Cultivos de tejidos vegetales y

micropropagación in vitro

Escuela de Bachilleres Ricardo Flores Magón

Maestra: Dr. Carmen Sol de la Peña

5° “A”

Isaac Joab Hernández Díaz NL: 19Yesenia Estefanía Jiménez Maza NL: 20

Cultivo de tejidos vegetales

El cultivo de tejidos vegetales es una serie de técnicas y procedimientos que nos permiten la manipulación en condiciones artificiales y perfectamente controladas de células, tejidos y órganos vegetales, así como de plantas completas.

El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigación de botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en la selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales.

La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la producción de microorganismos e identificación.

Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estéril.

A su escala mayor, como ocurre en la industria de la micropropagación, el cultivo de tejido se ha convertido en un proceso de manufactura que puede producir material vegetal libre o saneado de patógenos, de alta calidad, que puede atravesar fronteras internacionales.

Sobre un enfoque más técnico, esta metodología ha provisto a la industria de cruzamiento, de las metodologías apropiadas para generar, almacenar o manipular germoplasma de valor o genéticamente inestable sobre su camino a través del proceso de cruzamiento, donde el vehículo eventual para la propagación será la semilla.

¿Qué es el cultivo de tejido vegetal?

El punto de partida para el cultivo de tejidos es la iniciación. Este es el proceso por el cual se trae material vegetal en un medio de cultivo estéril. Requiere la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir su punto de crecimiento o tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán desde este inicio dependerán de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, órganos, raíces, bulbos u otros órganos.

Estos tejidos in vitro están ahora dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico; y son protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que se gane la entrada al mismo crecerá oportunamente a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos.

Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es cultivar los tejidos, deben darse además ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o ellos pueden colocarse en un medio líquido. Ellos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y un cocktail de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. Es conveniente preparar este medio ambiente nutricional incorporando estos compuestos químicos dentro del gel o líquido, ajustando el pH alrededor de 6 y esterilizando este medio de cultivo ya sea dentro del recipiente para cultivo o en uno separado.

Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es necesario el suministro de luz, pero a intensidades muy bajas, mucho más que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios unos altos niveles de luz.

Una temperatura controlada también es necesaria para estabilizar el crecimiento y mejorar la predictibilidad del desarrollo de los tejidos.

Facilidades requeridas para el cultivo de tejido

Ciertas facilidades son requeridas para que el cultivo de tejidos sea efectivo. Están involucradas dos fases de actividad.

1. El laboratorio - una habitación limpia conteniendo un número de estaciones de trabajo, cada una proveyendo aire filtrado - gabinetes de flujo de aire laminar estéril- en los cuales el material puede ser manejado sin riesgos de contaminación por el operador y transferido en forma segura a medios nutritivos frescos. Esta transferencia es el paso de manufactura individual en el cual los tejidos que crecieron previamente en medio de cultivo son manipulados y subdivididos con escalpelo y pinzas dentro del medio ambiente estéril del gabinete de flujo laminar, de manera de transferirlos a nuevo medio de cultivo y un nuevo recipiente para posterior crecimiento, multiplicación o desarrollo, y

2. El cuarto de crecimiento - una habitación iluminada, con aire acondicionado y con alto estándar de higiene en el cual los cultivos de tejidos pueden crecer y desarrollarse en forma segura por períodos de semanas o meses. Un régimen de iluminación y temperatura óptimas requiere un suministro de electricidad confiable y adecuada, ya que cada planta producida puede consumir unos 0,5 kW de energía.

Propagación de material vegetal por cultivo de tejido

En los años 60s se reconoció lo que el cultivo de tejido podía ofrecer a la horticultura y la agricultura y esto proveyó un estímulo para la evolución de la tecnología. Particularmente los beneficios aparecían en aquellas especies de cosecha donde existían algunos problemas de propagación. Por ejemplo, donde la producción de semillas es limitada, o las semillas no originan plantas veraces al tipo, o la propagación por medio de bulbos, tubérculos o esquejes es muy baja. La habilidad del cultivo de tejido para acelerar la multiplicación de líneas nuevas obtenidas por cruzamiento acelera su evaluación, y las puede colocar rápidamente en mercado. Este fue un avance radical para los mejoradores de estas cosechas. Además, donde hay una necesidad por un reemplazo rápido o anual con material sano nuevo en una escala confiable de tiempo.

