Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis de Posgrado

Crecimiento de tejidos normales yCrecimiento de tejidos normales yneoplásicos, "in vitro" : modificaciónneoplásicos, "in vitro" : modificación

en la reserva alcalina del medioen la reserva alcalina del medio

Ezeyza Cutó, Susana

1940

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Químicade la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:

Ezeyza Cutó, Susana. (1940). Crecimiento de tejidos normales y neoplásicos, "in vitro" :modificación en la reserva alcalina del medio. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0251_EzeyzaCuto.pdfCita tipo Chicago:

Ezeyza Cutó, Susana. "Crecimiento de tejidos normales y neoplásicos, "in vitro" : modificaciónen la reserva alcalina del medio". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.Universidad de Buenos Aires. 1940.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0251_EzeyzaCuto.pdf

Úhiversidad de Buenos Airesto­

' Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y'Náturales,

r4.

C R E C I M I E N T 0

de

TEJI DOS NORMALES Y NEOPLA SICOS" I N V I T R 0 "

b Modificación e rv c ' de m d' .

SUSANAEZEYZA cmo

ïbsis para Optar al grado de Doctor en Química.

Efectuada en el Instituto de Medicina Experimental

Padrino de Ïbsis:

' I y Profesor Angel H. RoffoW: w4 .. ,' 2:);

un E:&Lfi%us su¿.1? l. sangran“

Director:

Doctor Luis M. Correa Urquiza,

l 9 4 O

A MIS PADRES

Deseo expresar mi sincero agradecimiento, al Doctor

Angel HoRoffo, Director del Instituto de Medicina Experimen­

tal, a quien le debo la elección del tema, su dirección cien,

tifica y los elementosnecesarios para su realización,­Al Doctor Luis M, Correa Urquiza, Jefe del laboratorio

Químioo,bajo cuya dirección fué realizado, quien por sus co­

nocimientos e8pecializados en esta materia ha sido un inapre­

ciable guia, asi comopor su interés para la realización deeste trabajo.­

- S U M A R I 0 ­

- CAPITULO I ­

msToR;AO.IOÓ’UO0.000,.000......‘OOOOCIOOOOO...GElemIDJmESOOOOO..0..........’..'...000......

- CAPITULO II ­

MODIFICACIONES DEL CRECIMIENTO CELULAR POR EFEC­TO QUIMIus.......‘I.......'..A)Generfllidad65.ooooooo-oooo¡noonooonoíoooco- 14B)Inf1uencia sobre el crecimiento celular de

substancias químicas.Extracto embrionariO'trefonaSO¡Dot-oo 25Desmonas.....o,..¡...s.1.m........r.. 30Plasma.oooooo¿0too-onwooïo0.11.06... 31Substancias estimulantes é inhibidoras 33Proteinas y substancias derivadas...¿ 38SH...0.0...'.........,....’.....Homonas..O.’.......fi................Vitaminas.c¡.....,......o.......‘.... 47Substanciascancerigenas...¡......... 51

- ggggTULo III ­

MODIFICACIONEfi DEL CRECIMIENTO CELULAR POR EFECTODE DIVERSOS ¿AACTORES QUIMICOS Y MODIFICACIONESQUIMICASPROÚUCIDAS POR EL CRECIMIENTO CELULAR:

Anaerobion-SIOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOIDOURespiraCiónooooooooo.coooooooocuoooóa 54Respiracióny glucolisis.....¡....... 54Cuocienterespiratorio.........¡..... 60Hidratosde carbono.................. 61PHoooiconooooaoonoooooo-IOOOOOOOUÜVOO 63Potenciales de oxi-reducción.....¡.¡. 70Presiónosmótica..................s.. 71TenSión superfiCialocoo-oiuoínooo-ouo 72CCleStÜrinaoooooooaoooooooocooooooooo 73Grasas.0OOOOCCOOOOOOO.¡CCOO-I'OOOOOIOI

- CAPITULO Iv ­

CEULIQR.OOOOOOOOOIQOOOIIIOOOOC

- 0;.21TU10 v_..

