CRISTALIZACIN DE PROTENAS EN GELESPOR MTODOS CONTRADIFUSIVOSLaboratorio de Estudios CristalogrficosInstituto Andaluz de Ciencias de la TierraCSIC-Universidad de GranadaGRANADA-2000JOS ANTONIO GAVIRA GALLARDOLos trabajos contenidos enestamemoriaquepresentael licenciadoD. JosAntonio Gavira Gallardo para optar al grado de Doctor en Ciencias (Qumicas) han sidorealizados en el Laboratorio de Estudios Cristalogrficos del InstitutoAndaluz de Cienciasde laTierra.GRANADA-2000Fdo. Juan Manual Garca RuizFdo. Jos Antonio Gavira GallardoProfesor de Investigacin del CSIC.Laboratorio de Estudios CristalogrficosInstituto Andaluz de Ciencias de la TierraCSIC-Universidad de GranadaDirigida por:Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: J os Antonio Gavira GallardoD.L.: Gr. 420 - 2006ISBN: 84-338-3782-6 a mis padres yhermanos a Martina A AG GR RA AD DE EC CI IM MI IE EN NT TO OS S Cuantos cafs (en vaso, por favor) puede haber detrs de una tesis?Para los amantes, como yo, de este lquido elemento parecera lgico comenzar agradeciendo a J uan Valdes sus viajes a Colombia, pero el caf hay que tomarlo con su mejor ingrediente, los amigos y compaeros sin los que cualquier tesis se hara interminable.Quiero comenzar agradeciendo a J uanMa Garca-Ruiz la confianza que me ha tenido desdeeliniciodeestetrabajo.ConellayconelentusiasmoqueJ uanMadepositaen absolutamente todo lo que hace, cualquier tarea es posible. Le agradezco haberme permitido acceder a una formacin nada al uso con la que he descubierto el mundo de la ciencia del que ahora me considero parte integrante. Tambin le agradezco que haya compartido conmigo su saber hacer, esencial para disfrutar de una familia como el L.E.C. AFermnOtlora,hermanodeformacin,otrotanto.Leagradezcoquemehaya enseadoahacerlaspreguntasantesdetenerlasposiblesrespuestas.Que,congran paciencia,mehayaintroducidoenlarealidaddelcristalalavezquedesentraabalos entresijosdeladifraccin.LeagradezcoquemeensearaladiferenciaentreunRiojayun Ribera del Duero, y por la copa charlada. Le agradezco a todos los componentes del L.E.C., los que estn y los que estuvieron, elsoportarmischistesyelhabermeendulzadoloscafsdelosdascrudos.Enespecialle agradezcoaEva,factorcomndeestagranfamiliayquenossufreineludiblemente,los cuentosdeveranoquehacanlastardesllevaderas.EnestafamiliahayqueincluiraMati, nuestro angel protector que siempre ha cuidado de nosotros y nos ha sacado de ms de un apuro cuando ms lo necesitbamos. Al Ministerio de Educacin y Ciencia, por su ayuda econmica a travs de la beca de FPI, y al CSIC, por las ayudas para estancias cortas en el extranjero. A Martina le agradezco TODO y ms. A mi familia su apoyo, si hubo algo imposible ellos lo hicieron posible. Especialmente a mi madre por su clarividencia, de la que an hoy me sorprendo. Nadie se queda en el tintero, a vosotros os agradezco y agradecer de viva voz, uso legitimo del lenguaje que facilita la tarea de la comunicacin. J . A. Gavira-Gallardo ndice iCAPITULO 1: INTRODUCCIN 1.1. INTRODUCCIN, OBJ ETIVOS Y ESTRUCTURA DE LA TESIS........................................11.2. ESTRUCTURA DE LAS PROTENAS..................................................................................61.3. EL PROBLEMA DE LA CRISTALOGNESIS DE PROTENAS...........................................91.3.1 Principios generales de la cristalognesis de protenas.............................................91.3.2 Nucleacin..................................................................................................................111.3.3 Crecimiento................................................................................................................161.3.4 Cese del crecimiento..................................................................................................181.4. TCNICAS CONTRADIFUSIVAS DE CRECIMIENTO DE CRISTALES..............................191.4.1. Requerimientos y caractersticas de la contradifusin..............................................20CAPITULO 2: MATERIALES Y MTODOS2.1. LAS PROTENAS..................................................................................................................232.1.1 Lisozima......................................................................................................................252.1.2 Ferritina.......................................................................................................................262.1.3 Thaumatina.................................................................................................................272.2. LOS GELES...........................................................................................................................282.2.1. Protocolo de preparacin de los geles de agarosa...................................................282.2.2. Protocolos de preparacin de los geles de slice......................................................302.2.3. Protocolo de cristalizacin en batch de gel de agarosa............................................312.2.4. Protocolos de cristalizacin en contradifusin...........................................................322.2.4.1 Recuperacin de los cristales.....................................................................352.2.4.2 Montaje de cristales de protenas para difraccin......................................362.3. ANLISIS DE IMAGEN.........................................................................................................362.4. TCNICAS DE INDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN...............................................382.4.1. Difraccin de rayos X.................................................................................................382.4.2. Microscopa electrnica de barrido............................................................................392.4.3. Interferometra Mach-Zhender...................................................................................392.4.4. Tratamiento de datos.................................................................................................39CAPITULO 3: LOS GELES COMO MEDIOS DE CRISTALIZACIN 3.1. ANTECEDENTES.................................................................................................................413.2. LOS GELES COMO MEDIOS DE CRISTALIZACIN DE LAS PROTENAS.......................433.3. GELES DE SLICE................................................................................................................453.3.1. La superficie del gel de slice.....................................................................................473.3.2. Resultados y discusin..............................................................................................493.4. GELES DE AGAROSA..........................................................................................................573.4.1. Propiedades qumicas y fsicas de los geles de agarosa..........................................573.4.1.1. Polimerizacin............................................................................................583.4.1.2. Tamao de poro........................................................................................613.4.2. Resultados y discusin..............................................................................................633.5. CONCLUSIONES..................................................................................................................70ndiceJ . A. Gavira-Gallardo iiCAPITULO 4: LA EVOLUCIN DE LA SOBRESATURACIN EN LA TCNICA DE CONTRADIFUSIN 4.1. INTRODUCCIN...................................................................................................................714.2. BASES TERICAS DE LA CONTRADIFUSIN..................................................................724.2.1. El transporte de masa en sistemas difusivos............................................................724.2.2. Precipitacin y crecimiento en contradifusin...........................................................734.3. MTODOS DIRECTOS.........................................................................................................754.3.1. Seguimiento por interferometra................................................................................754.3.2 Concentracin total en el tiempo................................................................................764.3.2.1. Variacin de la concentracin de sal.........................................................784.3.2.2. Variacin de la concentracin de protena................................................834.4. MTODOS INDIRECTOS.....................................................................................................874.4.1. Influencia sobre la nucleacin...................................................................................874.4.2. Influencia sobre el hbito cristalino............................................................................944.5. CRECIMIENTO DE CRISTALES DE LISOZIMA...................................................................1064.5.1. Mecanismos de crecimiento de los cristales de lisozima..........................................1064.5.2. Velocidad de crecimiento de los cristales de lisozima...............................................1104.6. MEDIDA DE LA CALIDAD CRISTALINA...............................................................................1224.6.1. Medidas ex situ..........................................................................................................1224.6.2. Medidas in situ...........................................................................................................1294.7. CONCLUSIONES..................................................................................................................133CAPITULO 5: CRISTALES DE PROTENA REFORZADOS 5.1. INTRODUCCIN...................................................................................................................1355.2. CRISTALIZACIN EN GELES DE SLICE...........................................................................1365.2.1. Interaccin protena-gel de slice...............................................................................1375.2.1.1. Influencia del gel de slice sobre la densidad de nucleacin.....................1395.2.1.2. Incorporacin del gel de slice en los cristales de protenas.....................1445.2.2. Caracterizacin termogravimtrica............................................................................1515.2.3. Estabilizacin de lisozima en geles de slice.............................................................1635.2.4. Efectos morfolgicos.................................................................................................1665.2.5. Difraccin de cristales reforzados.............................................................................1725.3. CRISTALIZACIN EN GELES DE AGAROSA.....................................................................1815.3.1. Cristalizacin de lisozima en geles de agarosa.........................................................1815.3.1.1 Influencia del gel de agarosa sobre el flujo de nucleacin.........................1845.3.1.2. Incorporacin del gel de agarosa en los cristales de protenas.................1905.4. CONCLUSIONES..................................................................................................................193 J . A. Gavira-Gallardo ndice iiiCAPITULO 6: INFLUENCIA DE UN CAMPO MAGNTICO SOBRE LA CRISTALIZACIN DE LISOZIMA 6.1. INTRODUCCIN..................................................................................................................1956.2 ANTECEDENTES..................................................................................................................1966.3 ASPECTOS TERICOS........................................................................................................ 