david contra goliat (nanorods per vencer el càncer)
DESCRIPTION
Autora: Maria Martínez Pla | Tutora: Fina Sanz | Tema: Tractament del càncerTRANSCRIPT
DAVID CONTRA GOLIAT (NANORODS PER VENCER EL CÀNCER)
Maria Martínez Pla
Treball de recerca
Tutora: Fina Sanz
2n de Batxillerat (2.2)
Curs 2013-2014
Institut Monsterrat-Barcelona
Data entrega: 6-11-2013
2
ÍNDEX I) AGRAÏMENTS .......................................................................................................... 4
II) INTRODUCCIÓ........................................................................................................ 5
III) FONAMENTS TEÒRICS............................................................................................ 7
1.- La biologia del càncer............................................................................................. 8
1.1.- Origen del càncer.................................................................................... 9
1.2.- El càncer, una malaltia genètica................................................................ 10
1.2.1.- Oncògens................................................................................. 10
1.2.2.- Gen supressor de tumors.......................................................... 11
1.2.3.- Gen Caretaker.......................................................................... 12
1.3.- El càncer, és més que genètica................................................................ 12
1.4.- L’apoptosis i la lluita contra el càncer........................................................ 13
1.5.- Telòmers i la seva relació amb el càncer.................................................... 14
2.- Nanopartícules....................................................................................................... 16
3.- Nanopartícules d’or............................................................................................... 17
3.1.- Propietats nanopartícules or.................................................................... 18
3.1.1.- Facilitat de síntesis i funcionalitat............................................... 18
3.1.2.- Baixa toxicitat i biocompatibilitat................................................ 19
3.1.3.- Propietas òptiques................................................................... 21
3.1.4.- Resistència a infeccions bacterianes.......................................... 21
3.2.- Principals aplicacions de les nanopartícules d’or....................................... 22
3.2.1.- Nanopartícules per al diagnòstic ................................................ 22
3.2.2.- Nanopartícules per a l’alliberació de fàrmacs i altres
molècules terapèutiques..................................................................... 23
3.2.2.1.- Teràpia gènica............................................................ 24
4.- Gold nanorods: propietats, sintesi i aplicacions....................................................... 25
4.1.- Propietats òptiques.......................................................................... ............ 25
4.1.1.- Índex de refracció..................................................................... 26
4.2.- Sintesi de nanorods......................................................................... ............ 27
4.2.1.- Mètode seed mediated............................................................. 28
4.2.2.- Control de la forma i mida......................................................... 30
3
4.3.- Funcionalització....................................................................................... 30
4.3.1.- Nanorods funcionalitzats amb el PEG......................................... 31
4.3.2.- Nanorods funcionalitzats amb pèptids....................................... 32
4.4.- Aplicacions biològiques i biomèdiques...................................................... 33
4.4.1.- Nanorods i sensors................................................................... 33
4.4.2.- Alliberació del material genètic i fàrmacs..................................... 34
4.4.3.- Imaging........................................................................................ 35
4.4.4.- Teràpia i diagnòstic de la malaltia del càncer amb nanorods........ 36
4.4.4.1.- Teràpia fototèrmica.................................................... 37
4.4.4.2.- Diangòstic del càncer i els telòmers............................... 37
IV) FONAMENTS PRÀCTICS.......................................................................................... 38
Avaluació dels nanorods com a eines pel tractament del càncer.................................... 39
Objectiu......................................................................................................... 39
Material.................................................................................................... ............ 39
Procediment................................................................................................... 40
1.- Síntesi i estudi nanorods................................................................. 40
2.- Funcionalització de nanorods.......................................................... 46
3.- Assaig MTT (assaig de toxicitat)........................................................ 51
Resultats i anàlisi de resultats.......................................................................... 54
1.- Síntesi de nanorods........................................................................ 54
2.- Funcionalització de nanorods............................................................ 60
3.- Assaig MTT..................................................................................... 63
Conclusions..................................................................................................... 64
V) CONCLUSIONS....................................................................................................... 65
VI) TREBALL FUTUR...................................................................................................... 67
VII) BIBLIOGRAFIA...................................................................................................... 68
4
I) AGRAÏMENTS
Aquest treball s’ha realitzat dins del programa recerca secundària al qual vaig participar degut
a formar part del primer grup dels “Bojos per la biomedicina”, per aquest motiu hauria d’agrair
a moltes persones la realització d’aquest treball.
D’una manera molt particular, m’agradaria agrair molt sincerament a la Fina Sanz, tutora del
treball de recerca, per haver acceptat el treball, ajudar-me a fer-lo en tot moment i per estar
constantment pendent d’aquest.
També m’agradaria agrair-li al Pep Garcia l’entusiasme, la passió i la dedicació a la ciència que
m’ha transmès durant la realització de treball, al qual hi ha estat molt pendent, tant a l’hora
d’acollir-me al laboratori com durant en la redacció d’aquest.
A la Pilar Macià m’agradaria agrair-li que m’introduís el món de la recerca ajudant-me i
animant-me a participar al programa de “ Bojos de la biomedicina”.
5
II) INTRODUCCIÓ
Són molts aquells que la seva vida s’ha vist, com a mínim algun cop, colpejada pel càncer, ja
sigui perquè el seu cos s’ha vist envaït per la malaltia o perquè han viscut intensament el
patiment que els produeix a amics o familiars. Aquesta malaltia afecta a molta gent, gent de
totes les edats, i malgrat els esforços que s’han fet i s’estan fent, estudiant tant les seves
causes, com possibles tractaments, segueix augmentant el nombre de persones que pateix
aquesta malaltia i podríem dir que encara estem lluny d’aconseguir vèncer-la. És una malaltia
que pot començar a causa d’una simple mutació genètica, un simple error en l’expressió dels
gens, un error que treu la vida a milers de persones cada any. Així que vaig decidir que aquesta
malaltia, des d’un punt de vista molecular, seria la base del meu treball. Vaig triar estudiar-la
des d’un punt de vista molecular perquè és la part de la biologia que més m’agrada.
Casualment, vaig llegir sobre un tractament avantguardista, de recerca capdavantera, que
podria ajudar tant a la cura com al diagnòstic d’aquesta malaltia. Aquesta recerca estava
basada en la utilització de l’or, l’or dels anells, el que aparentment tan sols sembla útil en
l’estètica, com un símbol de riquesa, podria donar lloc a un tractament viable per una de les
malalties més agressives i comunes de tot el món. Però aquest or té la peculiaritat que està a
mida nanomètrica, són nanopartícules d’or. La seva mida nanomètrica i les seves propietats li
donen una capacitat d’internalització, sense provocar efectes tòxics a la cèl·lula, un fet que em
va impressionar.
Crec que aquest tractament desperta esperances fonamentades pel fet de la internalització, la
qual no produeix efectes tòxics, i per la seva capacitat de travessar barreres.
Finalment, vaig decidir que el meu treball de recerca es centraria en les nanopartícules d’or i el
càncer. L’IRB (Institut de Recerca Biomèdica) em va facilitar tant informació sobre el tema com
la possibilitat de fer pràctiques sobre aquest. A mesura que em vaig endinsar en la temàtica
vaig veure que unes nanopartícules d’or molt utilitzades en el camp del càncer eren unes que
s’anomenaven nanorods, les quals tenen una forma que incrementa les propietat idònies per
la seva utilització en aquest camp. D’aquesta manera el meu treball es basarà en els nanorods
com a principi pel tractament del càncer.
Aquest treball inclourà un estudi sobre la biologia molecular del càncer i la seva relació amb els
nanorods, així com una introducció al camp de la nanotecnologia i nanopartícules, fixant-me
en les propietats i aplicacions més prometedores de les nanopartícules d’or i en concret,
també dels nanorods.
6
A més, aquest treball contindrà una part pràctica molt important que es basarà en la síntesi de
nanorods utilitzant diferents reactius, la seva funcionalització, és a dir, la unió d’aquests amb
altres molècules, i un assaig de toxicitat en que s’avaluaran els nanorods sintetitzats i
funcionalitzats. Així podrem avaluar els nanorods com a eines per al tractament de la malaltia
del càncer i conèixer com ha de ser la seva sintetització depenent de la profunditat dels teixits
que s’hagin de tractar.
L’estudi teòric realitzat, juntament amb la realització de pràctiques en aquest camp, em
permetran obtenir unes conclusions presentades al final del treball.
Resumint, podria concloure que com més ens endinsem en l’estudi d’aquest tipus de
nanopartícules, més esperançador es veu el seu ús contra un gegant maligne com el càncer.
7
III) FONAMENTS TEÒRICS
8
1.- LA BIOLOGIA DEL CÀNCER
La malaltia del càncer ha estat coneguda durant tota la història, fins i tot els Egipcis ja la
coneixien, tot i que l’estudi formalitzat d’aquesta malaltia no va arribar fins al S. XVI, ja que
durant el segle anterior es va començar a comprendre com realment funcionava el cos. Però
els progressos més grans en la descripció molecular del càncer s’han realitzat durant els últims
50 anys, tot i que això no ha servit per desenvolupar armes definitives contra la guerra dels
càncers més comuns.
La incidència en els casos de càncer ha anat augmentant, actualment aquesta malaltia és
responsable del 10% de morts arreu del món i en alguns països de més del 25%.
A primera vista, la biologia del càncer pot semblar senzilla, ja que les cèl·lules cancerígenes són
cèl·lules que deixen de complir les ordres que han estat imposades a les cèl·lules de manera
individual dins l’organisme, és a dir, créixer, dividir-se i morir. Les cèl·lules cancerígenes es
multipliquen de manera incontrolada i de manera autònoma, envaint els mateixos teixits on
estan situades aquestes cèl·lules i a vegades s’estenen per la sang o la limfa fins arribar a altres
parts del cos, formant les metàstasis.
En general, el càncer comença amb una mutació en el DNA en una sola cèl·lula i després es
desenvolupa en múltiples fases a través de noves mutacions i aquestes passen a les cèl·lules
filles quan aquesta es divideix, sense reparar les mutacions.
Fem una reflexió, acabem de dir que el càncer sorgeix d’una mutació en una sola cèl·lula, d’un
sol error en el material genètic, si nosaltres tenim al voltant de 1014 cèl·lules, el càncer hauria
de ser una malaltia encara molt més freqüent ja que les nostres cèl·lules estan exposades
contínuament a agents que podrien danyar el DNA. Ens podríem preguntar llavors, per què no
Fig 1: Divisió de cèl·lules sanes i cancerígenes
9
succeeix tan freqüentment? La resposta és que tenim alguns sistemes per reparar mutacions,
contra el desenvolupament de cèl·lules cancerígenes i, tot i que aquests sistemes no funcionen
al 100%, es creu que tenen un grau bastant alt d’eficàcia.
1.1.- ORIGEN DEL CÀNCER
En els últims 30 anys s’ha progressat notablement en l’estudi de les causes del càncer incloent
el paper de la predisposició genètica, la relació entre la genètica i l’entorn i els agents
infecciosos.
L’inici d’aquest, es creu, és el dany del DNA, generalment, en una cèl·lula somàtica i amb la
progressió del creixement del tumor, depenent de l’acumulació de canvis genètics i
epigenètics (canvis que no suposen una alteració en la seqüència de nucleòtids del DNA) que
determinen el fenotip del càncer que s’està desenvolupant. Ho podríem mirar de manera que
la primera mutació dóna lloc a la primera cèl·lula cancerígena, generant una subclasse de
cèl·lules que posteriorment es podrien anar radicalitzant.
Mirant-ho globalment, segons la majoria de teories actuals de l’origen dels càncers, aquests
s’originen a les cèl·lules mare. Aquesta idea va sorgir al S.XIX quan es van veure les semblances
entre el teixit embrionari i el càncer, portant a proposar que els tumors creixien com les
cèl·lules embrionàries. Més tard, també al S.XIX hi va haver la demostració en teixits adults,
que podien activar-se en el càncer, donant lloc a la teoria de l’origen del càncer a partir de
cèl·lules mare adultes.
Un factor important que dóna suport a la teoria de les cèl·lules mare com originadores del
càncer és les semblances entre les cèl·lules cancerígenes i les cèl·lules mare adultes o
embrionàries. Sovint s’observa la sobreexpressió de molts oncògens (gens que transformen les
cèl·lules sanes en malignes, cancerígenes) diferents que porta a la pèrdua de diferenciació i
aquestes cèl·lules tornen a començar el cicle cel·lular d’abans de ser diferenciades. Les
semblances entre les cèl·lules cancerígenes i les cèl·lules precursores o les cèl·lules mare no
tenen perquè mostrar-se sempre, ja que no només reflecteix la naturalesa de la cèl·lula
originaria, sinó, que més aviat les conseqüències de la lesió oncogènica, sigui quin sigui l’estat
de diferenciació en que es troba la cèl·lula.
A part, també s’ha mostrat molt interès en l’existència de cèl·lules mare cancerígenes (són
cèl·lules cancerígenes que tenen propietats associades a les cèl·lules mare sanes, en concret
poden donar lloc a tots els tipus de cèl·lules que es troben en una mostra de teixit cancerigen)
ja que hi estan presents en molts, sinó tots, els tumors. Aquestes cèl·lules o més aviat el seu
10
concepte va aparèixer fa 100 anys, però des de fa poc temps se’ls hi ha donat molta més
importància gràcies a la identificació d’aquestes cèl·lules en una gran varietat de càncers.
Darrerament aquestes teories han estat recolzades per la resistència que presenten aquestes
cèl·lules davant la quimioteràpia i podrien explicar el fracàs en la cura de la majoria de càncers
metastàtics.
1.2.- EL CÀNCER, UNA MALALTIA GENÈTICA
Tenint disponibilitat del genoma humà i també del de ratolins, l’última dècada ha estat
testimoni de l'explosió de nous coneixements sobre la genètica humana. S’ha descobert que
els gens influeixen en moltes malalties com algunes del cor, diabetis i molts tipus de càncer.
Més de 1% de gens són “gens del càncer”, dels quals el 90% mostren mutacions somàtiques en
càncer.
Els càncers sorgeixen degut a l’alteració genètica, aquestes alteracions tenen lloc en tres tipus
de gens:
- oncògens: Aquests són una variant de gens que estan involucrats en alguns
comportaments com és la replicació del DNA o el creixement de les cèl·lules.
