:
T = ∑ xlxmx/R0
35
10. r: Tasa intrínseca de crecimiento poblacional, es la tasa a la que la población aumenta de
tamaño, es decir, el cambio en el tamaño de la población por individuo por unidad de
tiempo. Si r > 0, la población crecerá y si r < 0 la población disminuirá. Esta tasa se
determina por la siguiente ecuación:
r = ln R0/T
11. λ: Tasa finita de crecimiento poblacional, la cual combina el nacimiento de los nuevos
individuos con la sobrevivencia de los individuos existentes. Si λ > 1, la población
crecerá y si λ < 1 la población disminuirá (Gibson, 2002; Begon et al., 2006). Esta tasa se
determina por la siguiente ecuación:
λ = ��
5.2.2. Objetivo 2: Establecer la distribución potencial de la especie Gustavia
speciosa para el departamento del Valle del Cauca.
La distribución de la especie G. speciosa se estimó teniendo en cuenta La Hondonada como una
de las localidades y el resto se obtuvo de la revisión de herbarios y bases de datos como The
Plant List, Tropicos, Herbario Nacional Colombiano COL, Herbario CUVC (Luis Sigifredo
Espinal Tascón), Herbario VALLE “José Cuatrecasas Arumí”, Herbario TULV, Herbario de la
Universidad Icesi y el Catálogo de las Plantas y Líquenes de Colombia. Se realizó una tabla de
las localidades con las coordenadas, con la cual se lleva a cabo la elaboración del mapa de
distribución de Gustavia speciosa. La tabla contenía localidades dentro del Valle del Cauca, al
igual que localidades de otros departamentos con condiciones ecológicas similares a las de este
36 departamento. Se utilizó el programa de distribución MAXENT (Maximum Emtropy ver.
3.3.3k).
Para este trabajo se utilizó el modelo de máxima entropía (MAXENT), el cual consiste en
encontrar la distribución potencial de una especie por medio de una situación de entropía
máxima, esto quiere decir la más cercana a la uniformidad. Para esto se necesita: (1) localidades
de ocurrencia para usarlas como puntos de georeferenciación; (2) la región geográfica de interés
y (3) las variables ambientales. Se ha demostrado que el modelo de distribución de MAXENT es
superior al método estándar de parcelas, por lo que es recomendable utilizarlo en proyectos de
conservación. Ya que al comparar el modelo de parcelas y la extrapolación con el modelo de
distribución MAXENT, este último es sustancialmente superior ya que muestra resultados
probabilísticos, los cuales pueden ser sometidos a análisis de confianza y posteriormente ser
analizados proporcionando un nivel de eficacia que los métodos estándar no pueden o sus niveles
son muy bajos (Phillips et al., 2004). Este modelo de distribución trabaja a partir de un software
llamado MAXENT, el cual cuenta con una interfaz gráfica sencilla para el usuario y una interfaz
de línea de comandos que permite ejecutar automáticamente los guiones. Se encuentra escrito en
Java, lo que permite que pueda ser usado en todas las plataformas informáticas modernas y es de
acceso libre. Para este proyecto se trabajó con los valores por defecto del software, tales como:
umbral de convergencia = 10-5, iteraciones máximas = 1000, regularización valor β = 10-4, el uso
de características lineales, cuadráticas, producto y binomiales y los parámetros propios (Phillips
et al., 2006).
37
5.2.3. Objetivo 3: Desarrollar y depositar el código de barras de ADN para la
especie Gustavia speciosa en la base de datos The Barcode of Life Data Systems
(BOLD).
Este tercer objetivo pretende evaluar los diferentes loci propuestos para su uso como código de
barras de G. speciosa con la metodología estándar descrita posteriormente.
5.2.3.1. Lugar de estudios y toma de muestras.
Las muestras para la construcción del código de barras de ADN de la especie G. speciosa fueron
tomadas de dos poblaciones en la Reserva de la Sociedad Civil La Hondonada y en la Hacienda
La Alejandría en el departamento de Risaralda, municipio Pereira. En cada población se
escogieron 5 individuos adultos en los puntos más extremos dentro de los dos relictos de bosque
para maximizar que se vea reflejada la diversidad genética de las poblaciones y así evitar, en lo
posible, el muestreo de individuos parientes. A cada individuo se le tomó una muestra de 2 hojas
jóvenes funcionales y sanas que fueron cortadas con una tijera de altura. De las hojas se cortaron
suficientes cuadros dependiendo del tamaño de la hoja, de aproximadamente 1 cm2 evitando
tomar tejido del nervio principal y de los nervios secundarios. Se conservó el tejido en bolsas de
papel que se marcaron y guardaron en un contenedor plástico con tapa hermética con 10 g de gel
de sílice.
38
5.2.3.2. Extracción de ADN.
Para la extracción de ADN se pesaron 0,025g de material seco del tejido foliar y se maceró en el
Bead Beater Homogenizer (BioSpec Products Inc.) con 3 balines de acero por muestra y por 4
repeticiones de 30 segundos. Sin embargo, para los tejidos que aún no estaban homogenizados
después de las 4 repeticiones se les continúo procesando hasta que se logró homogenizar. Se
utilizó el kit para plantas DNEasy® Plant Mini kit de QIAGEN, siguiendo el protocolo propuesto
en el kit (QIAGEN, 2011) con los siguientes ajustes. El Buffer AP1del kit fue sustituido por el
Buffer CTAB + PVP al 2% y el tiempo de incubación de 10 minutos a 65℃ se aumentó a 1 hora
a 65℃ (González et al., 2009; Riba-Hernández et al., 2014). El buffer de lisis de CTAB+PVP al
2% permitió, debido al CTAB, que los lípidos de la membrana fueran eliminados, promover la
lisis celular y eliminar los polisacáridos al unirse a ellos (Doyle y Doyle, 1987). Mientras que la
adición de PVP, el cual es un polímero solido con alto peso molecular, soluble en agua y
químicamente inerte; sirvió para eliminar los polifenoles al formar un complejo con estos a
través de enlaces hidrógeno, permitiendo así que estos se encuentren separados del ADN
(Porebski et al., 1997).
Se inspeccionó el producto de la extracción de ADN por medio de una electroforesis en un gel de
agarosa al 1%, utilizando EZ-VISION™ Three de AMARESCO® para visualizar las muestras.
Este es un reactivo fluorescente no mutagénico que forma un complejo compacto con el ADN de
la muestra y migra con él simultáneamente durante la electroforesis. Se trabajó con una dilución
de 1:8 de este reactivo y se mezclaron 6µl de esta dilución con el ADN. Como marcador de peso
molecular se utilizó Lambda DNA/HindIII Marker, el cual se compone de 8 fragmentos de ADN
individuales purificados (en pares de bases): 23130*, 9416, 6557, 4361*, 2322, 2027, 564 y 125.
39 Por último el gel se corrió por 1 hora a 110 V y se observó en un transiluminador ultravioleta en
un largo de onda de 365 nm.
