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DATA ENTRADA SOL·LICITUD : 11 / juliol / 2013 DATA REQUERIMENT DOC.: 02 / abril / 2014
DATA ENTRADA DOC. REQUERIDA: 07 / abril / 2014 DATA ANÀLISI COMITÈ TÈCNIC: 10/ novembre/ 2014 DATA INFORME CDCG: DATA RESOLUCIÓ: DATA NOTIFICACIÓ:
Última actualització: 20/10/2014
Comitè Tècnic de Ciències Experimentals i Ciències de la Salut 1.- DADES DEL SOL·LICITANT Cognoms Nom COM: AR6692307 E-mail:
PASQUALI, Lorenzo Nacionalitat: italiana [email protected]
Data Naixement: 03 de juny de 1977 Tel: 622454891
2.- DADES ACADÈMIQUES PASQUALI, Lorenzo COM: AR6692307 DADES DEL TITOL QUE ES SOL•LICITA HOMOLOGAR
Denominació:
Expedit per: País de procedència títol:
Any del títol:
dottore di ricerca in CLINICA, GENETICA ED IMMUNOLOGIA DELLE MALATTIE DELL'ETÀ EVOLUTIVA Università degli Studi di Genova ITÀLIA 2012
DADES DELS ESTUDIS DE DOCTORAT:
Denominació: Període:
Titulació que li va donar accés: Tipus de programa d’estudis:
Phd Course in "Clinics, Genetics and Immunology of Children and Adolescents Diseases" 2009-2011 M.D. Degree and Specialization in Pediatrics, Universitat de Genova (Itàlia 2007) Només periode d'investigació
DADES DE LA TESI:
Títol: Àmbit:
Any :
"Regulación del Perfil Transcripcional de los Islotes de Langerhans: el Reguloma dels Páncreas Endocrino" Medicina 2012
Observacions Llicenciat en Medicina i Cirurgia per la Universitat de Génova (Itàlia 2002), aquest títol ha estat homologat per al Ministeri d'Educació Espanyol al títol de Llicenciat en Medicina. Metge Especialista en Pediatría per la Universitat de Gènova (Itàlia 2007), aquest títol té el reconeixement profesional del Ministeri de Sanitat i Política Social espanyol. 3.- DOCUMENTS que s’acompanyen a aquesta sol·licitud :
Model sol·licitud UB Còpia compulsada del COM
Còpia compulsada del títol de Doctor Traducció
Còpia compulsada de la certificació acadèmica dels estudis de doctorat
Traducció
Un exemplar de la tesi doctoral realitzada
Estructura CD Memòria explicativa de la tesi doctoral
Indicació dels membres del tribunal
Format paper CD Currículum vitae del sol·licitant:
Indicació publicacions derivades de la tesi
Justificant d’abonament de la taxa d’homologació.
Altres: Còpia compulsada credencial llicenciatura Còpia compulsada reconeixement professional
Currículum vitae
Número de hojas que contiene: 4 Nombre y apellidos: Lorenzo Pasquali DNI /Documento Comunitario/ Pasaporte:AA3486748 Fecha: 30/05/2013 Firma:
Lorenzo Pasquali, M.D., Ph.D. MD Research Fellow, Genomic Regulation of Pancreatic Beta-cells, Hospital Clínic, Institut d'Investigacions Biomediques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Center Eshter Koplowitz (CEK), c/Rosselló 153, 08036 Barcelona, Spain. www.betacellregulation.net INFORMACÍON PERSONAL: Fecha y lugar de nacimiento: 3 de junio de 1977. Londres Nacionalidad: Italiana y Inglesa Residencia: c/Consell de Cent 263 5/1, 08011, Barcelona, España. Tel +34 932275400 (lab ext 2598) Fax +34 93 4516638 Email: [email protected] EDUCACIÓN Y FORMACIÓN: Médico: Facultad de Medicina de la Universidad de Génova Italia, 2002 Especialista en Pediatría: I.GG. Gaslini, Italia, 2002-2007. Ph.D.: Facultad de Medicina de la Universidad de Génova Italia, 2012.
TÍTULOS ACADÉMICOS:
TITULO: Licenciado en Medicina y Cirugía
ORGANISMO Y CENTRO DE EXPEDICIÓN: Universidad de Génova, Italia
FECHA DE EXPEDICIÓN: 2002
CALIFICACIÓN: 110/110 cum laude
TESIS: “Identificazione di neonati a rischio di diabete mellito tipo I da avviare a prevenzione primaria.”
TITULO: Médico Especialista en Pediatría
ORGANISMO Y CENTRO DE EXPEDICIÓN: Universidad de Génova, I.GG. Gaslini, Italia
FECHA DE EXPEDICIÓN: 2007
CALIFICACIÓN: 50/50 cum laude
TESIS:” Identificazione di determinanti genetici di suscettibilità allo sviluppo e alla progressione della nefropatia diabetica.”
TITULO: Doctor en Clínica, genética e inmunología de las enfermedades de la edad evolutiva.
ORGANISMO Y CENTRO DE EXPEDICIÓN: Universidad de Génova
FECHA DE EXPEDICIÓN: 2012
TESIS: Regulación del perfil transcripcional de los islotes de Langerhans:
El reguloma del páncreas endocrino
ESTANCIAS DE INVESTIGACIÓN-FORMACIÓN 2008 hasta la actualidad:
M.D, Research Fellow, Genomic Regulation of Pancreatic Beta-cells,
Hospital Clínic, (IDIBAPS), Barcelona, Spain.
Proyecto: “Defining the epigenomic landscape of human pancreatic islets.”
2007-08 M.D, Research Fellow, Laboratory of the Regional Center of Pediatric
Diabetes I.G.Gaslini University of Genoa, Genoa, Italy
Proyecto:“Clinical identification of patients affected by monogenic
diabetes.”
2005-07 Visiting Research Scientist, Division of Immunogenetics, Rangos
Research Center, Children's Hospital of Pittsburgh, University of
Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, USA.
Proyecto: “Genome wide identification of genetic determinants to the
development and progression of diabetic nephropathy in type 1 diabetic
patients.”
1999 Internado electivo en endocrinología, Department of Endocrinology,
Imperial College School of Medicin, Charing Cross hospital, London (U.K.)