- gen supressors de tumors: Actuen com a guardians de l’estrès cel·lular, del dany del
material genètic o del creixement anormal dirigit pels oncogèns, responent promovent
l’apoptosis, mort cel·lular programada, o bloquejant la continuació del cicle cel·lular.
- gens caretaker (gens mutadors): Aquests estan involucrats en la detecció i reparació
del dany del DNA.
Les alteracions genètiques poden donar-se a les cèl·lules germinals, donant lloc a una
predisposició del càncer heretada.
1.2.1.- ONCÒGENS
Els oncògens són versions activades de gens normals (s’anomenen proto-oncògens)
que generalment tenen una capacitat o habilitat comuna d’accelerar la divisió cel·lular
i el creixement, encara que també contribueixen en moltes altres activitats, com evitar
l’apoptosis.
11
En les cèl·lules sanes, els proto-oncògens estan molt regulats, tant la seva expressió
com activitat, això és molt important ja que aquests podrien provocar un excés de
proliferació o la supervivència de la cèl·lula amb danys al DNA.
Un proto-oncògen pot esdevenir un oncògen de diverses maneres. Normalment, el
que succeeix és que la mutació afecta al codi genètic del gen i es transcriu una
oncoproteïna que té una bona activitat i la seva expressió no està regulada. Aquests
mecanismes poden ser classificats com alteracions estructurals, si és una mutació en
un sol gen, o amplificació de gens, si porta a una sobre-expressió del gen. Aquesta
sobre-expressió pot ser a causa de reorganitzacions cromosòmiques.
Però l’activació d’una sola mutació en un oncogèn no és suficient per causar el càncer,
els oncogèns han de col·laborar entre ells i s’han d’inactivar els gens supressors de
tumors.
1.2.2.- GEN SUPRESSOR DE TUMORS
Els gens supressors de tumors transcriuen unes proteïnes en nivells molt baixos, són
com una mena de guardians de la cèl·lula contra el dany del DNA induït, com pot ser,
mitjançant rajos ultraviolats o rajos X. Aquestes prevenen el carcinogènesis a partir de
la interrupció del cicle cel·lular o induint la mort cel·lular programada o apoptosis, és a
FIG 2: Mecanisme de la transformació de una proto-oncògen a un oncògen. El primer cas és una mutació en lloc determinat del gen que transcriurà una proteïna anormal. En el segon cas, trobem un amplificació dels
gens que donaran lloc a proteïnes normals però sobre-expressades. En el tercer cas hi ha una reorganització cromosòmica que pot portar a una sobre-expressió d’una proteïna normal o anormal.
12
dir, inhibeixen la proliferació cel·lular. El 0,1% total dels nostres gens són supressors de
tumors.
El primer gen supressor de tumors que es va identificar va ser el gen RB, aquest
codifica una proteïna que bloqueja el cicle cel·lular si hi ha alguna lesió al DNA unint-
se al factor de transcripció E2F. És molt important en el control de la proliferació i en el
desenvolupament de la majoria de les cèl·lules. Quan aquest gen és inactivat, el factor
de transcripció E2F no s’atura i transcriu el gens a proteïnes quan no toca, és a dir,
quan no es necessiten, això pot desencadenar una hiperproliferació o l’apoptosi (mort
cel·lular programada) de les cèl·lules.
El segon supressor de tumors identificat va ser el p53 que codifica una proteïna que és
un factor de transcripció. Aquest és molt important per aturar el cicle cel·lular en cas
que hi hagi una mutació. Inhibeix la proliferació quan aquest està sobre-expressat, en
canvi en nivells baixos permet una divisió cel·lular normal.
La inhibició d’aquest gen porta a la inestabilitat genòmica. Les cèl·lules tumorals solen
tenir nivells molt alts de p53, tot i que tendeixen a estar mutats.
1.2.3.- GENS CARETAKER
Aquests gens són els encarregats de codificar unes proteïnes que estabilitzen el
genoma i així prevenen l’acumulació de mutacions, són de vital importància per evitar
el dany cel·lular. Les mutacions en aquests poden donar lloc a inestabilitat genòmica,
provocant un augment de proliferació o una inactivació de l’apoptosi.
Aquests també són responsables de l’estabilitat cromosòmica, així doncs una mutació
en aquests també pot provocar inestabilitat cromosòmica, una de les principals formes
d’inestabilitat genètica que dóna lloc al càncer. Aquests gens són responsables de
moltes predisposicions hereditàries del càncer.
1.3.- EL CÀNCER, MÉS QUE GENÈTICA
Els càncers poden sorgir d’alteracions o canvis en l’expressió de gens i proteïnes que no
necessariament produeixen canvis en la seqüència de DNA que codifica aquesta expressió, això
s’anomena alteracions epigenètiques. Per exemple, les alteracions químiques del DNA tenen
greus efectes en l’expressió dels gens, però no hi ha cap alteració a la seqüència de DNA.
13
Un cas particular és la metilació (afegir un grup metil) en un gen que actua
com un silenciador en l’expressió d’aquest i un altre, la metilació en una
citosina, una alteració epigenètica, que té efectes profunds en la regulació
de la transcripció i replicació del DNA. És molt important el paper que
juga la metilació en la cèl·lula a l’hora d’inactivar gens supressors de
tumors durant el creixement d’aquest, i per això s’investiga com trobar
fàrmacs que es dirigeixin a aquests processos.
El DNA està associat a unes proteïnes, les histones formant la cromatina. Modificacions en les
histones o el DNA pot alterar l’estructura de la cromatina sense alterar la seqüència de
nucleòtids del DNA, aquestes modificacions són epigenètiques. El canvis en la cromatina
poden tenir una influència molt gran en l’expressió genètica, ja que si aquesta està
condensada, els factors involucrats en l’expressió dels gens no podran arribar al DNA, i els gens
estaran activats. Sinó és així, sinó està condensada, els gens podran ser expressats segons les
necessitats per a l’activitat de les cèl·lules. Els factors epigenètics, incloent la metilació del DNA
i les modificacions de les histones, poden dictar el destí de la cèl·lula i els patrons expressió
gènica.
1.4.- L’APOPTOSIS I LA LLUITA CONTRA EL CÀNCER
L’apoptosis o mort cel·lular programada és un procés essencial pel desenvolupament,
manteniment estable dels teixits i per l’eliminació de les cèl·lules, una de les possibles causes
d’aquesta pot ser que el seu DNA ha estat danyat i no es pot reparar.
Hi ha una estreta relació entre el càncer i l’apoptosi, ja que la majoria de cèl·lules tumorals no
tenen regulada la seva capacitat per morir d’apoptosi i la majoria de tractaments per al càncer
estan basats en induir l’apoptosi.
Quan la cèl·lula pateix estrès, hi ha una activació d’algun oncogèn o hi ha una desregulació del
creixement cel·lular, això porta a l’activació del gen supressor de tumors p53 que atura el cicle
cel·lular o activa l’apoptosi. Una proteïna que s’anomena Bcl-2 també està involucrada, ja que
regula l’apoptosi i la mort cel·lular.
Un excés o una disminució d’apoptosis pot donar lloc a moltes malalties com les malalties
neurodegeneratives o el càncer, ja que aquesta és una balanç entre les cèl·lules que viuen i les
que moren.
FIG 3: Grup metil
14
Com ja he dit anteriorment, el càncer sorgeix com a resultat de múltiples alteracions
genètiques i epigenètiques que donen lloc a una proliferació cel·lular descontrolada, de
manera que es resisteixen a l’apoptosi. Aquest fet és degut a la interacció entre els oncogèns,
encara que la inactivació dels gens supressors de tumors també hi està involucrada.
En el tractament del càncer, per exemple en la quimioteràpia, el que s’intenta és inhibir els
creixement o proliferació de la cèl·lula, per exemple bloquejant el DNA o proteïnes, o
simplement danyant el DNA.
Pot passar que si nosaltres tractem les cèl·lules amb una toxina letal, aquestes no morin pels
efectes directes de la toxina, però al cap de poc s’activarà un mecanisme que induirà una
apoptosi al cap de poc temps.
1.5.- TELÒMERS I LA SEVA RELACIÓ AMB EL CÀNCER
Els telòmers són regions de DNA no codificant que estan situades al final dels cromosomes que
protegeix el final 3’ del DNA de la degradació, i estan relacionats amb la reparació del DNA, és
a dir, s’encarreguen de l’estabilitat dels cromosomes en les cèl·lules eucariotes i també de la
divisió cel·lular. Els nostres telòmers estan formats per cadenes de TTAGGG repetides, unes
2000 vegades, associades a les proteïnes.
A mesura que les cèl·lules proliferen, les cadenes TTAGGG es van perdent, a no ser que s’activi
la telomerasa que afegeix aquesta seqüència als telòmers ja existents, encara que moltes de
les cèl·lules somàtiques normals no tenen una suficient activitat de la telomerasa, i els
telòmers es van desgastant. Si aquests són massa curts, que passarà al llarg del temps, els
cromosomes perden la seva funcionalitat.
FIG 4: Divisió cel·lular observant el progrés dels telòmers en cada divisió cel·lular
15
S’han observat que les cèl·lules cancerígenes tenen uns telòmers curts i alts nivells d’activitat
de telomerasa. Aquesta és capaç de salvar petits telòmers i així prevenir el dany del DNA i la
viabilitat de les cèl·lules cancerígenes.
En molts tumors humans s’ha observat la reactivació de la telomerasa i això porta a pensar que
és molt important per mantenir la viabilitat de les cèl·lules cancerígenes. La telomerasa s’ha
convertit en un biomarcador tumoral i també s’està investigant sobre teràpies del càncer
basades en la immunoteràpia dirigides contra aquesta proteïna. Tot i així s’ha de ser caut ja
que també pot tenir seves conseqüències, ja que si falta activitat de la telomerasa, aquesta pot
contribuir al desenvolupament del càncer, perquè els cromosomes s’aniran escurçant i això
pot desencadenar una inestabilitat cromosòmica que podria accelerar les mutacions i també
podria evitar l’apoptosi.
16
2.- NANOPARTÍCULES
La nanotecnologia dissenya materials, dispositius i sistemes a partir de l’escala nanomètrica,
de 1 a 100 nm (1nm = 10−9), tots aquests s’anomenen nanopartícules. Una nanopartícula, per
definició, és aquella en que totes tres dimensions estan en l’escala nanomètrica.
Cada dia que passa resulta més evident la utilitat dels nanomaterials en la medicina, tant pel
diagnòstic com pel tractament de malalties. De fet, en les últimes dècades, s’ha pogut
comprovar la importància de la nanotecnologia en diversos camps, inclòs el de la medicina.
En aquestes dimensions, les propietats físiques i químiques dels materials canvien radicalment.
Aquests canvis són deguts a la situació dels electrons en aquestes partícules tan petites, es deu
a les restriccions del moviment dels electrons. Les propietats també són alterades a causa de la
seva estructura atòmica, ja que tenen una àrea superficial molt gran en relació a la seva massa,
és a dir, tenen un percentatge molt més gran d’àtoms a la seva superfície respecte a partícules
de mida més gran.
Les primeres nanopartícules utilitzades en el camp de la medicina van ser els liposomes
(vesícules esfèriques amb una bicapa lipídica composta per fosfolípids i colesterol) que
s’utilitzaven com a sistemes que s’encarregaven de conduir i alliberar els medicaments de
forma activa, però aquests es van substituir per altres nanopartícules per la seva tendència a
fusionar-se en medis aquosos.
Hi ha una amplia varietat de nanopartícules, cada una amb unes propietats específiques que
les fan úniques, tot i així en aquest treball només s’estudiaran les nanopartícules d’or, les quals
formen part de les nanopartícules metàl·liques.
En aquesta escala, les interaccions entre les partícules són principalment, originades per
enllaços febles de Van der Walls, enllaços polars i interaccions electrostàtiques o enllaços
covalents.
17
3.- NANOPARTÍCULES D’OR
Els metalls nobles i els seus compostos tenen una llarga història com agents terapèutics en el
camp de la medicina. L’or és un dels materials més “preciosos” des de la seva primera
extracció al segle V aC, però aquest encara és més “preciós” quan el dividim en fragments més
petits de 100 nm. Quan aquestes partícules estan en escala nanomètrica exposen unes
propietats físiques, químiques i biològiques excel·lents, encara que sobretot destaquen les
seves propietats fototèrmiques, molt utilitzades en el tractament del càncer. Quan les
nanopartícules són activades per un estímul, generalment la llum làser, transformen aquesta
energia llumínica en energia calorífica i així desprenen calor que indueix la mort cel·lular,
actuant com a nano-calefactors.
En els darrers anys, hi hagut un increment del seu interès i un progrés en la síntesi i l’estudi
d’aquestes.
Hi ha molts tipus de nanopartícules d’or, cada tipus sintetitzat té diverses formes, mides i
aplicacions. Aquestes poden ser funcionalitzades per un ampli ventall de lligants, és a dir, que
es poden unir a molècules de molts tipus diferents (com per exemple els pèptids), i així
aconsegueixen una funció específica. A més poden ser manipulades perquè alliberin els
medicaments un cop han arribat a les cèl·lules corresponents, i també, per superar barreres
biològiques, com per exemple, partícules de menys de 12 nm poden ser capaces de travessar
la barrera hematoencefàlica (una barrera que està localitzada al cervell i és difícil de travessar
per a molts medicaments).
FIG 5: Situació de les nanopartícules d’or en l’escala mètrica
18
Les nanopartícules d’or presenten un gran potencial per l’elaboració de nanoestructures pel
transport, la vectorització selectiva de fàrmacs, la teràpia gènica...
3.1.- PROPIETATS DE LES NANOPARTÍCULES D’OR
L’ interès que desperten aquestes partícules en el camp de la biomedicina bé donat en part per
la seva baixa toxicitat. Aquesta, com moltes altres propietats, pot ser modificada, per exemple,
mitjançant la funcionalització de les nanopartícules d’or amb alguna molècula.
