cultivos microbiologicos referencia

Cultivos microbiológicos dereferenciaAutor: Rafael Amadeo Mateo Capilla

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Presentación del curso

Curso destinado sobre todo a profesionales del campo de la microbiología yaquellos que por formación puedan interesarle lo relacionado con los cultivos dereferencia.

Se recoge de modo simple en este curso los requisitos y procedimientos a teneren cuenta, de acuerdo a las normas establecidas para los laboratoriosmicrobiológicos y cultivos de referencia.






1. Cultivos de referencia

(Ref. Norma ISO 17025)

Los cultivos de referencia

Es el conjunto constituido por cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo.

Un laboratorio de microbiología cuenta con cultivos de referencia, a fin de acreditar o conservar laacreditación de un ensayo. Así, el número, la elección del género y su especie son dependientesde los ensayos que se elaboran y de las necesidades que asumen estos.

La necesidad de los cultivos de referencia:

La necesidad de los cultivos de referencia parte de demostrar una "trazabilidad". Para que ello selleve a cabo, se diseña y se sigue un protocolo documental a fin de que se mantenga un buen usoy manejo de dichos cultivos.

Los procedimientos que han de observarse de forma estricta son:

· La evaluación de la calidad de los medios de cultivo.

· La práctica de controles de calidad interno durante la ejecución de los ensayos.

· La realización de controles de calidad de reactivos.

· Pruebas confirmatorias, tales como la "prueba de CAMP"

· La validación demétodos.

Requisitos de los cultivos de referencia

Para que se cumpla un cultivo de referencia debe darse una serie de requisitos. Estos son:

· Células microbianas capaces de crecer; dándose una viabilidad.

· Cepas de referencia. Las colecciones aprovisionarán las cepas con instrucciones para surecuperación.

· Debe tratarse de un cultivo puro. Ha de observarse la pureza de la misma.

· La estabilidad genética. Es requisito fundamenta el que se de la estabilidad y elmantenimiento de características genotípicas y fenotípicas.

En todos los casos la manipulació ny modo de conservaciónde las cepas debe tenerespecial prevención sobre:

· El deterioro de las cepas.

· La contaminación cruzada.

· Mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas.

Asimismo, su crecimiento característico debe ser documentado en lo que respecta a cada mediosobre el que se manipula como cepa control.

El material de referencia

Se denomina material de referencia al material o sustancia que ostenta valores de una o máspropiedades suficientemente homogéneas y bien conocidas que permite su uso en la calibraciónde aparatos, la evaluación de un método de medición o la atribución de valores a estos materiales.

Las cepas de referencia

A fin de demostrar la trazabilidad, las cepas de referencia deben obtenerse directamente de unacolección con la reseña nacional o internacional de cultivo de referencia reconocido.






colección con la reseña nacional o internacional de cultivo de referencia reconocido.

Según la "ISO 11133-1:2000", son:

· microorganismos definidos, por lo menos a nivel de género y especie

· catalogados

· muy caracterizados

· de origen conocido

Dichas cepas son distribuidas y presentadas comercialmente liofilizadas; asimismo, los organismos de acreditación son los encargados de considerar válida la fuente de procedencia de lacepa a fin de que se cumpla con el requisito de prevenir mutaciones, deterioro o alteración de lascaracterísticas típicas de las cepas.

El número de repiques a partir de la cepa de referencia a de ser limitado, aceptándose hastacinco repiques como máximo a partir de dicha cepa de referencia.

Asimismo, toda cepa adquirida por una vía que no sea la propia colección, no podrá mencionarseutilizando el número que tienen en esa colección, sino únicamente como derivada de la cepa decolección.

Adquisición de las cepas de referencia

La adquisición de las cepas de referencia pueden provenir de:

· Obtención directa a partir de una colección nacional e internacional reconocida.

· Proveedores comerciales certificados por ISO que 9001. Comercializan repiques de cepasde referencia adquiridas en una colección reconocida. Generalmente el 3er o 4º repique.