5.2.3.3. Condiciones de la PCR.
La evaluación de la amplificación por PCR se realizó para las regiones del plástido codificantes
rbcL y maK, la región no codificante trnH-psbA y la región nuclear ITS de los genes ARNr. Se
trabajó con PCR de pruebas en 20µl, donde la mezcla de la reacción de la PCR contenía 2µl de
PCR Buffer a 10X para una concentración final de 1X en la reacción, 2µl de dNTPs a 2mM para
una concentración final de 0,2mM en la reacción, 2µl de cada uno de los primers a 2µM para una
concentración final de 0,2µM en la reacción, 0,15µl de Taq DNA Polymerase de Fermentas a
5U/µl para una concentración final de 0,75U/reacción, 2µl de ADN y H2O para un volumen final
de 20µl. El volumen de MgCl2 (Cloruro de magnesio) fue estandarizado para cada uno de los
locus trabajados, al igual que las condiciones térmicas de la PCR. Como control positivo de la
PCR se utilizó la orquídea Kefersteinia tolimensis, debido a su buen desempeño en el proceso de
amplificación. Se examinó el producto de la amplificación por medio de una electroforesis en un
gel de agarosa al 1,5%, para poder visualizar las muestras se utilizó EZ-VISION™ Three de
AMARESCO® en una dilución de 1:8, mezclando 6µl de esta dilución con 5 µl del producto de
la PCR. Como marcador de peso molecular se utilizó GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder de
Thermo Fisher Scientific, el cual se compone de 14 fragmentos de ADN individuales purificados
(en pares de bases): 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800,700, 600, 500, 400, 300, 200, 100.
Por último el gel se corrió por 1 hora a 110 V y se observó en un transiluminador ultravioleta.
40
5.2.3.3.1. Locus rbcLa.
Se amplificó el locus rbcLa, usando los primers propuestos por Kress y Erickson, (2007), los
cuales presentan las siguientes secuencias Forward: a_F 5´- ATG TCA CCA CAA ACA GAG
ACT AAA GC- 3´ y Reverse: a_R 5´- CTT CTG CTA CAA ATA AGA ATC GAT CTC- 3´. La
mezcla de la reacción de PCR contenía 2,8µl de MgCl2 a 25mM para una concentración final de
3,5mM, además, la mezcla contenía 0,8µl de BSA a 20µg/µl para una concentración final de
0,8µg/µl (Bovine Serum Albumin), el cual aumenta el rendimiento de la PCR partiendo de
plantillas de ADN de baja pureza (Thermo Fisher Scientific Inc., 2016). En relación a las
condiciones térmicas se aplicó el siguiente programa de: 94℃ por 1 min para denaturación, 35
ciclos de 94℃ por 30 s, 50℃ por 40 s para el anillamiento, 72℃ por 40 s para la extensión del
primer y con una extensión final de 72℃ por 5 min (Gonzalez et al., 2009).
5.2.3.3.2. Locus matK.
La amplificación del locus matK se llevó a cabo usando los primers propuestos por Kress y
Erickson, (2007), los cuales presentan las siguientes secuencias Forward: 2,1 F 5´- CCT ATC
CAT CTG GAA ATC TTA G - 3´ y Reverse: 5-R 5´- GTT CTA GCA CAA GAA AGT CG -
3´. La mezcla de la reacción de PCR contenía 2,8µl de MgCl2 a 25mM para una concentración
final de 3,5mM, además, la mezcla contenía 0,8µl de BSA. En relación a las condiciones
térmicas se aplicó el siguiente programa de: 94℃ por 3 min para denaturación, 40 ciclos de 94℃
41
por 30 s, 48℃ por 40 s para el anillamiento, 72℃ por 1min para la extensión del primer y con
una extensión final de 72℃ por 10 min (Yuet et al,. 2011).
5.2.3.3.3. Locus trnH-psbA
Se hizo la amplificación del locus trnH-psbA usando los primers propuestos por Kress y
Erickson, (2007), los cuales presentan las siguientes secuencias Forward: F 5´- ACT GCC TTG
ATC CAC TTG GC- 3´ y Reverse: 5-R 5´- CGA AGC TCC ATC TAC AAA TGG- 3´. La
mezcla de la reacción de PCR contenía 2µl de MgCl2 a 25mM para una concentración final de
2,5mM. En relación a las condiciones térmicas se aplicó el siguiente programa de: 94℃ por 4
min para denaturación, 35 ciclos de 94℃ por 30 s, 55℃ por 30 s para el anillamiento, 72℃ por
1min para la extensión del primer y con una extensión final de 72℃ por 10 min (Fazekas et al,.
2012).
5.2.3.3.4. ITS
En la amplificación del locus ITS se usaron dos pares de primers: los propuestos por Kress y
Erickson, (2007), los cuales presentan las siguientes secuencias Forward: ITS-5 5´- CCT TAT
CAT TTA GAG GAA GGA G - 3´ y Reverse: ITS-4 5´- GGT CCA GTC CGC CCT GAT GG-
3´ y los primers propuestos por Sun et al., (1994), los cuales presentan las siguientes secuencias
Forward: 17SE 5´- ACG AAT TCA TGG TCC GGT GAA GTG TTC G - 3´ y Reverse: 26SE
5´- TAG AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTA C - 3´. La mezcla de la reacción de PCR
42 contenía 2,8µl de MgCl2 a 25mM para una concentración final de 3,5mM. En relación a las
condiciones térmicas se aplicó el siguiente programa de: 94℃ por 2 min para denaturación, 35
ciclos de 94℃ por 45 s, 52℃ por 30 s para el anillamiento, 72℃ por 2 min para la extensión del
primer y con una extensión final de 72℃ por 3 min (Fazekas et al,. 2012).
5.2.3.4. Secuenciación.
Una vez se determinó la funcionalidad de las condiciones de PCR, se aumentó el volumen de
reacción a 50µl con el objeto de generar el molde para la secuenciación, donde la mezcla de la
reacción de la PCR contenía PCR Buffer a 1X, dNTPs a 0,2mM, cada uno de los primers a
0,2µM, 0,75U/reacción de Taq DNA Polymerase, 5µl de ADN y H2O para un volumen final de
50µl. La concentración final de MgCl2 fue de 3,5mM para los loci rbcL y matK y de 2mM para
el locus trnH-psbA; adicionalmente en la mezcla de la reacción del locus rbcL y matK se agregó
BSA a 0,8µg/µl. Los resultados de las PCRs fueron visualizadas según condiciones utilizadas
para las PCRs de 20µl.
La purificación del producto de la PCR para la secuenciación se ejecutó con el protocolo de
precipitación con iso-propanol. Este protocolo consiste en transferir el producto de la PCR a
tubos de 1,5 ml, a cada muestra se le agrega 0,5x volúmenes de Acetato de Amonio a 7,5M,
posteriormente se agregan 1x volúmenes de iso-propanol y se centrifuga por 30 min a 13000
rpm, a continuación se descarta el sobrenadante, se agregan 200µl de etanol al 70% y se
centrifuga por 15 min a 13000 rpm. Finalmente se descarta el sobrenadante, se deja secar durante
la noche y se resuspende en 20 µl de agua destilada libre de nucleasas. Se observó el producto de
43 la purificación en un gel de agarosa al 1,5% con las mismas condiciones de corrida planteadas
anteriormente. Se enviaron las muestras para la secuenciación a Macrogen, Korea. Se siguieron
las instrucciones propuestas por la empresa para la preparación de las muestras como que la
concentración de las muestras debe encontrarse en al menos 20ng/µl, debe existir una mínima
variación en la concentración entre las muestras, el volumen de las muestras debe estar entre 25-
30µl (mínimo 20µl); para la preparación de los primers se tuvo en cuenta la concentración, la
cual debe ser de 5 µM y se deben servir 4 µl de cada primer por muestra. Además, se tuvieron
en cuenta las instrucciones para servir el plato y los demás requerimientos del envió.