3.1.1.- FACILITAT DE SINTESIS I FUNCIONALITAT
Es poden sintetitzar amb una certa facilitat al laboratori i s’obtenen nanopartícules
d’un tamany entre 1 i 100 nm. Segons el procediment utilitzat podem sintetitzar
nanopartícules de diferents formes i mides:
- Nanoesferes, que tenen una mida des de 2 a 100nm de diàmetre. Poden
ser sintetitzades mitjançant una reducció de la solució
d’or i utilitzant diversos agents reductors com pot ser
el borohidrur de sodi (NaBH4). Mitjançant alguns
agents reductors podem controlar la mida de les
nanoesferes. Quan es mesura el seu espectre la seva
longitud d’ona està situada entre 510 nm i 550 nm, en
aquesta longitud d’ona, les radiacions de llum són
visibles.
- Nanorods, per sintetitzar els rods el mètode més conegut és a partir de les
seeds (nanoesferes). Aquestes seeds actuen
com a nucleacions pels nanorods, que
posteriorment els formaran. Aquesta síntesi
s’explicarà en més detall en l’apartat del
mètode seed-mediated. La seva longitud
d’ona està situada entre els 700nm i 1100
nm, és a dir, que abasten una gran part de l’espectre electromagnètic i els
19
làsers a partir dels quals són excitats ( que han de tenir la mateixa longitud
d’ona que els nanorods) són des de làsers de llum visible a infraroja.
- Nanoshells, aquestes tenen unes aplicacions molt
limitades per a estudis en humans. La seva longitud
d’ona està situada entre els 700 nm i 900 nm
(capten una bona part de l’espectre, des de la zona
visible fins a la infraroja), per tant serien òptimes
per utilitzar-les per al diagnòstic, imatge.
- Nanocages, aquestes tenen uns porus a la superfície. Han estat
sintetitzades a partir d’una reacció entre els nanocubes
de plata i una solució d’or. Les dimensions i la duresa de
les parets de les nanocages poden ser ajustades i
controlades ajustant a la quantitat de plata que té la
solució d’or.
Les nanopartícules d’or presenten una elevada àrea superficial de manera que poden
ser fàcilment funcionalitzades o bioconjugades modificant les seves propietats
superficials. Un exemple de funcionalització és la conjugació del PEG amb les
nanopartícules (un polièter augmenta el temps en que les nanopartícules poden estar
al plasma sanguini), que pot ser utilitzat en la teràpia del càncer i aconseguir una
vectorització passiva cap a les cèl·lules tumorals. Un altre exemple és la utilització
d’anticossos específics de manera que actuïn com a biomarcadors moleculars
sobreexpresats a la superfície de cèl·lules cancerígenes
3.1.2.- BAIXA TOXICITAT I BIOCOMPATIBILITAT
És molt important disposar d’informació sobre la toxicitat de les nanopartícules, tant
quan estan de manera aïllada com quan formen part de nanoconjugats (són les
nanopartícules un cop que ja han estat funcionalitzades). En aquest cas cal entendre
molt bé els enllaços que formen les dues molècules i així es poden mitigar els efectes
tòxics.
En molts estudis de biocompatibilitat, el que s’estudia és la toxicitat de les
nanopartícules en les cèl·lules in vitro, de manera que s’ha vist que moltes
20
nanopartícules són beneficioses en quantitats baixes, però si les dosis són altes,
aquestes són tòxiques.
La seva biocompatibilitat es deu a que els seus àtoms s’enllacen fàcilment amb el sofre
i les amines, i així es poden obtenir una sèrie de ramificacions on es situarien els
fàrmacs, al voltant de la nanopartícula. Aquests fàrmacs podrien actuar a la zona
afectada mitjançant les nanopartícules d’or, que actuarien com una mena de
nanotransportadors i conduirien el fàrmac només a les cèl·lules afectades, és a dir, els
transportarien de manera selectiva i així, hi hauria un menor risc de provocar efectes
secundaris.
Els nuclis de les nanopartícules d’or són químicament no radioactius i no tòxics, però la
seva citotoxicitat està relacionada amb el tamany i forma de les nanopartícules d’or, és
a dir, la seva citotoxicitat és variable.
En molts assajos per mesurar quin impacte ha tingut un fàrmac, és a dir, per mesurar
la toxicitat, en el nostre cas, de les nanopartícules o els nanoconjugats, sobre les
cèl·lules s’utilitza el LDH, una substància que indica l’alteració o la destrucció de les
membranes cel·lulars. Un altre assaig per mesurar la citotoxicitat de les cèl·lules és el
MTT, aquesta substància és la que he utilitzat en la part pràctica per mesurar la
toxicitat de les nanopartícules sobre les cèl·lules. Aquest assaig és un assaig
colorimètric que mesura l’activitat enzimàtica dels mitocondris. Si les cèl·lules
metabolitzen adequadament el MTT, és a dir si el redueixen, el cultiu de cèl·lules
formarà uns cristallets i quan es dissolguin serà d’un color violeta, desprès es podrà
quantificar l’activitat cel·lular per mesures de la seva absorbància.
La importància de realitzar aquests assajos és que les nanopartícules d’or poden
afectar a nivell cel·lular, a molts components i processos de la cèl·lula, com per
exemple els mitocondris, les membranes cel·lulars o els nuclis de les respectives
cèl·lules, incloent danys del DNA, apoptosis...
La majoria d’assajos MTT confirmen que les nanopartícules d’or no són tòxiques. Les
nanopartícules entren a la cèl·lula per endocitosis i això no indueix cap mena de
toxicitat. Es va observar que a més de no ser tòxiques, no canviaven el fenotip de les
cèl·lules.
Tot i que els seus nuclis no són tòxics, la seva toxicitat també varia segons la càrrega
que tenen; si les mateixes nanopartícules estan carregades negativament no són
tòxiques, però en canvi, si són catiòniques sí que ho són. Això és degut, a que les
nanopartícules catiòniques poden interactuar amb la membrana cel·lular ja que
21
aquesta està carregada negativament i la poden destruir, en canvi si són aniòniques no
poden interactuar amb aquesta.
A més, la major part de nanopartícules s’acumulen al fetge, això podria donar lloc a
una toxicitat hepàtica.
3.1.3.- PROPIETATS ÒPTIQUES
Les propietats òptiques són fonamentals per a la utilització de les nanopartícules d’or.
Aquestes propietats els hi permeten, que en presència de llum, aquestes poden
absorbir l’energia llumínica i transformar-la en calor, si és estimulada per la freqüència
de llum làser correcta, de manera que les nanopartícules poden escalfar una àrea de
mil vegades més gran que el seu tamany.
Depenent de la seva mida, forma, el medi que les envolta i el tipus de freqüència de la
llum que incideix sobre aquestes, la llum indueix una oscil·lació ressonant dels
electrons conductors i lliures. Aquesta ressonància s’anomena “localized surface
plasmon resonance” (LSPR), i abasta tant a la regió visible com a la infraroja de
l’espectre, això significa que les nanopartícules d’or responen a longituds d’ones molt
diferents i això permet que els nanorods penetrin a diferents profunditats, segons es
necessita.
En particular, els rods tenen una longitud d’ona transversal d’uns 520nm, la mateixa
que la de les nanoesferes i l’altra, la longitudinal, és molt variable, la qual es controla
ajustant les dimensions dels nanorods, però més o menys es formen entre 700 i 1100
nm, ja que en una longitud d’ona més gran els nanorods comencen absorbir l’aigua.
Gràcies a aquestes propietats òptiques, es poden obtenir millors imatges per el
diagnòstic d’algunes malalties i també s’han obert expectatives en un tractament
hipertèrmic per a les cèl·lules tumorals.
3.1.4.- RESISTÈNCIA A INFECCIONS BACTERIANES
Una altra propietat que les fa aplicable en el camp tant de la cirurgia com del
diagnòstic és la resistència a infeccions bacterianes que tenen les nanopartícules d’or.
Aquesta resistència a infeccions bacterianes ha portat a utilitzar l’or en microcirurgies
de l’orella i altres cirurgies que requereixen implants però que hi ha un alt risc
22
d’infecció, com pot ser l’ull. També, gràcies a aquesta resistència hi pot haver una
millor visibilitat a les imatges dels raigs X, que millora el diagnòstic del pacient.
3.2.- PRINCIPALS APLICACIONS DE LES NANOPARTÍCULES
D’OR
Les nanopartícules d’or han anat adquirint molta importància en el camp de la biomedicina
degut les seves aplicacions que s’estan contínuament desenvolupant. Explicaré les més
prometedores des d’un punt de vista terapèutic i de la alliberació de fàrmacs.
La majoria d’aquestes aplicacions estan relacionades amb l’excel·lent biocompatibilitat de les
nanopartícules i la resistència a infeccions bacterianes.
3.2.1.- NANOPARTÍCULES PER AL DIAGNÒSTIC
Actualment, les nanopartícules d’or s’utilitzen molt a nivell de diagnòstic i detecció de
malalties gràcies a les propietats físiques i químiques que permeten que les molècules
biològiques siguin detectades fins i tot en concentracions mínimes.
Les maneres de detecció poden ser classificades segons la manera en que els senyals
han estat generats en resposta d’una especifica molècula que ha estat unida. Un altre
mètode de detecció estaria basat en les interaccions entre les nanopartícules d’or i les
molècules localitzades en la superfície propera.
FIG 6: Diferents aplicacions nanorods
23
En el diagnòstic del càncer és molt importat la propietat d’absorció de la llum. S’està
desenvolupant una tècnica en la qual s’hi acobla un anticòs que es atret per les
cèl·lules cancerígenes al final de la nanopartícula, aquestes nanopartícules amb
l’anticòs acoblat es dissoldran amb el plasma sanguini i tot seguit s’observarà al
microscopi. Com que cada tipus de càncer té unes proteïnes úniques a la superfície de
la seves cèl·lules, les nanopartícules s’orientaran diferent segons el tipus de cèl·lules
cancerígenes a les que s’han enllaçat. D’aquesta manera podríem saber fins i tot el
tipus de càncer que té el pacient a partir d’una sola prova.
3.2.2.- NANOPARTÍCULES PER A L’ALLIBERACIÓ DE FÀRMACS I
ALTRES MOLÈCULES TERAPÈUTIQUES
Les nanopartícules d’or tenen un gran potencial per ser utilitzades com a
nanotransportadors de fàrmacs i macromolècules terapèutiques. Aquestes també són
útils en la preparació de sistemes intel·ligents que s’encarreguen d’alliberar la
molècula terapèutica que havia estat encapsulada com a conseqüència de la activació
d’un estímul intern, com pot ser un canvi en el pH, o extern, a causa d’una font de llum
làser. S’utilitza tant la vectorització activa, que engloba que li acoblis al sistema
d’alliberació alguna molècula que li permeti anar i trobar la cèl·lula que tingui el
receptor d’aquella molècula, com la passiva, en la qual es modifiquen les propietats del
nanotransportador perquè la molècula que hem unit s’acumuli al teixit que nosaltres
volem.
Els sistemes per alliberar fàrmacs amb nanopartícules d’or que actuen com a
nanotransportadors van expandint-se cada dia. Les seves propietats fan que siguin un
vehicle molt prometedor ja que es pot controlar la síntesi d’aquestes, fer-les de
diverses mides i gràcies als grups tiols les nanopartícules poden ser funcionalitzades
fàcilment. La seva superfície permet que s’hi puguin acoblar agents terapèutics molt
diferents.
L’efecte fototèrmic, és a dir, el fet que puguin convertir la llum en calor, és una gran
oportunitat en el tractament del càncer així com en el desenvolupament de vehicles
d’alliberació sensibles a estímuls lluminosos externs. Quan la llum és absorbida i
convertida en calor, la molècula s’infla i això facilita l’alliberació del fàrmac.
24
3.2.2.1- TERÀPIA GÈNICA
Aquesta teràpia representa una nova estratègia pel tractament de moltes
malalties, sobretot en el tractament de la malaltia del càncer.
Les nanopartícules d’or actuen com a vehicle del material genètic que és
fonamental perquè el tractament tingui èxit, ja que a l’àcid nucleic se li ha de
proporcionar: protecció davant la degradació, afavorir la internalització a les
cèl·lules i permetre una alliberació al nucli. Per aquest motiu, les
nanopartícules d’or són una aposta interessant per a la teràpia gènica.
Aquestes milloren l’estabilitat del DNA, redueixen la toxicitat i augmenten
l’eficàcia a l’hora d’internalitzar el material genètic.
A l’hora d’unir els àcids nucleics amb la nanopartícula, aquests poden ser
fàcilment modificats amb tiols i llavors poden ser injectats a les nanopartícules
mitjançant enllaços covalents, donant lloc a nanoconjugats covalents.
La utilització de nanopartícules funcionalitzades amb el PEG són molts
comunes en l’ús de la teràpia gènica.
Les funcionalitzades amb aminoàcids també han estat utilitzades com a
vehicles d’alliberació del material genètic, aquest nanoconjugat no provoca
toxicitat.
FIG 7:Teràpia gènica utilitzant nanopartícules or
25
4.- GOLD NANORODS: PROPIETATS, SINTESI I APLICACIONS
Hi ha molts tipus de nanopartícules d’or però jo exactament he treballat amb els nanorods ja
que tenen unes propietats òptiques i electròniques que les fan molt adequades per ser
aplicades en el camp de la medicina i biomedicina.
Els mètodes de creixement dels nanorods han estat i són estudiats i millorats degut a la seva
aplicabilitat, sobretot durant les últimes dues dècades, per obtenir mètodes de síntesis de
nanopartícules amb un rendiment més alt, una mida més ajustada..., és a dir, amb un control
més ajustat dels nanorods.
En aquesta secció s’estudiaran les propietats òptiques i es veurà com s’han de sintetitzar els
nanorods per aconseguir unes propietats més adequades.
4.1.- PROPIETATS ÒPTIQUES
Les propietats òptiques d’aquestes nanopartícules estan relacionades amb la mida i la forma.
Com ja hem dit abans, aquestes propietats són sensibles a processos que es produeixen a la
superfície, com pot ser l’adsorció, la precipitació i la transferència d’electrons. A més, aquesta
sensibilitat per l’entorn fa que puguin ser utilitzades com a sensors.