En dicha adquisición se debe mantener sus recipientes originales; siendo de obligadorequerimiento en la recepción o compra de insumo, el certificado de origen, donde conste elnúmero de repique y el origen entre otros.

Proveedores de cepas de referencia

1ª. Opción:

· ATCC (American Type Culture Collection).

· SVM (Foundation for the Advancement of Public and Environmental Protection)

· CECT (Colección española de cultivos tipos).

· CNCM. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) Institut Pasteur

· Etc.

2ª. Opción:

Los proveedores acreditados por ISO 9001 que llevan a cabo repiques a partir cepas adquiridas enla colección reconocida.

Oxoid Companie.






2. Cepas de colección de referencia

Material de referencia certificado.

Material o sustancia acompañado de un certificado, que posee valores de una omás propiedades, certificados por un procedimiento que establece sutrazabibilidad a una realización exacta de la unidad en la cual se expresan losvalores de dichas propiedades, para el cual cada valor certificado estáacompañado por su incertidumbre, con un nivel de confianza establecido.

Cepas de referencia certificadas:

La cepas de referencia certificadas es un material de referencia certificadobiológico.

La colección certifica que se suministra una determinada cepa, que es un cultivopuro, y que se han observado las convenientes pruebas morfológicas,bioquímicas y moleculares acomodadas.

Asimismo, al tratarse de un material biológico puede darse dificultades decertificación.

Reconstitución de las cepas de referencia

· Las Cepas de referencia adquiridas por el laboratorio de microbiología sonregistradas en planilla como marca el procedimiento.

· Las Cepas de referencia son almacenadas entre 0-5 º C hasta su uso.

· En la reconstitución y siembra de la Cepas de referencia, se utiliza elmedio de cultivo, las condiciones de incubación y el procedimiento indicado enlas disposiciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor delas cepas.

· Las Cepas de referencia serán sometidas a un control de calidad depureza y viabilidad, así se le dará registro.

Registro de cepas de referencia

· Identificación de la cepa.

· Género y especie del microorganismo

· TIPO y Nº de colección.

· Nº de lote.

· Fecha de recepción.

· Control de calidad de la cepa de referencia Conforme (SI/NO).

· Fecha de caducidad de la cepa.

· Personal responsable.

Control de calidad de pureza y viabilidad:






Este control se realiza a diferentes niveles del proceso; asimismo, se desempeñacada vez que se realiza un replique. El objetivo de dicho control es el deasegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos.

Frecuencia de realización de este control:

· Es el laboratorio el que establece en cada caso la frecuencia derealización del control de calidad de pureza y viabilidad para las cepas de reservaalmacenadas.

· En caso de no ostentar las características establecidas se ejecuta la"acciones correctivas" que se establecen en el procedimiento.

Registro de Control de calidad de pureza y viabilidad de las cepas:

· Fecha del control.

· Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. TIPO yNº de colección.

· Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo).

Pruebas a realizar (depende del microorganismo):

1. Coloración de Gram

2. Características de las colonias en medios selectivos

3. Pruebas bioquímicas y serológicas.






3. Cepas de reserva y de trabajo

Las cepas de reserva

Se considera cepas de reserva, aquellas cepas idénticas logradas mediante unúnico subcultivo de una cepa de referencia, o lo que es lo mismo, una serie dealícuotas de cultivos idénticos elaboradas en el laboratorio por subcultivo de lacepa de referencia.

Las cepas de reserva son preparadas y conservadas en el laboratorio, dentro delcual se destina un luga r para su almacenaje, señalando claramente de que setrata de cepas potencialmente peligrosas y cuya manipulación quedaexclusivamente restringida al personal autorizado.

Métodos para la preservación y mantenimiento de las cepas de reserva

Los métodos para la preservación y mantenimiento de cepas de reservaobtenidas a partir de cepas de referencia son la LIOFILIZACIÓN y laCONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS.

Se da el uso de agentes Crioprotectores

La Liofilización

Esta se define como el proceso de desecación desde el estado congelado.

Los Agentes Crioprotectores:

· Leche descremada de calidad microbiológica, con proceso de esterilizaciónpor vapor fluente, al 10% o 20% P/V. Asimismo, puede añadirse aditivos tales como el inositol.

