Cultivo organotípico de un tumor derivado de la ascitis de N el son en asociación con mesone fros de embrión

de pollo

V. ZAYDA MEDINA

l. DELEON R.

Departamento de Morfología Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, l. P. N.

ZAYDA MEDINA, V. & l. DEI.EÓN R., * 1969. Cultivo organotipico de un tumor derivado de la ascitis de Nelson en asociación con mesonefros de embrión de pollo. An. Ese. nac. Cienc. biol., Méx., 181 287-305.

Fecha de publicación: Octubre l• de 1970.

RESUMEN: Se establece un cultivo organotípico de la ascitis de Nelson. El tumor só­lido cultivado se obtiene por inoculación de la ascitis de Nelson por via intradérmica ab­dominal en ratones. Se cultivan fragmentos del tumor sólido de Nelson en asociación con mesonefros de embrión de pollo según el método de Wolff ( 1958), al que se introdujeron algunas modificaciones. Los cultivos se trasplantaron cada cinco o seis dias a medio nuevo con mesonefros recién obtenidos. Algunos cultivos pudieron mantenerse hasta durante 20 meses.

El crecimiento de los tejidos cultivados "in vitro" es de dos tipos: organi­zado y no organizado. En el crecimiento no organizado, cuando el medio es rico en substancias estimulantes del crecimiento, las células del trasplante emigran al medio con gran rapidez y se multiplican para formar amplias capas de célu­las indiferenciadas. Por otra parte, el crecimiento organizado corresponde más de cerca al crecimiento normal del organismo; cuando ocurre, el trasplante au­menta como un todo, la emigración de las células a partir de dicho trasplante se reduce a un mínimo, la estructura histológica se conserva y el cultivo suele continuar desarrollándose sin modificarla y aun conservando su patrón anatÓ-· mico (Fell, 1940; Borghese, 1958).

Los métodos modernos de cultivo de órganos fueron ideados por Shange­wa ys y Fell ( 1926) como medios para estudiar el ulterior desarrollo de yemas indiferenciadas de miembros y rudimentos de ojo "in vitro".

Wolff y su escuela (E. Wolff, 1954; E. Wolff y Schneider, 1957) esta­blecieron una verdadera técnica de cultivo organotípico con objeto de hacer un análisis de la acción de substancias estimulantes e inhibitorias y de la interac­ción de los órganos asociados, manteniendo en parabiosis órganos embrionarios de pollo y tejidos cancerosos, observando que se multiplican a expensas de las células embrionarias y explicando que la simbiosis que en un principio existe

* Becario de la COF AA

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entre las células normales de especies diferentes, se torna posteriormente en un "parasitismo".

En el presente trabajo tomando como base la técnica de Wolff se establece un cultivo organotípico asociando mesonefros de embrión de pollo con un tumor derivado de la ascitis de Nelson.

MATERIAL Y MÉTODOS

RECIPIENTES DE SIEMBRA.-Se usaron "godetes" de vidrio de 45 mm por lado y 15 mm ele grosor que tienen una concavidad de 35 mm de diámetro por 10 mm de fondo y 6 ce de capacidad. Los godetes se colocan sobre una capa de algodón dentro de una caja de Petri de 20 mm de fondo, lo que permitirá al cultivo mayor posibilidad de intercambio gaseoso.

CucHILLAs.-Se fabrican ex profeso soldando fragmentos de hojas de afei­tar de doble filo nuevas e inoxidables, con agujas de disección de metal (Fig. 1).

Medios de cultivo: Líquido de Gey, líquido de Tyrode, extracto embriona­rio, solución salina al 0.8%, solución de gelosa al 1 % en líquido de Gey.

Tumor ascítico de Nelson: Para inducir el tumor sólido, se anestesia hasta darle muerte a un ratón que contiene la bolsa ascítica, se abre la pared abdo­minal previa desinfección con solución de yodo dejando al descubierto la bolsa, se aspira con pipeta estéril, 0.1 mi del líquido ascítico que se diluye en 2.9 mi de solución salina estéril. De esta solución se inyecta 0.1 mi a ratones por vía intradérmica en región abdominal, para producir en diez días un tumor sólido. A otros ratones se les inyecta, por vía intraperitoneal la misma cantidad de lí­quido ascítico diluido para producir y mantener la ascitis que se forma a los siete días.