PARTE EXP * ' ’ ­

mediode Modlglcaclonerde la reservgalcalinadel'. provoca os or e crecimiento e te 'idosmales y neopla81cos in Vltrg". J nor“

.0 Oi... OIIOIO. 000......00 I. ‘OOOOOWVan (“DIODOS I os valores e la reserva alcalina," 'por modifica01on de los compbnentesdel cultivo,,.,,85

ObserVQCiOHQSQOQJQOQOOOooo000000....ProtOCOIOS.ooooooonooooooooo00000000Interprgtación de los resultados....Discusionde los reeultados.........conCIUSioneSoOcoooo...ccoo-Lo‘o'o-vo-onoResúmende los protocolos;.........Grá‘ioORy fotografías

CAPITULO IH‘ISÏORIA

Data de años atras la aplicación de los métodos dinámicos ¿ue

permiten el estudio de las partes vivientes; en oposición a los

estéticos de la histología. Se estudiaba 1a regeneración de tea' fecundados...

jidos en heridas, evolucion de huevostx ‘ .­1 Aunque el cul“

i tivo de tejidos es un método muydiferente, su origen aparece

, en los“trabajos hechos en tejidos al estado de sobrevida;En 1884 Wilhenlm Roux sigue la evolución de la placa medu­

lar en tubo neural de embrión de pollo. Para ello ponia en so;

lución de ClNa un fragmento de embrión. Roux dió el nombre de

explantación a su método. "Tratábase de grupos de células de

"determinismo endógeno“tan fuerte que vivian y se multiplica­

ban conforme el medio artificial les ofrecía un mínimo de con­diciones favorables".

Tuboimitadores,entre ellos Born,y gracias a estas expe­riencias, se adquirió la noción de que las células pueden con­servar su vitalidad "in vitro“.

Leo Loeb (1901) continuando sus estudios sobre regenera­

ción de tejidos eneuentra diversos medios de cultivo.

Aunqueno realizado, se veia ya 1a necesidad de la tempe­

ratura normal, de un medio que permita su invasión por las cé­‘ lulas, de la asepsia. '

La noción de‘la importancia de la concentración del ion Hdel medio fue indicado por Hirsohfeld y Deetjen (19Ól) que prue—

ban que los linfocitos tienen si la aloalinidad no lo impide.Joly comprobó(1903) que habia mitosis en los glóbulos ro­

jos de tritón, mostrando, que hay crecimiento de la masa a ex­

pensas del medio. x

Tambien están los estudios de Haberland (1898), aunque por

un métodoalgo diferente, sobre mitosis de tejidos vegetales.En todos estos trabajos dispares estaban sentados los prin­

cipios de esta técnica llamada primeramenteexplantación y lue­go cultivos de tejidos.

Y Ross Granville Harrison,basadob en ellos al estudiar la

génesis de fibras nerviosas "in vitro") es considerado su Oreader.H¿

.2­

La resonancia de sus.axperienoias fué tan grande que seis

añoa.después el Congreso Americano de Medicina y Cirugía tenía

a la orden del dia el cultivo de tejidos.

Burrows (1910) tubo éxito con diversos tejidos,demostrandoasí que el métodoera general.

A Carrel se debe, además de gran número de estudios sobre

tejidos normales y cancerosos, el descubrimiento fundamental dela acción excito-fcrmatriz de trcfonas, únicas proteinas quepueden mantener indefinidamente la vida. En 1912 Carrel aisló

una cepa pura de fibroblastos ¿ue se hallaban aún con vida en

lQSOidfiplicando la vida del animal que les dió origen."Las cé­lulas de homootermosson,pués’tan inmortales comolas de losinfusorios cultivados largos años por Woodruff". "Esta cepa de

fibroblastos representa la primer cepa pura de células que, porotra parte, no ha cambiadoni del punto de vista morfológico,ni del punto de vista de ritmo de crecimiento o caracteres bio­logicos durante este largo intervalo".

