CONCEPTO DE CRIOPRESERVACIÓN Y CONCEPTOS RELACIONADOS La criopreservación es el proceso en el cual células, tejidos, órganos o individuos completos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80ºC y -196ºC (el punto de ebullición del nitrógeno líquido) para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas. Normalmente para preservar una muestra biológica durante el mayor tiempo posible sin que pierda su calidad se utiliza nitrógeno líquido. De esta manera sumergiendo la muestra en nitrógeno líquido se alcanzan temperaturas de hasta -195,79ºC, la temperatura de ebullición del nitrógeno líquido. La utilización de helio líquido permite alcanzar temperaturas incluso menores de hasta -268,93ºC (temperatura de ebullición del helio). Las muestras criopreservadas en nitrógeno líquido sólo estarán afectadas por las radiaciones que puedan incidir sobre ellas puesto que la congelación impide todo movimiento molecular en la muestra. Se ha realizado recientemente una revisión a la terminología empleada para los procesos criobiológicos implicados en la vitrificación. Shaw y Jones, en 2003, establecieron claramente el significado en criobiología de los términos congelación (freezing) y descongelación (thawing), y afirmaron que sólo podían usarse para procedimientos donde se formaran o derritieran cristales de hielo (como sinónimo de deshielo o derretimiento). Cooling y warming, cuyo significado en inglés es enfriamiento y calentamiento, sólo se refieren a cambios de temperatura y pueden utilizarse indistintamente para la congelación tradicional y para la vitrificación. El consenso actual entre los criobiólogos es usar los términos congelación-descongelación para la congelación lenta y procesos relacionados, y calentamiento-enfriamiento para la vitrificación, es decir, términos vinculados con los cambios de temperatura y no de formación y derretimiento de cristales de hielo. Con base en estos argumentos, se ha propuesto, como primer paso en la dirección correcta, reemplazar de manera adecuada los términos en las etiquetas de los medios de vitrificación, como soluciones de calentamiento (warming solutions) en lugar de soluciones de descongelación (thawing solutions). • Slow freezing: criopreservación mediante formación de hielo en el medio extracelular. Es el método tradicional utilizado para criopreservación de células aisladas. Se basa en velocidades lentas de enfriamiento, al formarse hielo en el medio extracelular la célula se deshidrata mediante procesos osmóticos lo cual hace que aumente la concentración de sales en el interior de la célula. Este aumento de concentración provoca lo que se conoce como un descenso crioscópico, que consiste en una disminución del punto de congelación de la célula. Esto permite un descenso de temperatura sin formación de hielo intracelular. • Vitrificación: criopreservación sin formación de hielo intra o extracelular. Hay sistemas que en determinadas condiciones responden a la disminución de temperatura con la formación de un sólido amorfo, en lugar de formar una estructura cristalina como es el hielo en el caso del agua pura. La formación de este sólido, que se conoce también como estado vítreo, evita la movilidad de las moléculas que provocan las reacciones metabólicas, y con ello el envejecimiento o muerte celular. DESCRIPCIÓN DE ESTE PROCESO FÍSICO SOBRE SISTEMAS BIOLÓGICOS Bastan dos principios físicos para explicar lo que le ocurre a la célula mientras se enfría: el principio de ósmosis y el principio de descenso del punto de congelación. El principio de ósmosis nos dice que cuando tenemos un saco (célula) semipermeable de este tipo sumergido en otra disolución salina, entonces el agua empieza a fluir en un sentido tal que tiende a igualar las concentraciones de las disoluciones. O sea, si sumergimos la célula en una disolución de sales más concentrada que el interior celular, entonces el agua (y sólo el agua) sale de la célula; esta, por lo tanto, se encoge y reduce de volumen. Si, por el contrario, sumergimos la célula en una disolución más diluida que el interior celular, entonces empezará a entrar agua dentro de la célula intentando diluir también la disolución salina de su interior; el resultado es que la célula se hincha. El principio de descenso del punto de congelación nos dice que si tenemos agua pura y disolvemos sales en ella, entonces el agua no se congelará a 0ºC, sino por debajo de esta temperatura; a una temperatura tanto más baja cuanta más cantidad de sal hayamos disuelto en ella. Un ejemplo de este fenómeno, por todos conocidos, es el que se produce cuando evitamos el deterioro del radiador de nuestro automóvil al añadirle anticongelante.

