.Artculo de investigacinAnticuerpo realce tardo dependiente del paso bajo el dengue virus 4 aislamientosNitwara Wikan1,Sirikwan Libsittikul1,Sutee Yoksan12,Prasert Auewarakul23yDuncan R. Smith12* *Autor para la correspondencia: Duncan R Smithduncan.smi@mahidol.ac.th;duncan_r_smith@hotmail.comAfiliaciones de los autores1Instituto de Biociencias Moleculares de la Universidad de Mahidol, Salaya Campus, 25/25 Phuttamonthol Sai 4, Salaya 73170, Nakorn Pathom, Tailandia2Centro para Enfermedades Emergentes y Infecciosas Desatendidas, de la Universidad de Mahidol, Salaya Campus, 25/25 Phuttamonthol Sai 4, Salaya 73170, Nakorn Pathom, Tailandia3Departamento de Microbiologa de la Facultad de Medicina, Hospital Siriraj, Universidad de Mahidol, 2 Wanglang Road, Bangkoknoi, Bangkok 10700, TailandiaPara todos los correos electrnicos de autor, por favoriniciesesin.BMC Notas de Investigacin2015,8: 399doi: 10.1186 / s13104-015-1381-8La versin electrnica de este artculo es el que completa y se puede encontrar en lnea en:http://www.biomedcentral.com/1756-0500/8/399