PREMIOS Y DISTINCIONES:
Invited special Lecture. 64 ° Italian Pediatric National Congress, October 2008, “Induction of immune tolerance to facilitate β cell regeneration in type 1 diabetes” Winner of the Fondazione Gerolamo Gaslini award 2008 BECAS:
2011 EFSD and LillyResearch Fellowships “Mapping the human pancreatic islet-cell cis regulome“ 2007 “Assegno di ricerca” Universidad de Génova. “Prevalenza dell’autoimmunità contro la β-cellula e studio della storia naturale del diabete mellito tipo I in bambini e adolescenti con celiachia” SOCIEDADES CIENTIFICAS - Sociedad Española de Diabetes. - Societá Italiana di Genetica Umana. - Societat Catalana de Biologia - European Association for the Study of Diabetes. ACTIVIDAD ASESOR/EVALUADOR - Revisor de revistas científicas internacionales. PUBLICACIÓNES: Morán I, Akerman I, van de Bunt M, Xie R, Benazra M, Nammo T, Arnes L, Nakić N, García-Hurtado J, Rodríguez-Seguí S, Pasquali L, Sauty-Colace C, Beucher A, Scharfmann R, van Arensbergen J, Johnson PR, Berry A, Lee C, Harkins T, Gmyr V, Pattou F, Kerr-Conte J, Piemonti L, Berney T, Hanley N, Gloyn AL, Sussel L, Langman L, Brayman KL, Sander M, McCarthy MI, Ravassard P, Ferrer J. Human β cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metab. 2012 Oct 3;16(4):435-48 Aloi C, Salina A, Pasquali L, Lugani F, Perri K, Russo C, Tallone R, Ghiggeri GM, Lorini R, d'Annunzio G. Wolfram syndrome: new mutations, different phenotype. PLoS One. Jan 2012;7(1). Salina A, Aloi C, Pasquali L, Mascagni A, Cassanello M, Tallone R, Lugani F, Lorini R, d'Annunzio G. Comment on: Clinical application of best practice guidelines for genetic diagnosis of MODY2. Diabetes Res Clin Pract. 2012 Feb;95(2): Salina A, Pasquali L, Aloi C, Lugani F, d'Annunzio G, Lorini R. Neonatal diabetes caused by pancreatic agenesia: which other genes should be used for diagnosis? Diabetes Care. 2010 Aug;33(8) Gaulton K.#, Nammo N.#, Pasquali L.#, Simon J., Giresi P, Fogarty M, Panhuis T, Mieczkowski P, Secchi A, Bosco D, Montanya E, Berny T, Mohlke K, Lieb J, Ferrer J A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat Genet. 2010 Mar;42(3):255-9 #These authors contributed equally to this work.
Marciano R, D’Annunzio G, Minuto N, Pasquali L, Santamaria A, Di Duca M, Ravazzolo R, Lorini R Association of alleles at polymorphic sites in the osteopontin encoding gene in young type 1 diabetic patients. Clin Immunol. 2009 Apr;131(1):84-91.
Pasquali L, d’Annunzio G, Gastaldi R, Di Battista E, Calcaterra V, Larizza D, Lorini R, D’Amato E Collectrin gene screening in Turner Syndrome patients carrying kidney malformation. J Genet. 2009 Apr;88(1):105-8 d'Annunzio G, Minuto N, D'Amato E, DeToni T, Lombardo F, Pasquali L, Lorini R. Wolfram syndrome (diabetes insipidus, diabetes mellitus, optic atrophy and deafness [didmoad]: similar phenotypes by different genetic mechanisms. Diabetes Care 2008 Jun 19. Sep;31(9):1743-5. Pasquali L, Giannoukakis N, Trucco M. Induction of immune tolerance to facilitate β cell regeneration in type 1 diabetes. Adv Drug Deliv Rev. 2008 Jan 14;60(2):106-13. Pasquali L, Bedeir A, Ringquist S, Styche A, Bhargava R, Trucco G. Quantification of CpG Island Methylation in Progressive Breast Lesions From Normal to Invasive Carcinoma. Cancer Lett 2007 Nov;257(1): 136–144. Pasquali L, Trucco M, Ringquist S. Navigating pathways affecting type 1 diabetic kidney disease. Pediatr Diabetes 2007 Oct;8(5):307-322. Pasquali L, Fan Y, Trucco M, Ringquist S. Rehabilitation of adaptive immunity and regeneration of beta cells. Trends Biotechnol. 2006 Nov;24(11):516-22. Di Duca M, Oleggini R, Sanna-Cherchi S, Pasquali L, Di Donato A, Parodi S, Bertelli R, Caridi G, Frasca G, Cerullo G, Amoroso A, Schena FP, Scolari F, Ghiggeri GM; European IgA Nephropathy Consortium. Cis and trans regulatory elements in NPHS2 promoter: implications in proteinuria and progression of renal diseases. Kidney Int. 2006 Oct;70(7):1332-41. PUBLICACIÓNES DERIVADAS DE LA TESI DOCTORAL: Gaulton K.#, Nammo N.#, Pasquali L.#, Simon J., Giresi P, Fogarty M, Panhuis T, Mieczkowski P, Secchi A, Bosco D, Montanya E, Berny T, Mohlke K, Lieb J, Ferrer J A map of open chromatin in human pancreatic islets. #These authors contributed equally to this work. Nat Genet. 2010 Mar;42(3):255-9 Impact Factor 2012: 35.532 Citas hasta final 2012: 123 Pasquali L.#, Gaulton KJ.#, Rodríguez-Seguí S.#, Mularoni L., Miguel-Escalada I., Akerman I., Tena J., Gómez-Marín C., van de Bunt M., Ponsa-Cobas J., Morán I., Castro N., Nammo T., Cebola I.,García-Hurtado J., Maestro MA., Pattou F., Piemonti L., Berney T., Gloyn A., Ravassard P., Gómez Skarmeta JL., Müller F., McCarthy MI, Ferrer J Integrative epigenome maps link Type 2 diabetes susceptibility to sequence variation in pancreatic islet-cell enhancers #These authors contributed equally to this work. Science: under review.