Cuando tenemos un conjunto de células que queremos conservar en frío, inicialmente las células se tienen sumergidas dentro de un recipiente que contiene una solución salina isotónica, es decir, con la misma concentración que el interior celular. Cuando se empieza a enfriar éste preparado, el frío alcanza antes la solución exterior que el interior celular. Esto trae como consecuencia que se empiece a formar hielo en el medio extracelular cuando aún no se ha formado hielo dentro de la célula. A medida que se forma el hielo extracelular el agua líquida va desapareciendo. Al disminuir la cantidad de agua exterior, en base al principio de ósmosis antes enunciado, empezará a salir agua de la célula para compensar la posible diferencia entre las concentraciones intra y extracelulares. Al salir agua de la célula, la sal que estaba disuelta en su interior empezará a estar más concentrada: tanto más concentrada cuanto más agua salga. Y es aquí cuando interviene el segundo principio, el principio de descenso del punto de congelación. Y es que al estar más concentrada la disolución salina intracelular, la temperatura a la que se formará hielo desciende: será más difícil que el agua de dentro de la célula se congele y dañe sus estructuras. Así, mientras enfriemos poco a poco, el proceso continuará indefinidamente: crecerá el hielo extracelular, saldrá agua de la célula para compensar las concentraciones salinas dentro y fuera, se concentrará la sal dentro de la célula y descenderá aún más la temperatura necesaria para que se forme hielo dentro. Por ello, con una velocidad de enfriamiento suficientemente lenta podemos evitar por completo la formación del dañino hielo intracelular. TEORÍA CRIOBIOLÓGICA: En 1866 Mantegazza observo que los espermatozoides sobrevivían el enfriamiento a -17ºC. Pero no fue hasta 1949 (83 años después) en que Polge, Smith y Parkes descubrieron los efectos crioprotectores del glicerol sobre los espermatozoides y otras células de varias especies. Esto abrió el campo a una serie de descubrimientos subsecuentes que formaron la base de la actual teoría criobiológica. En síntesis, criopreservar una célula cualquiera consiste en exponerla primero a una solución salina hipertónica simple que contiene una sustancia crioprotectora permeable (por ejemplo, glicerol) y una no permeable (la sacarosa, por ejemplo). Esta exposición breve va a hacer que la célula se deshidrate y que el agua intercelular sea reemplazada por la sustancia crioprotectora permeable. Luego la célula será enfriada en una máquina hasta -7ºC (entre -6ºC y -9ºC según cada protocolo y el material que se desee congelar). En este punto el contenido será enfriado abruptamente y se disparará la formación de hielo en la solución extracelular. A partir de aquí se iniciará un descenso lento hasta por debajo de -30ºC donde irá aumentando paulatinamente la tonicidad de la solución (es decir, se hará cada vez más hipertónica porque habrá cada vez más hielo y la sal se ira concentrando en el crioprotector remanente aun en estado líquido, lo que deshidratara aún más la célula). Luego de -30ºC se podrá sumergir directamente en nitrógeno líquido (-196ºC) para ser almacenada casi, en términos prácticos, indefinidamente. Esta temperatura vitrificará la pequeña cantidad de agua remanente, evitando la formación de los peligrosos cristales de hielo. El hielo tiene otra oportunidad de formarse: cuando se quiera descongelar el material. Para evitarlo habrá que, a la inversa del congelamiento, hacerlo lo más rápido posible para no dar lugar a que el agua vitrificada que se está licuando se convierta en cristales de hielo. Luego habrá que rehidratar el material pasándolo por sucesivas soluciones cada vez más isotónicas. La formación de hielo comienza en el exterior celular (de -2ºC a -5ºC). Tras ello, dependiendo de la velocidad de enfriamiento, se pueden producir distintos resultados: a) Si el proceso de enfriamiento es suficientemente lento, entonces no se forma hielo dentro de la célula. Sin embargo las causas de la muerte celular vienen provocadas por una excesiva deshidratación de esta, que da lugar a una reducción de su volumen (en algunos casos irreversible). b) Si se enfría a una velocidad intermedia entonces sí se produce hielo intracelular, ya que la célula no se deshidrata suficientemente y por tanto el descenso del punto de congelación no llega a ser el necesario. c) Cuando se enfría a velocidades muy altas se produce la vitrificación. El régimen de velocidades de enfriamiento ocurre velocidades desde unidades a decenas de miles de grados por segundo. Estas velocidades tan altas consiguen la vitrificación, lo que conlleva la no formación de hielo a la vez que la no deshidratación celular. Aun cuando esta técnica no es en principio aplicable a un órgano