Recibido:27 de enero 2015

Aceptado:24 de agosto 2015

Fecha de publicacin:02 de septiembre 2015

2015 Wikan et al.Artculo AccessThis abierto se distribuye bajo los trminos de la licencia Creative Commons Attribution 4.0 License Internacional(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/),que permite el uso ilimitado, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que usted da apropiada crdito al autor (s) original y la fuente, proporciona un enlace a la licencia Creative Commons, e indicar si se han realizado cambios.La renuncia Dedicacin Creative Commons Public Domain (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos facilitados en este artculo, a menos que se indique lo contrario.AbstractoFondoEl concepto de mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infeccin por el virus del dengue (DENV) es una piedra angular de nuestra comprensin actual de la patogenia del dengue, a pesar de algunas dudas sobre el mecanismo siguen siendo, sobre todo en lo que respecta al comportamiento de los virus de baja y alta paso asla.Este estudio utiliz dos bajo DENV paso 4 aislamientos y un laboratorio adaptado DENV 4 aislado para investigar el potencial de paso bajo asla a someterse ADE.ResultadosSe observ poca o ninguna ADE de la infeccin en 2 das despus de la infeccin con aislamientos paso bajo, mientras que la alta mejora de la infeccin se observ con el laboratorio adaptado virus.Sin embargo, tanto de los aislamientos de paso de bajos mostraron altos niveles de infeccin (60-100%) por da 5 despus de la infeccin.ConclusionesEstos resultados muestran que bajo DENV paso 4 se someten a la infeccin por virus mediada ADE, pero que el proceso se retras significativamente temporalmente en comparacin con laboratorio adaptado DENV 4.Palabras clave:Anticuerpo mejora dependiente;Dengue;La infeccin;Clulas U937FondoEl virus del dengue es el mosquito ms importante transmitida enfermedad viral humana en todo el mundo.Cada ao se cree que son unos 400 millones de casos de infeccin, de los cuales unos 100 millones mostrar algunos sntomas[1].Infecciones sintomticas resultan en un amplio espectro de enfermedades, que van desde fiebre indiferenciada leve, a la fiebre del dengue a presentaciones ms graves de la enfermedad hemorrgica del dengue y el sndrome de choque por dengue[2].Las muertes pueden resultar de la infeccin con el virus del dengue, aunque stas son relativamente poco frecuentes, donde las instalaciones de hospitalizacin adecuadas y los conocimientos tcnicos apropiados estn disponibles[3].La especiede virus del dengue(familia Flaviviridae, gneroFlavivirus) se compone de cuatro virus diferentes de virus del dengue denominado (DENV) 1-4.La infeccin primaria en unos ingenuos resultados individuales en la generacin de amplia y robusta inmunidad adquirida, ofreciendo a largo plazo, y la inmunidad posiblemente toda la vida a la DENV infectar, sin embargo, slo la inmunidad transitoria se genera contra las infecciones con DENVs heterotpicos[3].Es importante destacar que algunos anticuerpos generados contra el DENV inicial pueden reconocer, pero no neutralizar un virus heterotpica y estos DENV: anticuerpo no neutralizantes pueden internalizarse en las clulas del receptor Fc teniendo como monocitos y macrfagos[2]las clulas que son normalmente o bien no susceptible o slo escasamente susceptibles a la infeccin directa con DENV.Este proceso, llamado anticuerpo mejora dependiente (ADE) de la infeccin fue descubierta en gran parte por el trabajo de Halstead y colegas que observaron que los niveles sub-neutralizacin de anticuerpos podran desencadenar este proceso[2]-[5].En particular, se cree que ADE se expande la masa disponible de las clulas diana, as como que conduce directamente a la infeccin de los principales reguladores del sistema inmune que resulta en una presentacin ms grave, y varios estudios han puesto de manifiesto la relacin entre la segunda infecciones con un virus heterotpicos y la enfermedad severidad[6]-[8].El concepto de ADE sustenta gran parte de nuestra comprensin de la patognesis de las infecciones DENV, y juega un papel importante en la conformacin de desarrollo de la vacuna donde los esfuerzos se centran en la generacin de un uniforme y la respuesta inmune igual a los cuatro DENVs para evitar posibles problemas de menores de individuos vacunados con severa la enfermedad como consecuencia de una infeccin natural adquirida[9].Recientemente, el concepto de ADE de la infeccin fue parcialmente desafiado por Chaichana y colegas que mostraron que los virus aislados directamente de los pacientes DENV mostraron poca o ninguna ADE de la infeccin in vitro, mientras que los virus de laboratorio adaptado sometieron a ADE significativo de infeccin usando suero o plasma de la misma pacientes[10].Los autores concluyeron que la fuente del virus era un factor importante en ADE, y por otra parte que la ADE de la infeccin con virus de laboratorio visto adaptado in vitro fue una consecuencia de paso repetido del virus[10].Hemos observado recientemente un fenmeno similar con el paso bajo (en comparacin con los virus de unpassaged Chaichana y sus colegas) aislados de DENV 4. Usando un protocolo optimizado con un anticuerpo monoclonal, se encontr que las condiciones que dieron lugar a alta ADE de la infeccin de clulas U937 con una virus adaptado laboratorio result en poco o nada de la infeccin con el virus de baja de paso[11].La publicacin del documento Chaichana[10]que no mirar a DENV 4 en su estudio hizo que el estudio actual en la que se realiz un anlisis ms completo de nuestro estudio preliminar[11]para tratar de encontrar la razn por bajas 4s DENV pasaje aparentemente no pudieron someterse a ADE de la infeccin.Sorprendentemente, se muestra que bajo DENV paso 4 aislamientos de hecho se someten a ADE de la infeccin, pero que este es significativamente retrasado temporalmente en comparacin con los virus de laboratorio adaptado.Resultados y discusinClulas U937 no diferenciadas son altamente susceptibles a la infeccin por DENV mediada ADE, pero son poco susceptibles a la infeccin directa DENV[12],[13].Estudios previos han sugerido que DENVs baja de paso o DENVs aislados directamente de los pacientes no sean objeto de ADE, o someterse a ADE slo escasamente en comparacin con los virus de laboratorio adaptado[10],[11].Para investigar ms a fondo, se seleccionaron tres DENV 4 aislados, uno de los cuales era un laboratorio de alto pasaje (LAB) virus (DENV 4 LAB), uno un DENV 4 aislado de fiebre dengue (DF) paciente adaptado y se pasaron tres veces en C6 / 36 (DENV 4 DF) y uno un DENV 4 aislado de fiebre hemorrgica del dengue (FHD) pacientes y se pasaron tres veces en C6 / 36 (DENV 4 FHD).Bajo condiciones estndar, estos tres virus se incubaron con ningn anticuerpo o diluciones crecientes de un anticuerpo producido por el hibridoma HB 114, que hemos demostrado previamente para ser capaz de mediar ADE con DENV 4 LAB[12].Las clulas se incubaron en condiciones estndar y se recogen en los das 1, 2, 3 y 5 despus de la infeccin antes del anlisis por citometra de flujo para determinar el grado de la infeccin.Resultados (Fig.1) muestran altos niveles de mejora de la infeccin con DENV 4 LAB desde el da 2 despus de la infeccin, con la mejora mxima observada con diluciones de anticuerpos entre 1: 200 y 1: 2000, en consonancia con nuestras observaciones anteriores[12].De manera significativa, tanto DENV 4 DF y DENV 4 DH mostr poco o nada de ADE en el da 2 despus de la infeccin, pero por el da 3 (DENV 4 DF) o el da 5 (DENV 4 FHD) despus de la infeccin, las clulas infectadas con el paso bajo los aislados mostr un alto grado de la infeccin, con la mejora mxima que se observa con diluciones de anticuerpo de 1: 200.Cabe destacar que las clulas infectadas con DENV 4 DF mostraron casi el 100% de infeccin por el da 5 despus de la infeccin, mientras que las clulas infectadas con DENV 4 DH mostraron aproximadamente un 60% la infeccin.Fig.1.ADE de la infeccin de las clulas U937 con DENVs altas y bajas de paso.Complejos anticuerpo-virus se generaron conunLAB DENV 4,bDENV 4 DF ycDENV 4 DHF y diferentes diluciones de HB 114 anticuerpos antes de la incubacin con las clulas U937 y el posterior cultivo durante 1-5 das despus de la infeccin.El grado de infeccin se determin mediante citometra de flujo.El experimento se llev a cabo de forma independiente por triplicado yerror baresmostrar SEMEstos resultados sugieren que cualquiera de los aislamientos de paso bajo estn entrando en las clulas durante el perodo de la infeccin, pero estn experimentando retrasado significativamente la replicacin, o que el proceso de infeccin en s se retrasa en comparacin con los virus de laboratorio adaptado.El concepto de la replicacin del retraso ha sido establecida previamente con el virus del Nilo Occidental[14],y se cree que los virus virulentos replican ms lentamente para evitar la deteccin inmune innata, mientras que los virus atenuados se someten a la replicacin rpida desencadenar una respuesta inmune ms fuerte innata.Para abordar esta cuestin, una condicin optimizada de ADE de la multiplicidad de infeccin (moi) 1 y 1: 200 se seleccion dilucin de anticuerpo y despus de la 2 h de incubacin de las clulas con el complejo anticuerpo-virus, las clulas se lavaron para eliminar ONU internalizado complejos de virus y posteriormente se incubaron en un medio estndar.Se observ una marcada reduccin en el nivel de DENV 4 infeccin LAB, pero slo los niveles mnimos (