1976.4 MATERIALES Y MTODOS.................................................................................................. 1996.5 RESULTADOS Y DISCUSIN .............................................................................................. 2016.5.1 Clculo de la anisotropa de la susceptibilidad diamagntica molar de la molcula de lisozima........................................................................................................................... 2026.5.2 Tamao del menor cristal orientable.......................................................................... 2026.5.3 Grado de orientacin.................................................................................................. 2046.5.4 Influencia del campo magntico sobre el flujo de nucleacin.................................... 2076.5.4.1 En batch...................................................................................................... 2076.5.4.2 En contradifusin........................................................................................ 2086.5.5 Efecto sobre la morfologa final de los cristales......................................................... 2126.5.5.1 En batch...................................................................................................... 2126.5.5.2 En contradifusin........................................................................................ 2146.5.6 Orientacin de los cristales en el interior de los capilares.......................................... 2166.6 CONCLUSIONES................................................................................................................... 217 CAPITULO 7: CONCLUSIONES GENERALES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO.................................................................................................................................... 219APNDICE A. CARACTERIZACIN DE LISOZIMA....................................................................................... 223BIBLIOGRAFA....................................................................................................................... 225 J . A. Gavira-Gallardo Introduccin Captulo 111 1. .I IN NT TR RO OD DU UC CC CI I N N If you can look intothe seeds of timeand say which grain willgrow and which will not, speak then to me ... Macbeth 1.1.INTRODUCCIN, OBJETIVOS Y ESTRUCTURA DE LA TESIS Hoy en da la cristalizacin de protenas sigue manteniendo el estatus de arte ms que el deciencia.Enlamayoradeloslaboratoriosdedicadosalaresolucinestructuralsesigue aplicando el mtodo de ensayo y error en la bsqueda del deseado cristal. La falta de un criterio racional se suple con el uso de condiciones de cristalizacin estadsticamente eficientes, esto es, aquellas que han permitido cristalizar un mayor nmero de protenas. Cada condicin se ensaya de forma puntual empleando las tcnicas clsicas de gota sentada o colgada y batch, con las que se persigueunalentahomogeneizacindelsistemadeformacontroladayestable.Estaformade operar da una visin restringida del problema y una informacin poco til a la hora de establecer unos criterios de cristalizacin. Ungradomayordecomplejidadlopresentanlastcnicascontradifusivasquese caracterizan por crear sistemas no homogneos que se desarrollan fuera del equilibrio. En este tipo de tcnicas la precipitacin est acoplada a un transporte de masas de tipo difusivo que controla la velocidad con la que se alcanza un determinado nivel de sobresaturacin y la sobresaturacin en cadamomentoencadapuntodelreactordeprecipitacin[HenischyGarcia-Ruiz,1986].El acoplamientodelfenmenoqumicodelaprecipitacinconlafsicadeladifusindificulta enormementelainterpretacindelosresultadosexperimentales.Laaparicindepatronesde precipitacinrtmicos,laposicindelprimerprecipitadoascomoelnmeroytamaodelos cristales han representado incgnitas de estas tcnicas durante casi un siglo [Henisch, 1970, 1988; Garcia-Ruiz, 1980]. El desarrollo en las ltimas dcadas de la tecnologa de la computacin capaz de realizar clculos iterativos ha posibilitado la aplicacin de soluciones numricas a la resolucin de las ecuaciones diferenciales que describen el transporte de masa en un medio difusivo (leyes de Fick)[HenischyGarca-Ruiz,1986].Arazdeestosavancesesposiblepredecir[Garcia-Ruiz, 1991]einclusosimular[Otalora,1996,OtalorayGarca-Ruiz,1996,1997]elcomportamiento espacial de un sistema de difusin-precipitacin a lo largo del tiempo.ndiceIntroduccinJ . A. Gavira-Gallardo Captulo 12Lacontradifusinengelessehaaplicadoconxitoalacristalizacindesustancias inorgnicas con un bajo producto de solubilidad y difciles de cristalizar empleando otras tcnicas [Henisch,1970],ascomoalaumentodelacalidaddeloscristalesdesustanciasfcilesde cristalizar[Lefaucheux,etal.,1982].En1991Garca-Ruizproponeaplicarlastcnicasde contradifusin en medios gelificados a la cristalizacin de macromolculas biolgicas como mtodo alternativo para realizar un amplio barrido de condiciones experimentales en una nica experiencia. Anteriormente se haba comprobado que los medios difusivos: capilares [Zeppezauer et al., 1968 y 1971;Salemme,1972]ymediosgelificados[RoberyBerthou,1987;KalKurayDevanarayanan, 1987], favorecen la cristalizacin de las macromolculas biolgicas y ayudan a aumentar la calidad deloscristalesquenucleanycrecenenunmediohomogneo.En1993,Garca-Ruizy colaboradores desarrollan el mtodo de acupuntura en geles (GAME) combinando ambos medios. EstemtodosepuedeconsiderarunaextensindelmtododeSalemmeenelqueelagente precipitanteensolucinsehacedifundirprimeroatravsdeunacmaradegelparaingresar posteriormente en el capilar que contiene la protena en solucin. La diferencia fundamental entre ambosmtodosestribaenque,mientrasenelmtododeSalemmeslosepretendeunalenta homogeneizacindelsistema,elGAMEsebasaenlarupturadeestahomogeneidad[Otaloray Graca-Ruiz,1996].Paraellolasconcentracionesinicialesdeagenteprecipitanteyprotenase escogendeformaqueenlosprimerosinstantesyposicionesseproduzcaunaelevada sobresaturacin que desestabiliza el sistema. Esta prdida de estabilidad se mantiene a lo largo del tiempo consiguiendo que en cada punto de la cmara de protena se alcancen distintos niveles de sobresaturacin,loquesetraduceenunbarridodecondicionesexperimentalesenunanica experiencia. A estas ventajas hay que aadir que los cristales crecen en un medio difusivo y limpio, similar al que se disfruta en condiciones de microgravedad, lo que en la mayora de los casos se traduceenunaumentodelacalidaddeloscristales.Porotraparteloscristalesseobtienen directamenteenuncapilarquepodemosemplearparalaadquisicindedatosdedifraccin evitandoelestrsalquesevensometidosloscristalesduranteeltraspasodelmediode cristalizacin al capilar. El trabajo realizado durante los ltimos aos en el seno de nuestro grupo ha demostrado que el mtodo de acupuntura en geles (GAMEi) se puede aplicar a un extenso nmero de protenas con caractersticas fsico-qumicas (peso molecular, punto isoelctrico, nmero de subunidades) tan variadas como: lisozima (14.3 kDa, 11.2, 1), insulina (5.8kDa, 5.35, 2), ferritina (456.0 kDa, 4.5, 24), concanavalina A (102.0 kDa, 8.1, 1), ribonucleasa A (12.6 kDa, 7.8, 1), etc. [Moreno, 1995; Moreno, et al., 1996]. Sin embargo, an no se ha producido una generalizacin del empleo de este mtodo como rutina en los laboratorios de cristalizacin, ya que es difcil comprender la necesidad de fijar unas elevadas concentraciones iniciales como nico medio para asegurar la obtencin de cristales de calidad y tamao apropiados. Enelmarcotericolaextrapolacindelateoraclsicadenucleacinycrecimientode sistemas temporalmente homogneos ha permitido realizar grandes avances en la comprensin de lacristalognesisdeprotenas[Chernov,1984].Enestesentido,laevaluacindela

i GAME del ingls Gel Acupuncture Method. J . A. Gavira-Gallardo Introduccin Captulo 13sobresaturacineselrequisitofundamentalsisequierecomprender,analizarycompararlos resultados de crecimiento cristalino obtenidos experimentalmente.Enelcasodeexperienciasencontradifusin,adems,hayquetenerencuentaquela sobresaturacin vara espacial y temporalmente y que ambas variaciones controlan la nucleacin y crecimientodeloscristales.Aunquesudesarrollosehasimuladoempleandoalgoritmosde computacin, al comienzo de este trabajo no disponamos de ninguna evidencia experimental de cmo se produce esta evolucin.Enestecontextoseenglobaelprimerobjetivodeestatesis:encontrarlosindicadores directosoindirectosquepermitanrealizarunseguimientodecmosedesarrollaelpatrnde sobresaturacinenexperienciasdecontradifusinysurepercusinsobrelacalidadfinaldelos cristales.Estosindicadoreslosbuscamostantoensolucin(GAME)comoenmediogelificado, asumiendo que el comportamiento de ambos sistemas es similar y que, por tanto, la informacin es decarctercomplementario.Posteriormentecomprobamoscomolapropiaconfiguracin experimental del GAME condiciona fuertemente la evolucin de la experiencia limitando el carcter comparativo de los datos obtenidos.Duranteeldesarrollodeestainvestigacintuvimoslaoportunidadderealizardistintas experiencias en condiciones de gravedad reducida (misin STS-95). En el transcurso de la citada misinsellevacaboelseguimientoespacialytemporaldeunaexperienciaencontradifusin empleandouninterfermetrodetipoMachZhender.Delanlisisdelosinterferogramas (desarrolladoenotratesisennuestrogrupo)sehaobtenidolaprimeraevidenciarealdela existencia de una onda de sobresaturacin que recorre la cmara de precipitacin [Garca-Ruiz, et al., 2000]. Porotraparteycomosueleocurrireneltranscursodecualquierinvestigacin,nos encontramosennuestrocaminoconpuntosque,sindesviarsedelosobjetivosiniciales, presentaban un inters adicional por su novedad y perspectivas de futuro.Lasegundametadeestetrabajonaceconlaideadeestablecerunnexoentrelas necesidades industriales y los cristales de protenas ms all de la resolucin estructural. Eldesarrollodenuevastecnologas[Thomson,1996],laadministracincontroladade frmacos [Gennaro, 1985] o la sntesis y maduracin enzimticas [Halgas, 1992] son campos en expansin.Elmecanismohabitualmenteempleadoparadisponerdeunaprotenaactivaesla inmovilizacin por adsorcin, unin o agregacin de las molculas a una matriz inerte. La adsorcin de la protena es el paso previo al entrecruzamiento o unin fsica de la enzima a la matriz en la que se ha inmovilizado [Ballesteros, et al., 1998].A raz de esta necesidad se nos plantea la posibilidad de obtener materiales compuestos protena-gelqueparticipendelascaractersticasfsicasyqumicasdeambos.Partimosdedos evidenciasexperimentales:1)laincorporacindelgeldesliceencristalesdecarbonatoclcico [Henisch,1988]y2)laposibilidaddecrecercristalesdeprotenasengelesdeslice[Roberty Berthou, 1987; KalKura y Devanarayanan, 1987]. A partir de estas evidencias la hiptesis de trabajo es que los cristales de protenas son capaces de incorporar el gel durante su crecimiento. Una vez IntroduccinJ . A. Gavira-Gallardo Captulo 14demostrada esta hiptesis, el siguiente paso consiste en encontrar la concentracin mxima de gel quepuedenincorporarloscristalesyestudiarcmoestaincorporacinmodificalacalidaddel cristal. Adems del propio inters cristalogrfico que puede representar la obtencin de cristales reforzados de protenas capaces de mantener su integridad estructural durante su manipulacin y resistir la deshidratacin, su inters acadmico es evidente. En los ltimos aos se ha dedicado un gran nmero de trabajos y monografas a descifrar el papel del solvente en el mantenimiento de la estructuratridimensionaldelasprotenas[Teeter,1991;Gregory,1995]yencristalizacin[Frey, 1994;J acobetal.,1998].Habitualmentesepiensaqueunadeshidratacindelasprotenas conlleva una prdida de la estructura nativa y, por tanto, de la capacidad enzimtica. Sin embargo, las enzimas poseen plena actividad cataltica a niveles de hidratacin tan bajos como 0.12-0.2h (h =gramosagua/gramosprotena).Porestopensamosquelasustitucindelamayorcantidaddeagua posibleenloscristalesdeprotenanodebeafectarasuestructurayque,portanto,mantendr intacta su funcionalidad. El tercer objetivo de este trabajo nace de la ambigedad de los datos que hasta la fecha se hanpublicadosobreelefectoqueuncampomagnticoejercesobrelacristalognesisde protenas. En 1997, Sazaki y colaboradores comprueban como se reduce el nmero de cristales de lisozima y ferritina que nuclean en presencia de un campo magntico de 10T de intensidad y que los cristales aparecen orientados en la direccin del campo magntico. En el mismo periodo, Ataka ycolaboradoresobservanunaumentodelflujodenucleacinensolucionessobresaturadasde lisozima que nuclean bajo la accin de un campo magntico de 0.6-1.2T de intensidad. El aumento de flujo de nucleacin iba acompaado de una reduccin del tamao final de los cristales [Ataka et al., 1997]. Esta diferencia de resultados fue relacionada posteriormente con la homogeneidad del campomagnticoaplicado,envirtuddelafuerzamagnticaqueungradientedecampopuede ejercer sobre cualquier sustancia magntica [Wakayama et al., 1997] Ladiversidaddelosresultadosylasdistintasconclusionesquedeellossederivanse deben a una heterogeneidad experimental. Basndonos en esto y en nuestro conocimiento previo encristalizacindeprotenasenmediosgelificados,abordamosesteestudioconlaideade esclarecercomoinfluyelaaplicacindeuncampomagnticohomogneoyconstantesobrela cristalognesis de protenas. Los diferentes objetivos propuestos barren ampliamente la problemtica de la cristalizacin de protenas desde distintos puntos de vista, pero con un nexo comn: las tcnicas contradifusivas. Tomandoestepuntocomoejecentraldelatesis,lamemoriasecomponedelossiguientes captulos:1.- En este captulo se exponen los objetivos y motivaciones de este trabajo y se introduce el problema de la cristalizacin de protenas y la contradifusin como una solucin viable. 2.- En el segundo captulo se describen de forma somera los materiales: protenas, geles, etc. y mtodos empleados en el transcurso de esta memoria, haciendo especial hincapi en losdistintosprotocolosdepreparacindemuestrasyexperiencias.Paraqueesta J . A. Gavira-Gallardo Introduccin Captulo 15informacin sea accesible, los protocolos se han esquematizado y simplificado, destacando los puntos de mayor relevancia. Los detalles especficos de cada experiencia se recogen en los apartados correspondientes. 3.- Puesto que los geles de slice y agarosa son la base sobre la que se desarrolla este trabajo hemos querido recoger en este captulo las caractersticas fsicas y qumicas ms relevantes, as como los diversos ensayos realizados para comprender la interdependencia entre estas caractersticas y las condiciones de preparacin. 4.-Enestecaptuloserecogelaevolucindela sobresaturacin en las experiencias de contradifusinensolucinlibreyenmediosgelificadosatravsdemtodosdirectose indirectos. Los resultados se analizan a la luz de las predicciones tericas de la evolucin delasobresaturacinenmediosdifusivosaplicandolasleyesdetransportedemasa de Fick. A partir de estos datos se establece una relacin entre la calidad de los cristales y la sobresaturacinatravsdelavelocidaddecrecimiento.Secomparalaeficaciadelos distintos medios para obtener un transporte de masa difusivo y se establecen los criterios para elegir las condiciones iniciales que permiten obtener el mayor barrido de condiciones, independientemente del medio elegido. A partir de los datos de difraccin de los cristales crecidosenmedioscapilares,gelificadosyenmicrogravedaddemostramoscomolas tcnicascontradifusivasrepresentanlamejoropcinparaobtenercristalesdeelevada calidad,independientementedelmedioempleado.Estaafirmacinsesoportaporla compresin de los fenmenos de transporte, nucleacin y crecimiento en medios difusivos.5.- Describimos en este captulo como se produce el crecimiento de cristales de protenas en medios gelificados, la interaccin protena-gel y el efecto de los distintos geles sobre la nucleacin y crecimiento de los cristales de protena. Demostramos como los cristales de protena incorporan el gel durante su crecimiento y como en el caso de los geles de slice su presencia a elevadas concentraciones condiciona la morfologa externa de los cristales ms all de la modulacin de la sobresaturacin expuesta en el captulo cuarto. Asimismo seestudialainfluenciadelgelsobrelacalidaddeloscristalesysupapelenlas caractersticas fsicas del cristal y de la protena. 6.- Por ltimo, en este captulo se estudian las bases de la orientacin de los cristales de protenaexpuestosalaaccindeuncampomagnticohomogneoyconstante. Empleamoslacristalizacinenmediosgelificadosparaestudiarestainfluenciaconuna reproducibilidad elevada. Discutimos las conclusiones publicadas hasta la fecha a al luz de estosresultadosyproponemoselusodeestanuevaherramientaparalaobtencinde grandes monocristales orientados en una determinada direccin. 7.-Aunquetantoladiscusindelosdatoscomolasconclusionesserecogenencada captulo, hemos querido analizar de forma global los resultados expuestos y acompaarlas de las posibles perspectivas de futuro. IntroduccinJ . A. Gavira-Gallardo Captulo 161.2.ESTRUCTURA DE LAS PROTENAS Lasprotenassonsistemascomplejosdeorganizacinespacialdetomosconpesos molecularesquepuedensuperarlascentenasdekilodaltons(kDa,1Da=1gr/mol).Laamplia variedad de funciones que desempean estos polmeros (enzimtica, regulatoria, estructural, etc.) estsustentadaenestaorganizacinespacial.Tantoesas,quealaestructuraproteicasela consideracomoelsegundocdigogentico.Unanlisisdetalladodesuarquitectura tridimensionalpermiteestablecercuatronivelesdeorganizacin.Elprimernivelserefiereauna organizacinatmicaqueseinfieredirectamentedelcdigogenticoyestconstituidoporla secuencia de aminocidos. Existe un total de 20 aminocidos, sillares de toda estructura proteica. NombreSmbolosMasaS*pK-COOH pK-NH3pK-RCarcterpI* AlaninaAla A71.0916.652.359.69-No polar6.02 ArgininaArg R156.19152.179.0412.48Cargado (+)10.76AsparaginaAsn N114.110.7782.028.80-Polar sin carga5.41 Ac. AsprticoAsp D115.093.532.099.823.86Polar cargado (-)2.97 CsteinaCys C103.15Alta1.7110.788.33Polar5.02 GlutaminaGln Q129.120.8642.179.13-Polar sin carga5.65 Ac. GlutmicoGlu E128.142.52.199.674.25Polar carga (-)3.22 GlicinaGly G57.0524.992.349.60-Polar-No Polar5.97 HistidinaHis H137.144.191.829.176.00Polar, carga (+)?7.85 IsoleucinaIle I113.164.1172.369.68-No polar6.02 LeucinaLeu L113.162.4262.369.60-No polar5.98 LisinaLys K128.17Alta2.188.9510.53Cargado (+)9.74 MetioninaMet M131.193.3812.289.21-No polar5.75 FenilalaninaPhe F147.182.9651.839.13-No polar5.98 ProlinaPro P97.12162.31.9910.60-No polar6.10 SerinaSer S87.085.0232.219.15-Polar sin carga5.68 TreoninaThr T101.11Alta2.6310.43-Polar sin carga6.53 TriptofanoTrp W186.121.1362.389.39-No polar5.88 TirosinaTyr Y163.180.04532.209.1110.07Polar sin carga5.65 ValinaVal V99.148.852.329.62-No polar5.97 Tabla.1.2-1 Caractersticas ms relevantes de los veinte aminocidos esenciales. *pIa25Cysolubilidad(S)expresadaeng/100gdeaguaa25Cextradosde:The Merck Index, Merck & Co. Inc., Nahway, N.J ., 11(1989); CRC Handbook of Chem.& Phys., Cleveland, Ohio, 58 (1977). Los aminocidos presentan una estructura comn constituida por un carbono central (C) al que se encuentranunidosungrupoamino,unocidoyunacadenalateralqueleconfierelas caractersticas fsico-qumicas (Tabla 1.2-1). La polimerizacin ocurre por la reaccin entre el grupo carboxiloyelgrupoaminodedosaminocidosdistintosgenerndoseunaamidasecundaria (enlace peptdico) con desprendimiento de una molcula de agua.O H COOH - ) CH(R - HN - CO - ) CH(R - N HCOOH - ) CH(R - N HCOOH - ) CH(R - N H2 1peptdicoEnlace1 22 21 2+ +48 47 6 ndiceJ . A. Gavira-Gallardo Introduccin Captulo 17Durante la elongacin de la cadena aminoacdica se pueden establecer puentes de hidrgeno entre los grupos carboxlicos y amidas de distintos aminocidos separados en la secuencia dando lugar a laaparicindeestructurassecundarias(hlicesylminas).Deestaformalacadenalinealde aminocidos se estructura en grupos lineales unidos entre s por codos o regiones desordenadas. Elplegamientodeestasestructurassecundariasgeneradasapartirdeunanicacadena polipeptdicasedenominaestructuraterciaria.Cuandovariasdeestasestructurasterciariascon idnticaodistintacomposicinseasocian,generanunniveldeorganizacinsuperiorque denominamosestructuracuaternaria.Lasfuerzasresponsablesdemantenerestaintegridad estructural son: las interacciones electrostticas, los puentes de hidrgeno, las fuerzas de Van der Waals, las interacciones hidrfobas y los puentes disulfuros. Salvo los puentes disulfuros se trata de fuerzas no covalentes importantes por su nmero ms que por su intensidad. Fig.1.2-1Representacinesquemticadelosnivelesdeorganizacinestructuraldelasprotenastomando comoejemplolahemoglobina,protenatransportadoradegasesensangre.Figuratomadadelaredde direccin no recuperable. IntroduccinJ . A. Gavira-Gallardo Captulo 18De la fuerte relacin entre la estructura de las protenas y la funcin que realizan se deduce la necesidad de conocer esta arquitectura tridimensional para poder entender los mecanismos de accin.Lasdisfuncionespatolgicasyeldiseodefrmacosenmedicina(Tabla1.2-2),los mecanismosenzimticosenlaindustria(textil,alimenticia,lctea,etc.)olapropiadisposicin espacialeneldesarrollodenuevastecnologassonsloalgunosejemplosquedependendel conocimiento de la estructura proteica para su desarrollo. PROTENA - VIRUSENFERMEDADINHIBIDOR / DROGA HemoglobinaAnemiaBenzafibrato, cido clofbrico. Dihidrofolato ReductasaCncerMetotrexato. Timidilato SintasaCncer Florurouracil y compuestos de la 6,7-imidazotetrahidroquinolina Nucleosido FosforilasaCncer 9-(arilmetil) derivados de la 9-deazaguanina Enzimaconvertidorade angiotensina HipertensinCaptopril y Enalopril ReninaHipertensinPptidos del anlogo de transicin Elastasa humana de leucocitos Enfermedad degenerativa de Lung Anlogos de cefalosporinas, fluorometil cetonas y 1-antitripsina ThrombinaTerapia anticoagulanteHirudin