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Laboratorio de Qumica Orgnica Aplicada. Prctica 2. Cromatografa en columna. 25

LABORATORIO DE QUMICA ORGNICA APLICADA

PRCTICA # 2

SEPARACIN POR CROMATOGRAFA EN COLUMNA DE PIGMENTOS VEGETALES

Y SUS ESPECTROS DE ABSORCIN

OBJETIVOS Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: 1. Preparar una columna para cromatografa. 2. Preparar un extracto de pigmentos de plantas. 3. Separar por cromatografa en columna la mezcla de pigmentos extrados. 4. Obtener el espectro de absorcin en la zona del visible de los pigmentos extrados. 5. Explicar los conceptos fundamentales en los que se basa la cromatografa. INFORMACION GENERAL Pigmentos de las plantas Las plantas verdes y algunos microorganismos que abundan en la superficie terrestre llevan a cabo un proceso llamado fotosntesis, por el cual, mediante la energa solar, transforman el bixido de carbono en carbohidratos como la glucosa y su polmero el almidn, que son compuestos con alto contenido en energa qumica y, por ello, estos seres vivos son productores primarios de los ecosistemas. La glucosa formada es utilizada por ellos mismos y por otros seres vivos durante el proceso de respiracin, en el cual se oxida hasta CO2 y H2O, obteniendo as la energa necesaria para llevar a cabo sus diversas funciones.

Para atrapar la energa solar e iniciar el proceso de transformacin de energa luminosa a energa qumica, las plantas superiores contienen en sus clulas un organelo llamado cloroplasto, en donde se encuentran los llamados centros de reaccin, formados por protenas y diversos pigmentos, en especial las clorofilas. Las clorofilas a y b se encuentran en las plantas y las bacterioclorofilas a o b se encuentran en las bacterias fotosintticas. Adems de estas molculas, los organismos fotosintticos tienen otros pigmentos con capacidad para absorber luz. Los pigmentos accesorios incluyen por ejemplo a los carotenos, xantofilas, antocianinas y otras molculas con colores caractersticos.

Departamento de Ingeniera y Ciencias Qumicas. Universidad Iberoamericana.


La estructura de estas sustancias se muestra en la fig. 1.

Fig. 1. Estructura de algunos pigmentos de plantas Estas sustancias son coloridas por el nmero elevado de dobles ligaduras conjugadas que poseen, lo que permite que las excite la radiacin con longitud de onda en la regin del visible. La clorofila absorbe bien en la regin del rojo y el azul y muy poco en la zona del verde. Las plantas que contienen clorofila son verdes porque la luz verde se refleja, no se absorbe. Estos pigmentos no son solubles en agua, pero pueden extraerse con solventes orgnicos cuando las clulas que los contienen se rompen. Los extractos tienen, adems de pigmentos, grasas y algunos otros compuestos incoloros. Entre los tipos de pigmentos ms solubles en solventes orgnicos, se encuentran las clorofilas (azul-verde) y los carotenoides (amarillo-naranja). Algunos colores rosas y rojos en las plantas (por ejemplo en el betabel, la col morada, la jamaica y en las flores) se deben a xantocianinas, las cuales si son solubles en agua y no se extraen con solventes orgnicos. Mtodos cromatogrficos Los mtodos cromatogrficos son mtodos de separacin que involucran la transferencia reversible de un compuesto que est adsorbido en una fase estacionaria (adsorbente) a una fase mvil (solvente) que fluye a travs de la fase estacionaria.