Comoel método es general existen hoy día numerosos inves­

tigadores que lo aplican a sus especialidades. Debenrecordar­

se los nombres de Fischer, Ebelin, Erdmann, Ehrlich, La escue­

la de Lewis y Lewis lo aplica a la morfología e histogénosis;

Levaditi a 1a inmunidad, farmacología y bacteriologia; Polícard.

Lambert, Roffo, pr0piedades de las células oanoerizadas; Mende­

léeff, Faure-Frómiatbioquímicabiofísica etc.En cuando a los tejidos cancerosos " se puede decir, que cada

'tumor cultivado ha marcadouna etapa en 1a historia de los cultivos

del cáncer“,Como precursor se considera a Vblpini, aunque no se sa­

be si sus trabajos se han efectuado en verdaderos cultivos o so­

lamente con tejidos al estado de sobrevida,Hasta el año 1916 eran

contados los tumores obtenidos, En ese año se cultivó el primero

de sarcoma fusocelular de rata y fué obtenido por Raffo,

“3-­GENERALIDADES

ïecnica

Antes de iniciar nuestra exposicióm diremos que, al método delos cultivos de tejido "in vitro" no se le debe considerar co­

mouna abtracción de la fisiología, sinó comouna ciencia inde­

pendiente, para cuyo desarrollo ha sido necesario idear una tec­

nica y con cuyo auxilio, siguiendo el método que exige pasar de

lo simple a lo complejo, habria de contribuir a dilucidar muchosproblemas de la Biologia.

Es quizás por ello que Stern dice a1 respecto refiriendo­

sé a loslcultivos; "cada especialista desde su punto de vistave las ventajas que puede llevarle, para 1a solución de susproblemas, los estudios hechos sobre las células vivientes".

"La citología antigua, la histologia, 1a anatomía patológica,la biologia química, la medicina experimental han sido rejuve­necidas por la aplicación de este método".

áCultivar un tejido consiste, en tomar el órgano o tejido,cortado en trozos de uno a dos mm. (cuando mas pequeños se evi­

ta mejor la necrosis) y colocarlo en mezcla de plasma y extrac­

to embrionario u otro medio apropiado, en recipientes de for­mas y tamaños adaptados a la índole del trabajo. Y todo con la

mas rigurosa asepsia.

Estos cultivos mantenidos en estufa a la temperatura de­

seable (los pertenecientes a animales de sangre fría a tempe­

ratura ambiente) crecen. Observado al microscopio se ve como

a un circulo de tejido nuevo que rodea al trozo inicial. Del

centro a la periferia hay tres zonas: zona necrótica, zona fér­til y zona de invasión. Las primeras corresponden al fragmento

de tejido, la tercera comprendelas células que se encuentranen el medio de cultivo y se designa algunas veces con el nom­

bre de colonia. Las dos últimas deben su origen a la emigra­

ción y a la proliferación. Cuandopredomina la emigración no

hay verdadero cultivo sino estado de sobrevida y subre auto­

lisis rápida. Puede tambien darse el caso que haya división

celular pero que no se repita indefinidamente; solo se forman

.4­Las nuevas células hasta que se agotan las reservas del fragmen­to Tambienesto se califica de sobrevida. El verdadero cultivo

existe cuando la multiplicación celular se hace a costa del me—dio.

Viven un tiempo variado según diversas causas, Para que pue­

dan continuar con vida se transplantan, es decir, se toma una par­te en la zona fértil y se traspasa a medionuevo de cultivo. Los

fifroblastos aislados por Carrel llevan mas de tres mil trasplan­tes en 18 años.

El cultivo "in vitro" y el crecimiento en trasplantes no son

similares pues el primero es cultivado en un medio no viviente;el segundo es un organismo vivo. No es comparable con el culti­

vo de simples células (protozoarios) por diferencia de su formade alimentación.