1
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI GENOVA
Doctorado
CIENCIAS Y TECNOLOGÍAS BIOMÉDICAS
Clínica, genética e inmunología de las enfermedades de la edad evolutiva
XXIV ciclo
Tesis doctoral:
Regulación del perfil transcripcional de los islotes de Langerhans:
El reguloma del páncreas endocrino
Directora:
Dra. Renata Lorini
Doctorando:
Dr. Lorenzo Pasquali
2
Composición del tribunal
Dr. Mohamad Maghnie Miembro interno
Università di Genova, Professore Associato, SSD MED/38 Pediatria generale e specialistica
Dipartimento di Scienze Pediatriche, Largo G. Gaslini 5, 16147 Génova
Tel.: 010-5636574
Correo electrónico: [email protected]
Dra. Daniela Larizza Miembro externo
Università di Pavia, Professore Associato, SSD MED/38
Clinica Pediatrica, Policlinico San Matteo
Piazzale Golgi – 27100 Pavía
Tel.: 0382-502885 (móv.) 335-203428
Correo electrónico: [email protected]
Dr. Alfredo Brusco Miembro externo
Università di Torino, Ricercatore, SSD MED/03 Genetica medica
Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica
Via Santena 19 – 10126 Turín
Tel.: 011-6334480 fax 011-2366662
Correo electrónico: [email protected]
Dr. Roberto Ravazzolo Miembro interno sustituto
Università di Genova, Professore Ordinario, SSD MED/03 Genetica medica
Dipartimento di Scienze Pediatriche, Largo G. Gaslini 5, 16147 Génova
Tel.: 010-5636802
Correo electrónico: [email protected]
Dra. Lucia Ghizzoni Miembro externo
Università di Torino, Ricercatore, SSD MED/13 Endocrinologia
Dipartimento di Medicina Interna, Div. di Endocrinologia, Diabetologia e Metabolismo
Ospedale Molinette
Corso Dogliotti 14, 10126 Turín
Tel.: 011-6709593 010-6335492 338-9368956 Fax: 011-2369593
Correo electrónico: [email protected]
3
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN 4
1. Diabetes mellitus 6
a. Clasificación y fisiopatología 6
b. Epidemiología y factores de riesgo 8
2. Regulación genética 10
a. Cromatina y expresión génica 10
b. Código histónico 11
II. OBJETIVOS 13
III. METODOLOGÍA 14
IV. RESULTADOS 18
1. Identificación y caracterización de las regiones
de cromatina abierta en los islotes pancreáticos humanos 18
2. Caracterización de los elementos reguladores en los
islotes pancreáticos humanos 23
V. CONCLUSIONES 26
VI. BIBLIOGRAFÍA 28
4
INTRODUCCIÓN
En febrero de 2001 las revistas Science y Nature1,2 presentaron en paralelo al mundo los
resultados del primer borrador de la secuencia del genoma humano. Desde entonces se ha
inaugurado para el estudio de la genética una década de innovaciones. Hoy, gracias a la
denominada next generation sequencing (NGS)3 resulta posible realizar la secuenciación de la
totalidad del genoma, que había requerido 13 años de experimentación, en un plazo de un
mes o aun menos.
Una de las primeras y más impactantes conclusiones que salieron a la luz fue el apreciar que
tan solo aproximadamente un 2% de la secuencia del genoma humano es codificante y, por
tanto, se traduce en proteínas. El número de genes presentes en el genoma humano no es
muy distinto del de otras especias; en este sentido, un análisis de esta porción “codificante”
del ADN ha puesto de manifiesto su notable conservación en animales incluso relativamente
alejados desde un punto de vista filogenético. Esto es, que lo que principalmente nos
diferencia genéticamente de un ejemplar de macacus rhesus o de mus musculus está
representado por variaciones en regiones no codificantes del genoma, aquel 98% de la
secuencia de ADN que aún en la actualidad constituye su parte más oscura.
Estos nuevos conocimientos de investigación de base ya se han implementado para
profundizar y comprender el papel que los factores genéticos desempeñan en la
fisiopatogénesis de enfermedades multifactoriales complejas, entre las que se cuenta la
diabetes.
La diabetes, un prototipo de enfermedad multifactorial compleja, es una enfermedad que se
presenta en la actualidad con una frecuencia cada vez más elevada en la población y con un
comienzo cada vez más precoz. Precisamente el rápido incremento de la incidencia de esta
enfermedad en la edad pediátrica ha despertado una nueva alarma en el seno de los países
occidentales, al tiempo que plantea un desafío para perfeccionar nuestra capacidad de
prevención y diagnóstico precoz.
Si bien la secuenciación del genoma humano ha aportado un mapa de referencia
imprescindible para la genética moderna, no ha sido sino con el desarrollo de estudios de
asociación realizados a gran escala (Genome Wide Association Studies, GWAS) como se han
podido identificar colecciones de variantes genéticas (por lo general se trata de un
5
polimorfismo de nucleótido único, SNP) cuya presencia se asocia con un mayor riesgo de
desarrollar determinadas enfermedades. Estas variantes generalmente están constituidas
por polimorfismos de nucleótido único (SNP): se han descrito varias colecciones de SNP
con una frecuencia significativamente mayor en la población que padece diabetes frente a
la población general.
Las conclusiones de los estudios GWAS han sido sorprendentes: salvo en casos rarísimos,
las variantes genéticas identificadas se encuentran en zonas no codificantes del genoma, en
ocasiones dentro de extensos intrones, o bien en regiones definidas como gene desert. Estas
regiones se encuentran en las zonas del ADN que desde hace tiempo se han etiquetado
como junk DNA, «ADN basura», precisamente porque no se les conocía ninguna posible
función. Por tanto, aquí nos hemos topado prácticamente con un abismo ¿La identificación
de estas variantes genéticas es simplemente fruto de errores en los cálculos estadísticos?
En suma, ¿están presentes solo en los ordenadores de los bioinformáticos o son de verdad
capaces de alterar los procedimientos fisiopatológicos de nuestro cuerpo?
El trabajo realizado a lo largo de este doctorado se ha articulado en torno a estos
interrogantes, desarrollando un modelo de mapa genético de la diabetes humana.
De este modo, nos proponemos en este estudio construir el reguloma del páncreas
endocrino, esto es, el conjunto de todas las regiones genéticas aptas para regular el perfil
transcripcional del tejido celular principalmente involucrado en el mantenimiento de la
homeostasis glucídica.
6
Diabetes mellitus
La diabetes mellitus es un trastorno metabólico con etiología multifactorial, caracterizado
por una hiperglicemia crónica. La enfermedad se debe a la ausencia de acción de la insulina
al nivel de los tejidos periféricos, ya obedezca ello a la destrucción autoinmune de las
células que en el páncreas producen esta hormona, como sucede en la diabetes mellitus de
tipo 1 (DM1), o bien sea en cambio el resultado de una carencia en la secreción de insulina
o de una reducción en su acción, así como una combinación de estos dos factores, como en
el caso de la diabetes mellitus de tipo 2 (DM2).
Por tanto, un papel central en la fisiopatología de la diabetes es el que desempeña el
páncreas insular, un tejido pancreático constituido por células sensibles en primer lugar a
la glucemia, en respuesta a la cual activan la secreción de diferentes hormonas con la
función de regularla. En concreto, aproximadamente un 80% de las células que componen
los islotes pancreáticos está constituido por células β capaces de producir insulina.
La hiperglucemia aguda severa, afección en la actualidad afortunadamente más bien rara,
conduce al coma hiperosmolar y puede resultar fatal. Las consecuencias de la
hiperglucemia crónica, en cambio, son las graves complicaciones con las que los pacientes
diabéticos pueden encontrarse con el transcurso del tiempo, como la retinopatía diabética,
la neuropatía periférica y la nefropatía renal. El impacto clínico de las complicaciones
crónicas de la hiperglucemia puede resumirse en la observación de que en Estados Unidos
la diabetes mellitus es la principal causa de ceguera y de amputaciones no traumáticas.