La separacin surge de las interacciones mutuas de componentes de una muestra, solvente y adsorbente. El adsorbente est presente en un gran exceso, con una gran superficie y con sitios polares capaces de unir reversiblemente pequeas concentraciones de sustancias por un proceso esencialmente electrosttico. El solvente compite con los componentes de la muestra por los sitios de unin. Estos componentes son desplazados reversible y continuamente en la direccin del flujo del solvente. El proceso descrito puede escribirse como un equilibrio competitivo en donde hay una particin de los componentes entre la fase estacionaria y la fase mvil:

componentes-adsorbente solvente-adsorbente componente-solvente Entre ms polar sea un compuesto, ms fuertemente se adsorbe en la fase estacionaria, por lo que su migracin a lo largo de ella es menor, siendo eludo (arrastrado) ms lentamente por la fase mvil, que los compuestos menos polares. De este modo, la separacin selectiva de los componentes de una muestra, por cromatografa, se debe a las diferencias en la migracin de los componentes individuales a lo largo de la fase estacionaria. En la cromatografa en fase lquida se usa una fase mvil (lquida) y una fase estacionaria (slida), siendo los adsorbentes ms comunes la slica gel (SiO2.H2O), almina (A2O3) y celulosa. La distribucin de los componentes entre la fase slida y lquida es determinada, adems de por la polaridad propia de cada compuesto, por el grado de actividad del adsorbente (el cual depende principalmente del grado de hidratacin y de la polaridad del solvente). El principal factor para controlar el movimiento de los diferentes compuestos en un cromatograma es la polaridad del solvente. Una lista de los solventes ms usados en los diferentes tipos de cromatografa, en orden de polaridad creciente, se indica en la Tabla 1. Entre ms polar sea un solvente, ms rpido es el movimiento de los compuestos y menos efectiva la separacin.

Menos polar Ms polar

Hexano Tolueno Cloruro de metileno Cloroformo ter Acetato de etilo Acetona Propanol Etanol Metanol Agua cido actico

Tabla 1. Disolventes comunes para cromatografa de lquidos

Cromatografa en columna La cromatografa en una columna de adsorbente proporciona un medio para la separacin y aislamiento de los componentes de una mezcla. La muestra se aplica en la parte superior de la columna y se deja pasar solvente a travs del adsorbente. Este proceso desarrolla el cromatograma en bandas que contienen los compuestos individuales; estas bandas pueden ser eludas (arrastradas) en secuencia por adicin de ms solvente y recolectadas en fracciones separadas. La columna se prepara y desarrolla usando el solvente menos



polar que disuelva a la muestra y que permita el movimiento de los compuestos a una velocidad prctica. Generalmente es necesario ir cambiando a solventes ms polares para efectuar la elusin de los compuestos, dependiendo de los grupos funcionales que tengan los componentes de la mezcla. La facilidad de ser eludo ms rpidamente, depender de la menor polaridad de los grupos funcionales, como se muestra en la Tabla 2. El cambio de solventes debe efectuarse gradualmente, mediante mezclas de los solventes (5 a 10% del solvente siguiente en polaridad), para evitar que se alteren las zonas que ya han sido desarrolladas (separadas). Las sustancias demasiado polares, como azcares o aminocidos, no pueden separarse de sus mezclas por cromatografa en columna, ya que con los adsorbentes anteriormente mencionados no pueden utilizarse agua o cido actico porque, con estos solventes demasiado polares, el equilibrio componentes-adsorbente se desplaza hacia el de solvente-adsorbente y de ah al de componentes-solvente y, de esta manera, todos los componentes de la mezcla se eluyen simultneamente.

VELOCIDAD menos polar

ms polar

RAPIDEZ DE ELUSIN ms rpido

ms lento

GRUPO FUNCIONAL alcanos halogenuros de alquilo alquenos dienos hidrocarburos aromticos halogenuros aromticos teres steres cetonas aldehdos aminas alcoholes fenoles cidos carboxlicos cidos sulfnicos