El tumor sólido así obtenido se extirpa y se coloca en una caja de Petri con solución salina estéril y tibia. Un fragmento de este tumor se pasa a nueva solución salina para enjuagarlo perfectamente y eliminar la sangre que pueda contener. Esta porción se utiliza para obtener los fragmentos de siembra. Todo este procedimiento se efectúa en las más estrictas condiciones de esterilidad.

MÉTODO DE SIEMBRA.-Una vez que se ha cerrado el cuarto de siembra, se desinfecta el campo de trabajo (Fig. 2) con solución de fenol al 5% en agua destilada. Se saca el tubo de extracto embrionario del congelador colocándolo en una gradilla metálica para que a temperatura ambiente se descongele. También se sacan los demás líquidos, para que al momento de usarse no tengan la tem­peratura del refrigerador.

En tripiés con rejilla de asbesto y al mechero de Bunsen, se pone en baño­maría la gelosa para que se licúe y al mismo tiempo se ponen a esterilizar por ebullición las cuchillas, pinzas cun·as y de dientes de ratón.

Mientras se licúa la gelosa, se cortan los fragmentos de siembra colocando dentro de una caja de Petri un portaobjetos <le Maximow sobre el que se dispone el fragmento de tumor mantenido en solución salina para efectuar los cor­tes con las cuchillas sobre la superficie esmerilada plana, procurando que los cortes sean precisos, sin desgarrar y deslizando una sola vez por cada corte. Se obtienen

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así fragmentos <le 0.5 mm que se enjuagan con solución salina estéril y tibia. Mientras no se efectúe la siembra estos fragmentos se mantienen en caja de Petri tapada dentro de la estufa a 37°C.

Para preparar el medio de siembra se agregan a los godetes estériles den­tro <le cada caja de Petri y sobre la capa de algodón ( Fig. 3), las siguientes soluciones en el orden indicado:

1.5 mi de extracto embrionario (con jeringa y aguja). 1.0 mi de solución de Tyrode ( con pipeta). 2.5 mi de solución <le gelosa licuada ( con pipeta).

La capa <le algodón se empapa con 10 mi de agua destilada estérii. Las cajas de Petri se tapan dejando solidificar la mezcla a temperatura ambiente (Fig. 4 ).

OBTENCIÓN DE MESONEFRos.-Se extraen del huevo, previa desinfección con alcohol especialmente en la región de la cámara de aire, los embriones <le 8 a 10 días colocándose en caja de Petri con solución salina estéril para su enjuagado. Una vez que todos los embriones se han extraído, se vuelve a desinfectar el campo retirando el recipiente en que se han recibido los cascarones.

Se preparan 5 cajas de Petri: una conteniendo los embriones en solución sa­lina, dos con un portaobjetos de Maximow cada una, y otras dos con solución salina.

Se coloca cada embrión dentro de la concavidad del portaobjetos de Maxi­mow en pos1c1on ventral, para que con ayuda <le las cuchillas se disequen los mesonefros (Fig. 5). Los mesonefros se van pasando a una <le las cajas con solución salina y los embriones desprovistos de los mesonefros se pasan a la otra caja con solución salina.

Una vez obtenidos todos los mesonefros, que se han enjuagado en solución salina para evitar cualquier resto de sangre, se procede a cortarlos en la otra caja con portaobjetos de Maximow en la misma forma en que se cortó el tumor y a colocar los fragmentos de mesonefros sobre el medio, que ya entonces de­berá estar solidificado, dichos fragmentos se distribuyen de manera que ocupen una superficie reducida formando una sola capa.

Sobre esta capa de mesonefros se colocan los fragmentos de tumor que se distribuyen con ayuda de las cuchillas, procurando que sólo ocupen la superficie cubierta por los mesonefros.