· Dicho producto puede conservarse en refrigeración o a temperaturaambiente por años.

Congelación a baja temperaturas

· Agentes Crioprotectores:

1. Leche descremada de calidad microbiológica (esterilización por vaporfluente) al 10% o 20% P/V.

2. Aditivos, del tipo del Inositol.

3. Glicerol al 10%.

4. Caldo BHI con glicerol 20%.

· Proceso de congelación:

a. Equipamiento o insumos para lograr la congelación

· Congelador o cámara o uso de Nitrógeno líquido.

b. Proceso de congelación






· Temperaturas de congelación:

La temperatura de congelación ideal es de -70° o -80° C, e incluso menortemperatura. En el caso de temperaturas superiores, como los -20° C, seconsidera como no ideal aunque podría ser la única forma posible; no obstantees preferible -40° C.

· Envases:

Los envases utilizados son el criovial o tubo estéril.

· Conservación del producto:

Su conservación puede darse a temperatura congelación por años.

· Posibles inconveniente:

Los inconvenientes que se puede encontrar en el proceso de congelaciónson entre otros:

1. problemas y pérdida de las cepas,

2. la falta de suministro de energía,

3. falta de insumos,

4. avería del equipamiento.

La preservación y mantenimiento de cepas de reserva

En la conservación y modo de mantener los microorganismos vivos, puros y lacepa microbiana auténtica, es primordial tener en cuenta los conocimientosfundamentales microbiológicos, suministrar condiciones ajustadas para cada tipode microorganismo, así mismo, tener en cuenta que con cada subcultivo, existeun riesgo de mutación de la cepa y para ello debe evitarse el crecimiento.

Factores determinantes de la viabilidad de la cepa

Los factores que determinan la viabilidad de las cepas, la cuales están sometidasal proceso de congelación para su reserva, son:

· el tipo de cepa, así por ejemplo que la resistencia de las bacterias Grampositivas es mayor que en el caso de las Gram negativas, y

· las óptimas condiciones del cultivo antes de someterse a bajas temperaturas.

Condiciones previas a la exposición de bajas temperaturas

Las condiciones previas que ha de tenerse en cuenta a la exposición de bajastemperaturas de las cepas son:

· La edad del cultivo

- la capacidad del microorganismo de sobrevivir puede verse afectada porla edad del cultivo.

- Los cultivos muy jóvenes o muy viejos muestran menor resistencia alshock térmico.

- La edad idónea corresponde con el fin de la etapa logarítmica, siendo el






principio de la fase estacionaria la de mayor probabilidad de recuperación, siendoel de los microorganismos en general de 24 horas de incubación a 37º C.

· Las condiciones de desarrollo

Estas son consideradas primordiales. Así observamos, por ejemplo, como laslevaduras que crecen aireadas y agitadas gozan de una mayor resistencia a latemperatura que aquellas que desarrolladas en un medio sólido.

Igualmente, se deben respetar y observar las instrucciones dadas por losfabricantes de los sistemas de preservación de cepas disponibles comercialmente.

Como ejemplo, observamos la supervivencia de los microorganismosalmacenados a -20º C en Mast Cryobank (Ref.: Mast Cryobank TM, ETICOR)

* Microorganismo..............................................................................Supervivencia

· Enterobacteraerogenes................................................................................. 48 meses

· Pseudomonaaeruginosa............................................................................... 18 meses

· Salmonellatyphimurium................................................................................. 48meses

· Staphylococcusaureus...................................................................................48meses

· Listeriamonocytogenes....................................................................................48meses

· Listeriaivanovii................................................................................................48meses

· Rhodococcusequi..........................................................................................48 meses

· Bacillus cereus................................................................................................24meses

· Clostridiumperfringes.....................................................................................48 meses

Procedimientos a seguir en las cepas de reserva

1. Previo a la inoculación, se rotulan los tubos o crioviales donde sealmacenan las cepas reserva. En cada criovial queda la siguiente información:

· Identificación de la cepa

· Tipo y Nº de colección

· Nº de repique

· Fecha de realización del C. res. (cepa de reserva)






· Fecha de vencimiento del criovial

· Nº de tubo o criovial

2. El desarrollo microbiano logrado, se inocula asépticamente en el mediolíquido sobrenadante que contienen los crioviales.