Tabla 2. Velocidades relativas de elucin para diferentes grupos funcionales

En la prctica, los pasos de desarrollo y elusin frecuentemente son distinguibles, ya que la banda que se mueva ms rpido puede empezar a emerger de la columna antes de que se complete la separacin de las bandas que se mueven ms lentamente. Frecuentemente, los compuestos a separar en la mezcla son incoloros por lo que no pueden verse las bandas. En este caso se recolectan fracciones de volumen pequeo. se evapora el solvente y los residuos se comparan por cromatografa en placa delgada para determinar cules fracciones tienen igual composicin y pueden ser reunidas. La columna se prepara en un tubo de vidrio que, en uno de sus extremos, lleva una llave de paso (puede utilizarse una bureta). El adsorbente se sostiene en un disco de vidrio poroso o un tapn de algodn o lana de vidrio cubierto con una capa de arena para retener partculas finas. La relacin usual de dimetro de la columna a altura del adsorbente es aproximadamente de 1 a 10 y debe haber suficiente espacio adicional en la columna para permitir que haya solvente arriba del adsorbente. Si el tubo tiene un dimetro de 1 cm o mayor, se llena parcialmente con el solvente que se vaya a usar para disolver la muestra. Se aade el adsorbente, ya sea seco, dejndolo caer como un chorro muy fino, o bien, suspendindolo en un vaso de precipitados con el mismo solvente y aadiendo la suspensin a la columna. Mientras se aade el adsorbente, debe mantenerse entreabierta la llave de la columna para que el solvente siga fluyendo lentamente. Si la columna tiene un dimetro menor a 1 cm (como las usadas en tcnicas de microescala, en las que se puede usar una pipeta



Pasteur como columna)) no se pone solvente y el adsorbente se aade en seco. En cualquiera de los casos, la columna debe ser compacta y uniforme; una columna no uniforme, en la que haya capas disparejas de adsorbente, cuarteaduras o burbujas, no es utilizable. Arriba del adsorbente se coloca una pequea capa de arena para prevenir que la parte superior del adsorbente sea alternada. El exceso de solvente es drenado de la columna, justo hasta arriba del adsorbente y entonces se aade, usando una pipeta Pasteur, la muestra disuelta en un volumen mnimo de solvente. La muestra debe adsorberse en la zona ms angosta posible, ya que las bandas se vuelven ms difusas a medida que la columna se desarrolla. Al llevar a cabo un cromatograma es importante mantener siempre el nivel de solvente arriba de la columna de adsorbente para prevenir la formacin de cuarteaduras en el adsorbente. Las mezclas complejas de pigmentos de plantas presentan un gran problema de separacin. Generalmente la separacin completa de todos los pigmentos de un extracto no se logra en un solo cromatograma; por ejemplo, las diferentes clorofilas pueden separarse utilizando azcar pulverizada como adsorbente pero la separacin de carotenos, menos polares, requieren de un adsorbente ms activo. Esta separacin fina no se llevar a cabo en esta prctica. En las condiciones de separacin usadas en esta prctica ocurren algunos cambios en los pigmentos ms sensibles durante la extraccin y cromatografa, logrndose nicamente una separacin parcial; adems, los compuestos incoloros se detectaran en el residuo si se evaporaran las fracciones. En este caso no se analizar la pureza de las fracciones para comprobar que la separacin fue completa; sin embargo, los principios del mtodo si podrn ser observados. Los resultados de esta cromatografa dependern de variables como la fuente de los pigmentos, la eficiencia de la extraccin, la actividad de la almina utilizada como adsorbente, las dimensiones de la columna, los volmenes de cada solvente y las mezclas de cada solvente utilizadas en el desarrollo. Cambios muy pequeos en algunos de estos factores pueden afectar la separacin e incluso causar cambios en las posiciones individuales de los pigmentos en el cromatograma. Ya que es imposible especificar todas estas variables, no importa que tan detallado sea el procedimiento indicado para llevar a cabo el cromatograma, no en todos los casos se obtendrn resultados ptimos. En el procedimiento dado en la parte experimental, se sugiere una secuencia general de cambio de solventes y recoleccin de fracciones pero los detalles dependern del cromatograma individual. El principal objetivo es obtener tantos pigmentos individuales como sea posible en tubos de ensaye separados. Espectroscopa de absorcin La espectroscopa de absorcin es la medicin de la cantidad de radiacin que absorbe un compuesto como funcin de la longitud de onda de la radiacin que incide sobre ella. En general, se irradia una muestra con una fuente de radiacin y se mide con un detector la cantidad de radiacin transmitida a diversas longitudes de onda. Las principales tcnicas espectroscpicas (y otras relacionadas), que constituyen herramientas poderosas para la elucidacin de estructuras en qumica orgnica son las siguientes: - Espectroscopa de infrarrojo, que observa las vibraciones de los enlaces y da evidencia acerca de los grupos funcionales presentes en una molcula. - Espectroscopa de ultravioleta-visible, que observa las transiciones electrnicas y da informacin acerca de los electrones, especialmente de los no compartidos y de los sistemas de enlaces mltiples en la muestra.