Los medios de cultivos

Pueden ser: a) soluciones salinas. Comono es un medio nu­

tritivo la proliferación dura poco y a expensas de la sobrevida

y no del verdadero crecimiento. Pero tiene gran utilidad porque

facilita la observación microscópica y para los estudios de em­

briogenesis cuando se quiere mantener un órgano o un embrión en­

tero con vida durante un tiempo limitado. b) sueros: sanguíneos,

linfáticos; hemolinfa, humor acuoso etc. c) Plasma coagulado porextrazto de tejido que es el verdadero medio de cultivo. Se uti­

liza plasma homologoo heterologo; en cualquiera hay crecimiento.Las substancias contenidas en este extracto embrionario no son

tampocoespecificas y sirven para la nutrición, excitación delcrecimiento y coagulación del plasma. Son solubles y se obtienen

por maceración del embrión en soluciones salinas.

Tejidos cultivados

Los tejidos han sido actualmente casi todos

cultivados. a) vegetales. b) invertebrados: langostas, insectos,gusanos, etc. c) vertebrados: batracios, serpientes, peces, avesy mamíferos (gatos, perros, cobayos, ratas, monosetc.) d) Loshumanos pueden ser tomados de autopsias (S. Gandolfo) o biop­

-5­sias. Tejidos embrionarios y tumores, piel, fibroblastos, epile­

lio pigmentario de la retina, cartílago, miocardio, ganglioslinfaticos, leucocitos de sangre normal y patológica.

Las dificultades técnicas para cultivarlos son variadas.

Contrariamente a lo que se pudiera creer, los vegetales son losmas difíciles de obtener. Sus células presentan una membranace­

lular rígida que no permite al citoplasma manifestar toda su plas­ticidad morfogenética.

Los batracios,en cambio,son de fácil cultivo por su gran vi­talidad y facultad de adaptación.

Los tumores son dificultosos. Cuandolos fibroblastos ais­

lados por Carrel tenían ya doce años y los tejidos normales ha­

bian sido casi todos cultivados, los de aquellos eran poco nume­rosos.

Los tejidos adultos no se consiguen facilmente.

Aplicaciones de los cultivos de tejidosA los más diversos estudios han sido sometidos los culti­

vos: observaciones histológioas y químicas bajo la influencia o

no de agentes fisicos y químicos. Se emplean colorantes vitales,el oinematógrafo, aparatos de proyección que permiten medir el

crecimiento. La miorodisección, empleandomicromanipuladores,ofrece la posibilidad de localizar las intervenciones sobre lascélulas o sobre ciertos elementos.

Se han podido aislar cepas celulares por medios físicos,biológicos o mecánicos. Drewproteje Hg. el grupo de células

necesarias y mata las restantes con rayos ultravioletas.Es conveniente hacer notar que no es necesario utilizar mé­

todos microquímiqos. En recipientes adecuados puede colocarse

cualquier cantidad de tejido y dejarlo actuar el tiempo conve­

niente, mientras no muestre signos de degeneración: las modifi­caciones producidas por su actividad son asi facilmente aprecia­bles.

El métodode los cultivos "in vitro" ha sido aplicado a la

.5­histología y a la química en todos sus divisiones y ciencias de­

rivadas: Química Biológica, Química Embriológica, Inmunidad, Far­

macología, Toxicología, Bacteriología, Patología (cancer, lepra,etc.) y Fisiología. Veamosalgunas opiniones sobre su aplicación.

"El método de Harrinscn —Burrows - Carrel es el único que

nos permite cultivar los ultravirus, pues los métodosde bate­riología corrientes han fallado hasta el presente". "Se esperaque en este sentido inagurado por Levaditi rinda servicios prac­ticos". "Es el métodoelegido para el estudio de los sueros ci­

totóxicos por que es el solo medio de eliminar toda influenciano citctrópica.

La aplicación de un suero "in vivo " se presta a confusión;

los efectos nocivos pueden deberse a simples trombosis capilareso a otras lesiones no específicas. Los cultivos constituyen un

reactivo muysensible a la acción de estos sueros".

Para la fisiología especial, la fisiología celular consti­tuye la base; para la segunda de estas disciplinas los cult1yuade tejidos aportan las posibilidades infinitas de un métodoper­fectamente adecuado".

En la química embriológica y en el estudio del cáncer ha

tenido esta técnica una gran aplicación.En la farmacología su utilidad ha sido más discutida.