Hoy día, hay muchas especies donde el cultivo de tejidos se ha vuelto un método regular y establecido de propagación, por ej. para la papa, dátiles, banana, un amplio rango de cultivos para flor cortada y numerosas plantas ornamentales de maceta.

El mayor beneficio del cultivo de tejido en la propagación de plantas es el dramático acortamiento del tiempo de producción. Por ejemplo, la papa se puede multiplicar convencionalmente por medio de tubérculos crecidos a campo en aproximadamente un factor de 10 por año, pero en cultivo de tejido puede hacerlo por un factor de 5 por mes, lo cual equivale a 1/4 de billón por año.

El cultivo de tejido viene a asistir a los mejoradores

Numerosos procesos y manipulaciones son llevados a cabo sobre las plantas en cultivo de tejido. Están desarrollándose constantemente nuevas técnicas y es definitivamente difícil resumirlas.

La propagación por cultivo de tejidos normalmente intenta preservar y copiar fehacientemente la identidad exacta de una línea varietal de plantas. Sin embargo, ligeras variaciones existen entre la identidad genética de células individuales dentro de los tejidos. Esta variación somaclonal, que siempre está presente y es una amenaza a la estabilidad en la micropropagación, puede ser útil para el mejorador vegetal debido a que puede representar formas latentes y noveles de la planta.

Las modificaciones de los procesos en cultivo de tejidos se han desarrollado para estimular el crecimiento y selección de nuevas líneas de cultivos de tejidos que puedan revelar características mejoradas después de la selección en el campo o invernadero.

El cultivo de protoplastos es otro método desde donde se puede originar variación somaclonal para el desarrollo de nuevos tipos de plantas. Los protoplastos son células vegetales a las cuales se les ha removido la pared celular rígida. Se han desarrollado técnicas especiales con la finalidad de liberar protoplastos desnudos desde los confines de sus paredes y permitir que cada protoplasto individual pueda regenerar en cultivo de tejido hacia una planta.

La hibridización somática es una técnica que puede permitir que diferentes especies de la misma familia sean cruzadas. Esto es usualmente imposible siguiendo el proceso normal de regeneración sexual de las plantas. Estableciendo cultivos de protoplastos de cada especie, los cultivos pueden ser mezclados y algunos protoplastos de cada especie se fusionarán al azar. Por una cuidadosa selección y cultivo, se podrán regenerar plántulas desde estos protoplastos híbridos y ser ensayados por características deseables in vivo.

El rescate de embriones es un proceso de laboratorio por el cual un huevo fertilizado o un embrión pueden removerse desde una planta y hacerse crecer y desarrollar en cultivo de tejido estéril hasta que pueda crecer en forma segura o sin ayuda. El huevo fertilizado usualmente proviene de genitores de valor donde el embrión falla en desarrollarse normalmente en la planta. Esto es de ayuda para el mejorador pues lo asiste en las cruzas entre subespecies en las cuales pueden haber evolucionado barreras naturales para la cruza. Ha sido particularmente útil para el mejoramiento en azucenas.

Los bancos de germoplasmas pueden ser maneras útiles de almacenar material vegetal, semillas o cultivos de tejidos, los cuales tienen características reconocidas

y de valor y por esto merecen un control adecuado y seguridad de mantenimiento. Los biólogos moleculares involucrados en ingeniería genética pueden mantener una colección de plantas en la forma de cultivo de tejidos, los cuales poseen características heredables identificables (genes) que pueden ser de utilidad para insertarlas en los genes de otras plantas. Esto es de utilidad a los mejoradores para lograr nuevas variedades de cultivos.

Micropropagación Es una técnica que nos permite la obtención de millones de plantas a partir de pequeñas secciones de tejido vegetal, llamadas explantes, esto en un espacio y tiempo reducidos. Otra ventaja es que al tratarse de un sistema de propagación colonial (las plantas hijas son exactamente iguales a la progenitora), es posible obtener un numero prácticamente infinito de plantas iguales a partir de una que muestre características deseables (planta elite). Las desventajas de este método son de requerir un equipo especializado y personal capacitado.

La micropropagación puede hacerse por tres vías diferentes:

1. Elongación de meristemos ya existentes (yemas), es la más sencilla.2. Inducción de brotes adventicios, que consiste en la desdiferenciación de

ciertas células, seguida por la rediferenciación de cada una de ellas en un brote o pequeña planta, la que se enlonga y enraiza para obtener la planta completa.

3. Embriogénesis somática, consiste en la obtención de un gran número de embriones a partir de células somáticas sin que existieran procesos sexuales.