- Espectroscopa de resonancia magntica nuclear, que da informacin sobre el entorno de todos los tomos de hidrgeno de la molcula en estudio y, por lo tanto, sobre la estructura de la cadena aliftica y/o aromtica y sobre los grupos funcionales cercanos a los hidrgenos. - Espectrometra de masas, tcnica en la que se bombardean las molculas con electrones para romperlas. El anlisis de las masas de los fragmentos obtenidos da informacin sobre el peso molecular, los heterotomos y los grupos funcionales presentes en la molcula original. El espectro electromagntico incluye todas las posibles frecuencias, desde cero hasta infinito. En la prctica, el espectro abarca desde frecuencias muy bajas, como las de radio utilizadas para la comunicacin con submarinos, hasta frecuencias muy altas, como las de los rayos gama. La Tabla 3 muestra la frecuencia, la longitud de onda y las relaciones de energa de las diversas zonas del espectro electromagntico. mayor frecuencia menor longitud de onda

longitud de onda

regin del espectro

energa por mol

efectos moleculares

10-10 m rayos gama

106 kcal

10-8 m rayos X

104 kcal ionizacin

Ultravioleta lejano

102 kcal

Ultravioleta cercano

transiciones electrnicas

10-6 m Visible

10 kcal color

10-4 m Infrarrojo 1 kcal vibraciones moleculares

10-2 m Microondas 10-4 kcal movimiento rotacional

10 0 m

102 m

Radio 10-6 kcal transiciones en el spin del electrn

Tabla 3. Espectro electromagntico El espectro electromagntico es continuo y la posicin exacta de la divisin entre cada regin es ms o menos arbitraria. En la parte superior se encuentran las frecuencias ms altas y, por lo tanto, longitudes de onda ms cortas y mayor energa. En la parte inferior se encuentran las frecuencias menores y, por lo tanto, longitudes de onda mayores y menor energa. Las molculas orgnicas sufren diferentes efectos de acuerdo a la energa de la radiacin que incide sobre ellas: Si se utilizan ondas de radio de baja frecuencia, se puede modificar el spin de los electrones, en especial el del hidrgeno, lo que aprovecha la tcnica de NMR. La energa en la regin de las microondas permite la rotacin de las molculas. En la regin del infrarrojo hay vibracin de los enlaces entre los tomos de una molcula. En el ultravioleta los electrones se excitan y pasan a niveles de energa ms altos dentro de las molculas. Los rayos X tienen tanta energa que excitan los electrones por encima de los niveles de energa del enlace y permiten la ionizacin de la molcula.



En la prctica # 1 se puede utilizar la espectroscopa de infrarrojo para determinar la presencia de los grupos funcionales en una muestra problema. En esta ocasin, utilizaremos la espectroscopa de ultravioleta-visible, nicamente en la regin de visible, para determinar las longitudes de onda de absorcin de algunos de los pigmentos de plantas, que fueron separados por cromatografa en columna. Posteriormente se verificarn los resultados con los datos reportados en la literatura. Espectroscopa en la regin del ultravioleta-visible La excitacin de los electrones de una molcula orgnica puede requerir desde 40 a 300 kcal/mol. Las longitudes de onda correspondientes a estas energas abarcan la regin del visible (400-800 nm), el ultravioleta cercano (200-400 nm) y el ultravioleta lejano (100-200nm). La informacin ms til se obtiene de los electrones y los pares de electrones no compartidos, pues estos enlaces son ms dbiles y requieren menos energa (y mayor longitud de onda) para pasar del estado basal al estado excitado. En especial en los alquenos, el fotn absorbido corresponde a la energa requerida para la transicin *. A estos grupos que facilitan la absorcin de energa para la transicin electrnica se les llama cromforos. Si el alqueno est conjugado, y entre mayor sea el nmero de dobles enlaces conjugados, la energa requerida para llevar a cabo esta transicin disminuye (y la longitud de onda aumenta), como puede observarse en la siguiente tabla:

nombre estructura (nm) etileno CH2=CH2 165 1,3-butadieno CH2=CH-CH=CH2 217 1,3,5-hexatrieno CH2=CH-CH=CH-CH=CH2 268 1,3,5,7-octatetraeno CH2=CH-CH=CH-CH=CH-CH=CH2 290 Si el cromforo se sigue extendiendo, la longitud de onda de la transicin * se desplaza a la zona del visible, en donde se da el mximo de absorcin (max). En esa situacin, la sustancia tendr color. Ya que la longitud de onda absorbida estar en la zona azul del espectro, el compuesto se ver amarillo. El color cambiar a rojo cuando la energa del fotn requerido para excitar a la molcula sea todava menor. La transicin * se observa abajo de 190 nm. En el caso de los compuestos que tienen el cromforo carbonilo: >C=O, ste tambin absorbe radiacin en la regin del ultravioleta., Sin embargo, el carbonilo contiene un tomo de oxgeno con pares de electrones no compartidos que se encuentran en el estado basal n y que pueden ser excitados al orbital *. La energa necesaria para esta transicin n * es menor que la del alqueno y la absorcin se encuentra en la regin del UV cercano (270 nm para la acetona). La max que presenta un cromforo en particular es muy sensible a los cambios estructurales en el sistema , es decir, al grado de sustitucin que tengan las dobles ligaduras, a la presencia de anillos aromticos, de heterotomos, etc. Es posible calcular la max de un compuesto en especial siguiendo las reglas de Woodward-Fieser. Refirindonos especficamente al caso de esta prctica, si se observa la estructura de los carotenos (de color naranja) se ver que son polienos conjugados. En las clorofilas (de color verde o azul-verde), el cromforo es ms complejo, pero bsicamente tambin corresponde a un sistema polinico altamente conjugado, con pares de electrones no compartidos en los tomos de nitrgeno (ver la Fig. 1). A continuacin se incluyen los espectros de visible-UV de los pigmentos aislados en dos cromatografas de extractos de espinaca. Los espectros de la primera cromatografa se reunieron en tres fracciones: 1) de polaridad baja, 2) de polaridad intermedia y 3) de polaridad alta. Los espectros de la segunda cromatografa en cuatro fracciones.



ESPECTROS DE ULTRAVIOLETA DE LAS FRACCIONES DE LA CROMATOGRAFA EN

COLUMNA DE PIGMENTOS DE PLANTAS

Tubo 2. Fraccin de menor polaridad, de color amarillo, eluda con hexano.

Tubo 3. Fraccin de polaridad baja, de color verde, eluda con cloruro de metileno.



Tubo 4. Fraccin de polaridad media, de color amarillo, eluda con acetato de etilo.

Tubo 5. Fraccin de polaridad alta, de color verde, eluda con metanol.



Nombres: Equipo: Grupo: TCNICA EN MICROESCALA: PREGUNTAS PARALELAS: a) Preparacin de la muestra de pigmentos: Pesa 1 g de hojas de espinaca cortadas en piezas pequeas y colcalas en un mortero con media cucharadita de arena y 3 mL de metanol.

Para qu sirve la arena en la molienda?

Muele con la mano del mortero hasta obtener una papilla, aade 6 mL de hexano y muele otra vez.

Por qu se extrae primero con metanol y luego con hexano?

Con una pipeta Beral pasa el lquido a un embudo de separacin chico, a travs de un embudo de vidrio con un pedacito de algodn del tamao de un chcharo. Trata de dejar el slido en el mortero.

Repite la molienda con otros 6 mL de hexano y renelos con el primer extracto en el embudo de separacin.

Aade 10 mL de agua de la llave a la solucin de hexano, tapa el embudo y agita. Deja separar las fases y remueve la capa acuosa inferior, ponindola en un vaso de precipitados.