5.2.3.5. Análisis de datos.
Después de obtenida las secuencias se realizaron los alineamientos utilizando la herramienta
bioinformática Geneious Basic (Cali, Colombia), el cual es un software que permite organizar y
analizar los datos haciendo un enfoque en secuencias moleculares, adicionalmente ofrece una
interfase amigable con el usuario (Kearse et al., 2012). Posteriormente las secuencias obtenidas
con los alineamientos (Anexo A) fueron comparadas por medio de un BLASTn con las
secuencias almacenadas en el GenBank. Posteriormente se depositó el código de barras de la
especie G. speciosa en BOLD, ya que la principal base de datos de BOLD incluye una interface
que permite al usuario buscar en cuatro diferentes repositorios que difieren en la longitud de la
secuencia analizada, el tipo de dato (público o privado) y secuencias de búsqueda a distintos
niveles de identificación. Para este caso se utilizó el repositorio o base de datos Species Level
Barcode (Ratnasingham & Hebert, 2007).
44
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Dinámica poblacional de Gustavia speciosa
6.1.1. Distribución de tallos por clases diamétricas.
Al aplicar la fórmula de Sturges al DAP de los individuos adultos se obtuvo un rango de 4,
clasificando a los individuos adultos dentro de las clases diamétricas que se muestran en la figura
2. La clase diamétrica que presenta mayor número de individuos es la que se encuentra en el
rango de 12-16cm con un registro de 26 individuos en esta clase, mientras que las clases con
menor número de individuos son las que se encuentran en los rangos 24-28cm y 28-30cm cada
clase con 1 individuo.
Figura 2. Distribución de tallos por clases diamétricas de los individuos adultos.
10
21
26
10
4
1 1
0
5
10
15
20
25
30
4 - 8 8 - 12 12 - 16 16 - 20 20 - 24 24 - 28 28 - 30
# In
divi
duos
Clases diametricas (cm)
45 Las clases diamétricas de Gustavia speciosa en la Reserva La Hondonada indican que en este
bosque las clases más pequeñas dentro de los individuos adultos son las que predominan (Fig. 2).
Así como también predominan las clases más pequeñas al incluir las plántulas y los latizos (Fig.
3), lo que indican que en la población se puede garantizar el reclutamiento y la regeneración. Lo
anterior también ha sido reportado para algunas poblaciones naturales a nivel nacional de Abarco
(Cariniana pyriformis), en las cuales se observa la regeneración y el reclutamiento en la
población gracias a la abundancia de las clases más pequeñas, mientras que en otras poblaciones
hay un limitado reclutamiento y en otras la falta de varias clases diamétricas representa una
afectación de las poblaciones (Cárdenas et al., 2015).
6.1.2. Clases de tamaño de la población.
A partir de la distribución de los individuos adultos en las clases diamétricas se pudo agrupar a
los adultos en 3 grupos (A1, A2 y A3). Esta selección se hizo teniendo en cuenta el límite de DAP
de 10 cm propuesto por Gentry, (1982), donde por debajo de este límite se agruparon los
individuos de 4-8 cm denominado A1, las clases siguientes 8-12 cm y de 12-16 cm se
denominaron A2 y el resto de las clases se denominaron A3 (Fig. 2). De esta manera se obtuvo la
estructura poblacional de Gustavia speciosa en la Reserva la Hondonada (Fig. 3).
46
Figura 3. Estructura poblacional por clases de tamaño.
La clase de tamaño con mayor representación son las Plántulas con una abundancia de 841
individuos, seguida por las clases Adultos 2 y Juveniles con una abundancia de 47 y 45
respectivamente y finalmente con las menores abundancias se encuentran los Adultos 3 con 16
individuos y los Adultos 1 con 11 individuos.
La estructura de la población de Gustavia speciosa para la Reserva La Hondonada presenta un
curva de Tipo II de acuerdo con Bongers et al., (1988), en la cual la primera clase de tamaño
tiene la frecuencia más alta, pero las otras clases están mal representadas dentro de la población.
Lo que indica que la población muestra una buena reproducción pero el reclutamiento es
discontinuo en las clases de tamaño más grandes. Esto puede deberse a dos razones: primero
algunas clases de tamaño podrían ser más críticas que otras clases con su mortalidad específica y
segundo la tasa de crecimiento depende del tamaño. Adicionalmente se puede concluir de la
figura 3 que las plántulas presentan una mortalidad muy alta debido a que esta es una de las
841
4510
4716
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Plántula Juvenil A1 A2 A3
# In
divi
duos
47 etapas del desarrollo más vulnerable de las plantas (Murcia, 1995) y coincide con los resultados
de Silvertown et al., (1996), el cual concluye que existe una alta mortalidad en la clase más
temprana para las especies forestales de larga vida en bosques tropicales.
En la figura 3 se observa una gran disminución al pasar de plántulas a juveniles, lo cual indica
una alta mortalidad de en esta clase. De acuerdo a los resultados de Coley y Barone, (1996), las
tasas anuales de daños en las hojas en los bosques tropicales alcanzan un promedio de 11,1%,
siendo estos daños producto de la herbívora. Sin embargo, durante el trabajo en campo no se
encontró evidencia determinante de que esta presión fuera la causa de la mortalidad en las
plántulas. Otros factores serían los cambios microclimáticos y la competencia entre especies por
los recursos naturales, pero no fue objeto de este estudio analizar esos factores. A diferencia del
paso de plántulas a juveniles, las otras transiciones no presentan cambios sustanciales.
6.1.3. DAP: fertilidad e infertilidad.
La figura 4 muestra a los 73 individuos adultos en función de su DAP y tiene en cuenta a los
individuos fértiles e infértiles, así mismo también presenta el valor mínimo de DAP que debe
presentar un individuo para considerarse en la etapa adulta. Para esto se trazó con una línea negra
el DAP propuesto por Gentry en 1982, el cual equivale a 10cm y una línea naranja el DAP
encontrado experimentalmente para este proyecto, el cual es de 4cm. El comportamiento de estos
individuos precoces puede ser consecuencia de una presión debida a condiciones adversas que
genera en la planta un gasto energético dirigido a una reproducción temprana en lugar de
invertirlo en crecimiento. Durante el estudio no se encontró evidencia de alguna de las posibles
condiciones adversas.
48
Figura 4. DAP vs. Individuos adultos. 10 cm umbral (Gentry, 1982) y 4cm umbral propuesto.
Un factor importante es la edad reproductiva del individuo ya que en esta etapa se genera
descendencia, cumpliendo de esta manera con ese papel ecológico fundamental en el proceso de
regeneración de la especie. Para Gustavia speciosa se observó la primera actividad reproductiva
a partir de los 4 cm de DAP, lo que indica una reproducción temprana, ya que la actividad
reproductiva es más reiterada en individuos con DAP> 10cm. Por otro lado en el caso del Abarco
(Cariniana pyriformis) se ha reportado por Cárdenas et al., (2015), que la actividad reproductiva
comienza en los 32cm de DAP, a lo cual los autores denominan casos extremos de actividad
reproductiva temprana, ya que para esta especie la reproducción es más frecuente a partir de los
50cm de DAP. Por lo tanto, al comparar con lo obtenido para el Abarco se puede decir que la
especie G. speciosa presenta una reproducción temprana en los individuos con DAP< a 10cm.