Además, año tras año, más de una cuarta parte de los nuevos casos de insuficiencia renal se
deben a la nefropatía diabética4.
Clasificación y fisiopatología
El National Diabetes Data Group (NDDG) publicó en 1979 la primera clasificación relativa a
la patología diabética5. Esta clasificación fue posteriormente aprobada por el Expert
Committee on Diabetes (1980) de la World Health Organization (WHO)6, y más tarde por el
WHO Study Group on Diabetes Mellitus.
En 2000, un comité de expertos7 analizó detenidamente esta clasificación a la luz de los
resultados obtenidos a lo largo de muchos años de estudio, tras lo cual propuso la introducción
7
de algunas modificaciones, que obedecen principalmente a la necesidad de clasificar la
enfermedad diabética desde un punto de vista etiológico.
En primer lugar, se eliminan los términos “diabetes mellitus insulinodependiente” y
“diabetes mellitus no insulinodependiente” por constituir una fuente de confusión y de
posibles malentendidos sobre el tipo de terapia necesaria.
Por el contrario, se conservan los términos “diabetes de tipo 1” y “diabetes de tipo 2”.
1. Diabetes mellitus de tipo 1: corresponde a aproximadamente el 10% de las personas
que padecen diabetes y en general aparece en la infancia o en la adolescencia. En la
diabetes de tipo 1, la carencia de insulina se produce a causa de la destrucción
autoinmune de las células β y determina generalmente una insulinodeficiencia absoluta.
La velocidad de destrucción de las células β es, no obstante, más bien variable, por lo que
la aparición de la enfermedad puede manifestarse de forma aguda, habitualmente en
niños y adolescentes, o más lentamente en adultos (en estos raros casos se habla de una
forma particular, denominada LADA, Late Autoimmune Diabetes in Adults).
2. Diabetes mellitus di tipo 2: corresponde a aproximadamente el 90% de los casos de
diabetes y se caracteriza por la combinación de una alteración en la secreción de insulina
y una reducción en la sensibilidad de los tejidos diana de esta hormona (músculos, hígado
y tejido adiposo). La base etiológica de la enfermedad es multifactorial y se caracteriza
por el concurso de componentes ambientales y genéticos. Las causas por tanto de la que
se ha definido como una nueva epidemia del siglo XXI hay que buscarlas en los hábitos
alimenticios y en el estilo de vida vinculados a la cultura occidental, así como a la herencia
de un background genético que predisponga al desarrollo de esta enfermedad.
3. Diabetes mellitus gestacional: se trata de una forma de DM2 con inicio o diagnóstico
de la intolerancia a la glucosa durante el embarazo. La diabetes gestacional puede remitir
tras el parto. No obstante, es frecuente que persista la intolerancia a la glucosa y la
posterior aparición de una DM2.
4. Otros tipos de diabetes:
Mutaciones monogénicas que alteran las funciones de las células beta: cromosoma 12,
HNF-1α (MODY 3); cromosoma 7, GCK (MODY 2); cromosoma 20, HNF-4α (MODY 1);
cromosoma 13, PDX1 (MODY 4), cromosoma 17 HNF-1β, (MODY 5), cromosoma 2
NEUROD1 (MODY6).
8
Trastornos genéticos de la acción de la insulina (insulinorresistencia tipo A,
leprechaunismo, síndrome de Rabson-Mendenhall, diabetes lipoatrófica, etc.).
Endocrinopatías (acromegalia, síndrome de Cushing, glucagonoma, feocromocitoma,
hipertiroidismo, somatostatinoma, aldosteronoma, etc.).
Otros síndromes genéticos vinculados a la diabetes (síndrome de Down, síndrome de
Klinefelter, síndrome de Turner, síndrome de Wolfram, ataxia de Friedreich, corea de
Huntington, síndrome de Laurence-Biedel, distrofia miotónica, porfiria, síndrome de
Prader-Willi, etc.).
Epidemiología y factores de riesgo
El porcentaje de la población mundial que padece diabetes mellitus se calcula en
aproximadamente un 5% del total, del cual en torno al 90% padece diabetes mellitus de
tipo 2.
La prevalencia de la DM2 se ha incrementado en todo el mundo en las últimas décadas a un
ritmo vertiginoso. En 2002 se computaron tan solo en Estados Unidos más de 18 millones
de personas afectadas por esta enfermedad8 y en la actualidad se ha diagnosticado DM2 a
uno de cada tres habitantes9.
La aparición de la DM2 tradicionalmente se ha referido en la edad adulta, a partir de los 40
años de edad. Ahora bien, desde hace un par de décadas se está asistiendo a una progresiva
anticipación del inicio de la enfermedad y en un número significativo de casos la
enfermedad se presenta ya en la edad infantil.
En 2001 la prevalencia de diabetes en Estados Unidos en la población de menos de 20 años
de edad se calculó en 1,8 casos por 1.000 habitantes10 y la intolerancia a la glucosa (primer
paso hacia el desarrollo de la diabetes mellitus) se encuentra ya presente en el 3% de los
adolescentes9. Estos datos sugieren que debe prestarse especial atención al posible
desarrollo de esta enfermedad ya en la edad pediátrica.
Entre los factores de riesgo más importantes para la aparición de la diabetes figuran:
obesidad (IMC igual o superior a 25 kg/m2 para la DM2), sedentarismo, hipertensión (PAS
igual o superior a 140 mmHg y/o PAD igual o superior a 90 mmHg), colesterol HDL (igual o
inferior a 35 mg/dl), triglicéridos (iguales o superiores a 250 mg/dl) e hipogonadismo11. El
9
aumento de la edad, además de asociarse a muchos de los cuadros patológicos referidos,
representa un factor de riesgo independiente para la aparición de la diabetes, ya que se
acompaña de una reducción fisiológica de la testosterona y del IGF-I y, por tanto, de una
menor sensibilidad de los tejidos periféricos a la insulina.
La predisposición genética al desarrollo de la DM2 es el resultado de la combinación de
varios loci (o genes) de susceptibilidad, cada uno con su repercusión específica sobre el
fenotipo. Los estudios de asociación GWAS han permitido comprender la base genética que
hace que una parte de la población sea más susceptible a desarrollar esta enfermedad. En
los últimos años, estos estudios han permitido identificar numerosos loci genéticos de
susceptibilidad al desarrollo de la enfermedad.
Hasta la fecha se han identificado 39 loci, y en cada uno de ellos se asocian numerosas
variantes genéticas con un mayor riesgo de desarrollar diabetes12.