3. Congelar o liofilizar la cepas de reserva.

4. Manipulación de la cepa de reserva a fin de obtener cepas de trabajo. Enel caso de las cepas congeladas de crioviales, se debe realizar este paso paraprevenir el descongelamiento y la contaminación del criovial a través del trasladoen su propia caja termostatizada y que repique en campana de flujo laminar.

Asimismo, ha de observarse que

· En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva, no se debenvolver a congelarse.

· El criovial vencido es eliminado del cepario y se registra.

· Cuando se fracciona alícuotas en leche u otros agentes crioprotectores,se utilizan, se descongelan y no se volverá a congelar ni a usar.

· Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se deben utilizar.

Registro de cepas de reserva

· Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo.

· TIPO y Nº de colección.

· Nº de Lote Cepa referencia.

· Nº de criovial o vial.

· Fecha de reconstitución de la Cepa referencia.

· Nº de repique.

· Frasco en uso.

· Fecha de baja criovial.

· Ubicación de almacenamiento.

· Observaciones

Las cepas de trabajo

Las cepas de trabajo son los Subcultivos de microorganismos obtenidos a partirde las cepas de reserva a fin de ser empleados en los ensayos que hagan falta.

Obtención de cepas de trabajo:

· Los cultivos de trabajo se consiguen a partir de la Cepas de reserva sobreun medio sólido o líquido no selectivo adecuado manejando un ansa estéril eincubando en condiciones adecuadas.

· Las cepas de trabajo no convienen ser subcultivadas.






4. Utilización general de cepas de referencia ysimopsis de los cultivos de referencia

(SEGUN LA ENAC)

SINOPSIS DE LOS CULTIVOS DE REFERENCIA

· El laboratorio de microbiología contará con cultivos de referencia.

· Los cultivos de referencia se manipulan en el laboratorio para:

1. Evaluar la calidad de los medios de cultivo,

2. asegurar la calidad de los resultados de ensayo

3. validar métodos microbiológicos.

· Se procederá:

a. al manejo de cultivos de referencia,

b. al aseguramiento de la trazabilidad y del origen de la cepa,

c. al conocimiento de las características de las cepas usadas en los ensayos afin de mantener su viabilidad y sus caracteres bioquímicos.






5. Criterios de validación y de mantenimientodel laboratorio microbiológico

(SEGUN LA ENAC)

Directrices para la calibración y lo controles de calibración

La frecuencia con la que se realizan la calibración y los controles de calibraciónestriba del uso, tipo y resultados precedentes de cada uno de los equipos. Así sesugiere el siguiente cuadro:






6. Criterios para la validación y verificación delos equipos

(SEGUN LA ENAC)

Como en el esquema anterior, la frecuencia con la que se realizan los criteriospara la validación y verificación de los equipos vienen dados por el uso, tipo yresultados precedentes de cada uno de los equipos. Así se sugiere el siguientecuadro:






7. Criterios para el mantenimiento de losequipos

(SEGUN LA ENAC)

La frecuencia con la que se realiza el mantenimiento de los equipos estribará dela necesidad, el tipo y las características precedentes de cada aparato.






8. Glosario de términos según la EntidadNacional de Acreditación

A continuación se recogen tal cual los terminos definidos por la Entidad Nacionalde Acreditación, a fin de respetar la exactitud en lo que se refiere a terminologíay definiciones, así como su referencia ISO.

Calibración

Conjunto de operaciones que permiten establecer, en condiciones específicas, larelación existente entre los valores indicados por un instrumento de medida o unsistema de medida, o los valores representados por una medida material o unmaterial de referencia, y los valores correspondientes obtenidos mediante unpatrón de referencia.NOTAS

1 El resultado de una calibración permite asignar valores de mesurandos a lasmarcas de escalas arbitrarias o estimar los errores de indicación de losinstrumentos de medida.