(dada la conductividad térmica finita de este), si que ha podido ser implementada en unos casos muy concretos, comprobándose la validez de dicha hipótesis. El Cryotop es un contenedor especial que consiste en una fina lámina para lograr el mínimo volumen a ser sometido a enfriamiento y descongelación que permite un resultado superior al 99% de supervivencia. Posee una tapa plástica para proteger a ovocitos y embriones de daños físicos y contaminación de todo tipo durante su almacenamiento en nitrógeno líquido. El Método Cryotop es simple, repetible, seguro y fácil para todos. Este método está actualmente siendo usado en 50 países y ha sido aplicado a más de 100.000 casos clínicos para ovocitos y embriones desde hace 8 años. Es el método más usado de criopreservación que ha demostrado las mejores tasas de supervivencia. Fue desarrollado por el Dr. Kuwayama en Advanced Medical Research Institute of Kato Ladies Clinic, el centro de IVF más grande del mundo actualmente. En la vitrificación las células son equilibradas durante 15 minutos en solución de etilenglicol; posteriormente, durante 45 segundos –como máximo– se sumergen en solución de vitrificación, se toman con poca solución de vitrificación y se cargan en el Cryotop u otros; inmediatamente, éste se sumerge en nitrógeno líquido para almacenarlo hasta el día de la transferencia. Para la desvitrificación, el Cryotop se sumerge durante un minuto en solución de desvitrificación a 37ºC, luego se coloca durante tres minutos en solución diluyente y, finalmente, se lava por 10 minutos en solución de lavado. CRIOPROTECTORES Solución base. La solución de criopreservación es preparada usualmente en medios con un pH estable que oscila entre 7,2 y 7,4. Para tal fin, se usan con éxito medios de cultivo embrionarios como el medio de cultivo TCM-199 (1996) el medio HEPES-buffered Ham's F-10 (2003). Sin embargo, el medio simple de Buffer Fosfato Salino (PBS) es el más utilizado, muchos autores reportan una mayor tasa de desarrollo in vitro en embriones vitrificados con medio a base de PBS suplementado con un medio h-CM (2003). Agentes crioprotectores. Los embriones sobreviven a la vitrificación solamente cuando son suspendidos en una solución con uno o varios solutos crioprotectores, ya que el enfriamiento a temperaturas subcero sin protección, mataría a la mayoría de las células inmediatamente, debido a daños causados por el crecimiento intracelular de cristales de hielo. Dicha solución crioprotectora debe vitrificar a una tasa repetible al enfriarse, permanecer vítrea al calentarse y no debe ser tóxica para los embriones durante el período de exposición antes de la vitrificación y durante el calentamiento. Es necesario incluir los agentes crioprotectores en la solución de vitrificación, ya que previenen el daño celular tanto en el proceso de enfriamiento como en el de calentamiento. En general, cuando los embriones son expuestos a un crioprotector, estos inicialmente se contraen por pérdida de agua, es decir, se deshidratan debido a la hiperosmolaridad inicial de la solución extracelular, y además porque los embriones son más permeables al agua que a los crioprotectores. Para tal fin, existen tres grupos de agentes crioprotectores: • Un primer grupo de crioprotectores de bajos pesos moleculares y permeables; entre ellos se encuentra el metanol, el etilenglicol, el propilenglicol, el dimetilsulfóxido, el 2,3 butanediol, el glicerol, y otros alcoholes. • Un segundo grupo de crioprotectores de bajos pesos moleculares y no permeables, como la galactosa, la glucosa, la sacarosa, la trehalosa y otros azúcares. • El tercer grupo está constituido por crioprotectores de alto peso molecular y no permeable, entre los que resaltan la polivinilpirrolidona, el alcohol polivinílico, el hialuronidato de sodio y otros polímeros. La presencia de crioprotectores permeables de bajo peso molecular es absolutamente necesaria durante el proceso de criopreservación. La mayoría de éstos, son capaces de penetrar al embrión a temperatura ambiente o superiores, siendo su penetración parcial, requisito indispensable para su protección. Sin embargo, la penetración completa del crioprotector dentro de la célula no es necesaria, ya que puede provocar toxicidad química y daño osmótico. Para alcanzar la vitrificación a ciertas velocidades de enfriamiento, la concentración de los solutos requerida debe ser alta, por lo tanto, la toxicidad de los solutos es de gran importancia. La toxicidad puede ser