Les propietats òptiques dels nanorods són atribuïdes a la interacció dels rods amb el raig de
llum incident a la seva superfície. Quan la radiació electromagnètica incideix en els àtoms d’or,
els seus electrons més externs es posen a oscil·lar amb la mateixa freqüència que la radiació de
la llum, produint una diferència de càrrega entre els electrons més externs i els que estan més
a prop del nucli. Aquest fenomen indueix una forta absorció de la llum. El fet que els nanorods
tinguin dos eixos de mides diferents donarà bandes d’absorció diferents en cada un dels eixos,
ja que la distància dels electrons lliures i els més interns és diferent en cada un dels eixos
considerats.
L’excitació de l’oscil·lació a través de l’eix llarg indueix una banda d’absorció molt més forta,
amb una longitud d’ona més llarga: la banda longitudinal. Mentre la banda transversal no és
significativa per la mida dels nanorods, la longitudinal sí que ho és i va des de la regió visible
26
fins a la infraroja, augmentant, a mesura que l’aspecte ratio va augmentant. Tal com es pot
apreciar a la figura 8 i 9.
4.1.1.- ÍNDEX DE REFRACCIÓ
L’augment de l’índex de refracció ( un paràmetre propi de cada medi que indica el
comportament de la llum al travessar-lo) de l’entorn al voltant del nanorod por induir
FIG 8: Els dos eixos que indiquen la longitud d’ona dels nanorods i la seva absorció: una al voltant del 520nm i l’altra molt més variable, entre 700 i 1200.
FIG 9: Els aspectes ratio de les diverses solucions de les seeds i nanorods estan relacionades amb el seu espectre, ja que com es pot veure a la gràfica quan l’aspecte ratio augmenta el seu pic també. Segons el seu aspecte ratio les solucions van canviant de color.
27
un augment de càrregues de polarització (càrregues que no estan lliures, aquestes
poden estar unides a una molècula o àtom) al voltant del nanorod.
La banda longitudinal del nanorod es desplaça cap a la regió infraroja amb una relació
directament proporcional a l’índex de refracció, com es pot veure en la figura 10.
L’índex de refracció indueix un desplaçament del plasmó, que seria com l’absorbància,
aquest fet ha rebut molt interès ja que això els fa idonis per construir sensors biològics
molt sensibles.
4.2.- SINTESI NANORODS
Un dels objectius de la nanociència és construir estructures petites pel disseny de materials
avançats, nanodispositius d’alt rendiment... En general, totes les nanopartícules inorgàniques
són molt atractives com a peces de construcció, i per aconseguir-les amb les característiques
desitjades, és important la manipulació de les condicions de síntesis per controlar la mida i la
forma d’aquestes.
Hi ha principalment dos mètodes de síntesi: el top-down i el bottom-up. En el top-down
s’utilitzen partícules més grans de les que necessitem i les modulem durant la síntesi per
aconseguir aquelles que nosaltres volem: les tallem, les perfilem...; en aquest mètode els
nanorods són generats a partir d’una sèrie de processos físics i de la depositació d’or. En canvi
en el mètode bottom-up s’utilitzen substàncies més petites per formar compostos moleculars
molts més complexos. S’utilitzen propietats químiques de molècules individuals per fer que els
components d’aquesta s’autoorganitzin. Concretament, durant la síntesi dels rods, el
procediment més freqüent és el seed-mediated, inclòs en el mètode bottom-up.
FIG 10: Relació desplaçament del plasmó i índex de refracció
28
4.2.1.- MÈTODE SEED MEDIATED
Des de principis del S. XX, molts investigadors utilitzen les seeds per sintetitzar
nanopartícules. El protocol que generalment es segueix està basat en la síntesi de
nanopartícules esfèriques d’or, les quals es sintetitzaran mitjançant la reducció de
l’Au3+ i que actuaran com a seeds o nucleacions dels nanorods. Aquesta reducció la pot
dur a terme l’àcid ascòrbic o l’NaBH4 amb presència d’hidroxilamina – un agent
reductor que afavoreix principalment la reducció dels ions d’Au –, en una solució
aquosa de CTAB, un detergent que determinarà la forma i la direcció en que creixeran
els nanorod. El CTAB es va començar a utilitzar per evitar l’alentiment i obstaculització
de les respostes òptiques i, a més, evitar la seva aglomeració. Aquestes seeds
s’afegeixen a solucions de creixement per poder obtenir els nanorods.
El mecanisme de la formació de nanorods en un medi aquós surfactant (són
substàncies que influeixen en la superfície de contacte entre dues fases, un d’ells és el
CTAB) no està completament provat. S’intueix que el CTAB adsorbeix l’or en forma de
bicapa, de manera que els nanorods queden en forma de cilindre, és a dir, les seeds
totes unides i al voltant, el CTAB que s’uneix a les cares del rod, tal i com es pot
observar en ambdues figures.
FIG 11: Formació del nanorod des de les seeds fins a la unió d’aquestes per a formar-lo mitjançant la bicapa de CTAB i així dirigint la direcció en que creixerà.
29
El creixement del nanorod estarà governat, generalment, per l’adsorció del CTAB, de
manera que es desenvolupen diverses cares del nanorod, de fet el nanorod només
creixerà per aquella cara en la qual el CTAB no s’ha unit. S’ha mostrat la importància
que té la cua del detergent CTAB, molt important per controlar la llargada dels
nanorods i també la seva eficàcia, com més curta és la cua més petits són els nanorods.
Malgrat aquesta importància, posteriorment, un cop la síntesi de nanorods estigui
acabada, aquest s’ha d’eliminar ja què és molt tòxic.
No totes les seeds s’uneixen per formar nanorods, algunes queden lliures en la solució,
aquestes esferes s’han d’eliminar. El mètode de separació mitjançant la centrifugació
no és efectiu si els nanorods i les esferes són de mides similars, de manera que aquesta
separació es fa molt difícil. S’ha intentat fer-ho mitjançant una cromatografia, tot i que
la separació només va ser possible parcialment.
Aquesta síntesi, posteriorment, s’ha anat millorant darrerament. Una de les millores va
consistir en afegir nitrat de plata a la solució; es va veure que augmentava
notablement el rendiment dels nanorods i també ajudava a un control més ajustat de
la seva forma. Aquesta es afegida a la solució de creixement, és a dir, un cop les seeds
ja han estat formades. La plata s’ha tornat essencial per la formació dels rods tot i que
encara hi ha discussions sobre com actua.
Un altre avenç ha estat utilitzar com a detergents una barreja d’ells: CTAB i BDAC. El
BDAC ajuda a créixer més l’aspecte ratio d’aquests, encara que afegir gradualment
l’àcid ascòrbic s’ha vist que també ajuda a augmentar-lo.
Fig 12: Formació del nanorod a partir de la bicapa que es forma de CTAB
30
4.2.2.- CONTROL DE LA FORMA I MIDA
Les formes es poden ajustar mitjançant la variació de les quantitats de reactius que hi
ha en les solucions de creixement. Per exemple si hi ha una quantitat d’àcid ascòrbic
insuficient hi haurà un excés d’ions d’or lliures en la solució, ja que és l’encarregat de
reduir l’or. Això farà que el cap dels nanorods sigui més aviat pla.
Principalment, hi ha dos mètodes per ajustar l’aspecte ratio dels nanorods d’or. Un, el
primer, és l’oxidació anisotròpica que és un procés que consisteix en controlar
l’aspecte ratio acurtant la seva allargada de manera selectiva amb calor del laser o
varis oxidants, tot i que els seus diàmetres queden intactes. Aquest escurçament
selectiu es creu que s’origina a partir d’unes molècules de CTAB de poca densitat que
hi ha als dos finals del nanorod.
El segon, és el mètode del sobrecreixement transversal, aquest ajusta els aspectes
ratios mitjançant una amplada selectiva, amb els seus diàmetres. Abans d’aquest
sobrecreixement, molècules tiol petites s’enllacen al final dels nanorods de manera
que bloquegen el creixement longitudinal. Aquest creixement es provoca abocant més
solució de creixement, de manera que els nanorods aconsegueixen un diàmetre més
llarg però la seva allargada queda intacta.
4.3.- FUNCIONALITZACIÓ
Per fer estables els nanorods sota diferents condicions i per fer-los aplicables en diversos
medis se’ls funcionalitza,és a dir, s’uneixen a diferents molècules. Existeixen diferents maneres
de funcionalitzar. La més comuna podríem dir que és l’enllaç entre l’or i una molècula tiol, tot i
que, la funcionalització pot no ser completa. La molècula tiol normalment s’uneix a les puntes
del nanorod, ja que allà la densitat de CTAB és molt més baixa. S’ha de tenir en compte que si
s’enllacen molècules petites amb un grup tiol, normalment, donarà lloc a una agregació
irreversible dels nanorods i és per això que s’utilitzen molècules grans i d’un pes molecular
també alt, com pot ser el PEG o el DNA. Les molècules tiol s’acostumen a enllaçar als dos finals
dels nanorods en concentracions baixes. Quan estan funcionalitzats amb el PEG, els nanorods
tenen una estabilitat més alta i milloren la biocompatibilitat.
Una altra alternativa és la utilització de disulfurs ja que són més fàcils de preparar i manipular i
a més, aquestes enllaços permeten que molècules més grans s’uneixin als nanords.
31
Una altra funcionalització de nanorods molt comuna es basa en el recobriment d’aquests amb
CTAB. Les molècules de CTAB formen una bicapa a la superfície de les nanorods d’or i s’ha
demostrat que els estabilitza amb aquesta bicapa de CTAB, que estructuralment és semblant a
una micel·la. Tot i que el CTAB és tòxic no es pot eliminar de la superfície ja que això podria
portar a una agregació dels nanorods. Aquests es tendeixen agregar quan la concentració de
CTAB està per sota de la concentració de micel·les que hi ha. L’estabilitat d’aquesta bicapa es
pot veure afectada o interrompuda per exemple per l’adició de substàncies orgàniques.
Una funcionalització secundària sovint es necessita per aconseguir superestructures i noves
funcionalitats. Es pot fer mitjançant interaccions electrostàtiques, interaccions entre l’antigen i
l’anticòs o partir d’una seqüència de DNA.
4.3.1.- NANORODS FUNCIONALITZATS AMB EL PEG
La funcionalització amb el PEG és una estratègia molt utilitzada. L’enllaç covalent que
es forma entre el PEG i la nanopartícula poden suprimir o si més no mitigar les
respostes immunogèniques i augmentar el temps, el qual, els nanorods poden estar al
FIG 13: Nanorods funcionalitzats A) funcionalitzats totalment B) CTAB substituït totalment C) CTAB substituït parcialment, a les puntes hi ha el PEG D) funcionalització secundària
32
plasma sanguini. Aquesta unió també pot proporcionar solubilitat als fàrmacs
hidròfobs, proteïnes i biomarcadors.
Les propietats que tenen els nanorods funcionalitzats amb el PEG, els fan idonis per
utilitzar-los en el tractament del càncer mitjançant la hipertèrmia i també per irradiar
amb un làser infraroig. Aquests nanoconjugats són molt estables i gairebé no són
citotòxics segons estudis on s’ha treballat amb cèl·lules d’hepatòcits, aquestes cèl·lules
componen el 70% o 80% de la massa total del fetge.
Un cop s’ha fet l’injecció d’aquestes nanopartícules, poden penetrar de manera eficaç
en tumors humans. S’ha trobat que en una sola injecció de nanorods funcionalitzats
amb el PEG utilitzant llum làser infraroja ja es pot iniciar la destrucció de la massa
tumoral.
El PEG s’utilitza per substituir el CTAB ja que aquest és molt citotòxic i en canvi el PEG
té un nivell citotòxic in vitro molt baix.
4.3.2.- NANORODS FUNCIONALITZATS AMB PÈPTIDS
Funcionalitzar els nanorods amb aminoàcids o pèptids és una altra de les maneres
efectives per guanyar especificitat i eficàcia als sistemes de nanopartícules basats en
l’alliberació de molècules. Per exemple les nanopartícules funcionalitzades amb
aminoàcids, com la glicina, que s’uneixen al DNA, donen lloc a una eficàcia major a
l’hora de l’alliberació de material genètic i a més, sense toxicitat.
Els nanorods funcionalitzats amb els pèptids també s’han utilitzat com a sistemes per
dirigir substàncies a les cèl·lules. Per exemple, el pèptid CALNN és funcionalitzat per les
nanopartícules per dirigir components intracel·lulars. La distribució d’aquestes
nanopartícules depèn de la seva mida ja que depenent d’aquesta podran creuar la
membrana cel·lular. Les nanopartícules de 30nm van poder creuar-la i a més
mostraven una afinitat molt alta per al DNA i RNA.
Els nanorods funcionalitzats amb els pèptids també són coneguts per activar
macròfags i també per a ser utilitzats per a l’alliberació de vacunes. Tot això és possible
per la seva habilitat d’enllaçar-se amb diferents biomolècules , de manera que no són
reconeguts pels macrofags i per tant no són eliminats.
Les nanopartícules que han estat funcionalitzades amb un pèptid inhibidor d’amiloide
(la β-amiloide, esta associada a la malaltia de l’Alzheimer, ja que forma unes plaques al
33
teixit cerebral el que es creu que causa la malaltia) s’ha trobat útil a l’hora de
subministrar el fàrmac. Aquestes nanopartícules funcionalitzades poden atacar
selectivament les fibres β-amiloide.
Les nanopartícules amb PEG que es funcionalitzen amb el pèptid compost per arg-gly-
Asp i un pèptid de senyalització de localització nuclear es dirigeixen específicament als
nuclis de les cèl·lules cancerígenes.
4.4.- APLICACIONS BIOLÒGIQUES I BIOMÈDIQUES
Per acabar amb l’estudi teòric em centraré en les principals aplicacions dels nanorods en el
camp de la biomedicina. Els nanorods d’or són un tipus de nanoestructures amb una amplia
varietat d’aplicacions biològiques i biomèdiques. Abans d’utilitzar aquestes partícules amb
finalitat terapèutica, és necessari un coneixement dels riscos que comporta la seva utilització
per la salut humana i també pel medi ambient. Per això s’han fet molts estudis in vitro sobre la
toxicitat d’aquests, amb diferents formes, mides i també diferents surfactants.
