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BLADDeficiencia de adhesión leucocitaria
bovinaManuel Félez
Coordinado por la profesora Pilar Zaragoza
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BLAD• Descubrimiento e importancia de la
enfermedad• Síntomas y lesiones• Base genético-fisiológica de la enfermedad• Diagnóstico de la enfermedad• Tratamiento de la enfermedad• Bibliografía
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Descubrimiento e importancia de la enfermedad
• Descrita por primera vez en Holstein Friesian en Estados Unidos en 1983
• Susceptibilidad aumentada a la acción de agentes infecciosos durante los dos años de vida del animal
• Función alterada de los neutrófilos• Años después descrita en Japón la misma enfermedad
en descendientes del caso de Estados Unidos• Grave enfermedad desde el punto de vista económico• Declaración obligatoria de portadores• Enfermedades similares en otras especies:
– LAD en humanos– CLAD en perros de la raza Setter irlandés
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Síntomas y lesiones
• Síntomas y lesiones in vivo• Hallazgos macroscópicos en la necropsia• Hallazgos microscópicos en la necropsia
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Síntomas y lesiones in vivo• En la primera semana de vida los terneros parecen totalmente
sanos• Anorexia, caquexia y retrasos en el crecimiento• Infecciones bacterianas continuas y fiebre elevada• Dermatitis, úlceras de decúbito y alopecias• Neutrofilia progresiva y muy temprana en el curso de la
enfermedad• Neumonía crónica• Hipertrofia de los ganglios linfáticos superficiales• Úlceras e inflamaciones granulomatosas de las membranas
mucosas orales y gingivitis• Diarrea crónica recurrente• Muerte alrededor de las siete semanas, aunque en algunos casos
pueden sobrevivir durante meses
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Hallazgos macroscópicos en la necropsia
• Adenitis y necrosis de ganglios linfáticos en la mayoría de las vísceras, particularmente en el mesenterio
• Pielonefritis granulomatosa• Serositis en rumen• Mucosa necrosada en íleon, con hiperplasia de
folículos linfoides, e infiltración de células plasmáticas, linfocitos y macrófagos
• Edema en las áeras paracorticales del encéfalo• Congestión esplénica y calcificaciones en el estroma y
vasos esplénicos
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Hallazgos microscópicos en la necropsia
• Ausencia de neutrófilos en la lámina propia de tejidos inflamados
• Macrófagos con estructuras citoplásmicas con restos bacterianos
• Hiperplasia mieloide granulocítica• En los vasos sanguíneos del hígado, riñón,
corazón, pulmón, glándulas salivares, abomaso y encéfalo aparece una marcada leucocitosis neutrofílica
• Marcada retención neutrofílica en el bazo
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Base genético-fisiológica de la enfermedad
• Recordatorio fisiológico de la inflamación
• ¿Dónde está el problema?• ¿A qué se debe este problema?• ¿Cómo se transmite?
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Recordatorio fisiológico de la inflamaciónDaño tisular
Inflamación
¿Qué sucede en la inflamación?
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¿Qué sucede en la inflamación?• Vasodilatación con aumento de la permeabilidad
capilar: llega al tejido fluido rico en complemento, inmunoglobulinas, y otras proteínas séricas
• Coagulación sanguínea local inducida por las células endoteliales: evitan la entrada y diseminación del organismo en la circulación
• El fluido vertido al tejido transporta al patógeno por la linfa hasta los ganglios linfáticos regionales
• El endotelio produce moléculas de adhesión celular para que aumente la capacidad de los leucocitos polimorfonucleados y de los monocitos a adherirse a dicho endotelio para realizar la extravasación hacia el tejido afectado
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Extravasación de los leucocitos
• Sucede en 4 fases:– Fase de rodamiento– Adhesión más fuerte (¡¡¡ALGO FALLA AQUÍ!!!)– Diapédesis– Migración del leucocito
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¿Dónde está el problema?
¡¡¡LOS LEUCOCITOS NO SE ADHIEREN AL
ENDOTELIO!!!
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Moléculas de adhesión celular
• Son las moléculas responsables de las adhesiones entre las células
• Divididas en cinco familias:– Cadherinas– Super gen inmunoglobulinas– Selectinas– Proteoglicano– Integrinas
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Integrinas• Son proteínas heterodiméricas transmembrana formadas por dos
cadenas polipeptídicas unidas no covalentemente• Se unen a diferentes ligandos y transmiten señales a través del
citoesqueleto• Son receptoras de matriz y se expresan en una variedad de células
hematopoyéticas y no hematopoyéticas• Son las responsables de la adhesión de los leucocitos al endotelio
vascular• Su expresión se regula por diferenciación celular y por el estímulo
inflamatorio• Modulan funciones celulares específicas:
– Crecimiento– Maduración– Migración– Proliferación– Citotoxicidad– Fagocitosis
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Integrinas• Existen gran cantidad de integrinas diferentes• Las integrinas cuya alteración originan el BLAD son las β-2-
integrinas, también llamadas CD11/CD18• Las CD11/CD18 sólo se expresan en leucocitos• Intervienen en distintos procesos:Funciones leucocitarias
– Quimiotaxis de fagocitos– Adhesión de leucocitos a sustratos– Fagocitosis de microorganismos opsonizados– Adhesión leucocitaria al endotelio activado
• Cada una de estas moléculas contiene dos subunidades, con una estructura α1β1
• Todas tienen la misma subunidad β (CD18) y se distinguen por su subunidad α, designada CD11a, CD11b y CD11c, para la LFA-1α, Mac-1α y p150.95α, respectivamente
• El BLAD se debe a un defecto en la expresión de la proteína CD18
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¿A qué se debe este problema?