Las principales conclusiones de los estudios GWAS realizados a gran escala han sido:
1. En una fracción mayoritaria de los loci, las variaciones genéticas vinculadas a la DM2
alteran la secreción de insulina. Esta observación subraya la importancia del estudio
de los islotes pancreáticos como tejido clave para comprender el papel del
componente genético en la fisiopatología de la DM2.
2. Salvo en casos rarísimos, las variantes genéticas identificadas se hallan en zonas no
codificantes del genoma, en ocasiones dentro de extensos intrones, o bien en regiones
definidas como gene desert, a distancias enormes de los genes. Esta última
observación sugiere que las variantes genéticas vinculadas a la DM2 modifican la
regulación de la expresión génica.
Las conclusiones resultantes de los estudios de asociación sobre la DM2 previamente
señaladas se centran en el papel desempeñado por la expresión génica en los tejidos
productores de insulina. De este modo, hemos considerado de capital importancia
profundizar en los mecanismos que rigen la regulación del perfil transcripcional de los
islotes pancreáticos de Langerhans a fin de arrojar luz sobre la enfermedad de la DM2.
10
Regulación genética
Cromatina y expresión génica
En las células eucariotas el ADN, depositario de la información genética que una célula
precisa para vivir, crecer y multiplicarse, se contiene dentro del núcleo, donde se presenta
como una compleja estructura nucleoproteica que recibe el nombre de cromatina.
Estructuralmente se presenta subdividida en aquellas regiones donde se encuentra
altamente condensada (heterocromatina) y otras regiones menos condensadas
(eucromatina). Ambas regiones muestran también una condición funcional diferente: el
estado menos condensado, representado por la eucromatina, es transcrito activamente,
mientras que el estado heterocromático es, por lo general, transcripcionalmente inactivo.
En la cromatina, el ADN se encuentra asociado a proteínas histonas y no histonas, y su
unidad fundamental se denomina nucleosoma.
El nucleosoma a su vez está constituido por un núcleo central discoidal resultante de la
agregación de 8 moléculas de histonas, en torno al cual se enrolla el ADN de manera
sinistrorsa en 1,65 giros.
Como es bien sabido, cada una de las células de nuestro cuerpo posee una copia idéntica de
material genético, aunque las células de tejidos distintos lo emplean de manera diferente,
de modo que, por ejemplo, las células que constituyen los islotes pancreáticos son capaces
de activar determinados genes (como el que codifica la insulina) y reprimir otros (por
ejemplo, la albúmina). Las células que constituyen los diferentes tejidos poseen por tanto
una red distinta de regulación de sus propios genes.
La organización del ADN en una estructura cromatínica permite empaquetar la totalidad
del material genético (de unos 2 m de longitud) dentro del núcleo celular (de en torno a 6
m de diámetro). De este modo, solo aquellos rasgos genómicos que resultan estrictamente
necesarios para la función celular se encuentran en un estado “abierto”, libre de
nucleosomas. Estas partes de ADN están por tanto expuestas al posible contacto, por
ejemplo, con factores de transcripción o enzimas capaces de transcribir el ADN en ARN, a
su vez traducido en proteínas, que representan la función última de un tipo específico de
11
células (como la producción de insulina en respuesta a la glucosa por parte de un grupo
celular que constituye el islote pancreático).
Las zonas desprovistas de nucleosomas son por tanto áreas del genoma de significativa
importancia en el proceso de regulación de la actividad transcripcional celular. Se localizan
típicamente en zonas no transcritas del genoma, cerca del inicio de transcripción de un gen,
donde puede tener una actividad del tipo “promoter”13, o bien a distancia de los genes y
desempeñar una función regulatoria, de tipo “enhancer”.
Las áreas de regulación de la actividad transcripcional de un tejido específico resultan de
particular interés para la genética humana por cuanto representan zonas de susceptibilidad
al desarrollo de patologías. Las mutaciones o alteraciones en la estructura de estas regiones
pueden de hecho dar lugar a alteraciones en la transcripción de genes clave susceptibles de
inducir perturbaciones moleculares que pueden manifestarse fenotípicamente como
enfermedades.
Código histónico
Recientes estudios han puesto de manifiesto una posible función de las histonas en la
regulación génica. Cada histona del octámero presenta una larga cola N-terminal que se
extiende fuera del nucleosoma: estas colas pueden experimentar numerosas modificaciones
químicas que influyen en la estructura de la cromatina, facilitando por ejemplo la
transcripción de un gen o, por el contrario, contribuyendo a su inhibición.
Existen ya numerosas pruebas que demuestran cómo muchos activadores de la transcripción
poseen una actividad histona acetilasa, así como, viceversa, muchos represores parecen
tener una actividad histona deacetilasa13,14.
Más concretamente, las modificaciones postraduccionales que afectan a las histonas pueden
ser acetilaciones (de residuos de lisina), metilaciones (de argininas y lisinas), fosforilaciones
(de serinas y treoninas), ubiquitinaciones, sumolizaciones y otras, actualmente poco
conocidas. El conjunto de las diferentes combinaciones de las modificaciones descritas
constituye el denominado “código histónico”, cuya lectura permite identificar las regiones
reguladoras del genoma.
12
En el estudio que describiremos en el párrafo siguiente, nos hemos centrado en la
trimetilación y la monometilación de la cuarta lisina de la histona 3. Estas modificaciones se
asocian con regiones con una actividad de regulación de la transcripción de los genes que les
son respectivamente proximales (H3K4me3, con función de tipo promoter) o distales
(H3K4me1, con función de tipo enhancer)15.
Asimismo, hemos analizado la acetilación de la lisina 27 de la histona 3 H3K27ac, que se
asocia a regiones activas en la inducción de la expresión génica tanto proximal como
distal16,17.
13
OBJETIVOS
El objetivo principal del proyecto es el de identificar en el genoma de los islotes pancreáticos
humanos adultos aquellas regiones no codificantes capaces de regular su expresión génica.
En particular, nos hemos propuesto: 1) crear un mapa de las regiones desprovistas de
nucleosomas en el genoma de las células que constituyen los islotes pancreáticos humanos
adultos; 2) identificar las modificaciones histónicas circunstantes; y 3) integrar estos
resultados con el perfil transcripcional de los islotes pancreáticos18.
14
METODOLOGÍA
Preparación de las muestras de islote pancreático.
Todas las muestras se han aislado de donantes de órganos que no presentaban ninguna
alteración del metabolismo glucídico. Los islotes pancreáticos se han aislado siguiendo los
procedimientos estándares19. Se hizo preceder de una incubación a 37 °C (en medio CMRL
1066 con un 10% de fetal calf serum) el transporte de las muestras, realizado a temperatura
ambiente en el mismo medio de cultivo, desde los centros de recogida del material clínico a
nuestros laboratorios. A su llegada, las muestras se pusieron nuevamente en cultivo a 37 °C
en el mismo medio, con adición de antibióticos (100 U/ml penicillin y 100 U/ml
streptomycin), durante tres días, antes de que se les aplicara la técnica FAIRE (Formaldehyde-
Assisted Isolation of Regulatory Elements).