La recerca realitzada durant les dues últimes dècades ha estat sobretot sobre les propietats
òptiques i partir d’aquí el desenvolupament d’aplicacions basades en aquestes propietats,
entre elles, per exemple, la utilització de les nanopartícules per a l’imatge.
Entre les aplicacions dels nanorods en el camp de la biomedicina he escollit la seva utilització
com a sensors, per l’alliberament de fàrmacs i l’ús en el diagnòstic per imatge.
4.4.1.- NANORODS I SENSORS
Les seves propietats han augmentat l’interès en l’aplicació de nanopartícules com a
materials de reconeixement, utilitzant-les per construir biosensors òptics. La relació
entre la mida, forma i els seu entorn, dóna lloc a canvis en la dielèctrica, és a dir, canvis
en la conducció d’electricitat, i també canvis en l’espai que hi ha entre partícules.
Aquests canvis els fan adequats per a ser utilitzats com a sensors.
Els sensors són uns materials que donen respostes davant d’un canvi químic o físic en
el seu entorn. Els que s’utilitzen en biologia s’anomenen biosensors ja que s’utilitzen
per reconèixer elements biològics. Hi ha diversos tipus de biosensors i utilitzem uns o
uns altres segons el tipus de canvi que es vulgui reconèixer. Canvis en l’absorbància
34
òptica dels nanorods poden fer que aquests siguin utilitzats com a marcadors, per
exemple, per l’orientació dels nanorods.
Principalment els biosensors basats en nanopartícules d’or són funcionalitzats amb una
molècula tiol que en identificar la molècula complementària causa canvis en les
propietats òptiques de les nanopartícules. La seva dispersió de la llum es pot utilitzar
per dissenyar sistemes amb baixos límits de detecció. La espectroscòpia ressonant
superfícial Raman (SERS) d’un sol o més nanorods pot ser utilitzada per detectar així
com també per examinar estructures de la substància, la qual, s’ha d’analitzar.
La funcionalització dels nanorods també ha portat avantatges en aquest camp, ja que
la seva conjugació amb àcids nucleics ha portat a dissenyar sondes per a una
identificació ràpida de diversos patògens.
Els nanorods també s’han incorporat al diagnòstic molecular, un exemple és la
detecció de IgG (immonuglobulina G, una de les cinc classes d’anticossos humorals
produïts per l’organisme, és molt comuna en fluids interns del cos com és la sang o el
líquid cefaloraquidi ). Els nanorods van ser conjugats amb una proteïna que s’unia a
aquesta immunoglobulina. Es podia veure ja que després de la incubació amb aquests
nanorods, hi havia una taca entre blava i grisa on eren localitzades.
4.4.2.- ALLIBERACIÓ DEL MATERIAL GENÈTIC I FÀRMACS
A causa del risc d’utilitzar un virus com a transportador per a respostes
immunològiques i també per la seva toxicitat es van començar a utilitzar vectors no
vírics per a la alliberació de material genètic i fàrmacs. Els nanorods han adquirit
interès a per a ser utilitzats com a nanotransportadors en les últimes dècades.
La utilització de nanorods com a vehicles d’alliberació és gràcies a la seva mida petita i
la seva facilitat de funcionalització. L’alliberament d’aquest fàrmac mitjançant la
irradiació d’un làser infraroig és bastant atractiu ja que en aquestes longituds d’ona,
entre 800 i 1200nm, el teixit és transparent a la llum. A més en aquesta regió de
l’espectre electromagnètic és fàcil que aquests siguin absorbits.
L’estratègia actual per la utilització d’aquests com a nanotransportadors és aprofitar el
canvi de forma dels nanorods quan estan exposats al raig infraroig i el material genètic
s’allibera ja que hi ha una reorganització d’àtoms. Després de la irradiació els nanorods
canvien a forma esfèrica.
35
La irradiació làser sempre ha de ser amb la freqüència adequada perquè es
desencadenin els efectes fototèrmics, ja que els electrons d’aquests s’escalfen i deixen
anar el DNA.
4.4.3.- IMATGE La mida, la forma, la composició i la seva estructura dels nanorods fan que sigui
possible una àmplia gamma de nanoplataformes que actuen com agents de contrast
d’imatge. L’eficiència dels nanorods com agents de contrast en la imatge és deguda al
procés únic d’interacció entre la partícula i la llum, l’excitació de SPR mitjançant la
llum. Com altres nanopartícules d’or, tenen un avantatge de la dispersió de la llum que
està a la regió infraroja, ja que el seu “SPR”,surface plasmon ressonance (explicat en
les propietats òptiques de les nanopartícules), està localitzat en aquesta regió.
La capacitat de la dispersió de llum és una de les propietats que les fa més idònies per
ser agents en la imatge, tot i així hi ha almenys tres propietats o mèrits pels quals
s’utilitzen els nanorods. Primer la capacitat d’ajustar les longituds d’ones dels
nanorods que les fa factibles per la imatge amb diferents excitacions per cada una de
les seves longitud. Una altra propietat, és que els nanorods no sofreixen
photobleaching - és a dir, es produeix la destrucció fotoquímica del fluorocrom, el
component que fa que la molècula sigui fluorescent – sota les mateixes condicions que
altres nanocristalls i per això són més estables per ser utilitzats en la imatge. L’última
propietat, de la qual ja n’he parlat abans, és la fàcil funcionalització a la superfície dels
nanorods que fa que pugui haver-hi grups que es dirigeixin al lloc d’on volem la imatge.
L’anisotropia dels nanorods permet fer un seguiment dels moviments de les
substàncies del medi cel·lular.
FIG 14: Alliberació del DNA i canvi en la forma dels nanorods
36
S’ha demostrat que els nanorods es poden utilitzar pel diagnòstic del càncer utilitzant
anti-EGFR anticossos, ja que aquest s’uneix amb molta facilitat a les cèl·lules
cancerígenes, en aquestes hi sol haver una sobreexpressió del EGFR (receptor del
factor de creixement epidèrmic). Les mutacions que duen a terme a una
sobreexpressió d’aquesta proteïna està associada a un gran nombre de càncers.
Aquestes mutacions podrien donar lloc a una activació constant del EGFR, així
provocant una divisió cel·lular descontrolada.).
4.4.4.- TERÀPIA I DIAGNÒSTIC DE LA MALALTIA DEL CÀNCER AMB
NANORODS
Conèixer la malaltia és de vital importància per entendre la utilització dels nanorods
com a eines per al tractament i diagnòstic d’aquesta.
Actualment, els tractaments de quimioteràpia tradicionals que s’utilitzen en el
tractament del càncer tenen greus limitacions a causa de la especificitat, la qual és
bastant reduïda, dels agents quimioterapèutics que es dirigeixen a les cèl·lules
cancerígenes. De tal manera, l’objectiu prioritari és la identificació d’un sistema
nanotransportador que permeti dirigir el fàrmac d’una manera selectiva i alliberar de
manera eficaç la dosi adequada del fàrmac a les cèl·lules cancerígenes i així poder
reduir i millorar l’eficàcia del fàrmac.
Utilitzar un tractament basat en nanorods, i en general també nanopartícules d’or,
presenta diversos avantatges en el tractament d’aquesta malaltia i aquest es pot fer
principalment mitjançant dos mecanismes:
- Mecanisme hipertèrmic
- Alliberació d’un fàrmac associat a la nanopartícula a causa de la incidència de
llum làser.
Tot i que el tractament de la malaltia està molt més endarrerit que el seu diagnòstic,
crec que és important esmentar-lo ja que un diagnòstic prematur de la malaltia del
càncer augmenta la probabilitat de curació, és a dir, un diagnòstic precoç pot ser la
diferència entre la vida i la mort. S’ha vist que el diagnòstic amb nanorods és molt
efectiu ja que fa fàcil la distinció entre les cèl·lules sanes i les cancerígenes.
37
4.4.4.1.- TERÀPIA FOTOTÈRMICA
La teràpia fototèrmica a partir dels nanorods d’or és un nou tractament
mínimament invasiu per al tractament del càncer. Per utilitzar aquesta teràpia
és molt important entendre bé l’efecte tèrmic.
Canviant l’energia del làser es poden aconseguir diferents nivells segons els
efectes tèrmics en els diversos teixits, des de la hipertèrmia, entre 43 i 50ºC, a
la desnaturalització de les proteïnes i el col·lagen, entre 55 i 75ºC, fins a
l’evaporació i carbonització, quan les temperatures són iguals o majors de
100ºC.
En el cas concret de la hipertèrmia, les freqüències infraroges del làser poden
penetrar als teixits amb una intensitat suficient per induir un tractament
localitzat. Així doncs, els nanorods transformen l’energia llumínica en
calorífica, i també són capaços de distingir entre les cèl·lules sanes de les
cancerígenes.
4.4.4.2.- DIAGNÒSTIC DEL CÀNCER I ELS TELÒMERS
Els nanorods també poden ser aplicats en la detecció d’aminoàcids i de la
seqüència de DNA. Així doncs aquests poden ser aplicats per detectar canvis de
conformació en el DNA, ja que els nanorods tenen una càrrega positiva i l’ADN
telomèric té una càrrega negativa, i formen interaccions electrostàtiques.
38
IV) FONAMENTS PRÀCTICS
39
AVALUACIÓ DELS NANORODS COM A EINES PER AL TRACTAMENT DEL CÀNCER
OBJECTIU: L’objectiu de la pràctica que s’ha realitzat ha estat analitzar els nanorods com a possibles eines
per al tractament del càncer.
Aquest objectiu es pot subdividir en tres apartats:
- Aprendre a sintetitzar nanorods per quatre vies diferents.
- Funcionalitzar els nanorods, donant-los hi unes característiques i funcions més
específiques.
- Avaluar la toxicitat dels nanorods prèviament funcionalitzats, mitjançant un assaig
MTT.
MATERIAL: Instruments:
- eppendorfs, pipetes, tubs de plàstic 50mL (fàlcon), cubetes de plàstic per mesurar
l’absorbància, reixetes de coure per al microscopi electronic, pinces, plaques de petri, placa
per posar les cèl·lules.
Aparells:
- Espectofotòmetre, vòrtex, agitador, centrifugadora, TEM (microscopi de transmissió
d’electrons), suport per a la sintesi de pèptids (porquet), HPLC (Cromatografia líquida d’alta
resolució), incubadora.
Substàncies per:
- a la síntesi de nanorods: sal d’or (HAuCl4), nitrat de plata, àcid ascòrbic, àcid clorhídric,
hidroquinona, surfactants utilitzats; CTAB (Cetrimonium bromide) i BDAC
(benzyldimethylammoniumchloride hydrate), hidròxid de sodi i borohidrur de sodi.
- a la síntesi de pèptids: 2-Clortritil (resina per a la síntesi peptídica), Fmoc-Glicina-OH, DCM,
DMF ( que s’utilitzen per augmentar el volum de la resina i deshidratar-la) , DIEA ( una base
que s’utilitza per acoblar el pèptid a la resina).
- a la funcionalització: PEG (C2nH4n+2On+1) i el pèptid penetratina.
40
- a l’assaig MTT: doxorribucina, tritó, el pèptid penetratina, medi de les cèl·lules, CTAB.
PROCEDIMENT:
1.- SINTESI I ESTUDI NANORODS:
1.1-SINTESI DE NANORODS
En aquesta part es sintetitzaran 4 tipus de nanorods, els quals tenen: mides diferents, per tant
absorbiran a una longitud d’ona diferent; variant els seus reactius de partida. Els nanorods es
sintetitzen en dos passos, primer es sintetitzen les seeds (nanoeferes, a partir de les quals es
formaran els nanorods), i després aquestes s’aboquen en quatres solucions de creixement on
els reactius utilitzats són diferents o estan en una diferent proporció.
1.1.1- Calcular les masses i els volums per obtenir les concentracions desitjades dels diversos
reactius per a la síntesi de nanorods, tenint en compte la situació dels reactius dels quals
disposem.
1.- 25ml dissolució de HAuCl4 1mM a partir d’una dissolució de Au 0.0294M.
25𝑚𝐿 ×0.001𝑚𝑜𝑙1000 𝑚𝐿
×1000𝑚𝐿
0.0294𝑚𝑜𝑙= 0.85𝑚𝐿 𝐴𝑢
2.- 10ml dissolució de AgNO3 10mM.
10𝑚𝐿 ×0.01𝑚𝑜𝑙1000𝑚𝐿
×169,8𝑔𝑟
1𝑚𝑜𝑙= 17 × 10−3𝑔𝑟 𝐴𝑔𝑁𝑂3
3.- 10ml dissolució Àcid Ascòrbic 100mM.
1𝑚𝑙 ×0.1𝑚𝑜𝑙
1000𝑚𝐿×
176.12𝑔𝑟1𝑚𝑜𝑙
= 0.0176𝑔𝑟 à𝑐𝑖𝑑 𝑎𝑠𝑐ò𝑟𝑏𝑖𝑐
4.- 10ml dissolució HCl(aq) 100mM a partir d’una dissolució HCl(aq) conc. (aprox 12M).
10𝑚𝐿 ×0.1𝑚𝑜𝑙
1000𝑚𝐿×
1000𝑚𝐿12 𝑚𝑜𝑙
= 0.083𝑚𝐿 HCl(aq)
5.- 20ml dissol. CTAB 200mM.
41
20𝑚𝐿 ×0.2𝑚𝑜𝑙
1000𝑚𝐿×
364.48𝑔𝑟1 𝑚𝑜𝑙
= 1,46𝑔𝑟 𝐶𝑇𝐴𝐵
6.- 5 ml dissol Hidroquinona 100mM.
5𝑚𝐿 ×0.1𝑚𝑜𝑙
1000𝑚𝐿×
110.13𝑔𝑟1𝑚𝑜𝑙
= 0.055𝑔𝑟 ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑞𝑢𝑖𝑛𝑜𝑛𝑎
7.- 1ml dissol NaBH4 500mM.
1𝑚𝐿 ×0.5𝑚𝑜𝑙
1000𝑚𝐿×
37.83𝑔𝑟1𝑚𝑜𝑙
= 0.0168𝑔𝑟𝑁𝑎𝐵𝐻4
8.- 1 ml dissol NaOH 10mM/ NaBH4 10mM a partir de dissolucions NaOH 100mM i NaBH4 500mM.