La estimulación de las yemas axilares o adventicias es el proceso más común que se conoce para la micropropagación de las plantas. Aquí, las citocininas causan una generación contínua de estas yemas en la base del cultivo que prolifera. Cada yema desarrolla en un tallo enanizado el cual a su vez puede producir más yemas en su base. Esta proliferación de tallos y yemas continuará siempre que sea mantenido un suministro adecuando de citocinina junto con nutrientes y espacio físico por subdivisión de los cultivos y transferencia de los mismos a medio fresco cuando sea necesario.

Alternativamente, el tallo puede separarse del suministro de esta hormona, la cual tiende a suprimir la formación de raíces, y ser transferido a medio nuevo conteniendo una hormona del grupo de auxinas, la cual estimulará el desarrollo radicular en la base del tallo. Tales tallos enraizados pueden transferirse luego afuera del ambiente estéril del cultivo de tejido y, con cuidadoso control de humedad y luz, ser aclimatada para volverse una planta que crece convencionalmente en forma dependiente de la fotosíntesis.

La embriogénesis es otro método que puede usarse para propagar las plantas en masa. Como indica su nombre, esta técnica causa que se formen embriones

generados desde el tejido en cultivo, proceso que por otra parte sólo ocurre en la formación de una semilla. Bajo el control de ciertas mezclas hormonales se forman los embriones dentro de una masa aparentemente desorganizada de un callo, en el cual nódulos de células comienzan a desarrollarse en forma que recuerda la estructura de un embrión de semilla. Si estos embriones se trasladan a otros medios, desde los callos, medios que están diseñados para permitir que el embrión germine, entonces desarrollará una estructura de planta completa, esto es una plántula, un talluelo enraizado que no difiere mayormente de la obtenida desde semilla. Como las plantas obtenidas por caulogénesis axilar o adventicia, estas plántulas también pueden aclimatarse para transformarse en una planta viable con capacidad de fotosíntesis.

Las ventajas de este método es que permite obtener muchos individuos iguales en una pequeña superficie, controlar las condiciones ambientales, estudiar diversos procesos de las plantas y evita el riesgo de que proliferen agentes patógenos (se realiza en medios esterilizados). Constituye uno de los métodos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. Se aplica en la producción masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales.

Equipo necesario para la micropropagación in vitro

AutoclaveEs donde se "esteriliza" todo lo que vamos a utilizar: agua, algunos nutrientes, material, etc. No se pueden meter proteinas. Es como una olla a presión, pero de mayor tamaño, donde se controla la presión y la temperatura (hasta 120º).

Cámara de flujo laminarEs donde se realizan todas las manipulaciones con la planta. Es un habitáculo con un operario en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire.

Medio de cultivoAgua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo, que se tapa con un tapón. Dependiendo del material que se va a propagar, el tubo se pone vertical o un poco inclinado.

o Medio BasalÉste incluye: -Agua -Macroelementos: N, P, K, Ca, S, Mg. -Microelementos: Fe, Zn, B, Mn, Cu, Ni, Co, Al, Mo, I. -Carbohidratos -Vitaminas -Aminoácidos

El medio basal puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento u hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas, acido abcísico) y ocasionalmente con otras sustancias (extracto de levadura, leche de coco, extractos vegetales, hidrolizados de caseína, peptona y triptona).

Debido a que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas condiciones, se les debe añadir carbohidratos.

o Medio solido: aquel que contiene un agente gelificante. -La dureza del medio depende del pH y de la composición química del medio. -El agente gelificante más empleado es el agar. -Agar: mezcla de polisacáridos extraídos de un alga marina. -La planta no puede digerirlo ni adsorberlo -No interactúa con los componentes nutritivos del medio. -El agar se funde a altas temperaturas (100ºC) y solidifica alrededor de los 40ºC -No se degrada con la luz. -Generalmente se utiliza a una concentración de 0.6 - 1%. -El principal problema es su elevado costo.

o Medio liquido: no requiere de agentes gelificantes. -Facilita la absorción de nutrientes por el explante. -Manipulación más sencilla para cambiar medios. -Cualquier exudado de la planta se diluye con mayor facilidad. -Algunas especies que crecen mal en medio líquido. -Si resulta posible el cultivo en medio líquido, se debe considerar el problema de la aireación. Se puede cultivar el explanto parcialmente sumergido, y si se necesita una inmersión total se debe utilizar un agitador.