Técnica FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements).
Tras tres lavados con buffer salino a temperatura ambiente, se ha añadido a las muestras de
islotes pancreáticos la cantidad de formaldehído precisa para obtener una concentración final
de un 1%. Después de incubarlas durante 10 minutos a temperatura ambiente, se ha añadido
glicina hasta una concentración final de 125 mM. Transcurridos 5 minutos, se han lavado
nuevamente los islotes tres veces en buffer salino a temperatura ambiente. Las células
tratadas de esta manera se han expuesto a 1 ml de buffer de lisis (2% Triton X-100, 1% SDS,
100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl a pH 8,0, 1 mM EDTA) y se han sometido a 5 ciclos de
centrifugación de 1 minuto con 0,5 mm glass beads (BioSpec). Tras ello se han sometido las
muestras a 15 ciclos de sonicación (Branson Sonifier 450D) a un 15% de amplitud. Después
de centrifugar a 15.000 g durante 5 minutos, se ha procedido a una extracción estándar de
ADN de las muestras con fenol-cloroformo. Un protocolo detallado de la técnica FAIRE ya fue
descrito anteriormente por Giresi P. et al.20.
Técnica ChIP (Chromatin Immuno Precipitation).
A las muestras sometidas a sonicación, según se ha descrito para la técnica FAIRE, se han
añadido 2 mg de anticuerpos (anti-H3Kme1, ab8895 Abcam, anti-H3K4me3 ab8580 Abcam,
anti-H2AZ3 ab4174 Abcam, anti-H3K27ac ab4729 Abcam) por cada 150 mL de cromatina
15
(correspondiente a unos 300-400 islotes pancreáticos procesados). Tras una incubación de
12 horas a 4 °C se ha procedido a añadir 40 mL de proteínas A y G y a una incubación de 2
horas a 4 °C.
Después de 3 lavados en low salt wash buffer, high salt wash buffer y LiCl immune complex
wash buffer, se han eluído los inmunocomplejos mediante la adición de 150 mL de IP elution
buffer.
El ADN aislado se ha purificado a continuación en columna (QIAquick PCR Purification Kit,
QIAGEN).
Secuenciación.
Los fragmentos obtenidos se han sometido a secuenciación mediante la plataforma Illumina
Genome Analyzer II siguiendo el procedimiento estándar21. Un total de 350 millones de
secuencias, constituidas por 36 bp cada una, se han alineado contra la secuencia de
referencia (hg18) utilizando Bowtie22 (command line: “bowtie -S -m 1 -n 1 -l 28 --
solexa1.3-quals”). El identificador obtenido de las secuencias alineadas se ha identificado
con base en la estadística mediante MACS23.
Las secuencias obtenidas de las cinco líneas celulares ENCODE (GM12878, HeLa-S3, HUVEC,
K562 y HepG2) (http://genome.ucsc.edu/ENCODE/) se han alineado empleando el mismo
método.
Análisis computacional de los Clusters of Open Regulatory Elements (COREs).
Para generar COREs específicos para los islotes pancreáticos utilizando la plataforma
computacional Galaxy24, hemos identificado regiones caracterizadas por contar con al menos
tres sitios de cromatina abierta específicos de los islotes separados unos de otros un mínimo
de 20 Kb. Un total de 3.348 regiones respondieron a estos criterios.
Como control hemos creado un set de regiones idéntico, en número y dimensiones, a los
COREs identificados, pero localizado según una distribución aleatoria en el genoma.
Las transcripciones RefSeq, ncRNA o Non-RefSeq Unigene se han asignado a los COREs
cuando la distancia al inicio de la transcripción era inferior a 10 Kb. Hemos utilizado el
software DAVID25 para evaluar las características ontológicas de los genes identificados.
16
Se ha evaluado la expresión de los genes identificados en varios tejidos (islote pancreático,
hígado, corazón, riñón, pulmón, músculo esquelético y tejido cerebral). Los datos en bruto
generados a partir de los microarrays Human U133A y GNF1H, normalizados según gcRMA,
se han obtenido del Novartis Gene Expression Atlas51. La diferente expresión entre los
tejidos se ha evaluado estadísticamente mediante el test ANOVA.
Análisis de clúster.
La subdivisión de las regiones identificadas a través de FAIRE y de H2AZ ChIP-Seq con base
en las modificaciones de las histonas se ha realizado utilizando el algoritmo de clúster
K-means en ventanas genómicas de 6 Kb centradas en la región diana empleando el software
Cluster326.
Análisis de ontología génica.
Para el análisis de ontología génica se ha empleado el programa en línea GREAT, utilizando
los parámetros de base27.
http://great.stanford.edu/public/html/index.php
Expresión génica del islote pancreático.
La expresión génica en el tejido pancreático endocrino se ha estimado mediante RNA-seq.
Se han extraído un total de 10 µg de ARN de una muestra de islote pancreático (pureza >90%)
mediante la utilización del TRizol (Gibco). Se han empleado resinas enriquecidas con poli-T
para aislar las fracciones de ARN mensajero y se ha sintetizado el ADN complementario
(cDNA) mediante una reacción de transcripción inversa cebada de random primers28.
Siguiendo la metodología estándar del protocolo “Illumina Genomic DNA sample prep kit”, se
ha procedido a la construcción de una librería de fragmentos de aproximadamente 200 bp.
Los fragmentos obtenidos se han sometido a secuenciación mediante la plataforma Illumina
Genome Analyzer II siguiendo el procedimiento estándar21, y se han alineado a la secuencia de
referencia (hg18) utilizando Bowtie. La relación entre el número medio de reads alineados a
los exones y el número de reads mapeados por millón (RPKM) se ha utilizado como
referencia para la cuantificación de la expresión de los genes anotados (RefSeq).
17
Los archivos pile-up para la visualización de la señal de chip-seq, así como la normalización
del número de reads alineados al genoma de referencia se han obtenido mediante programas
escritos ad hoc para este estudio empleando el lenguaje informático perl (cf. apéndice).
18
RESULTADOS
Identificación y caracterización de las regiones de cromatina
abierta en los islotes pancreáticos humanos
Hemos aplicado la técnica FAIRE20 a tres muestras de islotes pancreáticos humanos para
identificar las zonas del genoma desprovistas de nucleosomas (zonas de cromatina abierta)
que consideramos que son objeto de la conjunción de los factores de transcripción y capaces
por tanto de determinar la expresión de los genes en las células que constituyen el islote
pancreático.