1𝑚𝐿 𝑁𝑎𝑂𝐻 ×0.01𝑚𝑜𝑙1000𝑚𝐿
×1000𝑚𝐿0.1 𝑚𝑜𝑙
= 0.1𝑚𝐿 𝑁𝑎𝑂𝐻
1𝑚𝐿 𝑁𝑎𝐵𝐻4 ×0.01𝑚𝑜𝑙1000𝑚𝐿
× 1000𝑚𝐿0.5𝑚𝑜𝑙
= 0.02𝑚𝐿 𝑁𝑎𝐵𝐻4
1.1.2.- Pesar les masses o mesurar els volums dels reactius (les seves masses o volums són les
que acabem de calcular) i preparar les solucions utilitzant com a dissolvent per a tots els
reactius aigua mili Q (és una aigua que ha estat destil·lada dues vegades). Les solucions dels
reactius, les quals tinguin més d’1mL de solució es posen en tubs falcon i les altres en
eppendorfs per qüestions d’espai. Factors a tenir en compte a l’hora de fer les solucions:
- Si el CTAB està en estat sòlid, és una bona opció
posar-lo al bany maria perquè es dissolgui millor
amb aigua.
- L’últim a preparar ha de ser la dissolució amb
NaBH4/NaOH, ja que si està en aigua durant una
estona massa llarga, l’NaBH4 despren H2 al estar en
contacte amb l’aigua, perdent així les seves
propietats com a reductor.
1.1.3 - Sintetitzar les seeds, les nanoesferes, a partir de les quals es formaran els nanorods.
FIG 15: Eppendorfs i fàlcons
42
- S’han de dissoldre 2.5ml de la solució d’or i també 2.5 ml de la de CTAB ( un
detergent que s’utilitza perquè no es formin ni aglomeracions ni agregacions) i 460µL
de la solució de NaOH/NaBH4 (actua com a reductor de l’or).
- Agitar durant 30’.
1.1.4.- Preparació de les solucions de creixement dels nanorods, les quals hi ha diferents
reactius de manera que la seva mida, rendiment i longitud d’ona variarà.
- Solució 1: Aquesta solució de creixement estarà composta per: 75 µl de dissolució de
AgNO3, 5ml de dissolució de CTAB, 5ml de dissolució de Au, 55 µl de dissolució d’àcid
Ascòrbic i 250 µl de dissolució d’HCl. Un cop aquesta solució estigui preparada s’agita i
s’afegeixen 12 µL de seeds que s’han preparat anteriorment.
- Solució 2: Aquesta segona estarà composta per: 55 µl de dissolució de AgNO3, 5ml de
dissolució de CTAB, 5ml de dissolució de Au, 55 µl de dissolució d’àcid Ascòrbic i 250 µl
de dissolució d’HCl. Un cop aquesta solució estigui preparada s’agita i s’afegeixen
també, 12 µL de seeds.
- Solució 3: Aquesta tercera, els canvis que hi ha entre els reactius respecte les altres
solucions ressalten més: 80 µl dissolució de AgNO3, 5.135 ml de dissolució CTAB/BDAC
(100mg/297mg de surfactant, respectivament), 5ml de dissolució Au, 55 µl dissolució
Àcid Ascòrbic i 200 µl dissolució HCl. Un cop aquesta solució està preparada, s’agita i
també s’afegeixen 12 µL de seeds.
- Solució 4: En aquesta última, la composició de la solució de creixement és: 700 µl
dissolució de AgNO3, 4.3 ml de dissolució de CTAB (364mg) en aigua mili Q, 5ml dissol.
Au 1mM i 500 µl dissolució Hidroquinona 100mM. Un cop la mescla estigui preparada,
s’agita i es s’afegeixen 160µL de les seeds.
Fig 16: Solució Seeds
Fig 17: Balança on es van pesar els reactius
43
Hi haurà certes diferències entre les diferents solucions de nanorods. Les principals
diferències entre aquestes, seran segons els reactius que hi haguem abocat:
- Com més nitrat de plata hi hagi, els nanorods creixeran més.
- Una mescla de surfactants incitarà a que els nanorods tinguin una major
longitud, el que indica que absorbiran la llum a longituds d’ona superiors
(sobre els 900-1000nm).
- L’addició d’HCl(aq), acidifica el medi i s’ha comprovat que acidificant el medi el
rendiment dels nanorods és més alt.
- Utilitzar hidroquinona enlloc d’àcid ascòrbic, augmenta el rendiment dels
nanorods al voltant d’un 90% respecte altres subproductes i també obtenim
rods que absorbeixen a longituds d’ona al voltant dels 1000nm.
1.1.5.- Deixar reposar les solucions dels nanorods durant tota la nit a una temperatura d’uns
35ºC.
1.2.- MESURAR ELS ESPECTRES DELS NANORODS
Aquest procediment servirà per conèixer els espectres dels nanorods, és a dir, mesurarem les
seves absorbàncies, per tal de tenir una idea més afinada sobre les diferències entre els
diferents nanorods prèviament sintetitzats.
1.2.1.- S’agafen les quatre solucions, i es reparteix el contingut de cada una entre 6 eppendorfs
d’1.7mL.
FIG 18: Solucions dels nanords
44
1.2.2.- Es centrifuga i s’aspira el sobrenadant ( en el nostre cas és el surfactant de manera que
seran menys tòxiques).
1.2.3.- Separem 1 mL de cada tipus de nanorods, el qual, cada un es posarà en una cubeta
poder mesurar els seus espectres a l’espectrofotòmetre (S’ha de tenir en compte de no posar-
la malament, la llum de l’espectrofotòmetre a de travessar la part llisa de la cubeta ja que si ho
fa per l’altra els resultats no seran els reals!).
1.2.4.- Es mesuren les absorbàncies en el rang de l’espectre que va des de 400nm fins a
1100nm i s’obtenen les seves gràfiques (s’utilitza el CTAB com a blanc).
1.3.-PREPARACIÓ DE LES REIXETES I IMATGES D’AQUESTS AL TEM
En aquesta última part del procediment del primer objectiu, es miraran els nanorods al TEM
(microscopi de transmissió d’electrons). Per visualitzar-los, es col·loquen les mostres sobre les
reixetes, uns materials de forma rodona, com es pot veure en les FIG 21 i 22.
1.3.1.- Preparació de les reixetes per poder-les veure en el TEM.
- Aspiració d’una gota de 15µL de cada tipus de nanorod amb la pipeta i es col·loquen
sobre parafilm.
- Col·locació de la reixeta sobre la gota per la cara menys brillant i es deixa reposar la
reixeta durant un minut sobre la gota perquè la solució s’impregni.
- Es treu la reixeta i s’asseca una mica, simplement, tocant un paper.
FIG 19: Aspiració del sobrenedant FIG 20: Espectofotòmetre
45
- Es gira la reixeta i es col·loca en una placa de petri (s’ha de fer amb les 4 solucions).
- Deixar-les assecar tota la nit.
1.3.2.- Observació al TEM, un cop les mostres han estat assecades. El microscopi funciona
mitjançant un feix d’electrons i quan es troba amb algun tipus d’objecte, aquest feix rebota i
forma una imatge a partir de l’ombra que fan els electrons quan aquests reboten. Perquè
aquest feix d’electrons passi amb més facilitat es fa el buit. Just al costat trobem una columna
de nitrogen líquid, la funció de la qual, és mantenir la temperatura estable de manera que no
s’escalfi, actua com una mena de ventilador. La mostra es pot observar tant per la pantalla de
l’ordinador com per la de la lupa.
FIG 21: Reixetes FIG 22: Col·locació de les reixetes sobre les solucions
FIG 23: Instrument on es posa la reixeta, exactament a la punta.
FIG 24: TEM (Microscopi de transmissió d’electrons)
46
2.- FUNCIONALITZACIÓ DE NANORODS
2.1.- SINTESI MANUAL DE PÈPTIDS
Abans de la funcionalització dels nanorods, és a dir, abans d’unir-los a altres molècules,
dedicaré un apartat a la síntesi d’una d’aquestes molècules, els pèptids. Aquests s’utilitzen per
donar-los hi una funció més específica i ajudar a internalitzar els nanorods a les cèl·lules.
Explicaré com es sintetitza un pèptid al laboratori, tot i que no l’acabaré de sintetitzar ja que el
procés és molt llarg i rutinari i per això en l’apartat de funcionalització s’utilitzarà un altre
pèptid.
2.1.1.- Acoblar un aminoàcid a la resina ( Aquesta té grups exteriors NH2, de manera que el
grup carboxil, que està lliure en tots els aminoàcids, s’enllaçarà amb la resina formant l’enllaç
peptídic. L’altre grup de l’aminoàcid l’NH2, està protegit pel Fmoc, de manera que no es pot
formar cap enllaç amb aquest extrem). A l’hora de sintetitzar els pèptids sempre es comença
per l’últim aminoàcid d’aquest.
- Abans d’acoblar l’aminoàcid:
- S’afegeix 0.05gr de resina en una xeringa de 5ml amb un filtre que es situa a
dintre del porquet, que serveix per a sintetitzar pèptids (el porquet serveix
com a suport i recollirà el filtrat que no ens interessa).
- Afegir DCM a la resina perquè augmenti de volum i DMF perquè ajudi en la
neteja.
FIG 25: Enllaç entre la resina i l’aminoàcid
47
- Es posa l’aminoàcid glicina en un eppendorf un cop havent calculat el volum
que es necessita. Posarem tres equivalents en excés d’aminoàcid, és a dir, tres
vegades el que seria necessari perquè tota la superfície de la resina estigui
plena, ja que no tot l’aminoàcid s’acoblarà. Primer es calcula la quantitat
d’aminoàcid que es necessita sense excessos i després s’afegeixen, els que tu
creguis necessaris (normalment més de 2).
0.05𝑔𝑟 ×1.6𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑝𝑒𝑟𝑓í𝑐𝑖𝑒
1 𝑔𝑟.𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛𝑎= 0.08𝑚𝑚𝑜𝑙
0.08𝑚𝑚𝑜𝑙 ×297.3 𝑔𝑟
1 𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎 + 𝑓𝑚𝑜𝑐× 3 𝑒𝑥𝑐𝑒𝑠𝑠𝑜𝑠 = 71.3 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎
- Es dissol l’aminoàcid amb DMF, ja que l’aminoàcid no és soluble en aigua, i
acoblem la base, DEIA, a l’aminoàcid. El DIEA (s’utilitza per poder acoblar
l’aminoàcid a la resina). Utilitzarem 10 equivalents per al DIEA.
0.08𝑚𝑚𝑜𝑙 ×129.25 𝑔𝑟
1000𝑚𝑚𝑜𝑙×
1𝑚𝐿0.742𝑔𝑟
× 10 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑠 = 0.14𝑚𝐿 = 140µ𝐿
- Afegir la solució amb l’aminoàcid a la resina. S’agita i s’espera uns 30’( tot i que
normalment és una hora), perquè l’aminoàcid tingui temps d’acoblar-se a la resina.
2.1.2.- Es renta la solució ( ho vam fer 3 vegades amb DMF i 2 amb DCM).
2.1.3.- S’afegeix piperidine al 20% en DMF (trenca els enllaços entre l’aminoàcid i el protector,
el Fmoc, és a dir, desprotegim l’aminoàcid )a la solució. Quan han passat els 5min. es deixa
FIG 27: Porquet
FIG 26: DCM I DMF
48
caure el líquid de manera que també cau l’Fmoc i al tub només es queda la resina i l’aminoàcid.
Es repeteix el procés per assegurar-nos que l’aminoàcid a quedat desprotegit.
2.1.4.- Calcular la concentració d’aminoàcid que s’ha acoblat a la resina per saber el nombre
d’equivalent que haurem de posar a partir d’aquest punt.
- De la solució que havíem retirat(composta per l’Fmoc i DMF), 25mL s’utilitzaran per
calcular la concentració de l’Fmoc, que serà la mateixa que la de l’aminoàcid que s’han
acoblat a la resina, de manera que es podrà saber quina és la concentració
d’aminoàcid acoblat. Cal tenir en compte que la resina no ha d’estar tota plena ja que
se’ls hi ha de deixar lloc als aminoàcids per créixer.
- Càlcul absorbància: una cubeta amb la solució, és a dir, DMF i Fmoc, i en
l’altra només DMF què s’utilitzarà com a blanc. Resultat: absorbància 0.98 i
una longitud d’ona de 290nm. (la solució del DMF i l’Fmoc s’ha diluït 10 cops
perquè la solució estava massa concentrada i saturava l’espectrofotòmetre).
- Càlcul de la concentració:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó =𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏à𝑛𝑐𝑖𝑎 × 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó
𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡 𝑑′𝑒𝑥𝑡.𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟 × 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛𝑎 × 𝑙𝑜𝑛𝑔. 𝑐𝑢𝑏𝑒𝑡𝑎
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó =0.98 × 0.250𝐿
5800 × 0.05𝑔𝑟 × 1𝑐𝑚= 0.00084𝑚𝑜𝑙/𝑔𝑟 =
= 0.84𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝑟
- La concentració d’aminoàcid acoblada a la resina és de 0.84 mmol/gr, és a dir, la
meitat de la resina.
2.2.-AÏLLAR EL PÈPTID DE LA RESTA DE SOLUCIÓ
En aquest apartat s’explicarà com es trenquen els enllaços entre la resina i l’aminoàcid i com
aquest es separa de la resta de la solució. També s’explicarà el test de nihidrina, que s’utilitza
per saber si l’aminoàcid que has posat s’ha acoblat o no.
49
2.2.1- Abans de començar la preparació del cleavage, és a dir, abans de trencar els enllaços
entre el l’aminoàcid unit a la resina i aquest, separarem una mica de resina per poder fer el
test de Nihidrina.
2.2.2.- Test de Nihidrina. Aquest test localitza les amines lliures, si n’hi ha més d’un 5% la
solució es torna de color blau. Evidentment, al només tenir un aminoàcid, el qual el grup
amino està desprotegit, la solució serà de color blau. En el cas que haguéssim acoblat un segon
aminoàcid si la solució surt de color blau, aquest segon s’ha de reacoblar.