2 Una calibración permite también determinar otras propiedades metrológicas,como el efecto de las magnitudes de influencia.

3 El resultado de una calibración puede registrarse en un documento, enocasiones denominado certificado de calibración o informe de calibración.[VIM: 1993 ISO Vocabulario internacional de términos básicos y generales enmetrología]

Material de referencia certificado

Material de referencia, acompañado de un certificado, en el cual uno o másvalores de sus propiedades han sido certificados mediante un procedimiento queestablece su trazabilidad a una realización exacta de la unidad en la que seexpresan los valores de dichas propiedades. Cada valor certificado se acompañade una incertidumbre y el nivel de confianza correspondiente.

[Guía ISO 30:1992]

Límite de detección

Aplicado a análisis microbiológicos cualitativos - Número mínimo demicroorganismos que pueden ser detectados, pero en cantidades que no puedenestimarse con precisión.

Desviación negativa

Ocurre cuando el método alternativo da un resultado negativo sin confirmación yel método de referencia da un resultado positivo. Esta desviación se convierte enun resultado negativo falso cuando puede demostrarse que el resultadoverdadero es positivo.

Desviación positiva

Ocurre cuando el método alternativo da un resultado positivo sin confirmación y






el método de referencia da un resultado negativo. Esta desviación se convierteen un resultado positivo falso cuando puede demostrarse que el resultadoverdadero es negativo.

Cultivos de referencia

Término colectivo que se refiere a cepas de referencia, cepas de reserva ycultivos de trabajo.

Cepas de referencia

Microorganismos definidos por lo menos al nivel de género y especie,catalogados y descritos según sus características y preferiblemente de origenconocido. [ISO 11133-1:2000] Normalmente obtenidos de una colección nacionalo internacional reconocida.

Material de referencia

Material o substancia uno o más de cuyas propiedades tienen valoressuficientemente homogéneos y claramente establecidos como para poder serutilizados en la calibración de un aparato, la evaluación de un método de medidao la asignación de valores a materiales. [Guía ISO 30:1992]

Método de referencia

Método investigado a fondo, que describe con claridad y exactitud las condicionesy los procedimientos necesarios para medir los valores de una o máspropiedades y que ha demostrado tener una exactitud y una precisión apropiadaspara el uso que pretende hacerse del mismo, de manera que puede utilizarsepara evaluar la exactitud de otros métodos empleados pararealizar la misma medición y, en particular, para caracterizar un material dereferencia. En general se trata de un método normalizado nacional ointernacional.

Cepas de reserva

Cepas idénticas obtenidas mediante un único subcultivo de una cepa dereferencia. [ISO 11133-1:2000]

Exactitud relativa

Grado de concordancia entre los resultados del método evaluado y los obtenidosutilizando un método de referencia reconocido.

Repetibilidad

Grado de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismomesurando realizadas en las mismas condiciones de medición. [VIM: 1993 ISOVocabulario internacional de términos básicos y generales de metrología]

Reproducibilidad

Grado de concordancia entre los resultados de mediciones del mismo mesurandorealizadas en diferentes condiciones de medición. [VIM: 1993 ISO Vocabulariointernacional de términos básicos y generales de metrología]

Sensibilidad






Fracción del número total de cultivos o colonias positivos que son asignadoscorrectamente con el método utilizado. [ISO 13843:2000]

Especificidad

Fracción del número total de cultivos o colonias negativos que son asignadoscorrectamente con el método utilizado. [ISO 13843:2000]

Cultivo de trabajo

Subcultivo primario obtenido de una cepa de reserva. [ISO 11133-1:2000]

Validación

Confirmación, mediante la aportación de pruebas objetivas, de que se hancumplidos los requisitos para el uso pretendido o una aplicación específica. [ISO9000: 2000]

Verificación

Confirmación, mediante la aportación de pruebas objetivas, de que se hancumplido los requisitos establecidos. [ISO 9000:2000]

REFERENCIA: "Anexo I al G-ENAC-04 Rev.3 Noviembre de 2002 Glosariode Términos"






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