La caja de Petri con la capa de algodón humedecido y el godete contenien­do la mezcla gelifica<la con la asociación de mesonefros de embrión de pollo y de tumor ascítico sólido de Nelson, se incuba en la estufa a 37°C durante cinco a seis días al cabo de los cuales se trasplanta el cultivo resembrándolo.

RESIEMBRA DEL CULTIVO.-Una vez que los cultivos se han mantenido du­rante cinco o seis días a temperatura constante en las estufas destinadas para ello, se resiembran procediendo como si fuera a hacerse una siembra original, con la diferencia de que ahora ya no se colocan nuevos fragmentos de tumor, sino solamente se prepara la misma mezcla gelificada, se colocan mesonefros recién extraídos y se toma del cultivo con ayuda de las cuchillas sólo la porción que creció, colocándola en este nuevo medio con mesonefros recientes.

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Los embriones sobrantes, desprovistos de mesonefros se aprovechan, en todos los casos, para preparar extracto embrionario.

Se intentó cultivar fragmentos de mesonefros solo y de tumor solo, para comprobar si alguno de estos tejidos aislados tenían la capacidad de mantenerse y crecer en cultivo, para lo cual se prepararon cajas de siembra en la misma forma y siguiendo todos los pasos cuma se hizo en los cultivos organotípicos; se sembraron los fragmentos del tumor sin mesonefros en algunas cajas, y en otras, solamente fragmentos de mesonefros; se incubaron igualmente en estufa a 37°C.

INCLUSIÓN EN PARAFINA.-En todas las resiembras, con excepción de la primera, la mitad del crecimiento se trasplantó y la otra mitad con su corres­pondiente porción de gelosa se fijó en formol al 10% para después de varios días de fijación incluirla en gelosa licuada, que al solidificar se envuelve en un sobre de papel seda y se procesa para reincluirla en parafina, según la técnica de Chatton modificada por nosotros. En esta misma ·forma se incluyeron los mesonefros y el tumor que se intentaron cultivar aislados. La inclusi6n del tu­mor sólido sin cultivar se hizo en la forma habitual.

CoRTES HrsTOLÓGrcos.-De cada una de las inclusiones gelosa parafina se hicieron 10 cortes de 5 micras, que se tiñeron con la técnica hematoxilina-eosina. Se observaron al microscopio de una a tres preparaciones por cultivo fijado lo que hace un total de 394 laminillas.

RESULTADOS

Se hicieron 4 siembras a partir del tumor sólido obtenidos por la aplica­ción local intradérmica de la ascitis de N elson, en asociación con mesonefros de embrión de pollo de 8 a 10 días de incubación. Cada siembra se inició con seis cultivos dispuestos en sus respectivas cajas de Petri que se resembraron cada cinco o seis días a medios nuevos con mesonefros recientes.

En la siguiente tabla se resumen las siembras que se hicieron, el número de resiembras efectuadas, así como la duración de los cultivos, en cada uno de .los casos.

De la siembra I iniciada en abril de 1966 con seis cajas, se contaminaron cuatro de ellas en la primera resiembra, y se mantuvieron dos cajas de esta siem­bra hasta el final del experimento veinte meses después, soportando 102 re­siembras.

La siembra II iniciada en mayo de 1965, se mantuvo en cultivo por 40 días, ya que a la octava resiembra se presentó contaminación masiva en las seis cajas por lo que se desecharon.

La siembra III iniciada en junio de 1966, mostró contaminación en la pri­mera resiembra. La siembra IV, iniciada en julio de 1966, se mantuvo. en cultivo durante 17 meses hasta el final del experimento, realizándose 83 resiembras cada 5 ó 6 días en cada una de las seis cajas. ·

Se han designado como siembras, aquellas que se hicieron originalmente con

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el tumor de ascitis y resiembra las que se hicieron trasplantando el cultini a medio nuevo y mesonefros recién extraídos.

De la siembra I, se fijaron 108 cultivos; de la siembra II, 24; de la III, 6 y de la lV, 249; es decir un total de 384 culti\'os fijados que comprenden las mitades de cada resiembra y el cultivo entero contaminado.