o Función del medio de cultivoEs importante encontrar condiciones de cultivo no sólo para que las células crezcan y se dividan rápidamente sino también para que la mayor parte de ellas expresen su capacidad de rediferenciación y biosíntesis para una o varias substancias de interés. En varios de los estudios sobre cultivos de células y tejidos vegetales esto se ha tratado de resolver variando los componentes de los medios de cultivo (Martin 1980, Yasuda et al 1972, Calva y Ríos 1999) y las condiciones físicas y fisicoquímicas de los procesos (Fowler 1982, Rhodes et al 1987), aprovechando las ventajas que ofrece la rápida respuesta de las células in vitro ante pequeños cambios en su medio ambiente con respecto a las plantas crecidas por métodos tradicionales.

Los primeros medios utilizados en cultivo de células y tejidos vegetales fueron semisintéticos. Frecuentemente contenían extractos o complejos orgánicos como agua de coco, hidrolizado de caseína y extracto de levadura. Actualmente, la mayoría de los medios son de composición conocida (Tabla 2), estando constituidos básicamente por cinco grupos de ingredientes: nutrientes inorgánicos,

fuente de carbono, fuente de nitrógeno, vitaminas y reguladores del crecimiento que in vivo son sintetizados por una parte u órgano de la planta para luego ser transportados a otros órganos donde se metabolizan y/o acumulan (Seabrook 1980, Yasuda et al 1972). Las fuentes de nitrógeno más comunes son el nitrato y amonio, pero también se han utilizado urea, hidrolizado de caseína, extracto de levadura y aminoácidos, entre otros. La fuente de carbono más empleada es la sacarosa o glucosa y en menor grado la maltosa, galactosa, almidón y melaza. Los micronutrientes, generalmente adicionados al medio de cultivo en forma de sales, son utilizados por las células como cofactores enzimáticos, como el molibdeno para la nitrato reductasa y el magnesio para algunas cinasas (Murashige y Skoog 1962, Shenk y Hildebrandt 1972).

Las fitohormonas y sus inhibidores son substancias producidas por las plantas y regulan su respuesta a estímulos ambientales como luz, temperatura y humedad, ayudando de esta manera a regular y coordinar los procesos esenciales para el desarrollo normal de las plantas (Wain 1980, Doerner 2000, Crozier et al 2000). Este tipo de substancias se pueden dividir principalmente en auxinas, giberelinas, citocininas, ácido abscísico, etileno, brasinoesteroides, poliaminas, ácido jasmónico y el ácido salicílico. Las auxinas y giberelinas promueven el alargamiento celular pero inhiben la diferenciación, mientras que las citocininas estimulan la división mediante la cual se producen nuevas células y pueden también evitar el envejecimiento celular.El etileno estimula la maduración principalmente de frutos, el ácido abscísico inhibe la acción de las auxinas, giberelinas y citocininas operando como sistema de defensa natural contra efectos de estrés fisiológicos. Las más usadas en cultivos de células vegetales son las auxinas y citocininas. De las auxinas, el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) es la más usada para la inducción y mantenimiento de tejido calloso debido a que suprime severamente la organogénesis. De las citocininas, la más activa es la 2-indolaminopurina (2iP); sin embargo, las más utilizadas en cultivo de células vegetales son la bencilaminopurina (BAP) y la cinetina (Cin), una citocinina sintética afectada por la luz en el rango de longitud de onda de 300-800nm (Aitchison et al 1977, Street 1969 y 1977, Crozier et al 2000).

PlantaEl material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminación, aunque se lave mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que halla menos infecciones.

Cámara de cultivoLa cámara de cultivo es una habitación de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variación día-noche, etc..

Condiciones del cultivo in vitro

En la cámara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema más importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones.

En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas.

El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre sustancias contaminantes al medio para la planta. Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias.

Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo.

El pH ideal puede oscilar entre 5,2 y 5,8. Valores menores a 3.5 impiden la solidificación de los agentes gelificantes añadidos al medio sólido, un pH bajo afecta la absorción de determinados nutrientes por parte del explante.

Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.

El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.

El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años en prepararlo.

En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan en la oscuridad.

Las temperaturas también varían. Lo normal son 22-26ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y también 28-30ºC para plantas tropicales.

Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también influyen determinadas características de la planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de implante, parte más juvenil o más adulta.

En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ahí la importancia del cierre.

Etapas de la micropropagación

Etapa 0: Elección y preparación de la planta madre.

o Crecimiento en condiciones de sanidad controlada.

o Tratamientos de rejuvenecimiento.o Pretratamientos con reguladores de crecimiento.