Para qu se extrae con agua? Porqu es mejor que sea de la llave y no destilada?

Repite el lavado del hexano con una segunda porcin de 10 mL de agua de la llave. Tapa, agita y deja separar muy bien las fases.

Remueve nuevamente la capa inferior, elimina lo ms posible toda el agua.

Rene esta segunda fase acuosa con la primera, para posteriormente deschelas al drenaje.

Qu contiene este extracto y por qu puede desecharse al drenaje?

A partir de este momento, todo el material debe de estar bien seco. Lvalo slo si es necesario. Para secarlo, escurre bien el agua, enjuaga con una cantidad pequea de acetona, que puedes usar para varias piezas, escurre nuevamente y termina de secar la pieza con vaco.

Cmo afecta el agua a la cromatografa?

Transfiere la solucin de hexano a un matraz Erlenmeyer de 25 mL. Aade a este matraz suficiente sulfato de sodio anhidro para que se aclare la turbidez del hexano y quede un poco de polvo fino Deja reposar por 5 minutos agitando de vez en cuando. Si no queda polvo fino de sulfato anhidro, aade un poco ms del sufato y deja reposar otros 5 min.

Si ya se separ el agua, por qu se necesita el sulfato de sodio anhidro?

Con una pipeta Pasteur pasa la solucin colorida a otro matraz Erlenmeyer de 25 mL. Enjuaga el sulfato de



sodio con porciones de 0.2-0.3 mL de hexano. y con la pipeta renelas al matraz con la solucin de los pigmentos. Marca el matraz con tu nmero de equipo, ponle unas tres piedras de ebullicin y evapora la solucin, en una parrilla en la campana, a un volumen aproximado de 2-3 mL. Ten cuidado de no evaporar todo el solvente para evitar la descomposicin de los pigmentos.

Qu pasara si se omiten las piedras?

b) Preparacin de la columna de cromatografa:

Prepara la columna en una columna pequea con llave. Si no dispones de estas columnas, puedes usar una pipeta Pasteur corta, adptale en la punta un tubo capilar de plstico obtenido de una pipeta Beral; esto te permite tener un tamao de gota muy pequeo y tambin, si es necesario, detener el flujo de la columna. En la parte superior de la pipeta enrolla una liga, para poder sostener la pipeta con una pinza, sin que se resbale.

Con la ayuda de un alambre de cobre, coloca un pedacito de algodn, que no debe estar apretado, en la parte donde la columna se angosta. Cubre el algodn con una capa de arena de 3-4 mm de altura. Golpea ligeramente la columna para que la superficie de la arena est bien horizontal.

Para qu sirve la arena en la parte inferior de la columna?

Aade en seco el adsorbente para cromatografa a la columna, de preferencia slica gel (tambin puede ser almina pero no es tan conveniente). Deja caer el adsorbente dentro de la columna como un chorro muy fino. La altura del adsorbente en la columna debe ser de unos 10-12 cm (si es un pipeta de 6 a 8 cm) dejando espacio adicional en la columna para permitir que haya suficiente solvente arriba del adsorbente. Golpea muy ligeramente la columna, para que el adsorbente quede uniforme y su superficie horizontal. Evita golpearla mucho para que no se compacte demasiado.

Por qu es importante que el adsorbente est horizontal y que no tenga ni estratos ms compactos, ni grietas, ni burbujas?

Arriba del adsorbente coloca una pequea capa de arena, de 3 a 4 mm de altura.

Para qu sirve la arena en la parte superior de la columna?

Sujeta con una pinza la columna ya preparada en un soporte, a una altura adecuada para que puedas recoger las fracciones en tubos de ensaye sostenidos en una gradilla o un vaso y cambiar estos tubos con facilidad.

c) Cromatografa:

Numera consecutivamente 15 tubos de ensaye de 100 x 8 mm, marcndolos con masking tape. Acomdalos en una gradilla.



Con una pipeta Pasteur aade a la columna de cromatografa parte del extracto en hexano de los pigmentos de espinaca. Como la cantidad de adsorbente en la columna es pequea, aade slo una pipeta del extracto.

