“Año de la inversión para el desarrollo rural y la seguridad alimentaria”

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

UNIDAD I

PRÁCTICA Nº01 : Curva de calibración de glucosa, etanol y protenias

DOCENTE : Angel Castro

CURSO : Operaciones Unitarias I

ESTUDIANTES :

GARCÍA PÉREZ, Carlos

RIVAS SANDOVAL, Walter

CICLO : VIII

Nvo. Chimbote. Octubre de 2013

CURVA DE CALIBRACION DE GLUCOSA, ETANOL Y PROTEINAS

INTRODUCCION:

La conversión microbiológica de carbohidratos para obtener biomasa y productos de interés industrial es tema de constante actualidad debido a la creciente dependencia de los recursos renovables. Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la formulación de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de operación de las plantas industriales.

El grado en que un microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala. Desde este punto de vista, resulta de sumo interés poder llegar a determinar, estimar o predecir rendimientos que den cuenta de las transformaciones que se están llevando a cabo en un biorreactor. Los balances de materia y energía resultan a tal fin de suma utilidad y su empleo se ha extendido ampliamente en ciencias básicas y aplicadas. La aparición en el mercado de sensores que permiten medir importantes variables delos cultivos microbianos y el uso de ordenadores acoplados a los biorreactores (biorreactor = recipiente en el cual se cultivan los microorganismos) han ampliado el horizonte para la aplicación de balances de materia y energía. la producción de biomasa (biomasa = concentración de microorganismos expresada en gramos de células secas / litro de cultivo), consumo de las fuentes de C y energía, de nitrógeno y Oxígeno y las producción de CO2 y desprendimiento de calor son algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de medidas experimentales y utilizadas en el planteo y cálculo de balances de materia y energía.

Antes de proceder a considerar el sistema de análisis propuesto, es conveniente introducir algunas definiciones y hacer ciertas consideraciones sobre algunas “regularidades” observadas experimentalmente en el cultivo de microorganismos.

Un aspecto también importante de conocer y determinar durante la cinética de crecimiento de microorganismos, es su biomasa, la cual de encontrarse en un medio de cultivo que contenga todo los nutrientes necesarios para su crecimiento, ha de permitir el incremento de éste; lo cual además se puede determinar mediante densidad óptica con la ayuda de un espectrofotómetro, así también mediante el peso seco de la biomasa, en los cuales los valores tanto de las absorbancias como de los pesos deben de ser crecientes.

OBJETIVOS:

1. Elaborar curva de calibrado de DNS.

2. Elaborar curva de calibrado para proteínas mediante el método de Lowry.

MARCO TEORICO:

Curva de calibrado

La curva de calibrado es un método de química analítica empleado para medir la

concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de

elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en

principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de

espectrofotometría) y la variable a determinar (concentración). Para ello, se efectúan

diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el

consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas; después,

se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución de la variable

independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta. Se dice pues que la

respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva de calibración, se

puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del

analito. Las curvas de calibración suelen poseer al menos una fase de respuesta lineal

sobre la que se realiza un test estadístico de regresión para evaluar su fiabilidad.

Método del DNS

Consiste en la reacción generada por el extremo reductor del azúcar frente el ácido 3,5-

dinitrosalícilico y su conversión en acido 3-amino-5-nitrosalicilico y ácido D-glucónico. Esta

reacción genera que el color amarillo del 3,5-dinitrosalicilico se convierta en color rojo

ladrillo. Para seguir el protocolo descrito por Miller se debe conocer la composición de

DNS que está dada por fenol, bisulfito de sodio, hidróxido de sodio, sal de Rochelle y

ácido 3,5-dinitrosalicilico. Para generar la reacción es necesario que la mezcla entre el

reactivo y el azúcar reductor se lleve a cabo mediante el calentamiento de la muestra en

un choque térmico durante en el cual se procede 5 minutos en un recipiente con agua

hirviendo para permitir la apertura de la molécula en forma de anillo y dejar el extremo

reductor expuesto para la reacción. Luego se establece el choque térmico sumergiendo la

muestra durante 5 minutos en hielo para detener tal reacción y finalmente es leído por

medio de espectrofotometría a 540nm.