y argatroban PlasmingenoTerapia anticoagulante Protena recombinante sin capacidad inhibidora Anhidrasa carbnica Hipertensin ocular, Glaucoma Tienotiopiran-2-sulfonamidas (MK507) Proteasa de SIDASIDA C2-Dioles simtricos basados en siete miembros del ciclo de la urea, diseo de pptidos Transcriptasa inversa del SIDA SIDAAZT y neviparina. Rhino virus humanoResfriado comnProductos de farmacopea. Virus de la gripeGripe Anlogos modificados del cido neuramdico Tabla1.2-2Frmacosdiseadosapartirdelconocimientodelaestructuraproteicayenfermedades relacionadasconestasprotenas.ConfeccionadaporE.MihandirectordeldepartamentodeBiologa Estructural en la U. de Alabama en Huntsville, Alabama. La difraccin de rayos X de monocristales es la tcnica ms eficaz en la resolucin de la estructurademacromolculasbiolgicas.Otrastcnicascomolaresonanciamagnticanuclear (RMN) o las predicciones tericas han aportado casi el 20% del total de estructuras resueltas. Sin embargo, hoy en da la difraccin sigue siendo la tcnica ms empleada y a la que ms medios econmicosycientficossededican.AdiferenciadelRMN,ladifraccinnopresentaninguna limitacin en cuanto al peso molecular de la protena, pero necesita un cristal sobre el que realizar los estudios de difraccin. J . A. Gavira-Gallardo Introduccin Captulo 191.3.EL PROBLEMA DE LA CRISTALOGNESIS DE PROTENAS Loscristalesdeprotenashanrebasadolabarreradelaresolucinestructuralpara convertirseenmaterialesdeintersgeneralperse.Lasprotenasengeneralyloscristalesde protenas en particular han ingresado en la ltima dcada en las industrias electrnica y tecnolgica expandiendosucampodeaplicacinaungrannmerodenuevasdisciplinasdelconocimiento [Birge y Gross, 1995, Thomson, 1996]. Estas nuevas industrias dependen para su desarrollo tanto del conocimiento estructural como de la caracterizacin de las propiedades fsico-qumicas de los cristales, de ah la necesidad de disponer de grandes cristales de elevada calidad. Sin embargo, la mayora de los esfuerzos de la comunidad cientfica estn focalizados en la obtencin de cristales que permitan resolver la estructura de la protena. En este mbito las pruebas de cristalizacin se realizanempleandoelmtododeensayoyerrorquecarecedeunplanteamientoracionaldel problema.Para poder dar respuesta a ambas necesidades (tamao y calidad) es necesario disponer primerodelmarcotericoadecuadoquenospermitarealizarclculospredictivosdel comportamiento del sistema. Aunque la aplicacin de la teora clsica de crecimiento cristalino a la cristalognesis de protenas ha permitido realizar importantes avances existen an grandes lagunas sin resolver [Chernov, 1997].1.3.1.PRINCIPIOS GENERALES DE LA CRISTALOGNESIS DE PROTENAS La cristalizacin de molculas en solucin es un fenmeno de equilibrio qumico reversible cuyacinticaytermodinmicaestncontroladasporlascaractersticasfsicasyqumicasdel solvente y del soluto. Bajo ciertas condiciones el sistema segrega de la solucin un precipitado que disminuye la energa libre del sistema (ncleo crtico o un agregado no especfico) [Weber, 1991]. Esta disminucin de energa libre es tanto mayor cuanto ms ordenada sea la fase segregada.Tpicamenteseconsideraelfenmenodecrecimientocristalinodivididoentresfaseso etapas; nucleacin, crecimiento y cese del crecimiento. La formacin de un ncleo proporciona al sistema de superficie para continuar creciendo. Hay tres causas que provocan que un cristal deje de crecer: el consumo de las unidades de crecimiento (se ha alcanzado una situacin de equilibrio termodinmico),elincrementodelaenergadesuperficieporacumulodeimperfeccionesola incorporacin de impurezas sobre las caras del cristal [Kam, et al., 1978, Feher y Kam, 1985].Paramolculaspequeasyteniendoencuentalasconsideracionesfsico-qumicas oportunas es posible incluso predecir el comportamiento de una solucin ante un cambio exterior que desplace el equilibrio hacia la formacin del cristal [Boistelle y Astier, 1988, Chernov, 1993 y 1997]. La gran diferencia entre la cristalizacin de macromolculas biolgicas y la cristalizacin de compuestosinorgnicoslaestablecenladesigualdistribucin de las propiedades fsico-qumicas superficiales(polivalencia,forma,hidrofobicidad,etc.)ylaflexibilidaddeciertasregionesque complican el establecimiento de uniones favorables en el cristal. Adems, durante la cristalizacin ndiceIntroduccinJ . A. Gavira-Gallardo Captulo 110de pequeas molculas el solvente es excluido de la superficie en crecimiento, mientras que en el casodelaprotenaselsolventeesincluidoenelcristal(20-80%).Partedeestasmolculasde solventeseinmovilizanyordenan en la celdilla unidad de la protena rellenando los huecos que dejan las protenas en sus contactos internos en el cristal. Esta incorporacin es evidencia de las grandescavidadesquepresentanloscristalesdeprotenas.Cabeesperarpuesquelas interacciones entre las molculas de protena que componen el cristal sean dbiles y as ocurre en la mayora de las protenas que se han medido [Frey et al, 1988, Salemme et al, 1988]. Lacomplejidaddelasuperficieesresponsabledelelevadonmerodeparmetrosque podemos variar para disminuir la solubilidad de una macromolcula en solucin: fuerza inica, pH, temperatura, etc. [Ducruix y Gieg, 1999; McPherson, 1999]. Para solventar esta combinatoria de posibilidadessehandesarrolladomtodosdebarridodecondicionesquecarecendealgn planteamiento racional del problema.Lavariablehabitualmenteempleadaparadisminuirlasolubilidaddeunaprotenaesel cambio de la fuerza inica del medio (I)i manteniendo el resto de variables constantes (Fig.1.3-1). Paraentendercomovaralasolubilidaddeunaprotenaconlafuerzainicaconsideremoslas protenasensolucincomounpolielectrolitoqueaundeterminadopH,distintodesupunto isoelctrico(pI)ii,presentaunacarganetadistintadecero.Lapresenciadeestacarganeta restringe la solubilidad de la protena debido a las repulsiones entre cargas. Un leve aumento de la concentracin de sal hace que estas cargas sean apantalladas y que decrezca el espacio mnimo requerido para poder mantener las protenas en solucin, lo que se traduce en un aumento de la solubilidad de la protena o fenmeno de salting in. Al aumentar la concentracin de sal los iones se unen al agua ms fuertemente que a las cargas superficiales de la protena ya que la constante dielctricadelasuperficiedelaprotenaesmenorquelaconstantedielctricadelagua.Esta perdidadeaguahacequesefavorezcanlasinteraccionesentrelasmolculasdeprotenay promueva su precipitacin. Este fenmeno se conoce como el efecto de salting out provocado por laadicindesalaunmediosaturado.Lasumadeambosefectosdalugaralavariacindela solubilidad de la protena en funcin de la fuerza inica que se expresa de forma general a travs de la ecuacin de Green [Green, 1932]: ( ) ( ) C k C k S So i o + = log log Ec.1.3-1 donde ki y ko son las constantes de saltingin y saltingout, So la concentracin de equilibrio de la protena en agua pura y C la concentracin de sal.

i La fuerza inica (I) depende de la concentracin de soluto (c en molar) y de la carga de cada uno de los iones que componen el soluto (z): I =1/2(cz2). ii El pI (punto isoelctrico) corresponde al valor de pH al cual la protena presenta una carga neta nula. J . A. Gavira-Gallardo Introduccin Captulo 11100Regon de SubsaturacinRegin de sobresaturacinRegin de metaestabilidad C. Solubilidad C. MetaestabilidadSolubilidadFuerza inica Fig.1.3-1 Representacin del cambio de solubilidad de una protena en funcin de la fuerza inica. Apartirdelconocimientodelacurvadesolubilidaddeundeterminadosistemaproteico podemos aplicar el tratamiento termodinmico de la teora clsica de crecimiento cristalino. 1.3.2.NUCLEACIN Lanucleacineselprocesoporelcualunafaseslidasesegregadelasolucinpara formaragregadoscristalinostermodinmicamenteestables.Cuandolaformacindegrmenes ocurreenelsenodeunasolucinlibredepartculasysuperficiesextraassedenomina nucleacinhomognea. La presencia de partculas extraas puede provocar la aparicin de los ncleosaunosvaloresdesobresaturacininferioresalosrequeridosparaqueseproduzcala nucleacin homognea (nucleacin heterognea). En ocasiones el desprendimiento de pequeos fragmentos de cristales procedentes de la nucleacin primaria (homognea o heterognea) sirve de grmenes para la aparicin de nuevos cristales, en este caso se habla de nucleacin secundaria. Losmecanismosimplicadosenlaaparicindelanucleacinsecundarianoestndemasiado claros. Lafuerzamotrizdelcambiodefasedeunapartculaensolucinasuestadoslidoa presin y temperatura constantes viene determinada por el cambio de potencial qumico, ln = T k Ec.1.3-2 IntroduccinJ . A. Gavira-Gallardo Captulo 112donde k representa la constante de Boltzmann, T la temperatura absoluta y la sobresaturacin del sistema, definida como el cociente entre la concentracin actual y la concentracin de equilibrio (se asume que los coeficientes de actividad idnticos en ambos casos). El cambio de energa libre (Gr), asociado a la formacin de un agregado de volumen V y superficie S es ln = T kvVS GrEc.1.3-3 representa la energa libre de superficie entre el agregado y la solucin y v es el volumen molar. Para un agregado con geometra esfrica la Ec.1.3-3 se puede escribir como: ln34432 = T kvrr GrEc.1.3-4 Por simplicidad se toma la tensin superficial de agregados pequeos similar a la macroscpica y se desprecia el agotamiento de las unidades de crecimiento por la formacin del ncleo. En la representacin del cambio de energa libre en funcin de radio del agregado (Fig.1.3-2) se comprueba como existe una barrera energtica (G*) que debe de superarse para alcanzar un tamao de agregado estable, ncleo crtico (r*). El ncleo crtico corresponde al menor agregado que puede disminuir su energa libre aumentando de tamao. Diferenciando Gr respecto de r y teniendo en cuenta que la derivada se hace nula en el mximo, encontramos un valor para r* (ecuacin de Gibbs-Thompsom) ln2 =T kvr Ec.1.3-5 Sustituyendo el valor de r* en la ecuacin 1.3-4 obtenemos la cantidad de energa asociada a la formacin del ncleo crtico ( )22334ln 316 = = rT kvGr Ec.1.3-6 Laecuacin1.3-5indicaquealaumentarlasobresaturacindelsistema,eltamaodencleo crtico, el nmero de molculas necesarias para crear un agregado estable y la barrera energtica disminuyen. J . A. Gavira-Gallardo Introduccin Captulo 113G*r*GrTermino de Volumen(4r 3kTln) / (3v)T. Superficie4r20r (tamao de agregado)Energa libre de Gibbs Fig.1.3-2RepresentacinesquemticadelavariacindelaenergalibredeGibbsenfuncin del radio del agregado. Se han representado por separado las contribuciones de volumen y superficie y la suma de ambas. El flujo de nucleacin (nmero de ncleos formados por unidad de volumen en la unidad de tiempo)esunproblemacinticodeterminadoporlaprobabilidaddesobrepasarlabarrera energtica G* =T kGe B J*Ec.1.3-7 EnestaexpresinG*seasemejaalaenergadeactivacindeunareaccinqumica,pero mientrasestaltimapermanececonstante,G*esextremadamentesensiblealoscambiosde sobresaturacindelsistema.ElfactorpreexponencialBesuncoeficientecinticoquedepende directamente de la solubilidad de la molcula (nmero de molculas por unidad de volumen) y de la frecuencia a la que un ncleo crtico supera la barrera energtica de nucleacin para dar lugar a un cristal. El flujo de nucleacin depende fundamentalmente del trmino exponencial y por tanto de la sobresaturacin representada en