Los fragmentos de ADN aislados a través de esta técnica se han sometido a secuenciación
masiva con secuenciadores de segunda generación (Illumina Genome Analyzer II). A
continuación se han alineado las secuencias obtenidas con la secuencia genómica de
referencia (hg18) utilizando el software Bowtie22 y se ha identificado la señal obtenida de las
secuencias alineadas con base en la estadística mediante MACS23, permitiéndonos así
localizar con precisión las coordenadas genómicas de las regiones de cromatina abierta en el
genoma del islote pancreático.
Hemos localizado el 29% de las áreas desprovistas de nucleosomas a una distancia superior a
2 Kb del inicio de la transcripción de los genes, mientras que las áreas restantes han sido
localizadas en las proximidades del inicio de la transcripción de los genes o dentro de la propia
estructura génica (Fig. 1 a).
De este modo ha resultado posible comparar los datos obtenidos del estudio en curso sobre
los islotes pancreáticos con los obtenidos por el mismo método (FAIRE-seq) de otras cinco
líneas celulares humanas (HeLa-S3, HUVEC, GM12878, HepG2 y K562) facilitadas por el
proyecto ENCODE29. Esta comparación ha puesto de manifiesto que el 44% de los sitios de
cromatina abierta eran particularmente propios de los islotes pancreáticos (áreas del
genoma abiertas exclusivamente en los islotes pancreáticos pero no accesibles en las otras
cinco líneas analizadas); hemos definido estas regiones como “sitios de cromatina abierta
específicos de los islotes”.
Tan solo el 15% de los sitios específicos de los islotes y nada menos que el 52% de los sitios
ubicuos (áreas abiertas tanto en el genoma de los islotes pancreáticos como en las otras
19
líneas celulares) se han localizado en las proximidades de los promotores de los genes (primer
exón y 2 kb antes del inicio de la transcripción del gen) (Fig. 1 b-c).
Fig. 1: Distribución de todos los sitios de cromatina abierta (FAIRE) identificados en el
genoma del islote pancreático (a), de los sitios compartidos con otras cinco líneas
celulares (b) y de los específicos de las células β (c).
Estos datos sugieren que los sitios reguladores capaces de determinar la especificidad del
perfil transcripcional en el islote pancreático se encuentran lejos de los promotores (46% de
los sitios específicos de los islotes), representando posiblemente sitios reguladores distales del
tipo enhancers (“intensificadores”). Estos resultados están respaldados por recientes estudios
realizados en las líneas celulares humanas15.
A continuación hemos evaluado si estos elementos reguladores se encuentran organizados
en estructuras susceptibles de poder ser incluidas en auténticos y genuinos dominios
funcionales, capaces de determinar la transcripción de los genes en el islote pancreático. El
objeto de este análisis es el de identificar aquellos genes sujetos a la regulación de los sitios
específicos de los islotes identificados.
Hemos observado que todos los sitios de cromatina abierta, y concretamente los específicos
del islote pancreático, se encuentran físicamente distribuidos en grupos dentro del genoma.
En particular, las regiones se encuentran separadas por una distancia máxima dentro de los
grupos de 20 Kb (significatividad calculada respecto de una distribución normal) (Fig. 3 a-b).
Esta apreciación nos ha permitido identificar 3.348 dominios que contenían al menos tres
sitios específicos de los islotes separados por menos de 20 Kb entre sí. Hemos definido estas
20
estructuras como COREs (Clusters of Open Regulatory Elements) (Fig. 3 c).
Fig. 3: Identificación de Clusters of Open Regulatory Elements (COREs) a partir de los
sitios de cromatina abierta específicos de los islotes.
Los COREs presentan unas dimensiones medias de 24 Kb y alcanzan unas dimensiones
máximas de 592 Kb (Fig. 4 a). Se presentan habitualmente asociados a una única unidad
transcripcional: en particular, se localizan en las proximidades (no más de 10 Kb) de un gen
(RefSeq) en el 69% de los casos (porcentaje alcanzado 52%; P=3,6x10-45) (Fig. 4 b).
A continuación hemos analizado la expresión de los genes identificados de los COREs en los
islotes pancreáticos en 6 tejidos distintos. El conjunto de genes identificados de los COREs se
encontraba mayoritariamente expresado en el islote pancreático y en el tejido cerebral
(P<<1x10-5) respecto de los otros tejidos (músculo, hígado, corazón, riñón y pulmón), de
conformidad con la naturaleza neuroendocrina de la célula β30 (Fig. 4 c). Los genes
identificados participan en funciones específicas de los islotes (canales iónicos y elementos
del aparato secretor). En concreto, aquellos que presentan en su interior un mayor número
de sitios reguladores específicos de los islotes contienen factores de transcripción: algunos ya
descritos como esenciales en el desarrollo y el mantenimiento del fenotipo beta-celular y
otros aún no caracterizados (Fig. 4 d).
Fig. 4: Caracterización de los Clusters of Open Regulatory Elements (COREs)
21
ba
c
d
En concreto, un subgrupo de COREs se extiende hacia el 3’ o el 5’ de loci codificantes,
factores clave en la regulación del desarrollo del páncreas endocrino. A continuación, en la
Fig. 5, se muestra un ejemplo de un CORE que se extiende 31 Kb hacia el 5’ de PDX1, un
factor de transcripción involucrado en la diferenciación beta-celular. En este locus, los sitios
específicos de los islotes identificados coinciden con enhancers previamente caracterizados y
conservados en la escala evolutiva, denominados “Área I-IV”, y otros sitios con probable
actividad de enhancer pero que aún no han sido caracterizados.
De estos datos se puede inferir que los COREs representan dominios de regulación capaces de
determinar el perfil transcripcional en el islote pancreático.
22
Fig. 5: Ejemplo de un Cluster of Open Regulatory Elements (CORE) que se extiende 31 Kb hacia el 5’ del factor de transcripción específico del islote PDX1
23
Caracterización de los elementos reguladores en los islotes
pancreáticos humanos
Con la finalidad de caracterizar la estructura de la cromatina y, por consecuencia, identificar
las áreas genómicas capaces de controlar el perfil transcripcional de la célula β pancreática,
hemos aplicado a muestras de islotes pancreáticos humanos, de manera paralela a la técnica
FAIRE, la metodología ChIP.
Para los experimentos de ChIP hemos empleado anticuerpos capaces de reconocer las
modificaciones histónicas H3K4me3, H3K4me1 y H3K27ac: en la literatura estas
modificaciones se han descrito en relación con los promotores de los genes (H3K4me3), con
las áreas con actividad de enhancer (H3K4me1)15 y con elementos reguladores proximales y
distales activos (H3K27ac)16. Asimismo hemos utilizado anticuerpos capaces de reconocer la
variante histónica H2AZ. La H2AZ, de hecho, sustituye a las histonas tradicionales formando
enlaces débiles con el ADN susceptibles de poder ser fácilmente reemplazados por factores de
transcripción: esta variante resulta por lo tanto enriquecida respecto de las regiones con
actividad regulatoria.