• Secuenciando la proteína CD18 se observa una mutación el en aminoácido 128 que consiste en el cambio de una glicina por el ácido aspártico
• Existen 2 mutaciones puntuales en el alelo raro, una silenciosa, y una transición de una adenina por una guanina, que es la que induce el cambio de aminoácido
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¿Cómo se transmite?
• Se trata de una mutación autosómicarecesiva
• La transmisión sigue las leyes de Mendel
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Diagnóstico de la enfermedad• Se utiliza la técnica de la PCR acoplada a
la digestión con enzimas de restricción (RFLP’s)
• Pasos del diagnóstico:– Toma de muestras– Extracción del ADN– Amplificación mediante PCR– Digestión con las enzimas de restricción y
electroforesis
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Toma de muestras
• Pueden ser:– Sangre– Semen– Leche
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Muestra de sangre
• Se obtiene de la vena coccígea• Tiene que ser sangre fresca: se añade
EDTA (el citrato sódico y la heparina producen efectos indeseables para la amplificación del ADN)
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Muestra de semen
• Se obtiene directamente de las pajuelas
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Muestra de leche
• Se toman dos muestras:– Una para la extracción del ADN– Otra para que el laboratorio de referencia
analice los distintos parámetros de composición de la leche, especialmente número de células
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Extracción del ADN
• Muestra de sangre:– Método “standard”: se obtiene a base de
centrifugaciones, ruptura de los leucocitos y extracción con etanol
– Método “rápido”: se necesita menor cantidad de muestra y se utiliza para conservar la muestra a temperaturas bajo cero
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Extracción del ADN• Muestra de semen:
– Método “standard”: similar al de sangre, pero las paredes del tubo deben impregnarse de silicona
– Método “rápido” A: la muestra se lava y centrifuga con NaCl y después se resuspende en una solución de NaOH y dithiotreitol para luego someterla a 100ºC durante 10 minutos. Después se resuspende en tampón TrisClH para neutralizar la muestra y se recoge el sobrenadante
– Método “rápido” B: similar al de sangre, también destinado para conservar en congelación
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Extracción del ADN
• Muestra de leche:– Método “rápido”: con una centrifugación
inicial se elimina la grasa y el suero, luego se lavan las células con el tampón, se resuspenden en una solución de digestión a temperaturas muy bajas y una vez digerida la muestra se sube a 99ºC para inactivar la proteinasa K. Luego se vuelve a congelar a temperatura bajo cero para su conservación
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Amplificación del ADN (PCR)• Necesitamos:
– Agua ultrapura– Tampón de Taq polimerasa– Cl2Mg– dNTP’s– Taq DNA polimerasa– 2 cebadores:
• 5’ TCCGAGGGCCAAGGGCTA 3’• 5’ GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTAGTACAGG 3’
– No olvidar el aceite mineral para evitar la evaporización• Fases de la PCR:
– Desnaturalización inicial (30 segundos a 94ºC)– Ciclos de amplificación:
• Desnaturalización (30 segundos a 94ºC)• Hibridación (60 segundos a 56ºC)• Extensión (30 segundos a 72ºC)
– Reducción de la temperatura a 4ºC hasta que se saquen los tubos del termociclador
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Digestión de la amplificación (electroforesis)
• Se utilizan 2 enzimas de restricción:– Taq I– Hae III
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Tratamiento de la enfermedad
• A nivel individual no existe tratamiento• Se puede hacer selección negativa• Se pueden dirigir los cruces de
heterocigotos para que no haya homocigotos mutantes
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Bibliografía• · FELMER D., Ricardo, BUTENDIECK B., Norberto, BUTENDIECK B., Bárbara et al. DETECCIÓN DE UN
DEFECTO GENÉTICO EN BOVINOS MEDIANTE UNA PRUEBA DE ADN. Agric. Téc. [online]. ene. 2001, vol.61, no.1 [citado 10 Mayo 2007], p.42-50. Disponible en la World Wide Web: <http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-28072001000100005&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0365-2807.
• · Arch. Zootec. 49: 505-508. 2000• OBTENCIÓN DE DNA PARA EL ESTUDIO DE BLAD EN TOROS DE ARGENTINA Y ESPAÑA• Schifferli, C.2, M. Villaroel1, M.V. Arruga1,• ·Moléculas Adhesión.• T.M. MsC Juan Luis Castillo N.• Departamento de Especialidades Médicas• Facultad de Medicina• Universidad de Concepción• http://www.inflamacion.co.cl/pdf/adhesion.pdf• · Curso de Inmunología General• Enrique Iánez Pareja• Departamento de Microbiología• Universidad de Granada• http://66.102.9.104/search?q=cache:jNNLcW6zttkJ:www.ugr.es/~eianez/inmuno/cap_17.htm+fases+de+la+
extravasaci%C3%B3n+de+neutr%C3%B3filos+diap%C3%A9desis&hl=es&ct=clnk&cd=1&gl=es• · “DETECCIÓN DE PORTADORES DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS MEDIANTE BIOTECNOLOGÍA
GENÉTICA. APLICACIÓN A UN EJEMPLO CONCRETO: BLAD (DEFICIENCIA DE ADHESIÓN LEUCOCITARIA BOVINA)”
• Memoria presentada por D. Francisco José Vázquez Bringas para optar al grado de Licenciado en Veterinaria.
• Zaragoza. 1994