la figura 1.3-3. Existe un valor de sobresaturacin crtico (*) por debajodelcualelflujodenucleacinesextremadamentepequeo,aumentandodrsticamente cuando se rebasa este valor. En algunos casos es posible observar nucleacin por debajo del valor de sobresaturacin crtica-esloquehemosdenominadonucleacinheterognea.Lapresenciadeunasuperficie extraaenelmediopuededisminuirlaenergalibreinterfacialcuandolasmolculasdesoluto IntroduccinJ . A. Gavira-Gallardo Captulo 114presentan cierta afinidad por la partcula extraa (paredes del recipiente, partculas en suspensin, etc.)reduciendolaenergalibretotalnecesariaparalaformacindeunncleocrtico.Este descenso de energa es funcin del ngulo de contacto () entre la partcula en crecimiento y la superficieextraadeformaquepara=180lapartculanopresentaningunaafinidadporel sustrato mientras que para =0 la afinidad es mxima. Regin metaestable heterognea01 Nucleacin homognea Nucleacin heterognea*Regin metaestable homogneaFlujo de nucleacinSobresaturacin () Fig.1.3-3 Representacin esquemtica del flujo de nucleacin en funcin de la sobresaturacin para el caso de nucleacin primaria (homognea y heterognea). Por encima de una determinada sobresaturacin crtica (*)elflujodenucleacinaumentarpidamentemientrasquepordebajodeestevalorlanucleacines extremadamentepequea.Laflechaqueunelascurvasdenucleacinhomognea y heterognea representa unvalordesobresaturacinapartirdelcualelflujodenucleacinestanelevadoqueseraimposible distinguir el efecto de la presencia de impurezas.. Laformahabitualdeestudiarelfenmenodelanucleacinesatravsdeltiempode induccin () definido como el tiempo transcurrido desde que se alcanza un determinado valor de sobresaturacinhastaqueseobservalaaparicindelosprimerosncleos.Desudefinicinse deduce que depende de la tcnica de deteccin empleada. Se asume que el tiempo de induccin es inversamente proporcional al flujo de nucleacin de forma que representando ln() frente a (ln2)-1seobtieneunadependencialinealcuyapendienteesiguala16v3/3(kT)3.Estaesla metodologa habitualmente empleada para encontrar el valor de necesario para estimar el valor de r*.J . A. Gavira-Gallardo Introduccin Captulo 115Actualmentenoexisteunateoraunificadadelcomportamientodelassoluciones sobresaturadas de macromolculas biolgicas, lo que dificulta la comprensin de cmo ocurre el fenmeno de la nucleacin. La mayora de los estudios se han realizado empleando como protena modelo la lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL) y tcnicas tan diversas como la dispersin deluz,resonanciamagnticanuclear,calorimetradiferencialdebarridoolamicroscopa electrnica. En estos estudios se observa la formacin de agregados de diferente tamao en los primeros estados de la cristalizacin. [Mikol et al., 1989; Ducruix et al., 1996]. El tamao de estos agregados aumenta de dmeros a octmeros al aumentar la sobresaturacin [Bou et al., 1993] de acuerdo con la teora clsica de la nucleacin. Sin embargo, la existencia de agregados estables en solucin no implica necesariamente que sean las unidades de crecimiento como se ha apuntado [Pusey,1991].Niimuraycolaboradores(1995)encuentranqueelcrecimientodelosncleosse produce a partir de unidades monmeras a pesar de que existan en solucin agregados de mayor tamao.Rosenberger(1996)discrepadelainterpretacindeestosresultadosparaelcasode lisozima y propone un anlisis de los datos en trminos de la teora de coloides, ms acorde con las posiblesinteraccionespresentesenunasolucindemacromolculasenlaquelasdistancias intermolecularessondelordenoinclusoinferioresalasdelpropiocristal.Laformacinde agregados(hexmeros)queconstituyenlasunidadesdecrecimientoenelcasodeinsulinaola ausenciadeestosagregadosparaelcasodelisozimasepuedenexplicarbasndoseenla distribucin de cargas e hidrofobicidades sobre la superficie de las molculas. Trabajos recientes realizados empleando calorimetra diferencial de barrido apuntan en esta direccin [Igarashi, et al., 1999],aunqueporotraparteMichinomaeycolaboradores(1999)handetectadolapresenciade agregados estables de forma esfrica usando microscopa electrnica de trasmisin y consideran la formacin de estos como un paso intermedio de la nucleacin. La teora de coloides propone un comportamiento de las soluciones de protenas (caso de lisozima)queseapartadelateoraclsicadenucleacin,enlaqueseasumeunadistribucin estacionariadefluctuacionesdeconcentracin.Enestanuevaconcepcindelsistema,la nucleacin estar precedida por una separacin de fases lquido-lquido acompaada por grandes fluctuaciones de concentracin que dan origen a la nucleacin. Esta nueva concepcin del sistema est avalada por la reproducibilidad de las medidas de los tiempos de induccin para las mismas condiciones de sobresaturacin [Drenth y Haas, 1998; Haas y Drenth, 1999]. En cambio, segn la teora clsica de la nucleacin (fenmeno probabilstico) los tiempos de induccin pueden presentar dispersin en idnticas condiciones.La aplicacin de la teora de coloides da un giro a las interpretaciones de los resultados que hasta ahora se enmarcaban dentro de la teora clsica de crecimiento cristalino. IntroduccinJ . A. Gavira-Gallardo Captulo 1161.3.3.CRECIMIENTO El crecimiento de un cristal implica una serie de pasos que describen la migracin de las molculasdesdeelsenodelasolucinalasuperficiedelcristalysuposteriorincorporacin desplazando las molculas de solvente. Dependiendo de cual de estos procesos sea el ms lento el crecimiento estar controlado por el transporte en el seno de la solucin, el transporte sobre la superficie del cristal o la cintica de incorporacin (Fig.1.3-4). Teniendo en cuenta que el transporte de masa se puede considerar de tipo difusivo a distancias cortas (cercanas al cristal) incluso en ambientesconvectivosyconsiderandoelcristalrealdescritoporelmodelodeBCF(Burton-Cabrera-Frank,1951ymodificacionesdeBennemanyChernov),elmodelodedifusinencapa (Diffusin Layer Model) describe los posibles mecanismos de crecimiento de un cristal en solucin apoyndose en las ecuaciones de difusin de Fick [Nvlt et al., 1985]. =rC Ci S C. Transporte Ci=SCaso General SGelSoporte FsicoCmara de SalAmortiguador:>Columna de solucin>GelCmara de ProtenaCmara de SalAmortiguadorCapilaresMembranaCmara de ProtenaFig.1.4-1Posiblesconfiguracionesexperimentalesparalarealizacindeunaexperienciaencontradifusin en medio gravitatorio o de gravedad reducida. Cualquier combinacin de los elementos propuestos es posible siempre que se conserven los requerimientos mnimos. La ltima figura de la columna de la izquierda muestra posibles combinaciones, algunas de ellas empeladas ya en nuestro grupo durante las misiones espaciales en la que hemos participado. Adaptacin de Garca-Ruiz et al. (1999). Por ltimo y puesto que los coeficientes de difusin de la protena y la sal se diferencian en un orden de magnitud podemos asegurar que es la sal la que invade la cmara de protena. Si no sedisponedeunacmaradedesarrollosuficientementelargaolostiemposdeinduccinson extremadamente largos, la sal puede invadir y homogeneizar por completo la cmara de protena. Estoprovocaralaprdidadeladiscriminacinespacio-temporaldecondicionesconvirtiendola experiencia en un batch [Otlora, Novella, et al., 1999]. J . A. Gavira-Gallardo Materiales y mtodos 2 2. .

M MA AT TE ER RI IA AL LE ES S Y Y M M T TO OD DO OS S Apresurmonos pues a decir que no hayrecetas lgicas para hacer descubrimientos ... S. Ramon y Cajal 2.1.LAS PROTENAS Entrabajosenlosquesepretendeestablecerlosbeneficiosdeunadeterminada metodologaesnecesarioescogersistemasquehayansidoampliamentecaracterizados.En cristalizacin de protenas este papel lo representa fundamentalmente la enzima lisozima de clara dehuevo(HEWL)i,factorcomnenlamayoradelosestudiosdenucleacin,crecimientoy determinacindelacalidadcristalina.Puestoquelamayorpartedeestamemoriapretende demostrarlabondaddelastcnicascontradifusivasfrentealastcnicastradicionalesde cristalizacinescogimosestesistemacomoelementodecomparacin.Parageneralizaralgunas conclusiones y particularizar determinados estudios empleamos la thaumatina de Thaumatococcus daniellii y la ferritina de bazo de caballo en su forma mineralizada y desmineralizada (Apo). Ambas protenas,thaumatinayferritina,sehanempleadocomomodelosenestudiosdecrecimiento cristalino en condiciones de microgravedad y para evaluar el efecto de los geles sobre calidad de los cristales [Ng, et al., 1997; Lorber, et al., 1999] y sobre la influencia de la presencia de impurezas (agregados de la protena u otras protenas homologas) [Thomas, et al., 1998]. Enlatabla2.1-1serecogeunresumendelascaractersticasfsicasyqumicasms relevantesascomolascondicionesdecristalizacinquehemosempleadoenestetrabajo.Las entradas(I.D)queaparecenenlatablaserefierenalasestructurasresueltasapartirdelmejor juegodedatosdedifraccinhastalafecha.Estainformacin,juntoconlosgruposespaciales, estructuras,referencias,etc.,sehaobtenidoconsultandolaspginaselectrnicasdelbancode datos de protenas PDB (Proten Data Bank) (http://www.rcsb.org/pdb/) [Bernstein, et al., 1977]. i HEWL del ingles Hen Egg White Lysozyme. Captulo 223ndiceMateriales y mtodosJ . A. Gavira-Gallardo CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS PROTENA N AminocidosPM (Da)aN CadenaspIb

LISOZIMA12914.296111.3 THAUMATINA20722.203112.0 FERRITTINA174456.000+PMfe*N244.5 APOFERRITINA174456.000 Da244.3 CRISTALIZACIN CONDICIONES SISTEMA GRUPO ESPACIAL TampnSalT C P.D.B, I.D TetragonalP43212AcNa 50 mM, pH 4.5NaCl22193L TriclnicoP1AcNa 25 mM, pH 4.5NaNO3 223LZT LISOZIMA OrtorrmbicoP212121 AcNa 50 mM, pH 4.5NaCl451LZ1 THAUMATINATetragonalP41212NaHPO4 0.1M, pH 7.0 KNaC4H4O6 221THWFERRITINACbicoF432AcNa 0.20M, pH 5.0CdSO4 221BG7APOFERRITINACbicoF432AcNa 0.20M, pH 5.0CdSO4 221DATTabla2.1-1Caractersticasfsico-qumicasycondicionesdecristalizacinmsrelevantesdelosdistintos sistemasestudiadosenestamemoria.LoscdigosdePDBestn referidos a las estructuras resultas con los mejores datos de difraccin. a PM es el peso molecular en unidades de Daltons (1Da = 1 gr/mol). b El punto isoelctrico de la protena (pI) corresponde al valor de pH al que la protena presenta una carga neta nula. Las muestras de protena se preparan a partir del producto comercial por disolucin en el tampni de trabajo (lisozima y thaumatina) o por dilucin de la solucin comercial sobre el tampn (ferritina y apoferritina). Cuando se trata de un polvo liofilizado la disolucin se realiza empleando un sistema de balanceo o giro suave, nunca con agitadores magnticos ni mecnicos que pueden desnaturalizar la protena. Conviene que la pesada se exceda en un 10-15% del peso exacto, ya que como se ver ms adelante la presencia de sales y agua es de este orden. La muestra se filtra empleandofiltrosde0.45mdepasodeluzybajaadsorcinproteica(Millipore-MillexGV)ysu concentracinfinalsedeterminaporespectrofotometraa280nm.Cuandosedesconoceel coeficienteextincinmolarsepuederealizarunabuenaestimacinapartirdelnmerode triptofanos y tirosinas presentes en la secuencia aminoacdica [Pace et al., 1995].Al tratarse de experiencias realizadas en contradifusin las concentraciones empleadas son superiores a las que se utilizan habitualmente en tcnicas de cristalizacin tradicionales por lo que convieneprepararlassolucionesmadresdeformaextemporneaparaevitarlaagregaciny/o desnaturalizacin de la protena.