Sin embargo, los individuos con DAP≥ 10cm no presentan una actividad reproductiva precoz, ya
que Gentry, (1982) estandariza que por lo general con un DAP igual a 10cm el individuo es
activamente reproductivo y se encuentra en estado adulto, a pesar de lo propuesto para el Abarco
por Cárdenas et al., (2015).
49
6.1.4. Tabla de vida.
Se generó la tabla de vida de la población de Gustavia speciosa teniendo en cuenta su estructura
poblacional como se observa en la tabla 1. Se observa la mayor tasa de mortalidad en las
plántulas y en los adultos 3 por lo que preocupa la regeneración de la especie en el bosque. El
menor número de individuos entre los adultos uno y tres, lo cual indica que hace un período de
tiempo hasta la actualidad los adultos no tienen reemplazo.
Tabla 1. Tabla de vida de Gustavia speciosa en la Reserva La Hondonada.
X ax lx dx qx Fx mx lxmx Xlxmx Plántula 841 1,000 0,946 0,946 0 0,000 0,000 0,000 Juvenil 45 0,054 0,042 0,778 0 0,000 0,000 0,000
A1 10 0,012 -0,044 -3,700 24 2,400 0,029 0,285 A2 47 0,056 0,037 0,660 270 5,745 0,321 15,089 A3 16 0,019 0,019 1,000 24 1,500 0,029 0,457
Ro 0,378 T 41,868 r -0,023 � 0,977
Como se muestra en la curva de sobrevivencia (Fig. 5), la población de G. speciosa presenta una
sobrevivencia de los individuos muy variable en cada clase de tamaño entre las primeras clases
donde se observa que solo sobrevive el 5,4 % de los individuos cuando se pasa de Plántula a
Juvenil. Sin embargo, la sobrevivencia varía poco para el resto de clases de tamaño. Lo que
indica que la curva de supervivencia de G. speciosa es de tipo III (cóncava), donde hay una
50 mortalidad temprana extensa comparada con aquellos que posteriormente tendrán una alta tasa
de supervivencia (Begon et al., 1996).
Figura 5. Curva de sobrevivencia para las clases de tamaño de Gustavia speciosa.
Se realizó la proyección a 5 años sobre la sobrevivencia de la población en la Reserva La
Hondonada, teniendo en cuenta el valor arrojado para λ el cual fue de 0, 977, lo que significa que
al estar por debajo de 1 la población disminuirá en las próximas generaciones como se muestra
en la Figura 6A y 6B. Particularmente la tasa finita promedio anual de decrecimiento de la
población es 2,3%.
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
Plántula Juvenil A1 A2 A3
So
bre
viv
en
cia
(lx
)
Clases de tamaño
51
A
B
Figura 6. A. Proyección a 5 años de la sobrevivencia de la población. B. Proyección a 5 años de
la sobrevivencia de la población. Se excluyen las Plántulas.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 1 2 3 4 5
# In
divi
duos
Plántula Juvenil A1 A2 A3
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 1 2 3 4 5
# In
divi
duos
Juvenil A1 A2 A3
52 Como se observa en la figura 6 existe una disminución de la población en el tiempo en todas las
clases de tamaño. Una de las razones para esta reducción se puede considerar la ganadería
extensiva, la agricultura, la deforestación y la tala indiscriminada de especies maderables
valiosas (Calderón et al., 2002). En Colombia, estas se consideran la principal amenaza para las
especies de Lecythidaceae como consecuencia de la sobreexplotación. Por ejemplo, de las
especies Lecythidaceae que se encuentran en Colombia, el 34% se encuentran amenazadas, de
las cuales el 18% se hayan en la categoría de Vulnerables (VU), el 13% corresponde a la
categoría En Peligro (EN) y el 3 % a la categoría En Peligro Crítico (CR) (Calderón et al., 2002).
El abarco (Cariniana pyriformis) es la especie más amenazada de esta familia, pues
históricamente ha tenido una drástica reducción de más del 80% en el último siglo y no hay
indicadores a la fecha de que esta amenaza vaya a desaparecer con el agravante de que la
mayoría de las poblaciones se encuentran por fuera de las reservas naturales o áreas protegidas
(Cárdenas y Salinas, 2007).
Según Cárdenas et al., (2015) la densidad del Abarco en bosque natural para árboles con DAP
mayores a 10cm (Adultos) es de 0,52 a 1,72 Ind. /ha la cual se considera una baja abundancia
debido a su categoría CR. En contraste, la especie estudiada Gustavia speciosa presenta una
densidad en la Reserva La Hondonada para los individuos adultos de 730 Ind. /ha que concuerda
con su categoría “Casi Amenazada”. A pesar de que esta abundancia es mayor comparada con el
Abarco, G. speciosa se encuentra en un período de declinación que continuará si no se toman los
correctivos necesarios para su conservación.
53
6.2. Distribución geográfica
En el mapa de distribución potencial de la especie Gustavia speciosa (Fig.7), se muestra las
zonas dentro del departamento del Valle del Cauca donde se observa la probabilidad de
distribución siendo las zonas verdes las más probables con un 75 al 100% de presencia; las zonas
amarillas representan áreas intermedias de presencia con un 50 al 75% y las zonas rojas las
menos probables con un 25 al 50% de presencia. En términos de área, la presencia de Gustavia
speciosa abarca 630477, 65 ha (28,4%) del Valle del Cauca, de las cuales 13754,32 ha (2,18%)
corresponden a Áreas Protegidas. Se observa además en el mapa que la mayor concentración de
la especie se encuentra al norte del departamento.
54
Figura 7. Mapa de distribución geográfica potencial de Gustavia speciosa dentro del
departamento del Valle del Cauca.
Según la figura 8 de los ecosistemas del Valle del Cauca (FUNAGUA y CVC, 2010), la
distribución potencial de Gustavia speciosa se encuentra en el área ocupada por los ecosistemas
Bosque Medio Húmedo en Montaña Fluvio-Gravitacional (BOMHUMH) y Bosque Cálido Seco
55 en Planicie Aluvial (BOCSERA). En contraste, las zonas donde hay menos probable distribución
potencial de la especie son las áreas ocupadas por los ecosistemas Bosque Inundable Cálido
Pluvial en Planicie Fluvio-Marina (BICPLRY), Bosque Cálido Pluvial en Lomerío Fluvio-
Gravitacional (BOCPLLH) y Bosque Muy Frío Pluvial en Montaña Fluvio-Glacial
(BOSPLMG).
Figura 8. Mapa de distribución de los ecosistemas del Valle del Cauca por Biomas. Fuente:
FUNAGUA y CVC, 2010.