Se obtiene el explante con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado para lo cual es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia recibida.

Etapa 1: Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia.

Escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos de la planta madre, los cuales son desinfectados para luego obtener los explantes. En condiciones de asepsia (en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantes del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantes.

o Procedimiento:1. Cortar brotes con características juveniles.2. Lavar con agua y jabón.3. Se descartan las hojas, se dejan los pecíolos.4. Realizar la desinfección con etanol, hipoclorito de sodio,etc.5. Realizar tres enjuagues con agua destilada estéril.6. Cortar segmentos nodales, descartando los extremos basal y apical.7. Cada nudo contiene un meristemo axilar.8. Introducir un segmento nodal por tubo de ensayo conteniendo el medio de

cultivo.9. Tapar y colocar en cámara de crecimiento.

o ¿Cuáles son las principales limitantes en esta etapa?Contaminación por hongos, bacterias, virus, Mycoplasmas, Microartrópodos, Trips oxidación.

o Principales causas de contaminación fúngica:•Esterilización superficial inadecuada•Manipulación•Introducción de esporas por Trips

o Géneros de hongos más frecuentes:•Aspergillus•Candida•Cladosporium•Microsporium•Phialophora

o Bacterias:

•Principal agente contaminante.•Síntomas sobre el explanto o en el medio de cultivo.•Pueden aparecer luego de varios subcultivos.•Síntomas no visibles, plantas que no sobreviven la aclimatación.•(Bacterias no patogénicas, benéficas)

o ¿Cómo puede solucionarse?Hongos: Adecuada desinfecciónBacterias: AntibióticosUso humano y animalEfecto bacteriostático/bactericidaVirus: Cultivo de meristemas y termoterapia

o Oxidación:•Amarronamiento del explanto y/o el medio.•Inhibición del crecimiento y muerte del explanto.•Más marcado en especies que naturalmente tengan altos niveles de taninos u otros compuestos fenólicos.

o Causas:•Acción de enzimas oxidasas que son liberadas o sintetizadas en respuesta a heridas.•Sustratos distintos según el tejido.•Fenoles se oxidan a quinonas que a su vez tienen alto poder oxidante sobre proteínas.

o ¿Cómo puede solucionarse?•Agua estéril 2-3 hs previo a la introducción.•Empleo de antioxidantes en el último enjuague o en el medio de cultivo (ácido cítrico, ascórbico).•Transferencias frecuentes (cada dos o tres días) a medio fresco.•Carbono activado.•PVP

Etapa 2: Multiplicación de los brotes

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron de la Fase I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios entrenudos. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar

o Procedimiento:1. Extraer los explantos que brotaron en la etapa previa.2. Cortar separando brotes individuales o segmentos nodales (según el hábito

de crecimiento de la especie).

3. Separar los brotes por tamaño.4. Colocar en medio de multiplicación.

o ¿Cuáles son las principales limitantes en esta etapa?o Variación somaclonal

Variación genética heredable, que surge en plantas producidas por cultivo de tejidos.Desventaja importante cuando el objetivo es la fidelidad clonal.

o ¿Cómo puede solucionarse?•Reducir el número de repiques.•Uso racional de reguladores de crecimiento.•Evitar el 2,4 D.

Fase 3: Elección de un medio de enraizamiento de los explantes

Para enraizar los explante se utilizan 2 métodos:

o Enraizamiento in vitro•Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. •Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar.

o Enraizamiento ex vitro•Los explantes se deben transferir a un sustrato, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. •Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse. •Los explantes deben de plantarse en cámaras plásticas en el laboratorio.

Fase 4: Aclimatación de los explantes enraizadosLos explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales; el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. •En el momento en que se extraen los explantes de los recipientes de enraizamiento están poco adaptados a crecer en un invernadero. •Los explantes deben ser aclimatados a las condiciones de humedad y luz del invernadero antes de ser trasplantados a un área determinada.