El análisis histológico se hizo obser\'ando cuidadosamente las laminillas Je una resiembra, comparando con otras laminillas del mismo culti\'o correspon­dientes a resiembras sucesivas y con preparaciones de la resiembra equivalente de otras siembras. Por otro lado teniendo como patrón el estudio histológico del

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tumor ascítico sin cultivar ( Fig. 6) y el estudio citológico del líquido ascítico pudimos constatar que la estructura cito e histológica no variaba en los dife­rentes tiempos del cultivo ( Figs. 11 y 12).

El estudio histológico de un cultivo en sus diferentes resiembras, muestra que las células ascíticas han emigrado invadiendo el riñón embrionario ( Fig. 10); dichas células no sólo se mezclan con las del mesonefros sino que las destruyen en las porciones en donde se han implantado.

Los cultivos de mesonefros solo sin tumor, y el de tumor sin mesonefros no prosperaron, ya que aun en la primera resiembra, se notaron disgregados y sin posibilidades de crecimiento. En la figura seis se muestra el aspecto histo­lógico del tumor sólido sin cultivar, en donde pueden apreciarse las caracterís­ticas células tumorales sostenidas por un estroma conjuntivo. Del intento de cultivar este tumor sin asociarlo con el mesonefros, se observa una completa necrosis celular (Fig. 7).

El análisis histológico del mesonefros nos demostró entre otras característi­cas, la presencia de túbulos perfectamente delimitados con un epitelio ciliado hacia su luz (Fig. 8). Al tratar de cultivarlo sólo mostró necrosis celular (Fig. 9).

DISCUSIÓN

Wolff y Schneider (1957) aseguran que los fragmentos del condrosarco­ma de ratón de Fischer (S-180) cultivado en los medios comunes no llegan a proliferar ya que los trasplantes se disocian y necrosan al cabo de algunos días, pero si dichos fragmentos tumorales se asocian con fragmentos de embrión de pollo de ocho días de incubación proliferan activamente e invaden los órganos del embrión.

Hemos cultivado un tumor sólido obtenido por la aplicación intradérmica de ascitis de N elson a ratones. El cultivo mostró grandes posibilidades de cre­cimiento bajo las mismas condiciones de cultivo que Wolff aplicó con el S-180 pudiendo comprobar que las células ascíticas invaden el mesonefros, destru­yéndolo por completo.

Wolff hace notar que solamente los cultivos de tumor han mostrado gran­des posibilidades de crecimiento, y que esta diferencia entre órganos normales y cancerosos revelada por el cultivo organotípico, es un resultado de gran im­portancia.

Nosotros corroboramos esas posibilidades ilimitadas de crecimiento y man­teniendo el cultivo hasta por 20 meses constatamos que las células ascíticas no pierden su estructura citológica característica, comprobándolo por el estudio histológico que se hizo del tumor sólido y con un estudio citológico previo de la ascitis de Nelson (Pérez Zapata y Deleón, 1968). Se ha dicho (Fell, 1951) que esto no sucede con los cultivos de células en donde éstas pierden por lo menos alguna de sus estructuras y tocias o la mayoría de las funciones nor­males del tejido de donde provienen. En los cultivos organotípicos la estruc­tura histológica normal se conserva y, si el trasplante está en una etapa primaria de desarrollo, suele conservar su patrón histológico (Borghese, 1958).

Zayda Medina, v. & l. Dclcón R., CULTIVO ORGANOTIPICO DE UN TUMOR 293

En general, se menosprecia la extremada sensibilidad de los tejidos al trau­ma. Sabiendo la importancia de este factor, fabricamos cuidadosamente el ins­trumental de corte, lo que nos permitió hacer disecciones tan finas como las lo­gradas al disecar el mesonefros de embriones de pollo de 8 a 10 días.

;Los soportes empleados para los cultivos han sido muy variados: plasma (Moscona y Moscona, 1952), agar (Wolff y Naffen, 1952) y esponja de celu­losa ( Leighton, 1954). Nosotros usamos el agar obteniendo muy buenos re­sultados. Los recipientes de siembra que diseñamos permiten un buen inter­cambio gaseoso.