"Los cultivos de tejidos presentan un gran interés por quepermite conocer mejor-las reacciones de diferentes tejidos".

"No se puede dudar de la eficacia de la técnica de los cul­

tivos de tejidos para traernos pruebas indiscutibles en cuanto

a las acciones farmacodinámicas", dice Stern.

Varios autores han ensayado por este medio el efecto de di­versas substancias.

Sin embargolos resultados que se obtienen "in vitro" no

pueden en ninguna forma generalizarse, pues la experiencia indi­ca a menudohechos paradojales con lo que sucede "in vivo".

El mismoStern encuentra alguna objeciones.

“Ciertas substancias introducidas en el sistema general no

.7­

pueden concentrarse suficientemente al nivel de un proceso localtal comoun cáncer. Las solubles son inmediatamente excretadas

mientras las insolubles son fijadas y retenidas en todo el cuer­

po por las células del sistema reticulo endotelial y la concentra­ción a que es necesario llegar para bloquear ese sistema puede

Ser fatal para el sistema defensor."

Pero el problema es más complejo: las células normales no

tienen la mismaresistencia. Por ej. frente a los iones Pb y Cu

los fibroblastos sarcomatosos (sarcoma de Jersen) son un poco

más sensibles que los fibroblastos ordinarios, (cardíacos), me­nos que los fibroblastos de riñon e higado con respecto al Cu

pero ligeramente más que estos para el Pb;afcon esto se ve quela metaloterapia debe ser verdaderamente _selectiva para alcan­zar las células que se quieren destruir".

DISQHELQE_DEL_MEEQDQ

(A) Su gran ventaja, su gran conquista consiste en haber­

se hecho posible trabajar con tejidos aislados y vivos, subs­trayendo la investigación biológica de la complejidad de la in­

vestigación "in vivo", que en sus conclusiones debe tener siem­pre presente las influencias recíprocas del organismoen total.

"Por primera vez en fisiología, expresando los términoscrecimiento estímulo e inhibición encuéntrase en frente a fac­

tores dosables. El elemento vivo, la célula, comoel elemento

químico abre un horizonte, donde no hay solamente conjeturas".(Sterrs).

Carrel dice que el método hace posible reducir ciertos fe-°

nómenos a sus términos más simples, ya que puede ser estudiada

y por un‘período largo de tiempo, las influencias, entre si,

de tipos conocidos de células, y la acción sobre estas de subs­tancias determinadas. Ofrece, pues, posibilidades para el estu­dio de ciertos problemas que no lo tienen cualquier otro método

de investigación.Ademásintrodujo dos hechos esencialmente nuevos: la inmor­

talidad y la especificidad morfológica de la mayorparte de las

‘8­

células separadas del organismo. Los fibroblastos aislados en

Enero de 1912 por Carrel, vivenOaún, salvando así 1a objeciónde Harrison quien opinaba,en l9l3,que no se podia hablar de

inmortalidad pues no habían llegado a la edad límite del ani­

mal correspondiente.

La experimentación "in vitro" ha hecho posible,por la pro­

piedad de las células, que estan puedan sobrevivir separadas del

organismo 6 despúes de la muerte del animal, dependiendo eso pe­

riodo de tiempo del ambiente y de la clase de células.

Se ha discutido que el organismo no es una "simple adición

de sus elementos sino un conjunto armónico". "Sin las influen­

cias vasculares y nerviosas se introduce una serie de errores

que incapacitan para comprender el ser viviente organizado y

complejo".

Pero,replica Stern, las acciónes generales o especificasde la inervación o vasoularizaoión pueden ser reemplazadas por

las condiciones fisico-químicas del medio. Estos medios pueden

prepararse conteniendo substancias químicas diversas, vitaminas,hormonas, etc.