56 Las dos variables ambientales fundamentales que determinan el clima y su variación son la
temperatura y la precipitación, las cuales pueden estar influidas por factores naturales o efectos
producidos por actividades antropogénicas. Se utilizó la prueba de Jackknife para estimar la
contribución de cada una de las variables ambientales al modelo de distribución potencial. Como
se observa en la figura 9, la variable ambiental más importante (barras azul oscuro) es la variable
Isoterma (bio_3), la cual es la proporción entre el Rango Promedio Diurno de temperatura
(bio_2) y el Rango de Temperatura Anual (bio_7). La otra variable ambiental que también
contribuye al modelo es la Temperatura Estacional (bio_4). En consecuencia la variable
ambiental más importante es la temperatura, esto se corrobora con la distribución potencial de la
especie dentro de los ecosistemas BOMHUMH y BOCSERA, por lo tanto el gradiente de
humedad y temperatura es importante para la especie. Las variables ambientales utilizadas en
este modelo se encuentran descritas en el Anexo B.
Figura 9. Prueba de Jackknife para las variables ambientales.
57 La distribución potencial de la especie en estudio se encuentra principalmente en la vertiente
oriental de la cordillera occidental y norte del valle geográfico del río cauca donde predominan
las condiciones ideales de las variables ambientales, tales como la temperatura. La temperatura
promedio en esta zona andina y en especial en Yotoco es de 23,6℃ correspondiente a las zonas
verdes del mapa (Fig. 7). En contraste, en la costa pacífica del departamento del Valle del Cauca
correspondiente a la zona roja del oeste (BICPLRY y BOCPLLH), no hay presencia de la
especie donde la temperatura promedio es de 26,5℃ (IDEAM, 2015). Puesto que no hay estudios
específicos acerca de la tolerancia de la especie en un rango determinado de temperatura,
podemos asumir que una diferencia de 3℃ entre estas dos zonas pudiera ser determinante para la
supervivencia de G. speciosa. La otra zona donde no se observa presencia de la especie
corresponde a la zona roja localizada en el extremo oriental del departamento que es el Bosque
Muy Frío Pluvial en Montaña Fluvio-Glacial (BOSPLMG), donde la temperatura alcanza puntos
de congelación, de igual manera también cabe resaltar la no presencia de esta especie en zonas
muy húmedas, lo cual indica que no es afín con el exceso de humedad.
6.3. Código de barras de la vida de Gustavia speciosa
6.3.1. Extracción de ADN.
La extracción de ADN fue exitosa en la mayoría de la muestras para G. speciosa. Sin embargo,
como se observa en la figura 10, en algunas de las muestras no hubo extracción. Una hipótesis
58 para este resultado puede ser debido a la presencia de algunos compuestos químicos de la planta
tales como los polisacáridos o metabolitos secundarios, los cuales impiden la precipitación del
ADN. Igualmente en esta figura se observa que la calidad del ADN es aceptable a pesar de que
hay bandas débiles.
Carril 1: Marcador λ1/10.
Carril 2-6: Gustavia speciosa.
Carril 7: Otra especie de Lecythidaceae.
Carril 8: Control negativo.
Carril 9: Control positivo.
Carril 1: Marcador λ1/10.
Carril 2-6: Gustavia speciosa.
Carril 7: Otra especie de Lecythidaceae.
Carril 8: Control positivo.
Carril 9: Control negativo.
59
Carril 1-4 y 6-7: Gustavia speciosa.
Carril 5: Marcador λ1/10.
Carril 8: Control positivo.
Carril 9: Control negativo.
Figura 10. Extracción de ADN de G. speciosa con el kit DNEasy®.
6.3.2. Amplificación por PCR.
Figura 11. Amplificación del locus rbcL para G. speciosa.
60 Descripción de los carriles:
1-5: Gustavia speciosa. 10: Marcador GR100bp. 17: Control positivo.
6: Otra especie de Lecythidaceae. 11-15: Gustavia speciosa. 18: Control negativo.
7-9: Gustavia speciosa. 16: Otra especie de Lecythidaceae.
Figura 12. Primera amplificación del locus matK para G.speciosa.
Descripción de los carriles:
1: Marcador GR100bp. 8-15: Gustavia speciosa. 18: Control negativo.
2-6: Gustavia speciosa. 16: Otra especie de Lecythidaceae.
7: Otra especie de Lecythidaceae. 17: Control positivo.
61
Figura 13. Segunda amplificación del locus matK para G. speciosa.
Descripción de los carriles:
M: Marcador GR100bp. 4-11: Gustavia speciosa. +: Control positivo.
-: Control negativo.
En la figura 12 se muestra la primera amplificación realizada al locus matK, en la cual se observa
que muy pocas de las muestras fueron amplificadas exitosamente, por esta razón fue necesario
repetir la PCR para el locus con las muestras que no fueron amplificadas (Fig. 13). En la figura
13 los número de los carriles corresponden a los de la figura 12 en los que no muestran la
amplificación.
62
Figura 14. Amplificación del locus trnH-psbA para G. speciosa.
Descripción de los carriles:
1: Marcador GR100bp. 8-15: Gustavia speciosa. 18: Control negativo.
2-6: Gustavia speciosa. 16: Otra especie de Lecythidaceae.
7: Otra especie de Lecythidaceae. 17: Control positivo.
La amplificació de los locus rbcL, matK y trnH-psbA se logró como indican las figuras anteriores
(Figs. 11-14). Para rbcL se logró amplificar todas las muestras de ADN. Sin embargo, para matK
y trnH-psbA 4 muestras no fueron amplificadas debido a que el ADN de esas muestras se
encontraba degradado.
No se logró la amplificación del locus ITS con ninguno de los dos pares de primers ensayados
para G. speciosa. Las reacciones fueron repetidas 11 veces, logrando la amplificación del control
positivo. Sin embargo, las muestras de G. speciosa no dieron resultado. Una posible explicación
63 para este último resultado es la presencia de un cambio en la estructura del ITS en esta especie.
Otra posibilidad es una potencial mutación en el sitio de anillamiento de uno u otro de los
primers que no permite que este se una a la cadena de ADN para su posterior extensión.
6.3.3. Secuencias.
Figura 15. Purificación del producto de la PCR del locus rbcL.
Descripción de los carriles:
1: Marcador GR100bp. 7-11: Gustavia speciosa.
2-5: Gustavia speciosa. 12: Otra especie de Lecythidaceae.
6: Otra especie de Lecythidaceae. 13: Control positivo.
64 La purificación del locus rbcL (Fig. 15) presentó unas bandas muy débiles revelando una baja
cantidad de producto de PCR recuperado en el proceso de purificación, lo cual se ve reflejado en
una baja calidad de las secuencias.
Figura 16. Purificación del producto de la PCR del locus matK.
Descripción de los carriles:
1: Marcador GR100bp. 9-10: Otra especie de Lecythidaceae.
2-6: Gustavia speciosa.
7-8: Kefersteinia tolimensis (Control positivo).
65
Figura 17. Purificación del producto de la PCR del locus trnH-psbA.
Descripción de los carriles:
1: Marcador GR100bp. 7-11: Gustavia speciosa.
2-5: Gustavia speciosa. 12: Otra especie de Lecythidaceae.
6: Otra especie de Lecythidaceae. 13: Control positivo.
En la purificación de los locus matK y trnH-psbA (Fig. 16 y 17), se observan bandas débiles para
algunas muestras, las cuales indican una pérdida del material obtenido en la PCR. Además, hay
presencia de doble banda en algunas de las muestras indicando que los primers encontraron otro
sitio de acople en el ADN de G. speciosa.