Qu pasa si usas todo el extracto o si el extracto est en un volumen grande de solvente?

La muestra debe adsorberse en una zona de la columna lo ms angosta posible, ya que las bandas se vuelven ms difusas a medida que la columna se desarrolla.

Al llevar a cabo una cromatografa es importante mantener siempre el nivel de solvente arriba de la columna de adsorbente.

Por qu es importante que el solvente no baje de la arena?

Con una pipeta Beral o Pasteur, enjuaga la parte superior de la columna con cantidades muy pequeas de hexano hasta que todo el pigmento haya entrado en la columna.

Contina aadiendo porciones de 2-3 mL del hexano y anota todos los cambios en la apariencia de la columna.

Conforme las bandas empiezan a bajar y a separarse en la columna, recolecta las fracciones de los pigmentos separados en los tubos de ensaye numerados.

Por qu se separan en bandas los componentes de la mezcla, en vez de bajar todos juntos?

Cambia de tubo cuando est lleno hasta dos terceras partes o antes, si notas un cambio de coloracin en el eluyente.

Mientras el movimiento de los pigmentos ocurra a una velocidad apreciable, contina aadiendo porciones del mismo solvente, no importa cual sea el volumen utilizado ni cuantos tubos se llenen con el mismo eluyente.

Cmo notaras si una columna no estuvo bien preparada?

Si ya no hay movimiento de los pigmentos, empieza a usar como eluyente el solvente puro o la mezcla de la siguiente polaridad y contina con el mismo solvente hasta que nuevamente ya no haya cambios.

Por qu todos los solventes deben de estar bien secos?

Contina eluyendo los pigmentos con solventes y mezclas de solventes de polaridad creciente. El orden de solventes que debe seguirse, para esta prctica es el siguiente: Hexano, Hexano con 10% de cloruro de metileno, Cloruro de metileno puro, Cloruro de metileno con 10% de acetato de etilo, acetato de etilo puro, acetato de etilo con 10% de metanol, metanol puro.

Por qu es necesario hacer los cambios de polaridad tan paulatinamente?



Cuando se tienen mezclas muy complejas pueden utilizarse, adems de stos, otros disolventes y hacer los cambios aun ms paulatinamente, por ejemplo pueden usarse secuencias de mezclas de 5%, 10% y 20%.

Qu pasara si los cambios se hicieran solamente con solventes puros sin usar mezclas?

Ve anotando tus resultados en la tabla: los colores de las fracciones recolectadas, el solvente con el que se eluy cada una de ellas y el volumen aproximado de cada fraccin.

Cuntos componentes diferentes puedes apreciar que se separaron?

Al terminar la cromatografa, observa los tubos y en base a los colores determina cuales de ellos corresponden al mismo pigmento. Antalo en la tabla asignndole el mismo nmero de compuesto a las fracciones iguales.

Cuntas clorofilas y cuantos carotenos se separaron?

De acuerdo con las profesoras, rene en los matraces que se te indique el contenido de los tubos que correspondan al mismo pigmento. Esto debe hacerse con especial cuidado para no volver a mezclar los diferentes componentes ya separados.

Cul fue la secuencia de clorofilas y de carotenos de menor a mayor polaridad?

Al terminar la prctica, las maestras se encargarn de evaporar en la campana el solvente de cada uno de los componentes, hasta un volumen pequeo y con estas muestras se obtendrn los espectros de ultravioleta visible de cada una de los pigmentos separados. Para en anlisis de resultados se usarn los espectros obtenidos en semestres anteriores, que ya fueron incluidos en el instructivo.



HOJA DE RESULTADOS Nombres de los integrantes del equipo: # de equipo: Grupo: 1. TABLA DE RESULTADOS DE LA CROMATOGRAFIA: Nmero

de la fraccin

Solvente Color e intensidad del color

de la fraccin

Volumen aproximado

de la fraccin

Clase y nmero del compuesto separado (clorofila 1, 2 o

caroteno 1, 2) 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15

2. TABLA DE RESULTADOS DE LOS ESPECTROS DE ULTRAVIOLETA-VISIBLE Anota las max, de mayor a menor, en los espectros de las pginas 32-34 del instructivo.