iUntampnoreguladoresunsistemaqumicoformadoporunparcidodbil/baseconjugadaobase dbil/cido conjugado que amortigua los cambios de pH cuando se aade un cido o una base al medio. Captulo 224J . A. Gavira-Gallardo Materiales y mtodos 2.1.1.LISOZIMA Setratadeunaenzimalticaquehidrolizalosenlacesglicosdicosdetipo(1-4)del esqueleto de polisacridos de pptidoglicanos presentes en la pared bacteriana. El producto de la hidrlisis genera disacridos de N-acetil-D-Glucosamina y del cido N-acetil murmico. Aunque se puede obtener de diferentes fuentes, huevo, bacterifagos T4 y , de leche humana, papaya, etc. la mayora de los trabajos se han realizado con lisozima purificada de huevo de gallina (HEWL). La pureza de la protena depende de la casa comercial e incluso del lote de protena (apndice A) y desempea un importante papel en la nucleacin y crecimiento de los cristales [ver referencias en: Rosenberger, 1996 y Thomas, et al., 1996]. La lisozima est compuesta por 129 aminocidos con un peso molecular de 14.3 kD y pI 11.3.Suestructuratridimensionalpresentaun30.23%delosaminocidosimplicadosen estructurasen-hlices(ocho)yun6.20%enlminas-(dos)(Fig.2.1-1),estabilizadaporla formacin de puentes disulfuros. Fig.2.1-1 Estructura tridimensional de lisozima HEWL tetragonal representada con RasMOL V2.7.1 a partir delascoordenadasatmicasdepositadasenelPDB.Enambasrepresentacionessehandestacadolas regiones en -hlices y lminas-. RasMOL V2.7.1, Copyright (C) Herbert J. Bernstein 1998-1999. Comoveremoseneltranscursodeestetrabajo,lalisozimahasidoysiguesiendoel materialmsempleadoenlosestudiosdecristalognesisdeprotenas.EnelPDBserecogen hasta 610 estructuras resueltas, en su mayora son mutantes de las diferentes fuentes. La lisozima en su estado nativo se ha cristalizado en los sistemas tetragonal, ortorrmbico, hexagonal, triclnico y monoclnico, en diferentes condiciones de pH, temperatura y aditivos. Un buen resumen de las condicionesdecristalizacinsepuedeencontrarenlaspublicacionesdeRies-KauttyDucruix (1989) y Guilloteau (1992). Recientemente se ha relacionado el elevado nmero de polimorfos de estaprotenaconlaelevadaconcurrenciadeargininaun8.5%(tpicamente3%enprotenas) Captulo 225Materiales y mtodosJ . A. Gavira-Gallardo involucradaen los tres contactos intermoleculares (macroenlaces) presentes en el cristal [Oki, et al.,1999].Elpolimorfotetragonalseharesuelto a una resolucin de 1.33 [Vaney, et al., 1995] aunquelaestructuraamayorresolucin(0.92)sehaobtenidoconlisozimacristalizadaenel sistema triclnico [Walsh, et al., 1998] cercano a los 0.94 obtenido a partir de un cristal de lisozima tetragonal crecido en contradifusin en condiciones de microgravedad [Garca-Ruiz et al, 2000]. 2.1.2.FERRITINA Laferritinaesunaprotenadealmacenamientoycatlisisdehierroendiferentes organismos.Constade24subunidades(cadenaspeptdicasde174aminocidoscadauna)con estructura globular de 12 nm de dimetro (576 aminocidos bsicos y 624 aminocidos cidos en la superficie).Cadasubunidadpresentauntotalde5-hlices(59.66%delosaminocidosdela protena). Las 24 cadenas configuran una esfera hueca de 7-8 nm de dimetro que es capaz de almacenarhasta4500tomosdeFe(III)pormolcula,aunquenormalmentesloseencuentra saturada en un 20%. La esfera contiene 8 tneles en forma de embudo de 3-4 de dimetro que presentaunfuertecarcterhidroflicodebidofundamentalmentealapresenciaderesiduos glutamatos y aspartatos, mientras que el interior del hueco presenta un carcter fundamentalmente hidrfobo (Fig.2.1-2).La ferritina presenta dos tipos de cadena: H (pesada) y L (ligera) con diferente afinidad por los tomos de hierro. Las cadenas tipo L tienen mayor afinidad por el hierro que las de tipo H y estnhabitualmenteasociadasaclulasdereservadehierro,mientrasquelasdetipoHson abundantes en clulas con un fuerte metabolismo de hierro. Esta protena ha evolucionado poco y su secuencia se encuentra bien conservada en animales, plantas y bacterias aunque la proporcin entre cadenas de tipo H y L varan segn las especies y dentro de la misma especie dependiendo desulocalizacin.Enhumanosexistenmsde25isoformascondiferentesproporcinentre cadenas tipo L y H dependiendo del tejido del que proceden. La ferritina de bazo e hgado son ricas en cadenas de tipo L y constituyen los rganos de reserva de hierro junto con la mdula sea.Las principales funciones fisiolgicas que las ferritinas desempean en humanos son: 1) la dereservadehierro,unelementoesencialperofuertementetxicoenestadolibre,2)sonuna fuente de hierro fcil de obtener cuando los niveles en plasma disminuyen y 3) protegen las clulas frente a la oxidacin. Representa la principal fuente de hierro para la sntesis de hemoglobina y su deficienciaprovocalaanemiadeficientedehierro,laenfermedaddeficientemscomnenel mundo industrializado. Actualmente se encuentra resuelta la estructura por difraccin de rayos X con un lmite de resolucinde1.95paralaestructuranativa[Hempstead,etal.,1997]y1.85enmutantes [Takagi, et al., 1998]. Sin embargo, no es posible dar detalle de la interaccin entre el mineral y los residuosaminoacdicosimplicados,posiblementedebidoaladificultaddeinterpretacindela densidadelectrnicaenlaregindealmacenamientodelhierro.Laformadesmineralizadaest resuelta con un limite de resolucin de 2.05 [Gallois, et al., 1997]. Captulo 226J . A. Gavira-Gallardo Materiales y mtodos Fig.2.1-2 A la izquierda hemos representado la molcula de ferritina (monmero de 24 cadenas) mostrando la entrada de la cavidad de reserva de hierro. A la derecha una sola cadena L por separado. La ferritina y apoferritina se encuentran disponibles comercialmente purificadas de bazo de caballo. Ambas estn libres de contaminacin con otras protenas pero presentan hasta un 45% de oligmeros (>de 24 subunidades) en forma de dmeros, trmeros, etc. que modifican fuertemente la conductadenucleacinycrecimientodeloscristales[Saeede&Boyde,1980,Thomas,etal., 1998]. 2.1.3.THAUMATINA Es una protena que se extrae de bayas africanas (Thaumatococcusdaniellii). Se emplea como edulcorante con un poder varios miles de veces superior al de la glucosa, lo que la hace una buenacandidatacomoedulcorantenocalorfico.Enlanaturalezasepresentaendosformas isomorfas (A y B) que difieren en un solo aminocido en la posicin 46, asparragina en la forma A y lisina en el isomorfo B. Est compuesta de 207 aminocidos con un peso molecular total de 22.0 kDa, y un punto isoelctrico de 12.0. La estructura tridimensional se compone de cuatro -hlices (10.63%)y13lminas-(30.92%)organizadasendosdominiosestructuralesestabilizadospor ocho puentes disulfuros (Fig.2.1-3). Se ha cristalizado en tres formas polimrficas, monoclnica (C2), ortorrmbica (P212121) y tetragonal (P41212) [Ko, et al., 1994]. Los mejores resultados de difraccin los obtuvieron para las formasortorrmbicaytetragonal(1.75)aunqueelpolimorfotetragonalpresentabaintensidad apreciable hasta 1.5 y fue la forma con mayor contenido de molculas de agua 123 frente a las 105 de la forma ortorrmbica. Captulo 227Materiales y mtodosJ . A. Gavira-Gallardo Fig.2.1-3EstructuratridimensionaldethaumatinarepresentadaconelprogramaRASMOL.Enambas representaciones se han destacado las regiones en -hlices (gris claro) y lminas- (gris oscuro). 2.2.LOS GELES La palabra gel recoge a un extenso nmero de sustancias que son capaces de polimerizar enunasdeterminadascondiciones.Engeneralpodemosreferirnosalosgelescomounamalla tridimensional que compartimenta el espacio en poros y cavidadesi. Cuando estas cavidades estn embebidas de una solucin acuosa las denominamos hidrogeles y participan de las caractersticas fsicas y qumicas de ambas fases. Dependiendo del camino seguido para su obtencin los hidrogeles se clasifican en geles de tipofsicoogelesreversiblesygelesdetipoqumicoogelesirreversibles.Enlosgelesfsicos (agarosa,gelatina,etc.)lapolimerizacintienelugaratravsdeinteraccionesdbilesdelas unidadesmonmeras.Losgelesqumicos(poliacrilamida,slice,etc.)seobtienenporreaccin qumicadelasunidadesmonmerasyportantoexistenverdaderosenlacesqueestabilizanla estructura. Los geles de slice son considerados a veces como un caso intermedio debido a que la polimerizacintienelugarapartirdeagregados(partculasprimarias)detamaosuperioralas unidades monmeras. Sin embargo, esta consideracin no est de acuerdo con la dificultad para estabilizar estas partculas esfricas en solucin (sol).Enestetrabajohemosusadolosgelesdeagarosaygelesdeslicecomosoportede capilares en el mtodo de acupuntura en geles y como medio de crecimiento de los cristales. 2.2.1.PROTOCOLO DE PREPARACIN DE LOS GELES DE AGAROSALos geles de agarosa se generan por descenso trmico de un sol preparado por disolucin delamuestraenaguaoenlasolucindetrabajo.Existeunaampliavariedadcomercialde derivados de agarosas con distintas temperaturas de fusin y gelificacin en funcin del grado de modificacin y/o procedencia. En la tabla 2.2-1 hemos recogido las caractersticas ms relevantes de los distintos productos que hemos empleado en este trabajo, as como las compaas que los suministran. Una informacin ms amplia y detallada se ofrece en el siguiente captulo.

iLaIUPACrecomiendaemplearlasiguienteclasificacindelosporosdeunmaterialbasndoseensu dimetro (d): microporos d Br- >NO3- >Cl- [Picullel y Nilsson, 1989]. En nuestro caso nos interesa conocer la influencia sobre la temperatura de gelificacin de los aditivos que bamos a emplear en la cristalizacin de lisozima, esto es: acetato de sodio 50 mM, pH 4.5 y cloruro sdico a distintas concentraciones. El cloruro sdico en solucin acuosa aparece como un claro agente estabilizador de la estructura del gel de agarosa, tanto por la interaccin del anin cloruro con las fibras de gel como por la exclusin de los cationes sodios de la interfase de hidratacin de la agarosa. Para estudiar esta interaccin, realizamos una serie de experiencia en las que el gel se prepar sobre soluciones tamponadas con concentraciones de sal crecientes (7 a 10% p/v) y comparamos estos resultados con los obtenidos a partir del gel preparado sobre agua desionizada (Milli-Q, 18.2 cm-1).Captulo 363Los geles como medios de crecimientoJ .A. Gavira-Gallardo Se prepararon 50 ml de agarosa al 1% p/v siguiendo el protocolo I., sobre cada una de las soluciones reseadas en la tabla de la figura 3.4-7. De los 50 ml, 1 ml se emple en la medida de la transmitancia a 350 nm. Con los 49 ml restantes se sigui el descenso de temperatura (Fig.3.4-7) usandountermmetrodecontacto(MartinMarten80.000consondatermopartipok,Cromel Alumel con una resolucin de 0.1C en un rango de temperaturas de -50C a 200C). 