Observamos que a partir de las 24 hs de incubación el tumor ascítico y el mesonefros se asocian formando un solo fragmento, mostrando mitosis que revelan la multiplicación de las células cancerosas que a los 8 días de incu­bación invaden el riñón embrionario.

En el procesado histológico, al tratar de aplicar las técnicas comunes nos encontramos con muchas dificultades, resueltas en parte con la aplicación del método de Chatton ( 1962) y en parte con el uso de sobres de papel seda para evitar que se disgregara el cultivo al aplicar los distintos deshidratantes pa­ra la incubación en parafina.

SUMMARY

An organ culture of Nelson's Ascites is stablished. The solid tumor is ob­tained by inoculation of Nelson's ascites by intradermic abdominal way in mice. Pieces of solid tumor are cultured in association with mesonephros of chicken embryos according to Wolff's method ( 1958) modified by us. Cultures were trasplanted every five or six days to a new medium with freshly mesonephros. Sorne cultures were mainteined in activity during twenty months.

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Fig. !.-Esquema de las cuchillas diseñadas para cortar los fragmentos de tumor y de mesonefros.

Fig. 2.-Aspecto general del ··campo"" antes de iniciar la siembra.

Zayda Medina, v. & l. Dclcón R., CULTIVO ORGANOTIPICO DE UN TUMOR 297

Fig. 3.- Recipientes de siembra: cajas de Petri conteniendo la capa de algodón y el "godeteº', antes de agregar las solu­

ciones nutritivas.

Fig. 4.-Recipientes de siembra conteniendo los medios nu­tritivos.

Zayda Medina, v. & [, Deleón R., CULTIVO ORGANOTIPICO DE UN TUMOR 299

Fig. 5.-Portaobjetos de Maximow con los mesonefros de embrión de pollo una vez que han sido extraídos.

Fig. 6.-Corte histológico del tumor sólido de Nelson indu­cido en ratones. Obsérvese la abundancia de las células neo­plásicas sostenidas y rodeadas por tejido conjuntivo. Tec.

Hematoxilina-Eosina 200 x.

Zayda Medina, v. & l. Deleón R., Cl' LTIVO ORGANOTIPICO DE l ' N TlTMOR 301

Fig. 7.-Corte histológico de un "cultivo" del tumor sólido sin mesonefros de embrión de pollo. Nótese la necrosis celu­

lar. Tec. Hematoxilina-Eosina 320 x.

Fig. 8.-Corte histológico de mesonefros de embrión de pollo de 8 dias de incubación mostrando un tubo cortado transversal­mente en el que se observan los cilios de las células epitelia-

les. Tec. Hematoxilina-Eosina, 200 x.

Zayda Medina, v. & l. Deleón R., CULTIVO ORGANOTIPICO DE UN TUMOR 303

Fig. 9.-Ccrte histológico de un ··cultivo·· de mesonefros sin tumor sólido. Los tubos han perdido su estructura iniciándose

la necrosis celular. Tec. Hematoxilina-Eosina, 120 x.

Fig. 10.-Corte histológico de un cultivo organotípico del tumor sólido de Nelson en Ascciación con mesonefros de em­brión de pollo. Pueden distinguirse los tubos mesonéfricos invadidos ya por las células ascíticas. Tec. Hematoxilina-

Eosina. 120 x.

Zayda Medina, v. & l. Deleón R., CULTIVO ORGANOTIPICO DE UN TUMOR 305

--·------=----Fig. 11.- Corte histológico de un tumor organotipico mor sólido de Nelson y de mesonefros de embrión de constituyendo un solo fragmento. No se reconocen los

mesonéfricos. Tec. Hematoxilina-Eosina, 128 x.

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pollo tubos

Fig. 12.-Corte histológico de un cultivo de tumor sólido de Nelson y mesonefros de embrión de pollo; compárese la morfología celular con la del tumor sólido mostrado en la

fig. 6. Tec. Hematoxilina-Eosina, 300 x.