Aún asi, dice Craoiun,no eSÏSÉÉEÉÉra cada instante un me­dio igual a ese que las partes vecinas crean a un organismo da­do. Si así fuera la célula aislada 6 en sociedad viviría exac­tamente. Pero son tan delicadas las condiciones de ese medio

(interior) que escapan al investigador. No existen mas que en

el lugar natural asignado a cada elemento por la realización

del plan morfológico."El cultivo "in vitro" se ha colocado dentro del cuadro

de estas previsiones""El métgdg nos permite apreciar solamente La parte celu­

l r de fenómen del ou la rt t r i ular h l

nervio n ued er o cid n l e er’ " ­

plementarias "in vivo". Pero nadie dejará de notar la importan­

oia,para el estudio de un proceso, de estas etapas parciales ocomponentesintercelulares. Apareciendo las modificaciones

7

histológicas y químicas fuera de la influenoiencia vascular ynerviosa? se puede poner en evidencia,por esta manera,los pro­

cesos que la células pueden sufrir por ellas mismas, o bien poracción intercelular looal“.Se puede localizar asi el origen deciertos fenómenos y es aquí en donde los cultivos son un méto­do de elección.

B) La discusión ha llegado aún más lejos, sosteniendo al­

gunos autores que las condiciones de vida "in vitro" cambian

totalmente las propiedades histológicas de los tejidos.

Según‘fleyer,"in vitro" el crecimiento no parece que llegue

a formar tejido real, no hay producción de substancias inter­celular "in vivo" los fibroblastos (lo cita comoejemplo) se

transforman en cartílagos y huesos, en cultivos se multiplicanen el mismonivel de¿- diferenciación,que es el mismoaparen­temente al que estaban al explantarloá.

Las diferencias son tan grandes, para el autor, comopa­ra poder afirmar que parecen tener un tipo de crecimiento pro­

pio y las ODServacionesde ellos obtenidos.aplicables con mu­cha cautela solamente a las condiciones vivas.

Según Champylas células de 1a zona de invasión no recuer­

dan en nada al tejido inicial. Policard no ha podido observar

la producción ni aún la persistencia de los glomérulos y de las

estructuras epiteliales que caracterizan el parenquinarenal.Para el mismoChampylas células harían "in vitro" su on­

togéneais en sentido inverso, tenderian a volver al estado em­

brionario, llamando a esto fenómeno, desdiferenoiaoión."Se debe admitir según la hipótesis de Champy,quelos ele­

mentos cultivados "in vitro" siguen tres etapas, es decir,quela desdiferenciación es la vez: 12) intercelular° desaparición

de la polaridad funcional, desaparición del condriomaespecífi­

co, de miofibrillas; 22) tisular: desaparición de estructuras;59) blastodérmicas: desaparición de la función epitelial y re­

torna al estado pre-epitelial".Craciun no admite este retorno a caracteres embrionarios,.

-10­

Porque cambie la morfología de esos elementos no es razón para

atribuirles retorno a ese estado. Hayuna desdiferenciaciónpero en una dirección propia de los tejidos cultivados. Cier­

tas estructuras desaparecen ó se simplifican, pero tambien hay

aparición de otros caracteres: nefrocitosis, ameboismo,fagb­sitosis. Y repitiendo la opinión de Hacker dice: “cada elemen­

to, además de su estado habitual Z, hereda la posibilidad depresentarse bajo las formas Z' Z" Z"' que aparecen cuando elambiente sufre transformación.

Para Craciun "Los cultivos representan una tal anomalía,determinando una morfología particular y es un fenómeno de

adaptación al medio".

Yaestos caracteres propios les da un nombreapartezca­ta plasia.

Pero existen una cantidad de observaciones que limitan

las opiniones anterioreso,

Con el perfeccionamiento de la técnica muchas de estas

anomalías han desaparecido. Fischer con poco o sin extracto

embrionario obtuvo reaparición de caracteres que denotaban

especificidad celular. Tambientrabajando a baja temperatura

se consiguieron crecimientos más lentos, pues a las condi­ciones de intensa multiplicación era debida la variación del

tejido. Por este medio Menegauxy 0diette obtuvieron que los

ostecblastos,que no se distinguian de los fibroblastos de oc­

razón,en condición de cultivos normales, dejaran ver producciónde oseina. Los tejidos epiteliales muestran no solo membranas

sino tambien signos de organización, de tubos, aoini, querati­nización etc.