En la tabla 2 se presentan las secuencias de las dos poblaciones que fueron de buena calidad, las
cuales fueron obtenidas de 1 muestra de rbcL, 5 de matK y 8 de trnH-psbA. En cuanto al tamaño
de las secuencias se obtuvo que el largo del locus rbcL fue de 1137bp, para matK entre 709-
918bp y para trnH-psbA entre 428-642bp. Las accesiones semejantes están marcadas en la tabla
2 con igual color. En términos de disponibilidad de secuencias se encontraron que el locus rbcL
66 posee 2 secuencias depositadas para Gustavia. El locus matK no posee secuencias depositadas
para Gustavia. El locus trnH-psbA posee 3 secuencias depositadas para Gustavia. Es interesante
anotar que la ausencia de secuencias para el locus matK se puede utilizar para enriquecer la base
de datos del GenBank.
Tabla 2. Resultados obtenidos de los alineamientos realizados en Geneious al comparar con el
GenBank por medio de BLAST.
Locus # Muestra Población Tamaño (bp) seq.
# Acc GenBank
% Identida
d ID Referencia
rbcL YFG 016J Hacienda
La Alejandría
1137
AF077652 98 Grias
cauliflora
Morton et al., 1998
JQ734519 98 Grias sp. Kalyankar et
al., 2012
Z80175 98 Gustavia
poeppigiana
Morton et al., 1996
FJ038094 99 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
matK
YFG 004 Reserva
La Hondonada
882
JQ626516 83 Eschweilera
grandiflora
Baraloto et al.,
2012
JQ626416 83 Escweilera
chartaceifolia
Baraloto et al.,
2012
JQ626351 83 Escweilera
parviflora
Baraloto et al.,
2012
FJ514764 83 Eschweilera
grandiflora
Gonzalez et
al.,2009
YFG 005 Reserva
La Hondonada
918
KC627404 85 Oubanguia
laurifolia
Parmentier et
al., 2013
JQ626516 85 Eschweilera
grandiflora
Baraloto et al.,
2012
JQ626416 85 Escweilera
chartaceifolia
Baraloto et al.,
2012
KC627646 84 Scytupetalum
klaineanum
Parmentier et
al., 2013
YFG 016J F7
Hacienda La
Alejandría 720
JQ626516 97 Eschweilera
grandiflora
Baraloto et al.,
2012
FJ514764 97 Eschweilera
grandiflora
Gonzalez et
al.,2009
67
JQ626419 97 Lecythis
idatimon
Baraloto et al.,
2012
JQ626416 97 Escweilera
chartaceifolia
Baraloto et al.,
2012
YFG 017 F8
Hacienda La
Alejandría 709
JQ626516 98 Eschweilera
grandiflora
Baraloto et al.,
2012
FJ514764 98 Eschweilera
grandiflora
Gonzalez et
al.,2009
JQ626419 97 Lecythis
idatimon
Baraloto et al.,
2012
JQ626416 97 Escweilera
chartaceifolia
Baraloto et al.,
2012
trnH-
psbA
YFG 004 Reserva
La Hondonada
642
AY172781 83 Lecythis
zabucajo
Hamilton et al., 2003
GQ982238 81 Gustavia
superba
Kress et al., 2009
JN221697 82 Lecythis
pisonis
Huang et al., 2015
FJ038977 92 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
YFG 005 Reserva
La Hondonada
463
GQ982238 99 Gustavia
superba
Kress et al., 2009
FJ038977 77 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
FJ038976 77 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
JN661767 93 Gustavia
environmental
Hibert et al., 2011
YFG 006 Reserva
La Hondonada
515
GQ982238 93 Gustavia
superba
Kress et al., 2009
FJ038977 96 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
FJ038976 96 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
FJ038971 91 Eschweilera
coriacea
Gonzalez et
al.,2009
YFG 007 Reserva
La Hondonada
458
GQ982238 97 Gustavia
superba
Kress et al., 2009
FJ038977 97 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
FJ038976 97 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
GQ428722 96 Lecythis
poiteaui
Gonzalez et
al.,2009 YFG 013 Hacienda 428 FJ038977 98 Gustavia Gonzalez et
68
La Alejandría
hexapetala al.,2009
FJ038976 98 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
FJ038983 94 Lecythis
poiteaui
Gonzalez et
al.,2009
FJ038982 95 Lecythis
zabucajo
Gonzalez et
al.,2009
YFG 014 Hacienda
La Alejandría
443
FJ038977 95 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
FJ038976 95 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
EU769900 84 Symplocos
laurina
Banu et
al.,2008
KR534031 88 Barringtonia
fusicarpa
Huang et al., 2015
YFG016J Hacienda
La Alejandría
594
GQ982238 87 Gustavia
superba
Kress et al., 2009
FJ038977 87 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
FJ038976 87 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
JN221780 83 Eschweilera
tessmannii
Huang et al., 2015
YGF 017 Hacienda
La Alejandría
574
GQ982238 88 Gustavia
superba
Kress et al., 2009
FJ038977 88 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
FJ038976 88 Gustavia
hexapetala
Gonzalez et
al.,2009
JN221780 84 Eschweilera
tessmannii
Huang et al., 2015
El locus rbcL ha sido sugerido como locus de código de barras por su universalidad y la facilidad
para su amplificación y alineamiento, al igual que su amplia representación en el GenBank, lo
cual permite hacer comparaciones con otros genes del plástido. Este locus amplificó bien en las
muestras de Gustavia speciosa (Fig. 10). Sin embargo, solo fue obtenida una secuencia para este
locus debido a dificultades en el procedimiento de purificación del producto de PCR.
69 A pesar del éxito en la amplificación de este locus, al momento de realizar la purificación no se
encontraron resultados satisfactorios, como se muestra en la tabla 2 solo fue posible obtener una
sola secuencia útil. Esta secuencia tuvo un alto porcentaje de identidad (99%) con una accesión
de otra especie del género Gustavia hexapétala (Gonzalez et al., 2009), corroborando que la
secuencia pertenece por un lado al locus rbcL y por otro que la muestra hace parte de la familia
Lecythidaceae, además, al arrojar resultados de especies cercanas a G. speciosa se indica que la
muestra pertenece al género Gustavia. En el caso de rbcL la distancia genética para resolver
entre especies congéneres debe ser el 1% o menos (Newmaster et al., 2006). Así, se puede
afirmar que la muestra no es la misma especie que las obtenidas en el GenBank.
Para el caso de los loci matK y trnH-psbA la cantidad de secuencias obtenidas fue mayor, lo que
aportó una mayor confianza sobre los resultados obtenidos. Los resultados del porcentaje de
identidad para estos dos loci también arrojaron que las secuencias pertenecen tanto a matK como
a trnH-psbA, además de que las muestras hacen parte de la familia Lecythidaceae. Para el locus
matK Sang et al., (1997) y Gonzalez et al., (2009) proponen que la distancia genética para
resolver entre especies congéneres debe ser menor que el 1%. En el caso del trnH-psbA el
alineamiento y el análisis es difícil por los cual es considerado un locus de segundo nivel, más
utilizado para la diferenciación entre géneros (Newmaster et al., 2006). En cuanto a la especie
para matK siguiendo el porcentaje de diferenciación entre especies se obtuvo que ninguna de las
muestras son la misma especie que las arrojadas por el GenBank. Aunque para el locus trnH-
psbA, también se obtuvo lo expresado anteriormente, este no fue posible compararlo con algún
porcentaje debido a la discrepancia presente en la literatura. Por ejemplo, Sang et al., (1997)
asegura que el porcentaje de diferenciación entre especies es del 1,29%, mientras que Gonzalez
et al., (2009) afirma que el porcentaje debe ser del 6,26%.