Fraccin max 1 max 2 max 3 max 4 max 5 max 6 max 7 max 8 Cromatografa 1 1. polaridad baja 2. polaridad media 3. polaridad alta Cromatografa 2 1. polaridad baja 2. polaridad media baja 2. polaridad media alta 3. polaridad alta PREGUNTAS DE PRELABORATORIO 1. El contenido de agua en los tejidos de plantas es muy elevado. Tomando esto en cuenta, explique porqu

la extraccin de pigmentos se lleva a cabo en metanol y luego se pasan al hexano. Sera conveniente extraer directamente con hexano?

2. Cul sera el efecto en los resultados de la cromatografa en columna si ocurriera alguno de los

siguientes errores: a) Al aadir la muestra a la columna se usa una cantidad excesiva de solvente. b) No se mantiene el nivel del solvente arriba del adsorbente y la columna se agrieta. c) No se elimina completamente el metanol del extracto de pigmentos antes de hacer la cromatografa.



3. Diga cules son algunas de las aplicaciones ms importantes de la cromatografa en columna. 4. Qu informacin, en general, nos da el espectro de absorcin en UV de un compuesto y para qu sirve

esta informacin? 5. Responda a la pregunta 15-21 de la pgina 712 del captulo 15 del libro Qumica Orgnica de Wade.

(La copia de la informacin necesaria est incluida en el manual de este laboratorio). PREGUNTAS DE POST LABORATORIO: 1. El extracto de las plantas, adems de pigmentos contiene compuestos incoloros. Explique qu hara para

detectar estos compuestos y tener una buena separacin entre estos compuestos y los pigmentos. 2. En un cromatograma de un extracto de hojas verdes, se separaron cuatro bandas coloridas en la siguiente

secuencia: 1:amarillo-naranja, 2:verde, 3:amarilla, 4: verde. Asumiendo que estas bandas corresponden a los dos carotenos y a las dos clorofilas cuya estructura se da en este instructivo, indique cul compuesto corresponde a cada una de las bandas 1 a 4 y explique su respuesta.

3. Cree que la cromatografa que hizo podra optimizarse? Cmo? 4. Existen otros tipos de cromatografa en las que tambin se utilizan columnas:

a) la cromatografa de intercambio inico; b) la cromatografa de gases; c) la cromatografa de lquidos de alta presin. Diga cules son las principales caractersticas, las diferencias entre ellas y las aplicaciones de estas tcnicas.

5. Busque en el Merk Index u otro manual las max de los - y -carotenos y de las los - y -clorofilas. 6. Qu informacin dan los datos espectroscpicos de los componentes separados en esta cromatografa?

Compara los datos experimentales de la tabla 2 con los valores reportados (pregunta 5)? Qu conclusiones pueden sacarse de esta informacin respecto a la identidad y pureza de los compuestos separados?

REPORTE 1. Entrega la HOJA DE RESULTADOS con la informacin obtenida en la prctica. 2. Conclusiones de los datos obtenidos en la hoja de reporte. 3. Responde a las preguntas de postlaboratorio. BIBLIOGRAFIA Wilcox, Jr. Charles F. & Wilcox, Mary F.; Experimental Organic Chemistry. A Small-Scale Approach,

2nd. Ed., Prentice-Hall, New Jersey, USA, 1995. pp. 122-145 y UV 154-162. Mayo, Dana W., Pike, R. M. & Trumper Peter K., "Microscale Organic Laboratory with Multistep and

Multiscale Syntheses", 3rd. Ed., John Wiley, USA, 1994. pp. 97-101. Williamson, Kenneth L., "Macroscale and Microscale Organic Experiments", 2nd. Ed., Heath and

Company, USA, 1994. pp. 170-182. Eaton, David C., "Laboratory Investigations in Organic Chemistry", McGraw-Hill, USA, 1989. pp. 127-

139.


Nmero de la fraccin

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