0 5 10 15 20 25 30 3530405060708090100[Agarosa] Medio pHInitialT[NaCl] pHFinal(1.0% p/v) (oC) (% p/v) ===========================================================AcNa 50mM 4.1822.010.0 4.18AcNa 50mM 4.2522.59.0 4.23AcNa 50mM 4.2622.08.0 4.26AcNa 50mM 4.2823.07.0 4.28AcNa 50mM 4.5122.0 - 4.51Agua Milli Q 6.9323.0 - 6.90Agua Milli Q 5.4022.0 10.0 5.60T (C)t (min) Fig.3.4-7 Curvas de enfriamiento de la agarosa (1% p/v) para distintas condiciones de pH y fuerza inica. Como se observa en la grfica 3.4-7 el descenso de la temperatura a lo largo del tiempo presenta una cada exponencial dependiente de las caractersticas de la solucin. Con objeto de comprobar si estas variaciones eran aleatorias (un artefacto del mtodo experimental) o realmente dependientes de la concentracin de sal y del pH, realizamos un ajuste de los datos a la ecuacin de enfriamiento de Newton que en su forma integrada se expresa como: ( )kte A B T + = Ec.3.4-2 donde los valores A y B representan las constantes de integracin. Los ajustes fueron buenos en todos los casos pero presentaban una desviacin sistemtica a partir de los 15 minutos aproximadamente apuntando a un cambio en la velocidad de enfriamiento. Captulo 364 J .A. Gavira-GallardoLos geles como medios de crecimiento 304050607080 T (C)0 10 20 30 40304050607080T (C)t (minutos)0 10 20 30 40t (minutos)Fig.3.4-8Representacindelenfriamientoenfuncindeltiempoparasolucionesdeagarosaal1%p/v preparadas sobre agua (a), NaCl 10% p/v (b), solucin tamponada de acetato de sodio (c) y NaCl 10% p/v sobrelasolucintamponadaconacetatodesodioapH4.18.Laslneascontinuasrepresentanelmejor ajuste a los datos de la ecuacin 3.4-2. -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11151617181920212223K[NaCl] (% p/v) Fig.3.4-9 Valor de la constante de enfriamiento k, en funcin de la concentracin de sal, para experiencias realizadas en tampn acetato de sodio (cuadrados) o en agua (crculos). Captulo 365Los geles como medios de crecimientoJ .A. Gavira-Gallardo Representandoelvalordekfrentealaconcentracindesalseobservaunaclaradependencia lineal (Fig.3.4-9). Comprobamos que k disminuye al aumentar la fuerza inica y que este descenso es ms acusado a valores de pH cidos apuntando a un efecto sinrgico de la sal con el pH. Entodoslosajustesencontramosquelacurvaobtenidainfravaloralosdatos experimentalesapartirdeundeterminadovalordet.Asimismo,experimentalmenteobservamos comoestecambiodevelocidadcoincidebastantebienconlapercepcinvisual,y espectrofotomtricas(Fig.3.4-12)delaformacindelgel.Lavariacindelavelocidadde enfriamiento es debida a que la polimerizacin es un fenmeno de tipo exotrmico (-5kJ /mol). Este calor que se genera fundamentalmente durante la transicin ovillo hlice implica la prdida de entre 1 y 10 sitios de hidratacin por unidad de disacrido incorporado a una doble hlice [Piculell y Nilsson, 1989]. 304050607080T (C)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100304050607080T (C)t (minutos)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100t (minutos) Fig.3.4-10Ajusteendostramos,delascurvasdeenfriamientodeagarosaal1%p/vendiferentes condicionesexperimentales(verFig.2.1-6).Lasflechassealanencadagrficalatemperaturadondese observ un cambio de comportamiento. Para comprobar este punto realizamos un ajuste exponencial en dos tramos: tomamos la regininicialyajustamosalaecuacindeenfriamientoaadiendopuntoapuntohastaquela calidaddelajuste(R)empezabaadescender.Operandodelamismaformaconlareginfinal, encontramos un nico punto, excepto para la solucin sobre agua con NaCl 10% p/v, a partir del cual los dos ajustes perdan calidad (Fig.3.4-10). Representando los valores de esta temperatura de transicinfrentealaconcentracindesal(Fig.3.4-11)encontramosquelanubedepuntosse Captulo 366 J .A. Gavira-GallardoLos geles como medios de crecimiento ajustaba bien a una lnea recta de acuerdo con el comportamiento liotrpico del cloruro de sodio (Ec.3.4-1). La constante de proporcionalidad toma un valor de 1.8CM-1, el doble del obtenido por Piculell y Nilsson (1989). Esta pequea desviacin puede ser debida al efecto sinrgico del pH o a la imprecisin de la determinacin.Estos datos ponen de manifiesto que la adicin de NaCl aumenta la estabilidad del estado helicoidal de la agarosa como evidencia el aumento de la temperatura de gelificacin. Este efecto esdebidofundamentalmentealaadsorcindelanincloruro,mientrasqueelcatinsodioes expelido de la superficie del gel. La interaccin cloruro-gel no se puede considerar una interaccin fuertecomodemuestraeldesplazamientodeesteporotrosionessiguiendolaserieliotrpica descrita al inicio de este apartado. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.039.039.540.040.541.041.542.042.543.043.544.0AY =A +B * XValor Error---------------------------------A 40,5 0,4B 1,8 0,3---------------------------------R =0,96134To (C)[NaCl] (M)0 2 4 6 8 10[NaCl] (% p/v) B Fig.3.4-11 A) Dependencia de la temperatura de transicin ovillo hlice (To) con la concentracin de sal, obtenidaenestetrabajoapartirdelavelocidaddeenfriamiento.Lossmbolosvacosmuestranlosdatos obtenidos en agua, no tomados en cuenta en el ajuste. B) Datos de Piculel y Nilsson (1989). Captulo 367Los geles como medios de crecimientoJ .A. Gavira-Gallardo La adicin de sales puede por tanto producir un efecto no slo en la transicin ovillohlice sinotambinenlaspropiedadespticasymecnicasdelgel[PiculellyNilsson,1990].Para corroborarestepuntorealizamoselseguimientodelapolimerizacindelgeldeagarosapor espectrofotometra a 350 nm. Los datos de transmitancia en funcin del tiempo se recogen en la figura 3.4-12. 0 10 20 30 40 50405060708090100[Agarosa] Medio pHInitialT[NaCl] pHFinal(1.0% p/v) (oC) (% p/v) ===========================================================AcNa 50mM 4.1822.010.0 4.18AcNa 50mM 4.2522.59.0 4.23AcNa 50mM 4.2622.08.0 4.26AcNa 50mM 4.2823.07.0 4.28AcNa 50mM 4.5122.0 - 4.51Agua Milli Q 6.9323.0 - 6.90Agua Milli Q 5.4022.0 10.0 5.60Transmitancia (%)t (min)Fig.3.4-12Evolucindelatransmitanciaalolargodeltiempodurantelapolimerizacindeungelde agarosa al 1% p/v preparado a diferentes concentraciones de sal y pH (tabla en la grfica). Enestafiguracomprobamoscomolacantidaddeluztransmitidadisminuyeconeltiempoyse estabilizaalos40minutosaproximadamenteindependientementedelascondicionesdelmedio. Observamoscomolapresenciadecualquieraditivo:salotampn,aceleraelprocesode gelificacin y se obtiene como resultado final un gel ms opaco. El descenso de la cantidad de luz transmitida est asociado a un aumento de la cantidad de centros difusores de luz: partculas en suspensin o mayor densidad de la malla de gel. Por otra parte sabemos que la presencia de sal estabiliza las estructuras de doble hlice en solucin frente a la conformacin en ovillo. Esto explica eldescensodelacantidaddeluztransmitidaenlosprimeros10minutoscuandoannos encontramos alejados de la temperatura de gelificacin y el hecho de que este descenso sea mayor en las soluciones con algn aditivo frente a la preparacin en agua desionizada. En todos los casos entre los 10 y 40 minutos el descenso de la transmitancia es pequeo y est asociado a la segunda Captulo 368 J .A. Gavira-GallardoLos geles como medios de crecimiento etapadelapolimerizacin(hlicegel).Apartirdeestosdatosesimposibledistinguirsiel descenso de la trasmitancia final del gel en las soluciones con aditivos es debido a que la malla de gel es ms densa o a un aumento del nmero de hlices que pueden estar o no formando parte de la estructura del gel. Actualmente estamos diseando experiencias encaminadas a distinguir cual es el efecto final sobre la estructura del gel. Por ltimo nos interesaba conocer la estabilidad del gel frente al pH. Para ello realizamos unseguimientodelavariacindelpHalolargodeltiempodeungelpreparadosobretampn acetatodesodio50mMypH4.56(Fig.3.4-13).Duranteelprimermesnoobservamosningn cambio significativo y las variaciones se pueden considerar dentro del error instrumental 4.560.02. A partir del primer mes se observ un lento descenso del pH, debido posiblemente a la hidrlisis espontnea de las unidades de agarobiosa. 0 20 40 60 80 1004.464.484.504.524.544.564.584.604.62pHt (Das) Fig.3.4-13 Estabilidad del pH a lo largo del tiempo de un gel de agarosa (1.0% p/v) preparado sobre tampn AcNa 50mM, pH 4.5. PodemosdecirquelosgelesdeagarosamantienensuestabilidadapH4.5duranteun periododetiempodeunmesaproximadamente.Apartirdeesemomentoelgelenvejece lentamenteprovocandounaacidificacindelmedio.Estedatoesnecesariotenerloencuenta cuando se quieren conservar los cristales crecidos en geles durante un largo periodo de tiempo. Experimentalmentehemoscomprobadocomoloscristalesdelisozimacrecidosengelesde agarosa presentan un aspecto amarillento junto con el gel, despus de ms de tres meses. Captulo 369Los geles como medios de crecimientoJ .A. Gavira-Gallardo 3.5.CONCLUSIONES Es posible preparar geles de slice en un amplio rango de pH variando la cantidad de cido empleado para la valoracin. El volumen de cido necesario para obtener un gel a un determinado pH depende de la vejez de la solucin S (metasilicato de sodio de 1.06 gr/ml de densidad, protocolo II-a). El envejecimiento de la solucin S implica la formacin de partculas de slice en suspensin quepuedenmodificarlaestructurafinaldelgel.LacarbonatacindelasolucinSprovocaun descensodelpH,disminuyendolacantidaddecidonecesarioparalavaloracin.Estas modificaciones que pueden afectar a la estructura ntima del gel no influyen en el comportamiento macroscpico.Asimismo,laincorporacindeunasalalsoltampocoprovocavariacionesenla transparencia del gel con respecto a un gel libre de sal. Sin embargo, el aumento de la fuerza inica acelera el proceso de polimerizacin y modifica el pH final para el mismo volumen de cido, por lo que cabe esperar una estructura de gel diferente. Por el contrario se confirma que cuando se aade unamolculadegrantamao(macromolculabiolgica),lapolimerizacinseveimpedidaylas partculas de gel floculan. Esto imposibilita el empleo de los geles de slice a partir de metasilicato de sodio en la preparacin de muestras con macromolculas biolgicas cuando la mezcla se realiza en estado sol (apartado 3.3.2). Este problema se evita cuando los geles se preparan a partir de los derivados alcoxilados de slice (TMOS o TEOS). En este caso es posible incluir molculas de elevado peso molecular en estado sol obtenindose, tras la polimerizacin, geles a concentraciones tan bajas como 1% v/v. Sinembargo,noesposiblegeneralizarestecomportamiento.Lapresenciadepequeas cantidades de sal o las propias caractersticas de la macromolcula pueden llevar en algunos casos a la floculacin de la mezcla. En cuanto a los geles de agarosa hemos confirmado que la polimerizacin transcurre en dos etapas segn se deduce de los datos de enfriamiento y evolucin de la transmitancia con el tiempo.Laprimeraetapa,asociadaalaformacindelashlicesoagregadosprimarios,es fuertemente dependiente de las condiciones del medio. La presencia de agentes liotrpicos (NaCl) estabilizalaformacindehlicesyaumentalatemperaturadegelificacin.Esteefectoseve reforzado a valores de pH cidos. Este comportamiento se traduce en la obtencin de geles con caractersticasestructuralesdistintas,comoseinfieredelosestudiosespectrofotomtricos (apartado 3.4.2). La diferencia estructural por una parte y la modificacin de la actividad de los iones cloruro (que interaccionan con el gel) y sodio (excluidos del gel) por otra parte, deben tenerse en cuenta a lahoradeevaluarlainfluenciadelosgelesdeagarosasobrelanucleacindeloscristalesde protenas. Captulo 370ndice J.A. Gavira-GallardoEvolucin de la sobresaturacin en contradifusin 44.. L LA A E EV VO OL LU UC CI I N N D DE E L LA A S SO OB BR RE ES SA AT TU UR RA AC CI I N N E EN N L LA A T T C CN NI IC CA A D DE E C CO ON NT TR RA AD DI IF FU US SI I N N El mundo no perecer por falta de maravillas sino por falta de curiosidad. J.B.S. Haldane 4.1.INTRODUCCIN Enlcaptuloprimeroseviocomolasobresaturacineselparmetrotermodinmicoque impulsaycontrolalagnesisycrecimientocristalino. Su evaluacin es indispensable si se quiere realizarunainterpretacindelosresultadossobrelabasedelasteorasquepredicenel comportamiento de un sistema o para establecer un control