De manera análoga al procedimiento seguido para la técnica FAIRE, los fragmentos obtenidos
de los experimentos ChIP se han sometido a secuenciación masiva y se han alineado las
secuencias obtenidas con la secuencia genómica de referencia (hg18) empleando el software
Bowtie22. La señal obtenida de las secuencias alineadas se ha identificado mediante MACS23.
Combinando las regiones identificadas gracias a la técnica FAIRE con las caracterizadas por la
presencia de la variante histónica H2AZ, hemos identificado en torno a 95.000 regiones con
una probable actividad regulatoria en las células que constituyen el islote pancreático.
Gracias a un análisis de clúster, hemos podido caracterizar las regiones identificadas
atendiendo a las características de la cromatina circunstante (Fig. 6), definiendo 4 grupos
principales. Unas 14.000 regiones presentaban un enriquecimiento en H3K4me3 y H3K27ac
típico de los promotores (G1), mientras que en torno a 31.000 regiones presentaban una alta
densidad de histonas marcadas por las modificaciones H3K4me1 y H3K27ac (G3),
anteriormente descritas en elementos reguladores a distancia como enhancers. Otro grupo
presentaba un enriquecimiento de menor entidad de las mismas modificaciones histónicas
24
(G2), al tiempo que un número menor de regiones, aun encontrándose en un estado de
cromatina abierta, no presentaba ningún tipo de enriquecimiento de las modificaciones
histónicas analizadas en el estudio.
Para comprender las diferentes características y propiedades de las regiones génicas
identificadas, hemos realizado los siguientes análisis bioinformáticos:
1. La localización de estos elementos con respecto a los genes anotados en el genoma
(Fig. 6) ha puesto de manifiesto que efectivamente las regiones pertenecientes al grupo
G1, que presentan una firma epigenética a la de los promotores, se encuentran próximas
al inicio de la transcripción de los genes, al contrario que todos los restantes grupos
identificados.
2. Todos los elementos identificados, independientemente del grupo en que hayan sido
clasificados mediante el análisis de clúster, están constituidos por secuencias genéticas
filogenéticamente muy conservadas, lo que hace suponer una posible gran relevancia
biológica.
3. El análisis de los genes presentes en torno a las regiones génicas identificadas ha puesto
de manifiesto que, si bien al grupo G1 se asocian genes con unas características
ontológicas atribuibles a términos ubicuos de activación génica, las regiones del grupo
G3 se asocian fuertemente a genes que caracterizan la especificidad del islote
pancreático (cf. apéndice). Las regiones G3 rodean los genes que caracterizan las células
que constituyen el islote pancreático, como por ejemplo INS, GCK, ABBC8, PDX1, ISL1,
HNF-1α, HNF-4α, HNF-1β, NEUROD1 o RFX6.
4. Para comprender las posibles funciones de los elementos reguladores identificados,
hemos estudiado su relación con la actividad transcripcional de los genes circunstantes.
Solo las regiones G1 y G3 (promotores y enhancer) se asociaban con un incremento de la
transcripción de los genes circunstantes en el islote pancreático. Consecuentemente con
la identificación realizada a través del análisis de ontología genética, exclusivamente las
regiones pertenecientes al grupo G3 (enhancer) se asocian con una expresión específica
del tejido y, por tanto, con la transcripción de los genes expresados en el islote
pancreático y no en otros 16 tejidos analizados31.
Hemos definido aquí el reguloma del páncreas endocrino, esto es, el conjunto de todas las
regiones genéticas capaces de regular el perfil transcripcional del islote pancreático. Por otra
25
parte, también hemos identificado y caracterizado elementos reguladores proximales y
distales respecto de la estructura de los genes. En línea con recientes publicaciones15, hemos
demostrado que la colección de elementos reguladores distales de tipo enhancer es capaz de
regular la expresión de los genes específicos de los tejidos, en nuestro caso de los genes que
definen el islote pancreático de Langerhans.
Fig. 6: Mapa de los elementos reguladores de los islotes pancreáticos humanos.
26
CONCLUSIONES El estudio y la comprensión de la variabilidad interindividual representan uno de los
principales retos para la medicina moderna y la clave para alcanzar, en un futuro próximo, la
que se define como personalized medicine, en la que el enfoque terapéutico iniciado con la
delimitación del caso clínico a través de una exhaustiva anamnesis y de un análisis de los
hábitos alimenticios y del estilo de vida del paciente podrá ponderarse y complementarse de
manera personalizada con información sobre la susceptibilidad genética del sujeto, a fin de
planificar un abordaje terapéutico integral y, en definitiva, más tolerable y eficaz.
Es en este ámbito donde se circunscribe el estudio realizado en el transcurso de este
doctorado, que ha permitido arrojar luz sobre algunos de los procesos clave en la regulación
de la expresión génica en los islotes pancreáticos.
Hemos demostrado que las regiones capaces de regular y controlar la expresión génica
específica del tejido en los islotes pancreáticos de Langerhans son elementos reguladores
distales que se encuentran por lo general en dominios de cromatina abierta que hemos
denominado COREs. Una posterior profundización en la estructura cromatínica circunstante
ha permitido una precisa localización y caracterización de los elementos reguladores y de sus
funciones.
Los datos obtenidos constituyen por tanto el primer mapa detallado de las áreas no
codificantes capaces de regular la expresión génica de las células que constituyen el tejido
endocrino pancreático, esto es, zonas de susceptibilidad al desarrollo de enfermedades de la
homeostasis glucídica.
El valor de estos resultados estriba en la obtención tanto de mapas génicos como de nuevos
instrumentos que facilitarán el diagnóstico y la comprensión de la fisiopatología de los
síndromes caracterizados por alteraciones del metabolismo glucídico.
Gracias a este trabajo fijamos así las bases para el estudio y la identificación de las variantes
genéticas causativas que predisponen a la diabetes y a otros síndromes que afectan al
metabolismo glucídico; además, la ampliación del estudio a tejidos primarios procedentes de
pacientes con estas enfermedades permitirá poner de relieve aquellos procesos
fisiopatológicos, a nivel de la regulación génica, que se alteran en pacientes con disregulación
27
del metabolismo glucídico.
Queda todavía mucho por avanzar para comprender cómo una predisposición genética
puede traducirse en el desarrollo de una enfermedad compleja como la diabetes. La
caracterización del background genética constituye un sólido punto de partida, fundamental,
sí, pero aún insuficiente. El desafío que nos planteamos para el futuro es el de poder arrojar
luz sobre otro complejo proceso crucial: comprender y evaluar el efecto de las variantes
genéticas en su interacción con el entorno.
28
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