70
7. CONCLUSIÓN
En términos de la estimación de la dinámica poblacional de la especie Gustavia speciosa en la
Reserva La Hondonada se encontró que la disminución de la población (2,3%) aunque se puede
considerar baja, lo ideal es que el valor de λ sea igual o mayor que 1 para que la población
permanezca en el tiempo. Es necesario entonces, para la población de esta reserva establecer
acciones de conservación que eviten su declinación en un futuro, enfocándose principalmente en
la clases de plántulas debido a su alta mortalidad, esto con el objetivo de que haya más
reclutamiento en las clases posteriores, especialmente en la clase de adultos 2 ya que de estos
individuos depende la regeneración de la población.
Según la figura 7 que presenta la distribución potencial de la especie Gustavia speciosa para el
departamento del Valle del Cauca, la especie se encuentra localizada principalmente en la
vertiente oriental de la cordillera occidental donde se hayan las condiciones ambientales óptimas
para la especie principalmente la temperatura y la humedad. La temperatura promedio en Yotoco
es de 23,6℃ que corresponde a la zona verde, la distribución más probable para la especie. En la
zona roja del oeste no se encuentra población puesto que la temperatura promedio es de 26,5℃.
Esta diferencia de temperatura puede ser determinante para el establecimiento de la especie en
esas zonas. También se encuentra muy escasa presencia en el extremo oriental del departamento
donde las temperaturas son muy inferiores en comparación con su hábitat natural.
Adicionalmente, como parte de las acciones de conservación se podría hacer una búsqueda e
introducirla en municipios como Bolívar, Trujillo, El Dovio, Versalles, Roldanillo, La Unión,
71 Buga, La Victoria, Cartago y Tuluá; donde aún no se ha reportado pero existen las condiciones
para su presencia.
En relación al aspecto molecular de este estudio, no existe un único locus que permita por si solo
hacer una perfecta identificación hasta el nivel de especie, es por ello que se hace necesario el
uso de al menos dos locus para la obtención de un buen código de barras de ADN. Otra
dificultad es la disponibilidad de primers universales para el éxito de la amplificación de los
locus más utilizados en plantas terrestres. Dada la dinámica actual de la investigación y los
avances tecnológicos se espera que en los próximos años la identificación genética se convierta
en un proceso rutinario no solo para aspectos taxonómicos sino para la identificación de nuevas
especies y la mejor compresión de las dinámicas ecosistémicas.
72
8. RECOMENDACIONES
Atendiendo a los resultados de este estudio, se observó una disminución en la población de
Gustavia speciosa en la Reserva La Hondonada. Debido a que las poblaciones silvestres se
ven principalmente afectadas por la degradación y fragmentación del hábitat, se sugiere
tomar acciones de conservación por parte de las entidades competentes tales como la CVC, el
DAGMA y en general los biólogos de la conservación. Por otra parte debido a la escases de
información sobre el estado de las poblaciones naturales de G. speciosa, se recomienda llevar
a cabo más estudios enfocados en la preservación de las poblaciones de esta especie en el
Valle del Cauca. Se consideran las siguientes sugerencias:
• A pesar del éxito reproductivo, que es debido a una eficiente polinización, es
necesario conocer el organismo polinizador de Gustavia speciosa para futuros
procesos de restauración.
• La supervivencia de una especie está determinada por el éxito en la regeneración, lo
cual incluye estudios relacionados con el monitoreo del nacimiento, crecimiento y
mortalidad de los individuos. Por ello se debe realizar este tipo de monitoreo para la
supervivencia de G. speciosa. En vista de la alta mortalidad de las plántulas en este
estudio, estas deberán tener la prioridad en la conservación de esta especie.
• En los ecosistemas la regeneración y supervivencia de las especies se ve determinado
por la viabilidad de las semillas. En consecuencia, es importante conocer el
porcentaje de germinación para garantizar valores suficientes para la restauración de
la especie.
73
• Se precisa tomar acciones para controlar la degradación y fragmentación del hábitat,
ya que influye en la dispersión y colonización de nuevos espacios para la especie. Así
como el estudio de los organismos dispersores.
• Otro aspecto importante son las condiciones del suelo como la disponibilidad de
nutrientes. Entonces, es necesario hacer los estudios del suelo respectivos para
conocer su condición y así tomar las medidas necesarias que vayan en pro de la
supervivencia de G. speciosa.
• Se precisa realizar una búsqueda de poblaciones naturales de G. speciosa en
municipios como Bolívar, Trujillo, El Dovio, Versalles, Roldanillo, La Unión, Buga,
La Victoria, Cartago y Tulua; donde la especie no ha sido reportada pero existe una
alta probabilidad de presencia de la especie de acuerdo con el mapa de distribución
potencial. Lo anterior con el objetivo de llevar a cabo una posible introducción de la
especie en estas zonas y la respectiva evaluación del estado de conservación de la
población.
• En relación al aspecto molecular de este estudio, es necesaria la implementación de
otros primers que permitan una mejor amplificación de los loci trabajados en este
estudio. Especialmente el locus ITS del cual no se obtuvo resultados.
• Debido a que en el GenBank las secuencias depositadas tanto para la familia como
para la especie son escasas, es necesario un esfuerzo sostenido para generar nuevos
resultados acerca de la genética de la población que alimenten esta base de datos.
74
8.1. Lineamientos de manejo
Los lineamientos para la conservación de especies y sus hábitats se promueven a partir del estado
de conservación y su grado de amenaza. Estos planes deben incluir una gestión integral que
asegure acciones a corto, mediano y largo plazo, dirigidas a conservar o restaurar poblaciones
amenazadas con impacto local, regional o nacional (Kattan et al., 2005). Estos lineamientos
deben involucrar aspectos interinstitucionales, participación de las comunidades, proyectos de
investigación, programas educativos, normativa y marco legal. En base a la normativa y políticas
nacionales tales como la Política Nacional para la Gestión Integral de la Biodiversidad y sus
Servicios Ecosistémicos (PNGIBSE) del Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible
(MADS, 2011); la Estrategia Nacional para la Conservación de Plantas (García et al., 2010);
Planes de manejo para la conservación de 22 especies focales de plantas en el Departamento del
Valle del Cauca (CVC y FUNAGUA, 2011) y el Protocolo para la Formulación de Planes de
Conservación y Manejo de Especies Focales (Kattan et al., 2005), se proponen los siguientes
lineamientos para la conservación de Gustavia speciosa en la Reserva la Hondonada:
• Continuar con el sistema de control y vigilancia sobre el bosque de La Reserva La
Hondonada por parte de la CVC para controlar la explotación y el tráfico ilegal de la
madera. Así como reforzar los incentivos económicos a las comunidades para la
conservación de la población natural, tales como la exención de impuesto a los
responsables de los predios donde se desarrollen planes de conservación.