bioquímica (causante de desnaturalización enzimática) o por estrés osmótico, siendo afectadas ambas formas de toxicidad por la concentración de los crioprotectores y por su tasa de permeabilidad. El crioprotector etilenglicol es más permeable al embrión que el propilenglicol y éste a su vez es más permeable que el glicerol. Este orden se relaciona inversamente con la embriotoxicidad, lo cual es una evidencia de la relación de los componentes bioquímicos con la embriotoxicidad de los crioprotectores. En pruebas de vitrificación, se evidenció que el etilenglicol vitrificó a una concentración de 6,5 M, el dimetilsulfóxido y el glicerol vitrificaron a 5,0 M, el propilenglicol vitrificó a 4,0 M y por último el butilenglicol vitrificó a 3,0 M. Como se observa, existen considerables diferencias entre las distintas molaridades a las cuales los crioprotectores son vitrificados. Una tasa aceptable de vitrificación puede ser obtenida con altas concentraciones de un solo crioprotector, pero estas concentraciones son frecuentemente tóxicas para los embriones. El desafío, entonces, es encontrar solutos o una mezcla de solutos que permita obtener una solución vitrificable y que no sea tóxica a las células. Generalmente, mezclas de crioprotectores vitrifican a concentraciones bajas, siendo así probablemente menos tóxicas. La ventaja en el uso de mezclas crioprotectoras es que se combinan las propiedades vitrificantes de un crioprotector con la baja toxicidad de otro. En una serie de estudios han seleccionado la mezcla de etilenglicol y glicerol como la adecuada para la vitrificación. Se ha demostrado que los blastocitos bovinos son más permeables a altas concentraciones de etilenglicol que de glicerol, la concentración intracelular de etilenglicol aumenta muy rápidamente debido a su bajo peso molecular lo cual podría tornarse tóxico. En otro estudio, al evaluar la viabilidad in vivo de embriones de conejo post vitrificación, de igual forma las mezclas presentan un porcentaje mayor de nacimientos. La adición a la solución de vitrificación de agentes crioprotectores no permeables como los polímeros y los sacáridos ha reseñado que reduce la concentración intracelular de etilenglicol a temperatura ambiente, mejora la tasa de supervivencia de embriones bovinos vitrificados, independientemente del estadio de desarrollo que presenten. La sacarosa confiere un efecto protector adicional, ya que este crioprotector, no permeable, causa una deshidratación al embrión, con lo cual se reduce la probabilidad de formación de hielo intracelular, concentrando macromoléculas en el citoplasma y facilitando la vitrificación intracelular. Azúcares como la dextrosa y la sacarosa previenen la penetración excesiva de otros crioprotectores al embrión, a través de una penetración ligera de estos sacáridos a la célula a la vez que ocasionan contracción celular. RIESGOS Durante estos dos procesos, el enfriamiento y la descongelación, las células son expuestas a un número de factores estresantes que pueden infligir diferentes grados de daño, a saber: la toxicidad de los medios o agentes crioprotectores, las modificaciones osmóticas y el efecto del enfriamiento. Citotoxicidad: Cada crioprotector tiene un máximo de concentración en el que daña a las estructuras celulares o del tejido, debido a la excesiva deshidratación celular o a la desnaturalización de proteínas. Se ha comprobado que la combinación de varios tipos de crioprotectores hace descender la citotoxicidad de estos. Formación de cristales de hielo: Estos cristales se forman tanto fuera como dentro de la célula y son los cristales intracelulares los que comportándose como cuchillas cortan las estructuras internas de la célula, especialmente las membranas. Entre los 0ºC y los -30ºC el hielo cambia continuamente de conformación lo que provoca que se acentúe el efecto "cuchilla" del mismo. Debido a estos efectos durante la congelación se debe evitar la formación de hielo intracelular siguiendo una serie de reglas: • Deshidratar la célula. Hay que extraer el agua de la célula y sustituirla por crioprotectores que mantengan el equilibrio osmótico. • Controlar la velocidad de congelación. Hay que controlar la velocidad de congelación para que la formación de los cristales intracelulares sea lo menos dañina posible. Si la congelación se produce demasiado rápido se forma el hielo intracelular y si se da demasiado lento se produce el colapso celular. • Ralentizar el metabolismo celular. Para ellos se trabaja a temperatura ambiente o a 4ºC.