2.2.3- Clivatge del pèptid:
- Preparació de l’àcid TFA (àcid trifloruracètic) per trencar els enllaços, aquest estarà
diluït al 2% amb DCM(s’utilitza quan resina es 2-clortritil).
-S’afegeix la solució de TFA a la solució. La solució es va tornant d’un color més
vermellós i deixem que, després d’agitar-ho durant 30s., passi a través de la columna i
recollim el pèptid. Aquest procés es repeteix 5 cops.
- S’obté la solució amb el pèptid, aquest cas l’aminoàcid, sense la resina.
- A continuació, s’evapora el dissolvent amb un flux de N2 durant uns 5 min. de manera
que només quedi l’aminoàcid al falcon.
- Un cop evaporat, el pèptid es dissol en 2mL d’H2O i s’agita la solució. Tot seguit
s’afegeix l’acetonitril per dissoldre bé l’aminoàcid (en el cas de que el pèptid no es
dissolgui bé amb aigua).
2.2.4.- Passar el pèptid per la columna d’HPLC. L’aparell separarà les substàncies de la mostra
segons la seva polaritat. Per separar les substàncies segons la seva polaritat, s’utilitzaran dos
gradients l’aigua i l’acetonitril. El que normalment es fa és començar des d’un 0% d’acetonitril
fins a un 100%. Un cop tenim el cromatograma, si hi ha dos pics que estan molt junts o alguna
part de la gràfica que no la veiem clara, el que fem és ajustar més el gradient, de manera que
tenim una informació sobre les substàncies més exactes. Un cop tinguéssim clar quin és el pic
que ens interessa el separaríem de la resta de la solució ,i ja tindríem el nostre pèptid pur:
- S’ha de filtrar per eliminar les possibles impureses que hi puguin haver a la solució de
manera que només quedi l’aigua, l’acetonitril i el pèptid. S’agafa una mica de la mostra
i es fa passar a través de la columna.
2.2.5.- Un cop s’ha identificat el pic que es el pèptid ja és pot separar de la resta de solució.
50
2.3.-FUNCIONALITZACIÓ NANORODS:
En aquests apartat unirem els nanorods a dos tipus de molècules diferents: el PEG i a un
pèptid, per poder assajar-los posteriorment.
2.3.1.- Es centrifuguen els nanorods a 8600 rpm. durant 15min. per intentar eliminar el CTAB i
disminuir la seva toxicitat.
2.3.2.- S’elimina el sobrenandant i posem els nanorods en un vial utilitzant com a dissolvent
l’aigua (8mL).
2.3.3.- A continuació es funcionalitzaran amb un pèptid ja sintetitzat i també amb el PEG
cadascuna de les solucions.
- Funcionalització amb el PEG, el qual s’utilitza per augmentar el temps que els
nanorods poden estar al corrent sanguini i per desplaçar el CTAB mitjançant enllaços
covalents ja que tenen un grup tiol. Aquest el funcionalitzarem amb els quatre tipus de
nanorods. En cada eppendorf hi haurà 50µL de PEG i 1mL de solució.
- Funcionalització amb el pèptid: el pèptid que s’utilitzarà serà la penetratina que té un
aminoàcid, la cisteïna, que s’enllaça a l’or mitjançant el grup tiol i el CTAB es desplaçat.
També s’utilitza per a la internalització dels nanorods dins les cèl·lules ja que se li ha
afegit un fluoròfor, una molècula fluorescent que permet detectar el pèptid i poder
veure si els nanorods han estat internalitzats. El pèptid també s’utilitzarà per
FIG 28: Columna HPLC FIG 29: Test nihidrina
51
funcionalitzar les quatre solucions de nanorods. En cada eppendorf hi haurà 20 µL i
també, 1mL de solució.
- Funcionalització pèptid + PEG: Vam provar de funcionalitzar els nanorods ambdues
molècules, únicament els de la solució 3. En l’eppendorf hi haurà 50 µL de PEG i 20 µL
de pèptid i 1mL de la solució de nanorods.
2.3.4- Es deixen agitant tota la nit perquè no es produeixi una agregació de nanorods ja que
hem tret bona part del CTAB del medi.
2.3.5.- Estudiar els espectres dels nanorods funcionalitzats per saber si aquesta els ha afectat.
3.- ASSAIG MTT (ASSAIG DE TOXICITAT)
3.1.- SEMBRAR LES CÈL·LULES
En aquest apartat es sembraran les cèl·lules que necessitem per a l’assaig MTT. Les cèl·lules
estan en un medi amb glucosa (nutrients), antibiòtics i suero. Utilitzarem cèl·lules HeLa, la
primera línia immortal de cèl·lules de càncer d’ovari.
3.1.1.- Contar les cèl·lules:
- Dipositem 20µL de solució amb cèl·lules sobre un hemocitòmetre (una mena de placa
que esta dividida en quatre parts), comptem quantes cèl·lules tenim a cada zona i es fa
la mitja. Després multipliquem x10000 i tenim el nombre de cèl·lules/mL.
FIG 30: Nanorods agitant-se. FIG 31: Centrifugació dels nanorods.
52
3.1.2- Calcular els mL de cèl·lules i medi que necessitem tenint en compte que volem 5000
cèl·lules a cada pouet. Hi ha 425000 cèl·lules/mL i volem 5000 cèl·lules/pouet i hi ha 60 pouets
de 180µL per tan necessitem 0.67mL de solució de cèl·lules i 10,13mL de medi.
60 𝑝𝑜𝑢𝑒𝑡𝑠 ×5000 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠
1 𝑝𝑜𝑢𝑒𝑡×
1𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó425000𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠
= 0.67𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó 𝑑𝑒 𝑐è𝑙 · 𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠
180µ𝐿 × 60 𝑝𝑜𝑢𝑒𝑡𝑠 = 10800µ𝐿 𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó 𝑑𝑒 𝑐è𝑙 · 𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠 + 𝑚𝑒𝑑𝑖)
10.8𝑚𝐿 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 0.67𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó 𝑐è𝑙 · 𝑙𝑢𝑙𝑒𝑠 = 10.13𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖
La solució es posarà en tots els pouets excepte als del voltant que només es posa medi perquè
les cèl·lules no es vegin afectades per les condicions del seu voltant. Els pouets dels extrems
poden veure’s afectats i evaporar-se una mica de medi, per tant no els utilitzarem.
3.1.3.- Deixar-les tota la nit a la incubadora 37ºC i 5% CO2.
3.2.- INTRODUCCIÓ DELS NANORODS A LES CÈL·LULES SEMBRADES
3.2.1- Centrifuguem els nanorods durant 10min. a 10000 rpm. i també els que estan
funcionalitzats i aspiració del sobrenadant.
FIG 32: Sembrar les cèl·lules als diferents pouets.
53
3.2.2.- Afegim el medi de les cèl·lules en tots els eppendorfs (540µL, ja que els pouets són de
180µL i en volem fer triplicats).
3.2.2- Centrifuguem els nanorods per segona vegada (per intentar canviar el màxim possible el
dissolvent per medi) i per primera vegada una solució de nanorods amb CTAB (aquets aniran
directament amb CTAB), la solució és la 1.
3.2.3.- Aspirem el medi i hi afegim un altre cop el medi de les cèl·lules (560µL a cada
eppendorf).
3.2.4.- Preparem d’una dissolució de doxorrubicina i una altra amb el pèptid ja utilitzat per a la
funcionalització.
- Dissolució de 60µL de doxorrubicina (un fàrmac molt potent contra el càncer) i 500µL
de medi cel·lular (sonicar la solució de doxorubicina per tal de que es dissolgui millor).
- Dissolució aquosa de 60µL del pèptid i 500µL de medi.
3.2.5.- Traiem les cèl·lules de la incubadora i aspirar el medi de 42 pouets, els que
necessitarem per posar els nanorods i les altres substàncies que volem assajar.
3.2.6.- Marquem a la placa la posició que ocuparà cada substància, fent triplicats de cada
solució: es van marcar 3 pouets per a cada solució de nanorods, per les solucions amb el PEG
funcionalitzat i també per a cada solució amb el pèptid sintetitzat, tres més pels nanorods
sintetitzats amb el pèptid i el PEG i per la solució de doxorrubicina, i també tres, pels nanorods
amb CTAB, i finalment tres més amb una solució només amb el pèptid, a part dels controls
positius i negatius. En el control positiu totes les cèl·lules han de romandre vives, per tant
només posarem medi i en el negatiu totes mortes de manera que vam posar tritó.
3.2.7- Posarem 180µL de la solució adequada en cada un dels 42 pouets que necessitem.
Fig 33: Senyalització d’on aniran les solucions Fig 34: Aspiració del medi de les cèl·lules
54
3.2.8- Deixarem la placa durant 24 hores a la incubadora.
3.3.- ASSAIG MTT
3.3.1- Treure les cèl·lules de la incubadora, que han estat 24hores reposant i les nanopartícules
han fet efecte. Aboquem 20µL de MTT a cada pouet. Aquesta substància forma una mena de
cristallets blaus si les cèl·lules metabolitzen adequadament el MTT.
3.3.2.- Es deixa la placa durant 4 hores en repòs perquè tingui temps a reaccionar. Es cobreix
amb alumini per aïllar les cèl·lules de l’entorn. 3.3.3. A les 4h, eliminar el medi que hi hagi als pouets i afegir DMSO per dissoldre els cristalls
blaus. Si les cèl·lues estan vives, hauran format més cristalles i si estan mortes, per culpa dels
reactius afegits, no formaran cristallests.
3.3.4. Es mesura l’absorbància de tots els pouets i es compara amb el control positiu per saber
el percentatge que tenim de cèl·lules vives de cada substancia assajada.
RESULTATS I ANALISI DE RESULTATS
1.- SÍNTESI DE NANORODS
1.1.- ESPECTRES NANORODS
Solució 1:
55
Aquesta primera solució que té una mica més de plata respecte la segona, té dos pics, com tots
els nanorods: el primer al voltant del 520nm que correspon a la banda transversal que és la
mateixa longitud d’ona que les nanoesferes (aproximadament, ja que és la mesura
d’absorbància del diàmetre del rod) i l’altre pic, el longitudinal, característic de cada nanorod
(ja que la longitud d’ona d’aquest pic pot variar de l’ordre de 600 a 1100nm), està al voltant
dels 800 o 820nm i la seva absorbància màxima és de 0.85. Aquest pic és molt important quan
els nanorods s’han d’irradiar, ja que la llum làser que s’ha d’aplicar ha de ser de la mateixa
longitud d’ona.
Solució 2:
Aquest segon espectre, en la qual hi ha una quantitat menor de plata que en la primera, la
seva banda longitudinal ha disminuït tant en absorció com en longitud d’ona ja que la seva
absorbància és de 0.73 i la seva longitud d’ona de 720nm.
56
Solució 3:
La tercera gràfica, la qual té una barreja de surfactants, és bastant diferent respecte les dues
anteriors. La banda longitudinal ha augmentat notablement ja que es situa completament a la
zona infraroja, aquest pic està entre els 1050 i 1100nm. L’absorbància es manté més o menys
igual, al voltant de 0.7 (la resolució de l’aparell no es molt bona i per tant no s’observa bé el
pic).
Solució 4:
57
L’espectre d’aquesta última solució, en la qual hi havia un quantitat de seeds major i s’havia
canviat l’àcid ascòrbic per la hidroquinona, és una mica diferent respecte a la tercera.
El segon pic, la seva longitud d’ona es manté al voltant del 1000nm, que també està situada a
la zona infraroja, però la seva absorbància és molt major. La mostra ha estat diluïda 10x.
S’observa també una clara diferència entre el pic longitudinal i el transversal. El pic a 520nm és
molt poc intens, per tant indica que hi ha poques nanoesferes (subproductes de la reacció).
1.2.- IMATGES TEM NANORODS
Solució 1:
En la primera solució es va observar que els nanorods tenien una mida al voltant d’uns 40 nm
d’allargada i d’uns 12 nm d’amplada. També es va observar que a part de nanorods hi havia
una quantitat significativa de nanoesferes, és a dir, el rendiment de la solució és bastant
dolent, segurament al voltant del 60%.
FIG 35: Imatge TEM solució nanorods 1 (59000x)
58
Solució 2:
La mostra de la solució 2, la qual tenia una mica menys de nitrat de plata, canvia una mica
respecte la primera. Tot i que la seva llargada era igual, al voltant també de 40 nm, l’amplada
varia, al voltant d’uns 14nm. La disminució del nitrat de plata, ha fet que creixin d’amplada
però no de llargada, de manera que la relació entre la seva llargada i amplada disminueix
respecte la primera solució. La concentració de nanoesferes respecte la solució no ha variat
gaire.
Solució 3:
Aquesta solució és molt diferent a les altres dues. El que crida més l’atenció el nombre
increïblement gran de nanoesferes, degut això ens va ser molt difícil trobar nanorods, el
rendiment de la solució era molt baix. Però els pocs nanorods que hi havia, les mides eren
notablement més grans, la seva llargada era al voltant de 55nm i la seva amplada entre 10 i
14nm (no vam tenir temps de treure imatges).
Solució 4:
Observant la solució de nanorods caracteritzada per afegir hidroquinona, es va poder observar
que el nombre de nanoesferes era molt baix, per tant, el rendiment de la solució era bastant
FIG 36: Imatge TEM solució nanorods 2 (79000x)
59
alt, al voltant d’un 90%. La mida dels nanorods és molt semblant a la de la solució 3, la longitud
al voltant de 60nm i l’amplada era més o menys la mateixa, entre 10 i 14nm.
1.3.- ANÀLISI DE RESULTATS
Un cop havent estudiat els nanorods, mitjançant el seu espectre i imatges, s’ha vist que els
nanorods, possiblement més aptes per al tractament del càncer, serien els de la solució 4, la
solució que té una quantitat bastant major de seeds i també hidroquinona. Arribo a aquesta
conclusió, degut a que aquests tenen una longitud d’ona gran situada a la regió infraroja, per
tant el làser utilitzat podrà travessar uns quants cm els teixits. Un làser per poder travessar
teixits ha de tenir una certa longitud d’ona, en aquest cas, l’infraroig travessa fins a 10cm
alguns teixits . A més, aquesta síntesi té poques nanoesferes, per tant amb una quantitat
menor de solució obtindríem la mateixa quantitat de nanorods.