Método de Bradford para determinación de proteínas

Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las

proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja.

Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un

coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 μg),

simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las

sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Elaboración de curva de calibrado para glucosa: Método de DNS

1. Se añade 1 mL de reactivo DNS a cada tubo de ensayo que contiene 1 mL de muestra

a analizar.

2. Mantener la mezcla en baño de agua a ebullición durante 5 minutos, luego enfriar con

agua helada por un tiempo de 3 minutos.

3. Añadir 5 ml de agua destilada a cada tubo de ensayo, dejar reposar por 15 minutos,

pasados estos, agitar hasta homogenizar la solución obtenida.

4. Leer las muestras a una longitud de onda de 540 nm, utilizando agua como blanco.

5. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de

calibrado.

Determinacion de proteínas por el método de Lowry:

1 Colocar la muestra problema 0,05 mL, 0.95 mL de agua destilada y 0.5 mL

reactivo de Lowry.

2 Agitar energéticamente y dejar 15 minutos.

3 Agregar 5 mL de reactivo de Folin, agitar energéticamente y dejar 30 min en

reposo.

4 Leer la absorbancia a 500 nm.

RESULTADOS:

A. Llenar la siguiente tabla para azucares reductores por DNS

Tubo Solucion estándar de glucosa

(0.1 g en 50 mL) en mL

Agua destilada mL Concentracion

g/L

Absorbancia 540

nm

1 0 1 Blanco 0.018

2 0.1 0.9 0.2 0.115

3 0.2 0.8 0.4 0.152

4 0.3 0.7 0.6 0.317

5 0.5 0.5 1.0 0.446

6 0.6 0.4 1.2 0.588

7 0.7 0.3 1.4 0.737

8 0.8 0.2 1.6 0.771

9 0.9 0.1 1.8 0.887

10 1 0 2 1.027

0 0.5 1 1.5 2 2.50

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.21,027

0,887

0,737

0,446

0,317

0.018

f(x) = 0.541357142857143 x + 0.0204761904761905R² = 0.996914606696267

Gráfica 1. Curva de calibrado de la concentración de la glucosa mediante el método de DNS.

Concentración de glucosa en g/L

Abso

rban

cia a

540

nm

B. Llenar la siguiente tabla para determinación de proteína Lowry:

Tub

o

Solucion estándar de

seroalbumina (1 mg/ml) en

mL

Agua destilada

(mL)

Concentracion

(mg/mL)

Absorbancia

(500 nm)

1 0 1 Blanco 0.0052

2 0.2 0.8 0.2 0.008

3 0.3 0.7 0.3 0.015

4 0.4 0.6 0.4 0.025

5 0.6 0.4 0.6 0.028

6 0.8 0.2 0.8 0.045

7 1 0 1 0.045

DISCUSION:

Hartree (1972), las lecturas de absorbancia obtenidas en la elaboración de la curva de

calibrado para determinación de glucosa, se dieron de manera decreciente y de forma

proporcional al contenido de glucosa en las muestras utilizadas, lo cual es validado con la

gráfica y el coeficiente de correlación lineal obtenido, R² = 0.9901, lo cual nos indica que

el comportamiento de los puntos, relación entre la concentración de glucosa en las

soluciones y la absorbancia tienen un comportamiento lineal, mejor dicho que a mayor

concentración de glucosa en las soluciones se obtendrá mayor absorbancia.

CONCLUSION:

Lo obtenido es adecuado y confiable para realizar la curva de calibrado para

determinar las concentraciones de glucosa en otras soluciones, debido al

coeficiente de correlación lineal obtenido, R² = 0.9969.

BIBLIOGRAFIA:

1. Alarcón Elías; A. 2010. Producción de etanol por zymomonas mobilis. México distrito federal; México. Tesis de maestría.

2. Bradford M (1976) A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.

3. Buitrago Estrada Johana Carlina, Tenjo Camacho Dolly Giselle, 2007. Obtencion de un sustrato Fermentable de origen vegetal y su evaluación con células libres de Saccharomyces cerevisiae. Trabajo de Grado para optar el titulo de microbiólogo Industrial.