Como regla general podemos afirmar que aproximadamente el 50% de las células que congelamos no sobrevivirán a la descongelación por métodos convencionales. Actualmente se ha logrado superar esta etapa y de la congelación se ha pasado a la vitrificación, de tal forma que con este nuevo método se consigue que no se creen cristales de hielo y sobrevivan prácticamente todas las células inmersas en el proceso. Los principales problemas que se plantean en la actualidad son para la congelación de óvulos, entre el que destaca el desmontaje irreversible del huso meiótico durante el enfriamiento: los ovocitos maduros están bloqueados en Metafase II (segundo bloqueo meiótico) donde los cromosomas están unidos a los microtúbulos del huso meiótico. Este estadio es muy sensible al enfriamiento debido a que los microtúbulos pueden ser despolimerizados. Esto puede conducir a un aumento de la poliploidía y aneuploidía cuando los ovocitos descongelados son fecundados. Pickering y col. encontraron que al enfriar ovocitos humanos a temperatura ambiente durante 10 minutos causaba danos irreversibles al huso meiótico. Otros han argumentado que la perdida de cromosomas después de congelar y descongelar ovocitos no sería tan importante como se pensó, este argumento parece ser más una crítica contra la falta de estudios de diagnóstico genético de preimplantación en embriones generados a partir de ovocitos congelados que un argumento científico bien fundamentado.

Curiosamente, Songsassen et al. encontraron que había diferencias significativas en la sensibilidad de los ovocitos al enfriamiento según provinieran de diferentes hembras de monos Rhesus. Si esto es verdad también para humanos, podría explicarse entonces, en parte, porque ha sido tan difícil obtener niveles altos de supervivencia con ovocitos congelados de una manera reproducible. • Los componentes del citoesqueleto se pueden despolimerizar y conducir a una alteración en la forma y los movimientos de los orgánulos y proteínas dentro de las células. • La exocitosis espontánea de los gránulos corticales conduce a la reacción prematura de la zona pelúcida, impidiendo la entrada de espermatozoides. • La fecundación reducida debido a los efectos de los medios crioprotectores (que aumentan su toxicidad con el tiempo de exposición y la temperatura), y el enfriamiento sobre la zona pelúcida (produciendo el endurecimiento o la rotura de la zona). • Activación partenogenética debido al choque (shock) térmico o a la acción de los crioprotectores. • Choque osmotico durante la deshidratación y rehidratación. • Daño a la membrana celular. • Diginia producto de la retención del segundo cuerpo polar luego de la fecundación. MEJORAS TECNOLÓGICAS Para comparar los procesos de slow-freezing y vitrificación se realizó un estudio criopreservando blastocistos, especialmente los sometidos al trauma debido a la biopsia del blastómero para la investigación de pre-implantación genética (PGS). Los resultados clínicos y de laboratorio fueron comparados para determinar el efecto de las técnicas de criopreservación en el desarrollo e implantación de embriones humanos. Los resultados se miden por la supervivencia después de la descongelación o recalentamiento, embarazo y la implantación. La descongelación de blastocistos congelados lentamente fue del 83% en comparación con el 97% de blastocistos vitrificados. En 160 casos los embriones biopsiados se transfirieron y los resultados

fueron slow vs vitrificados: descongelación (71% vs 95%), embarazo (23% vs 37%) e implantación (26% vs 36%, P<0,05). En conclusión los resultados revelaron que la vitrificación obtiene resultados siempre superiores en comparación con la congelación convencional.