PLANTAS OBTENIDAS IN VITRO:•Hojas delgadas•Tallos débiles•Raíces débiles y poco funcionales•Conexión tallo-raíz incompleta•Baja tasa fotosintética

PROCESO GRADUAL:•Disminución de la HR•Crecimiento autotrófico•Condiciones sépticas

Dificultades que presentan las especies leñosas in vitro.•Menor capacidad regenerativa•Efecto de dormancia en yemas•Inducción de rejuvenecimiento•Menor tasa de multiplicación•Mayor oxidación inicial del explante•Desinfección más dificultosa•Enraizamiento y aclimatación limitantes

Costos de la micropropagaciónCapital para la instalación del laboratorioCosto de la mano de obraCosto de los materiales

Características del comportamieno in vitro del material a propagar• Facilidad de establecimiento, rejuvenecimiento, etc.• Tasa de multiplicación• Enraizamiento in vitro/ex vitroPérdidas que ocurren en cada etapa del proceso• Contaminación• Hiperhidricidad• % plantas que no enraizan• % plantas que no sobreviven la aclimatación

Principales plantas que se reproducen por la micropropagación

o Clavelo Petuniao Violeta africanao Gloxíneao Anturuimo Orquídea o Papao Clavelo Rosa de tallo largoo Ave paraísoo Flor de Liso Eucalyptus grandiso Acca sellowianao Actinidia deliciosao Allium cepa

Laboratorios establecidos en México

o Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (LCVT) de la Facultad de Química de la UNAM

o Laboratorio del Departamento de Química de la UAAo ININo Jardín Botánico de la UNAMo Universidad Autónoma del Estado de México (UAEM)o Universidad Autónoma de Chapingo (UACH)o Laboratorio de Cultivo de Plantas de la Facultad de Ciencias Biológico-

Agropecuarias de Peñuela (zona Córdoba-Orizaba)o Agromod

El uso de cultivo de tejidos vegetales en la lucha contra enfermedades

Los virus y otros patógenos que invaden los tejidos vegetales en forma sistemática, pueden ser muy dañinos para la eventual producción o calidad de la cosecha, como ocurre por ejemplo en papas y crisantemos. Las enfermedades virales son difíciles de controlar efectivamente, porque a menudo es difícil diagnosticar que una planta está infectada y la pérdida en la producción puede ser la primera indicación y no hay productos químicos que a campo puedan controlar la infección.

El cultivo de tejidos ofrece un número de ventajas para la prevención de virus vegetales. El cultivo de vegetales que es iniciado dentro de cultivo puede ser ensayado por métodos serológicos específicos por la presencia de virus conocidos. Así, la iniciación de plantas libres de virus puede ser asegurada.

Estos cultivos tipificados por ausencia de virus podrán luego propagarse rápidamente en cultivo de tejido por distribución de nuevos stocks sin el temor de propagar virus que podrían haber estado incluidos en las plantas. Durante esta rápida propagación en cultivo no hay riesgo de una reinfección con virus lo cual podría ser posible durante la propagación de nuevos stocks saludables en el campo o en el invernadero.

Si, por otro lado, se encuentra que una planta de valor que no puede reemplazarse contiene virus, el cultivo de tejido ofrece otra solución, la eliminación del virus por cultivo de meristema. El pequeño número de células que rodea el punto de crecimiento o meristema de la planta generalmente crece muy rápido de manera que es poco probable que esté infectada con el virus. Y si una pequeña pieza de tejido conteniendo el meristema es cortada con sumo cuidado y colocada en un medio de cultivo, luego después de algunos meses para la recuperación y crecimiento del tejido, puede aparecer un nuevo cultivo libre de virus.

Referencias

Articulo Micro propagación de plantas de ornatoPrograma de investigaciones Biológicas Ing. Hugo Lizalde Miramontes M. en C. Eugenio Pérez MolpheM. en C. Rafael Gutiérrez Campos Laboratorio de fisiología vegetal

Cultivo in vitro POR: Débora Frid, 2009http://articulos.infojardin.com/Frutales/cultivo-in-vitro-reproduccion.htm

Cultivo de tejido vegetal

Traducción del trabajo del Dr. W.M. Morgan, del International Plant Laboratories, Baltonsborough, UK.

Cultivo de células y tejidos vegetales: fuente de alimentos para el futuro Dr. Graciano Calva Calva Investigador responsable del laboratorio de Ingeniería Metabólica del De-partamento de Biotecnología y Bioingeniería del Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, México. Dra. JosefinaPérezVargasCoordinadora de la Maestría en Ciencias en Ingeniería Bioquímica del Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec, Estado de México, México.Revista digital universitaria

http://www.manufactura.mx/industria/2012/05/29/el-cultivo-de-tejidos-vegetales

http://www.agromod.mx/micropropagacion/

http://www.uv.mx/gaceta/Gaceta55-56/55-56/ser/Seraca01.htm