75
• Mediante un programa de reproducción cisrca situm, crear un invernadero en el área
donde se incluyan semillas con una buena diversidad genética de G. speciosa dirigidas a
restaurar la conectividad de los dos relictos de bosque que se encuentran fragmentados en
La Reserve La Hondonada, lo cual serviría para el establecimiento de un corredor
biológico con cercas vivas. Con el objetivo de aumentar el área de distribución donde la
especie pueda establecerse y evitar la disminución de la población.
• Generar un plan de monitoreo para la población natural de G. speciosa en La Reserva La
Hondonada, la cual evalué la dinámica poblacional con una duración mínima de 12 años.
Esto con el objetivo de obtener datos comparativos a largo plazo sobre el estado de esta
población.
• Se debe realizar una evaluación del estado de conservación de las poblaciones de la
especie G. speciosa reportadas en otras localidades como la vereda Pico de Águila en el
municipio de Cali, la Hacienda Hato Viejo en el municipio de Yotoco, la Vereda La
Pradera en el municipio de San Pedro y la quebrada La Raquelita en el municipio de
Sevilla.
• Planificar e implementar campañas de sensibilización y educación ambiental en donde se
ha reportado la presencia de la especie, con el objetivo de resaltar la importancia
ecológica de la especie, el valor de sus servicios ecosistémicos y la transmisión del
conocimiento sobre su ecología.
• Llevar a cabo estudios sobre la fenología de la especie y propagación ex situ con el
objetivo de identificar problemas de restauración en el departamento del Valle del Cauca.
Así como el estudio de la fisiología de las semillas y la propagación circa situm para
cercas vivas y corredores biológicos.
76
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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84
ANEXOS
Anexo A: Secuencias obtenidas en formato FASTA.
>rbcL_YFG016J
CCGTTTAGGAGGAACAGAAGATACCATGGGGAACCCCAAACAGAGCCCTCCCCAGACCCATCAGAAAACAGACAAGCCAAAACTAAACCAAGAGATCGATTCTTATTTGTAGCAGAAGATTTCTTAACCACCACGATTTTTAATTTTTGCCTAATCTCCTTCTCTTTTCTTGTAACAACATGTTCGCCACCTATGTTACTTACTTTCCTTTATCGTTACAAAGGGCGATGCTATCACATCCACCCCGTTCCCGCAGAACACTCTCAATATATTGCTTATGTACCTTTCCCTTTATACCTTTTTGAATAACTTTCTGTTACTTACTTCTTTACTTCCATTGCGGTTAATCTATTTGGTTTCAAAGCCCTTCTCCCTCTACGTCTCTAAGATCTGCGAATTCCTCCTGCGTATACTAAAACTTTCCAAGGACCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAAAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGTGYCYCTKTCCTGATGGGTCYTRGGARGSCTCTGTTKGGGTTATCNNNNNNNNCCTATGGTATCTTCTGGTTTCTCATKRWGTGGGCTTTAGWCTCTGTTTGTGGTGASATGATGTACATCCCAACAGGGSACGACCATTTAYKTGTTCAATTTATCTCTTTCAACTTKGATACCATGAGGCGGTCCTTGGAAAGTTTTAGTATACGCAGGAGGAATTCGCAGATCTTCTAGACGTAGAGCGCGCAGGGCTTTGAACCCAAATACATTACCCACAATGGAAGTAAACATGTTAGTAACAGAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAAGGATAAGCTACATAAGCAATATATTGATTGTCTTCTCCGGGAACGGGCTCGATGTGATAGCATCGCCCTTTGTAACGATCAAGGCTAGTAAGTCCATCGGTCCACACAGTTGTCCATGTACCAGTAGAAGATTCGGCAGCTACCGCGGCCCCTGCTTCTTCAGGTGGAACTCCAGGTTGAGGAGTTACTCGGAATGCGGCCAAGATATCAGTATCTAAGGTTTTATATTCAGGAGTATAATAAGTCAATTTGTAATCTTTAACACCAGCTTTGAATCCAACACTTGCTTTAGTCTCTGTTTGGGGGGGACATAAAAAAAGCCTCATTTTGGTTAA
>matK_YFG004
CATAATAAAAARTTAMARKAGKCTTGTTCTACAAAAMAATCGTYTTTNNTWTTTTCAAWAAAAAAAAAAGATTATTCTTKTTCTTGTATATTTCYCATGTGAATATGAAMYTWTNTCNNNNGTTTTTTGTTTWAGCTTCAATCARTCTTNTTCATTTACTATCAATATCTTCTAGAACCTTNTTTTGAATGAATATATTTTTAYCCAAAAATAGGACATGTTGTGAAAGTCTTTACTGAGGATNTTTCAAGCCATTCTATGGTTYTTCAAAAATCCTTTCATGCATTATGTTAGCTATCAANNGGAAANNTYAATTTTGGCTTCAAAAGGAATGTCTCTTTTSATGAAAATATNNGGAAATATTGTCTTGTCAATNTTCTGGNNCCACATTATTTTTATGTGTGGTCACAATCAAGAATGATCCATATAAACCAATTATCCAATCATCTCCTCAACTTTCTGGCTGTCTTTCAAGTGTGTGACTAAACTCTTCAATAGTACATAGTCAAATGCTA
85 GAAAATTTATTACTAATMGGTAATGGTATTAAGAAGCATCATACCATGTTTCCAATTATTCCTATGTTTGGATCATTATCTAAAACAAAATTTYSTTCCAAAWGTATTATTAAAACATCCCATTAGTAAGCTAGCCTANNCCGATTTAGCAAAWTTTGATATTATTRACCGATATGAGMATACATATAGAAWTCTTTTCTCATTATCATAGCSRRATCCTCAAAAANNNAAAAAAAATRGAAWTTGGTTYAANNAAACSGTTTTAATTTCCACTTCYSGGGGRAAAAAANNNNNNNNAAAGCCAAAAAAAGGCTTTTTTCCCCCCACCGGGAAAAGTTTGAACCAAGATTTCAAAAGGGAAAGGGG
>matK_YFG005
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89 Anexo B: Variables ambientales utilizadas en MAXENT
BIO1 = Annual Mean Temperature
BIO2 = Mean Diurnal Range (Mean of monthly (max temp - min temp))
BIO3 = Isothermality (BIO2/BIO7) (* 100)
BIO4 = Temperature Seasonality (standard deviation *100)
BIO5 = Max Temperature of Warmest Month
BIO6 = Min Temperature of Coldest Month
BIO7 = Temperature Annual Range (BIO5-BIO6)
BIO8 = Mean Temperature of Wettest Quarter
BIO9 = Mean Temperature of Driest Quarter
BIO10 = Mean Temperature of Warmest Quarter
BIO11 = Mean Temperature of Coldest Quarter
BIO12 = Annual Precipitation
BIO13 = Precipitation of Wettest Month
BIO14 = Precipitation of Driest Month
BIO15 = Precipitation Seasonality (Coefficient of Variation)
BIO16 = Precipitation of Wettest Quarter
BIO17 = Precipitation of Driest Quarter
90 BIO18 = Precipitation of Warmest Quarter
BIO19 = Precipitation of Coldest Quarter