Otro estudio demostró que la vitrificación en cuatro pasos fue mejor que en un solo paso y podría mantener la integridad de los cúmulos de células que es necesario para la viabilidad, la madurez y la competencia de desarrollo de ovocitos. Al igual que en otras etapas de desarrollo las tasas después de la vitrificación de ovocitos lesionados fueron menores en comparación con el grupo control. Nuevas investigaciones ayudarán a esclarecer los mecanismos celulares y moleculares de la criopreservación de ovocitos. Para investigar los efectos del almacenamiento en nitrógeno líquido se realizaron pruebas con ovocitos midiendo la supervivencia, la fertilización y desarrollo embrionario posterior a la vitrificación y el calentamiento. Los ovocitos maduros fueron vitrificados con Cryoleaf y almacenados en nitrógeno líquido durante un periodo de 8-10 días, 90-92 días y los días 180-182, respectivamente. Después del calentamiento, los ovocitos que sobrevivieron fueron inseminados mediante ICSI y se cultivaron durante 120 h. Se redujo la tasa de supervivencia después del almacenamiento de la duración máxima (90,4±7,9%) en comparación a la de los otros dos grupos (97,4±3,0% y 98,0±3,3%). La tasa de fertilización en el grupo de 180-182 días (66,6±22,0%) también se redujo (P<0,05) en comparación con los grupos de 8-10 días (92,2±10,8%) y 90-92 días (94,7±9,1%). Además, el número de embriones en estadio de blastocisto se redujo también significativamente (P<0,05) después de mucho tiempo.

APLICACIONES a) Reproducción asistida. Criopreservar gametos y embriones nos permite almacenar material genético en un rango de usos muy variados, desde las necesidades de preservación de la fertilidad de los pacientes con cáncer, hasta la

reproducción de especies de interés agropecuario o la preservación de genomas en las especies animales y vegetales amenazadas de extinción. La reproducción asistida permite manejar el tiempo de ocurrencia de los eventos (timing) de la fecundación y las transferencias. La criopreservación de espermatozoides esta estandarizada, pero la de ovocitos permanece aún en su fase experimental. Su desarrollo significaría un importante impacto clínico ya que: • Permitiría la preservación de la fertilidad en pacientes oncológicas o en aquellas mujeres sin pareja. • Reduciría o eliminaría la necesidad de utilizar drogas de hiperestimulación ovárica. • Evitaría entonces el síndrome de hiperestimulación ovárica. • Sería una opción terapéutica para las pacientes anovuladoras. • Permitiría estudiar el estatus de salud de las donantes de ovocitos seis meses después de la donación (como se hace actualmente con los donantes masculinos). Actualmente con los estudios sobre embriones se tiende a intentar mejorar los procesos en sus puntos débiles, estos son los procesos relacionados con el desarrollo y la implantación del embrión en el útero materno. A nuestro entender, poco se sabe del efecto polarizado y no polarizado de las células del epitelio uterino en cocultivo sobre el crecimiento del embrión criopreservado. Se establece para investigar el efecto de estas monocapas con medios secuenciales cultivo de embriones de ratón vitrificado y calentado en términos del desarrollo y la calidad del blastocisto, incidencia de la apoptosis y la expresión de genes relacionados. Los embriones de ratón se cultivaron hasta la etapa de ocho células cuando que fueron asignados aleatoriamente a tres grupos de tratamiento: control, no polarizado y polarizado. Después de 96 h en el tratamiento se evaluaron los resultados mediante un análisis de varianza para datos continuos.

En el grupo de monocapa polarizada, la calidad y la formación de los blastocistos habían mejorado significativamente respecto a los otros dos grupos (P<0,05). La incidencia de la apoptosis y la expresión de genes relacionados, tales como Bax fue mayor en los blastocistos del grupo control (P<0,05). La abundancia relativa de Bcl-2 era similar para todos los tratamientos. Así pues, la incidencia de la apoptosis se ve reducida a causa del cocultivo de los embriones con las células epiteliales de útero de ratón.