En la solució 3 s’hauria d’augmentar el seu rendiment, potser s’aconseguiria, substituint l’àcid
ascòrbic per la hidroquinona.
Les solucions 1 i 2, per ser més eficients, haurien de millorar molt en la qüestió del rendiment,
ja que obtenim molts subproductes. A més, a l’augmentar la longitud d’ona, el làser és capaç
de travessar més els teixits.
FIG 37: Imatge TEM solució nanorods 4 (59000x)
60
2.- FUNCIONALITZACIÓ DE NANORODS
2.1.- ESPECTRES NANORODS FUNCIONALITZAT
Solució 1:
La funcionalització ha fet que la l’absorció de la banda longitudinal disminuís notablement,
encara que la longitud d’ona ha disminuït molt poc. L’absorbància que ha disminuït més
severament ha estat, la de la solució de nanorods funcionalitzats amb el pèptid. Perdre absorbància significa que hi ha menys nanorods en la solució, els quals probablement
els hem perdut durant l’aspiració del medi, un cop han estat centrifugades o perquè s’han
quedat enganxats a les parets dels eppendorf.
61
Solució 2:
En aquesta segona solució totes tres solucions tenen un aspecte molt semblant amb només
uns petits canvis però l’aspiració del CTAB no ha provocat canvis.
Solució 3:
62
La principal diferència entre les nanopartícules funcionalitzades i les no funcionalitzades és el
seu pic longitudinal encara que la diferència no s’aprecia bé per culpa de la qualitat de
l’espectrofotòmetre.
Però tot i així en els aspectes més importants les gràfiques són bastant semblants.
Solució 4:
En aquesta última solució, totes les gràfiques tenen un perfil molt semblant, és a dir, que no
s’han perdut rods durant el procés de funcionalització ni el rentat. També es pot observar que
no s’ha produït una agregació dels nanorods.
2.2.- ANÀLISI DE RESULTATS SOBRE LA FUNCIONALITZACIÓ DELS RODS
Les funcionalitzacions dels nanorods haurien d’aportar avantatges respecte als que no n’estan,
ja que el PEG ajuda a que aquests puguin estar més estona al plasma sanguini i, a més a més,
aquest, generalment, no és tòxic, de manera que poden mitigar la toxicitat dels nanorods.
Respecte als nanorods no funcionalitzats, no han canviat gaire ni les seves longitud d’ona ni la
seva absorbància, això ens fa suposar que la pèrdua de nanorods ha estat petita.
63
La funcionalització amb el pèptid ajudaria a internalitzar els nanorods dins les cèl·lules. El
pèptid utilitzat no hauria de ser tòxic i, per tant, també estaríem reduint la toxicitat dels rods.
3.- ASSAIG MTT
Els resultats de l’assaig MTT no varen ser els que ens esperàvem: quasi totes les cèl·lules, com
es mostra en la imatge, estaven mortes, ja que no havien metabolitzat el MTT. Les úniques que
van sobreviure van ser aquelles que estaven amb un medi amb doxorribucina, un fàrmac pel
càncer i les nanopartícules amb CTAB. Ens va sorprendre molt que fins i tot les nanopartícules
amb PEG fossin tan tòxiques que poguessin matar les cèl·lules.
Això crec que podria ser degut a l’agregació de nanopartícules.
L’agregació de nanorods podria ser una causa de la elevada mort cel·lular, ja que els nanorods
amb CTAB són menys tòxics que els altres, per tant no crec que sigui resultat d’un excés de
CTAB i en canvi sí que podria ser degut a l’aglomeració de nanorods, ja que quan no hi ha
suficient CTAB aquests s’aglomeren.
Una altra de les causes podria ser la concentració utilitzada de nanopartícules. En tota la
pràctica no s’ha parlat de concentració de nanorods perquè és difícil de quantificar i es va
utilitzar un volum reduït. Però tot i això, potser aquest volum utilitzat era massa elevat i, per
tant, tòxic.
64
CONCLUSIONS
Aquesta pràctica ha estat dividida en tres blocs clarament diferenciats: la síntesi de nanorods,
la seva funcionalització i l’assaig de la seva toxicitat.
En el primer bloc, el de la síntesi, he après a sintetitzar nanorods controlant les seves mides i
longitud d’ona a la que absorbeixen, d’una manera molt aproximada. Segons quina longitud
d’ona volem utilitzar, haurem de sintetitzar els rods amb uns paràmetres concrets. La síntesi
que crec que seria més apta per a possibles futures aplicacions, a partir dels paràmetres que
han estat estudiats mitjançant el seu espectre i les imatges obtingudes, serien els nanorods de
la solució amb hidroquinona i una majors quantitat de seeds, la número 4, ja que obtenim un
rendiment més alt de rods respecte a subproductes i, a més, absorbeixen a una longitud d’ona
d’uns 900-1000nm on el làser utilitzat per irradiar-les podrà travessar més els teixits respecte
als rods que absorbeixen a 800nm.
El segon bloc va ser la funcionalització dels nanorods, els quals van estar funcionalitzats amb el
PEG i un pèptid, donant-los-hi avantatges i funcions més especifiques. En aquest bloc es va
mesurar un altre cop els seus espectres respectius per assegurar-nos que no havíem perdut
massa nanopartícules durant la funcionalització a l’eliminar el medi i també que la
funcionalització no havia modificat les característiques del rod (si l’espectre varia, pot significar
que les dimensions han variat o que els rods han agregat) .
En el tercer i últim bloc va consistir en la realització d’un assaig MTT per comprovar la toxicitat
de les partícules sintetitzades anteriorment i així saber si serien aptes per ser injectades o no.
Els resultats no van ser els esperats, ja que els nanorods prèviament sintetitzats, segons
l’assaig, eren molt tòxics, una gran quantitat de cèl·lules havien mort, tot i que generalment la
toxicitat de nanopartícules és bastant baixa.
Aquest resultat podria haver estat causat per l’agregació de les partícules; ja que, en alguns
casos, a l’afegir un pèptid, aquestes agreguen. Una altra de les causes com ja hem nomenat
podria ser la concentració de les nanopartícules, la qual no es coneix. El no haver-la calculat, ja
que suposa moltes dificultats, aquesta podria ser molt alta i per tant provocar una alta toxicitat
i en conseqüència, la mort cel·lular.
65
V) CONCLUSIONS
El càncer no és una malaltia simple que admeti tractaments generals i uniformes per a tots els
pacients, ara bé, els nanorods representen una eina que permet un tractament diversificat i
personalitzat que pot resultar eficient en molts tipus de càncer, donant una esperança per
arribar a trobar un tractament més eficaç.
En el primer apartat s’ha vist la dificultat de tractar la malaltia a causa de la gran quantitat de
factors que hi intervenen, els quals poden ser tant factors genètics com l’activació o inhibició
d’alguns gens; o epigenètics com és el cas de la metilació, ja que no altera l’expressió gènica.
La inhibició d’alguns gens pot ser molt devastadora ja que pot augmentar la velocitat de
proliferació cel·lular, inactivar l’apoptosi, i la seva activació també, per exemple, pot produir un
augment de telomerasa i provocar seriosos canvis en els telòmers.
Un cop feta aquesta introducció al càncer, vaig veure que un possible futur tractament es
podria basar en la utilització de nanorods, motiu pel qual en els següents apartats es va
realitzar un estudi sobre aquests: les seves propietats, aplicacions, síntesi...
En els següents apartats, he presentat les nanopartícules per tenir un cert coneixement sobre
aquestes i així poder presentar les nanopartícules d’or. Les nanopartícules podrien ser idònies
pel tractament de la malaltia ja que poden ser fàcilment sintetitzades i funcionalitzades,
especificant així la seva funció, i tenen una alta biocompatibilitat cosa que ajuda a la
funcionalització. La seva baixa toxicitat és un dels seus trets característics més ressaltats, ja en
baixes quantitats, en molts casos, són beneficiosos i finalment, una última propietat, les
propietats òptiques.
En el quart apartat, el més extens, m’he centrat en els nanorods de manera més concreta però
sense oblidar les característiques generals de les nanopartícules d’or. S’ha entrat una mica
més en detall en les propietats òptiques, molt importants, ja que aquestes possibiliten que
puguin arribar fins a teixits més o menys profunds, fins a uns 10cm. S’ha estudiat la seva
síntesi, com a partir de nucleacions, les seeds, es formen els nanorods i finalment, la seva
funcionalització amb dos molècules: el PEG i un pèptid. S’ha vist que aquestes es poden
utilitzar de maneres diferents.
Un cop estudiats de manera teòrica els nanorods, vaig voler avaluar-los com a tals de manera
pràctica, així doncs vaig aprendre a sintetitzar 4 tipus de nanorods diferents per estudiar-los
per saber la seva mida i el seu espectre, molt relacionat amb la profunditat que poden arribar.
Vaig funcionalitzar-los amb dues molècules diferents, i finalment vaig assajar la toxicitat amb
66
cèl·lules HeLa dels nanorods tant funcionalitzats com no. Els resultats obtinguts no van ser els
esperats ja que es van morir la majoria de cèl·lules, possiblement per una agregació o una
concentració massa alta de nanorods les quals, segurament, van provocar que els nanorods
tinguessin una alta toxicitat. Tot i això els nanorods més idonis per al tractament del càncer
serien els de la solució que conté la hidroquinona, que és la quarta, ja que ha augmentat el
rendiment i la longitud d’ona a la qual absorbeixen, al voltant de 1000nm, encara que perquè
es poguessin utilitzar en un futur s’hauria de reduir notablement la toxicitat.
Aquest treball ha tingut un impacte molt positiu en mi, ja que durant la realització d’aquest he
estat llegint diferents articles científics de diversos temes i enfocats i treballats des d’un punt
de vista diferent. En segon lloc, aquest treball m’ha donat la possibilitat de poder estar en un
laboratori d’investigació capdavantera, cosa que m’ha permès descobrir una mica més el món
de la recerca, una experiència que ha resultat molt positiva. Finalment durant la realització del
treball, he anat aprenent a redactar, sintetitzar i a fer entendre el que vull explicar.
67
VI) TREBALL FUTUR
Un cop havent fet aquest petit estudi sobre els nanorods com a eines per al tractament del
càncer, i després d’haver obtingut els resultats de l’assaig, tornaria a sintetitzar els nanorods
però aquesta vegada calculant la concentració d’aquests, per minimitzar la toxicitat i així que
aquests poguessin donar lloc a futures eines per possibles aplicacions en el càncer, tan si
actuen sols com funcionalitzats.
També s’hauria de mirar de reduir l’agregació possiblement provocada pel pèptid ja que això
fa que els nanorods siguin inviables, així doncs provaria de funcionalitzar els nanorods amb
altres pèptids per intentar reduir l’agregació al màxim.
Després a més llarg termini, jo, personalment, provaria de funcionalitzar un pèptid o proteïna,
seguint les millores comentades anteriorment, capaç d’inhibir el cicle cel·lular i així que aturés
la proliferació de cèl·lules cancerígenes.
68
VII) BIBLIOGRAFIA
ALKILANY, Alaaldin M. i MURPHY, Catherine J. Tocixity and cellular uptake of gold nanoparticles: what we have learned so far? J. Nanopart. Res. Abril 2010.
AL-QADI, Sonia i REMUÑÁN-LÓPEZ, Carmen. Nanopartículas metálicas: oro. Facultad de Farmacia. Universidad de Santiago de Compostela. Ananles RANF. 2009.
CAI, Weibo al. Aplicactions of gold nanoparticles in cancer nanotechnology. Nanotechnology. Science and Applicacions 2008.
CHEN, Huanjun al. Gold nanorods and their plasmonic properties. Chem Soc Rev. Setembre del 2012.
CORBELLA, Josep. El càncer té cèl·lules mare que guien el creixement. La Vanguardia, 3 d’Agost del 2012.
GIASUDDIN, ASM al. Use of gold nanoparticles in Diagnostics, Surgery and medicine: A Review. Bangladesh J. Med Biochem. 2012.
GIL, Joan. Apoptosi i càncer. Unitat de bioquímica, Universitat de Barcelona, Campus Bellvitge.
GUI, Chen i CUI, Da-xiang. Functionalized gold nanorods for tumor imaging and targeted therapy. Cancer biol. Med. 2012.
HENRNANDO GRANDE, Antonio. Nanotecnología y nanopartículas magnéticas: la física actual en lucha contra la enfermedad. Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. 2007.
KENNEDY, Laura C. al. A New Era for càncer treatment: Gold-Nanoparticle-Mediated Thermal Therapies. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 2010.
KUMAR KOLLURI, Siva. Induction of apoptosis in cancer cells. Novembre del 2010.
MANDAL, Anaya. http://www.news-medical.net/health/Cancer-History-(Spanish).aspx
PASTORET, Anna.http://bioinformatica.uab.es/genetica/curso/EnsayosAlumnos/annapastoret/
PELENGARIS, Stella i KHAN, Michael. The molecular biology of Cancer. A Bridge from Bench to Bedside. Wiley-Blackwell. Abril 2013
PÉREZ-JUSTE, Jorge al. Gold nanorods: Synthesis, characteritzation and applications. Cordination Chemistry reviews. 2005.
ROSSI, F. Al. Laser activated gold nanords for photothermal Treatment of cancer. Institute of Apllied Physics “Nello Carrara”. 2012.
SELL, Stewart. On the stem cell origin of cancer. American Journal of Pathology. Juny del 2010.
69
TIWARI, Pooja M. al. Functionalized Gold Nanoparticles and their Biomedical Aplications. Nanomaterials. 2011.
TRAN, Kristina L. Synthesis, Carcteritzation, and self-assembly of gold nanorods and nanoprisms. University of south Forida Scholar Commons. 2010.
VIGDERMAN, Leonid al. Functional Gold nanorods: synthesis, self-assembly and sensing apllicactions. Advanced Materials. 2012.
VIGDERMAN, Leonid i ZUBAREV, Eugene R. Therapeutic platforms based on gold nanoparticles and their covalent conjugates with drug molecules. Advanced Drug Delivery Reviews. 2013.
YUANYUANG, Li al. Gold nanoparticle-based biosensors. Gold bulletin. 2010.