sobre su desarrollo.Ensistemastemporalmentehomogneosesposiblemedireinclusopredecirlaevolucin de la sobresaturacin, lo que permite su modulacin y optimizacin en funcin de las necesidades. Enelmbitoprcticolastcnicascontradifusivasnorequierenuncontroltanexhaustivoyaque escogidasunascondicionesinicialesadecuadaslaevolucintemporaldelasobresaturacin,alo largodeladireccindedesarrolloessuficienteparaasegurarnosqueenalgnpuntolas condicionessernlasdeseadas.Sinembargo,estainformacincarecedeprecisinalahorade interpretar los resultados. En este captulo se aborda este problema de forma conjunta. Por una parte se buscan los indicadores que nos permitan evaluar la evolucin de la sobresaturacin y se confirma la veracidad deestosindicadoresconlasmedidasdirectasobtenidasdelosdatosdeinterferometra.Porotra partesecomparalaeficaciadelastcnicascontradifusivasfrentealastcnicastradicionalesde crecimientocristalino,enlabsquedadelasmejorescondicionesdecrecimientodecristales. Asimismosedemuestraqueestablecidasunascondicionesinicialesadecuadas,lastcnicas contradifusivas son capaces de encontrar las condiciones idneas para el crecimiento de cristales deelevadacalidad.Estecomportamientosejustificabasndoseenlaevolucindela sobresaturacin. Captulo 471ndice Evolucin de la sobresaturacin en contradifusinJ.A. Gavira-Gallardo 4.2.BASES TERICAS DE LA CONTRADIFUSIN Lossistemascontradifusivossecaracterizanporsucomplejidad.Eltransportedemasa difusivoseencuentraacopladoaunfenmenodeprecipitacinporreaccinqumicaoporel cambio de la solubilidad de las molculas que precipitan. En el primer caso los reactivos difunden en sentido contrario y la precipitacin se produce cuando el producto inico de las especies supera el producto de solubilidad por encima del valor necesario para que la probabilidad de que se forme unagregadonoseadespreciable.LaaplicacindelasecuacionesdeFickdeladifusinyel desarrollo de distintas teoras para dar explicacin a la aparicin de los primeros precipitados han permitidodesarrollarmodelostericosquepredicen el comportamiento espacial de un sistema de difusin-reaccin a lo largo del tiempo [Henisch y Garca-Ruiz, 1986; Garca-Ruiz, 1991]. A raz de estosresultadosOtlorayGarca-Ruizextrapolanestetratamientoasistemasenlosquela precipitacin es provocada por un cambio de solubilidad y desarrollan algoritmos computacionales desimulacin[Otlora,1996,OtlorayGarca-Ruiz,1996,1997].Estosresultadossehan confirmado experimentalmente por primera vez con la obtencin del patrn de sobresaturaciones a partir de datos de interferometra Mach-Zehnder [Garca-Ruiz et al, 1999; 2000]. 4.2.1.EL TRANSPORTE DE MASA EN SISTEMAS DIFUSIVOS Paradescribirlacinticadelprocesodenucleacinycrecimientotenemosqueteneren cuenta que nos encontramos en un medio en el que el transporte de materia es de tipo difusivo y queportantosepuededescribirapartirdelasegundaleydeFickqueparticularizadaparauna dimensin se expresa como: 22XCDtC =Ec.4.2-1 C representa la concentracin de la especie que difunde en funcin del tiempo (t) y de la posicin (X)alolargodelacmara,Deselcoeficientededifusin.Estaecuacinpuedeserfcilmente generalizadaatresdimensionestomandoladivergenciadelaconcentracinenelespacio.A temperatura constante y considerando el coeficiente de difusin independiente de la concentracin y del tiempo y para unas determinadas condiciones iniciales de concentracin (fuentes inagotables) y de contorno (sistemas semi-infinitos) [Garca-Ruiz, 1981] la solucin analtica se puede aproximar a [Crank, 1975]: t DXerfc C C =20 Ec.4.2-2 SiendoerfcelcomplementodelafuncindeerrordeGaussyC0laconcentracininicial.La relacin entre la distancia de difusin y la raz cuadrada del tiempo es caracterstica de procesos en losqueeltransporteestcontroladoporladifusin,porloqueamenudoseusaparaidentificar este comportamiento a partir de unos datos experimentales.Captulo 472ndice J.A. Gavira-GallardoEvolucin de la sobresaturacin en contradifusin Lasaproximacionespropuestassondemasiadodrsticas,yaquelossistemasrealesno son semi-infinitos y las fuentes se agotan a lo largo del tiempo. En condiciones reales no es posible obtener una solucin analtica de la ecuacin de Fick, por lo que el problema se aborda desde otros frentes.La disponibilidad de microprocesadores capaces de realizar clculos iterativos ha permitido desarrollarsolucionesnumricasparaabordaresteproblemacuandoladimensinsobrelaque difunde es finita y la concentracin de reactivo en la fuente vara con el tiempo [Henisch y Garca-Ruiz, 1986]: ( ) ( ) ( [ ] t x x C t x C t x x C t t x C , , 4 ,61) , ( + + + = + ) Ec.4.2-3 dondexytrepresentanunadiscretizacindelespacioydeltiempo.Laecuacinanteriorse cumple si la relacin entre los parmetros discretizados se mantiene como: ( )612= Dxt Ec.4.2-4 condicinqueminimizaloserroresenlosclculositerativossininfluirenlamodelizacinrealista del transporte.Ladescripcindeunsistemarealapartirdesolucionesnumricasdebedecumplir ademslascondicionesdeconsistencia,convergenciayestabilidad.Estasaseguranque:1)el proceso de discretizacin es reversible, esto es, que podemos recuperar las ecuaciones originales apartirdelasalgebraicasatravsdeunaexpansinenseriesdeTaylor,2)quelasolucindel sistemadeecuacionesalgebraicasconvergealasolucinexactadelsistemadeecuaciones diferenciales cuando los elementos discretizados tienden a cero y 3) que la tendencia de los errores espontneosdelassolucionesdelasecuacionesalgebraicastiendeadisminuirensucesivas iteraciones [Otlora, 1996]. 4.2.2.PRECIPITACIN Y CRECIMIENTO EN CONTRADIFUSIN Unavezsimuladoeltransportedemateriaesnecesarioincluirlosfenmenosde precipitacinycrecimientodeloscristales.Cuandolaprecipitacintranscurreatravsdeuna reaccin qumica, basta con incluir el producto de solubilidad para determinar las posiciones en que aparecenlosprecipitados.Laformacindeunprecipitadoactacomosumiderodelosreactivos quecombinadoconeltransportedemasadifusivo es suficiente para dar explicacin al fenmeno deprecipitacinperidicacomoconsecuenciadeunfrentedesobresaturacinquerecorrela cmara de precipitacin [Ostwald, 1897]. En el caso de las protenas la situacin parece algo ms complicada. La precipitacin no se produce por reaccin qumica sino por una reduccin de la solubilidad de la protena provocada por Captulo 473 Evolucin de la sobresaturacin en contradifusinJ.A. Gavira-Gallardo lamodificacindelascaractersticasfsico-qumicasdelmedio(fuerzainica,pH,temperatura, constante dielctrica, etc.). En el transcurso de una experiencia el agente que provoca el cambio de algunadeestaspropiedadesnoseconsumedurantelaprecipitacin,oalmenosno significativamente.Elcontinuoavancedelagenteprecipitanteenlacmaradeprotenaprovoca sucesivos episodios de precipitacin que, acoplados a un transporte de masa difusivo, controlan el rangodesobresaturacionesbarridoencadaexperiencia.Deestaformaaplicandolassoluciones numricas del transporte en medio difusivo y la dependencia de la concentracin de equilibrio de la protenaconlaconcentracindesal(curvadesolubilidad),esposiblepredecireldesarrollo completodeunaexperienciadeprecipitacinycrecimientodecristalesdeprotenassegnlas ecuaciones termodinmicas descritas en el captulo primero [Otlora, 1996].Sinembargo,esnecesariointroduciralgunasmodificacionesenestasecuacionespara incluirlano-homogeneidaddelmedioduranteeldesarrollodelaexperiencia.Estacaracterstica propia de los sistemas contradifusivos aparece reflejada en la dependencia del flujo de nucleacin conlavelocidaddesobresaturacin.Ensistemastemporalmentehomogneoselflujode nucleacinserepresentacomolaprobabilidaddequeunncleopre-crticosuperelabarrera energticadenucleacin,aesasobresaturacin.Cuandolasobresaturacinevolucionaenel espacioconeltiempo,apareceunnuevotrminoexponencialenlafuncindeprobabilidadde nucleacindependientedelavelocidaddesobresaturacin.Cuandoestoocurreelflujode nucleacin est fundamentalmente controlado por la velocidad de sobresaturacin, de forma que, a mayor velocidad de sobresaturacin para alcanzar un determinado valor de sobresaturacin, mayor ser el flujo de nucleacin.Elcrecimientodeloscristalessesimulaadmitiendouncontroldelcrecimientodetipo cintico que se ajusta a la ecuacin general de crecimiento:moC C A kdtdM) ( = Ec.4.2-5 donde M es la masa del cristal, K es una constante cintica, A es la superficie del cristal, C y Co son las concentraciones protena en el punto discretizado y la concentracin de protena de equilibrio a laconcentracindesalenelmismopuntoenelmomentodiscretizadorespectivamenteym describeelmecanismodecrecimientodelcristaltomadocomo1.5(crecimientopornucleacin bidimensional) en las simulaciones. Dependiendo del valor de Co un cristal continuar creciendo o se disolver hasta desaparecer si el valor de la sobresaturacin tomado como C/Co desciende por debajo de uno. Apartirdeestaspremisassehandesarrolladoennuestrolaboratoriodiversosalgoritmos de simulacin de los fenmenos de precipitacin acoplados a una reaccin qumica o provocados porelcambiode solubilidad en sistemas contradifusivos. A lo largo de este captulo se comparan los resultados experimentales con los obtenidos a partir de las simulaciones tericas y se discuten lasposiblesvariacionesoconcordanciasencontradas,ascomofuturasestrategiasquenos permitan seguir avanzando en este sentido. Captulo 474 J.A. Gavira-GallardoEvolucin de la sobresaturacin en contradifusin 4.3.MTODOS DIRECTOS Lasobresaturacineselparmetroquenosindicaloalejadoquenosencontramosdela situacindeequilibrio.Suevaluacinimplicaelconocimientodelasconcentracionesdeagente precipitanteydeprotenaencadamomentoycadapunto.Hoyendaslolastcnicas interferomtricaspermitenseguirestaevolucinatravsdelcambiodendicederefraccin.En sistemas temporalmente homogneos la contribucin al ndice de refraccin de la sal es conocida y constante de forma que cualquier variacin corresponde slo a la evolucin de la concentracin de protena. Sin embargo, cuando esta evolucin est asociada al cambio de concentracin de ms de uncomponentecomoocurreencontradifusin,lainformacinqueseobtienecorrespondeala integracindelaevolucindecadaunodeellos.Porotraparteeldesarrollodeestetipode experienciasrequierequelascaractersticas fsico-qumicas del sistema no se vean alteradas por lapresenciadeningnfactorexternoyportantoslosepuedenllevaracaboencondicionesde gravedad reducida. Una alternativa a la microgravedad la ofrece el mtodo de acupuntura en geles, ya que es elnicoenelquelanucleacinyelcrecimientodeloscristalestienenlugarensolucin.El seguimientoencontinuodelavariacindelaconcentracindesalyprotenaesprcticamente imposibleconlosmediosdelosqueactualmentedisponemos.Porellooptamosporrealizarun seguimiento de la variacin de las concentraciones promedios en el interior del capilar y comparar estos resultados con los obtenidos a partir de simulaciones realizados con el ordenador.4.3.1.SEGUIMIENTO POR INTERFEROMETRA Parapoderobteneruncuadrorealdelaevolucindelpatrndesobresaturacines necesariodisponerdeunescenariolimpiocontransportedemasadifusivoyquecumplalos requerimientos mnimos. Actualmente slo disponemos de un medio capaz de ofrecer condiciones tan aspticas, la microgravedad. La siguiente condicin es disponer de una direccin de desarrollo paralocualnuestrolaboratoriopropusounamodificacindelosactualesreactoresFID(Free InterfaceDiffusion)facilitadosporlaESA(AgenciaEspacialEuropea)enlosqueseampliabala longitud de la cmara de protena de 7 a 70 mm (reactor FID-XL).La experiencia se llev a cabo durante la pas