b) Criopreservación de órganos y tejidos. Aunque los métodos tradicionales de criopreservación son efectivos para células y para muchos de los tejidos simples, para órganos artificiales y tejidos de estructuras más complejas son inaceptables, viéndose dañados por la formación de hielo. La vitrificación, proceso por el cual la fase líquida de cualquier sistema vivo es convertido en un sólido amorfo similar al vidrio, carente de estructura cristalina, parece ser a día de hoy la alternativa más acertada para la criopreservación de órganos evitando la formación de hielo y sus consecuentes daños. Un vidrio es esencialmente un líquido que no puede fluir en órdenes de magnitud de interés para el observador, y un sistema biológico vitrificado puede teóricamente ser almacenado durante cualquier periodo de tiempo deseado debido a la ralentización extrema en todos los cambios en los procesos de difusión por debajo de la temperatura de transición de estado vítreo (TG). En órganos, este proceso se consigue con la ayuda de altas concentraciones de crioprotectores. Las soluciones vitrificantes son soluciones de crioprotectores suficientemente concentrados para permitir la vitrificación de un sistema biológico a tasas de enfriamiento requeridas para órganos. Grandes avances han sido desarrollados en tecnologías de vitrificación, y es posible vitrificar hoy en día un órgano entero. Sin embargo la recuperación del órgano con completa de viabilidad tras el trasplante es todavía difícil debido en gran parte a la devitrificación. La devitrificación es el proceso de formación de hielo durante el recalentamiento. En el proceso de enfriamiento se forman núcleos de hielo que están a temperaturas demasiado bajas para originar el crecimiento del cristal, sin embargo es durante el recalentamiento cuando estos núcleos encuentran temperaturas que maximizan el crecimiento del cristal de hielo. Los órganos más estudiados han sido riñón y corazón, pero ninguno ha sido recuperado de forma reproducible después de un enfriamiento por debajo de temperaturas de -20ºC. Hasta la fecha, pequeños ovarios, conductos sanguíneos, válvulas de corazón, córneas y otras estructuras similares que pueden ser enfriadas y recalentadas tan rápidamente como para evitar la devitrificación, son las únicas estructuras macroscópicas que se conocen que hayan sido recuperadas, al menos en parte, tras su vitrificación (G. Fahy, 2009). Desde que los trabajos de Polge, Smith y Parkes demostrasen las propiedades crioprotectoras del glicerol en 1949, la criopreservación de células, tejidos y órganos ha llegado a ser un área de investigación muy activa. Las técnicas para preservación de células en suspensión fueron aplicadas a sistemas multicelulares como piel (Billigham, 1952), córnea (Smith, 1963) y tejido endocrino (Huggins, 1968), obteniendo muy buenos resultados de recuperación y viabilidad tras su recalentamiento. Este éxito en tejidos hace que surjan intentos de desarrollar métodos similares para criopreservación de órganos enteros. En 1957 se perfunde por primera vez un órgano de mamífero con glicerol, enfriado y preservado a -20ºC de la mano de Audrey Smith (A.Smith, 1957). En estos experimentos pioneros un corazón de hámster fue

perfundido con 2M de glicerol y expuesto a -20ºC, tras su recalentamiento y lavado del crioprotector, algunas contracciones débiles podían apreciarse en el órgano. Sin embargo, en los grupos de control, donde el corazón no era perfundido con ningún crioprotector, los corazones no presentaban ningún síntoma de funcionalidad tras su recalentamiento. El glicerol se añadía gradualmente porque los órganos sujetos a una perfusión inmediata eran dañados severamente, mientras una perfusión gradual con la misma concentración de glicerol era mucho mejor tolerada. No obstante, cuando los corazones se exponían a temperaturas menores de -20ºC no se observaba ningún signo de recuperación. Poco tiempo después, en 1961, Smith y J.E. Lovelock (Smith et al, 1961) mostraron como el útero de un conejillo de indias, tras ser enfriado hasta -79ºC con una concentración del 20% de glicerol, presentaba una habilidad contráctil normal tras su recalentamiento. Durante los años siguientes un gran número de experimentos fueron llevados a cabo con corazones y más particularmente con riñones, con resultados decepcionantes de pérdida completa de viabilidad, o algunos con signos parciales de viabilidad tras su recalentamiento, y muy pocos que demostraran alguna funcionabilidad del órgano en su trasplante tras recalentamiento. Una pequeña excepción es el éxito de recuperación tras criopreservación y almacenaje durante largo tiempo de pequeños segmentos de intestinos caninos (Hamilton et al, 1967). El hecho más importante es probablemente que la criopreservación de órganos es un proceso altamente complejo que envuelve variables inter-independientes, algunas muy difíciles de controlar. Existen algunas diferencias importantes entre órganos y células en suspensión que explican porque no pueden aplicarse métodos similares para su criopreservación. La supervivencia de las células tras su criopreservación y recalentamiento dependen básicamente de las tasas de cambios de temperatura y concentración de las soluciones crioprotectoras. En células estos parámetros pueden ser variados en un amplio rango y optimizados mediante la práctica de experimentos, mientras que en órganos existen una serie de propiedades diferentes que hacen menos viable la supervivencia que vamos a enumerar a continuación: • La adición y lavado de crioprotector en órganos puede ser llevado a cabo sólo por perfusión vascular. Los procesos de perfusión pueden dañar los órganos, especialmente por las altas concentraciones de crioprotectores necesarias, debido a su toxicidad y a las diferencias de presiones osmóticas creadas alrededor de las células. Estos problemas osmóticos pueden ser resueltos en células fácilmente mediante dilución del medio, pero en el caso del órgano son necesarias técnicas que permitan una perfusión gradual. • El volumen de los órganos afecta a la transferencia de calor de una manera negativa: mientras las células en suspensión pueden ser enfriadas en contenedores con una alta relación superficie-volumen, en los órganos, con una pequeña relación superficie-volumen, no pueden excederse de tasas de 1ºC/min para evitar gradientes de temperaturas dañinos. Existen teorías y experimentos que muestran evidencias de que en el caso de órganos bajas tasas de enfriamiento son preferibles, ya que el órgano está formado por varias células y no todas están en contacto con el medio extracelular. Además en el caso de los órganos, están formados por distintos tipos de células, cada cual requiere una determinada velocidad de enfriamiento para su supervivencia óptima. Afortunadamente, la alta concentración de crioprotectores necesaria hace que la supervivencia dependa en menor medida de las tasas de enfriamiento. • Para células individuales el hielo extracelular no produce daños, pero no es así en el caso de los órganos. Los órganos están formados por células que forman parte de estructuras y tienen conexiones que pueden ser dañadas por cristales de hielo extracelulares, provocando así daños en el órgano. Todas estas diferencias hacen que se hayan tenido que desarrollar distintos métodos distintos de criopreservación han tenido que ser desarrollados en el caso de órganos. Hasta la fecha se han aplicado métodos de vitrificación en órganos enteros con pobres resultados. Sin embargo en un reciente trabajo (2009), Gregory Fahy presentó los resultados de un riñón de conejo vitrificado que fue posteriormente trasplantado sin presentar rechazo alguno y con evidencias de funcionalidad. En 1998, Fahy empezó a estudiar cómo obtener mejoras en el control de la toxicidad de los crioprotectores, del proceso de nucleación y del crecimiento de hielo. Sus estudios se basan en la tolerancia de las muestras de distintas mezclas de crioprotectores perfundidas a distintas temperaturas, siempre probando la toxicidad en riñones de conejo. Una de sus soluciones vitrificantes con mejores resultados es la denominada M22, donde el número hace referencia a la temperatura de incubación de dicha solución (-22ºC).

Según la ONT, organismo que demanda de los bancos de tejidos españoles, de las 768 búsquedas iniciadas en 2010, 13 fueron de sangre de cordón umbilical, 224 de medula ósea/sangre periférica y 531 de MO/SP y SCU simultáneamente, la distribución a lo largo de estos últimos años. Actualmente España dispone de una tasa de 16,33 búsquedas de DNE iniciadas/pmp/año.

Durante el año 2010 se han realizado un total de 399 trasplantes alogénicos no emparentados, en los que en 80 se empleó médula ósea, en 178 sangre periférica y en otros 141 sangre de cordón umbilical. Destaca el notable aumento del empleo de sangre de cordón umbilical durante los últimos años, así como el uso de sangre periférica; respecto a los trasplantes de médula ósea, después de unos años en los que se podía observar una tendencia descendente, se ha ido produciendo un ligero aumento desde 2006, pasando de los 30 realizados en 2005 a los 80 de 2010.

Esta información corresponde a CryoBioTech, que es un grupo de investigación centrado en la criopreservación, situado en la Escuela Superior de Ingenieros de la Universidad de Sevilla, España. Su objetivo es tratar de comprender mejor la física oculta tras el campo de la criobiología. Fundado por el profesor Ramón Risco (Univ. Sevilla, España) en 2004, este grupo estudia diferentes formas para lograr el almacenamiento a largo plazo de material biológico: las células y tejidos. El grupo está formado por investigadores y alumnos con gran interés.