Contrariamente a los fenómenos de desdiferenciación se ha

podido ver diferenciación celular. Carrel y Ebeling, Fischer yMaximovhan comprobadola transformación de linfocitos y monc­

citos en fibroblastos con producción de fibras conjuntivas;

Shipley, la hamatopoiesis.

Cuandopudieron aislarse cepas puras de tejido epitelial la

desdiferenoiación no se confirmó. El mismoChampyanota que:"Las células epiteliales guardan sus caracteres en presencia

de cierta proporción de células conjuntivas. La presencia deun tejido antagónico determina la disposición en tubos de un

cultivo renal".Resumiendoestos hechos Craciun y refiriendose a la ola­

sificación de Champyya citada, opina que, la primer etapa es

un hecho indudable; la segunda la desdiferenciación o catapla­

sia aparece de una manera menos obligatoria, depende de las

condiciones del medio, acciones interoelulares, abundancia de

trefonas, ritmo de crecimiento sobre-vida más o menos larga.

En la tercera etapa, los hechos negativos priman sobre los po­SitiVOS .

La embriología ha dado una nueva interpretación a la lla­

mada desdiferenciación. En 1918 Spemanndescubrió que la región

del labio dorsal del blastóporo era un diferenciador u organi­zador. Injertando un pedazo de él en otro embrión causaba la

formación en el huesped de los primeros órganos axiales. Ini­

ciaba la autodiferenciación y células que por si mismasno po­drían modificarse se diferenciaban irreversiblemente.

Antes de la gastrulación el destino de las células no es­

tá determinado. Un trozo de epidermis1que normalmente formaría

el cordón nervioso ectodermal,puede ser intercambiado por epi­dermis ordinaria. La piel cambiará en cordón nervioso y el cor­

dón nervioso en piel. Estas transformaciones no se producen des­

pués de la gastrulación. Aunqueno hay diferenciacióngactúa el

proceso invisible que rige a las células.Otros órganos se diferencian a causa del anterior organi­

zan a su vez estructuras cercanas. Son organizadores dc segundogrado ej. la estructura axial ejerce efecto en el desenvolvimien­to de la viscera taraoica y abdominal.

A cierta altura del desarrollOphay órganos que contienen

-l24

dentro de ellos mismostodos los factores para el desenvolvi­

miento. El tiempo debe ser importante y en cierta etapa puede

un órgano(o parte de ¿1)depender del organizador de segundo gra­do y en otro autodiferenciarse.

Existe tambien un proceso llamado de doble seguridad.

El globo del ojo puede inducir un cristalino en epidermis ex­

traña. Pero en otros anfibios se forma en ausencia de él, es

decir,no depende del organizador de segundo grado; es en estecaso autodiferenciador. Probablemente se encontrará con mayor

estudio que las células se transforman en lo que deben ser ba­

jo la influencia de tres o más causas oontribuidoras. El doble

aseguramiento debe corresponder a un proceso de seguridwi demodo,que el embrión pueda completarse si una de esas causasfalla.

En muchoscasos esta desdiferenciaoión,ó la carencia depoder diferenciador "in vitro" de ciertos tejidos,podria atri­buirse,no a las condiciones metafísiológioas de vida inheren­tes a ese método,sinó a que dl tejido de por si (y ya en el

mismoembrión) no tiene poder autodiferenciador.

Y asi se encuentran tejidos autodiferenciadores en cultivos y

otros que carecen de esa propiedad.

Este poder es diferente según el tejido.

El riñon produce glomérulos, capilares,según Reinhov. Elcartílago tiene buena diferenciación (Strangeways).Los nacimientos de los miembrostanto"in vitro" comoen tras­

plante tienen poco desarrallada esta facultad; pero el ojo lo

posee notablemente, produce todos los constituyentes normalesaunque sin crecer mucho (Strangeways y Fell).

Lo mismo como "in vivo" se encuentran organizadores de se­

gundo grado y estructuras que dependen de ellos, los cultivos

podrían retrogradar, no por defecto de mótodo,sinó por no es­tar presente esa influencia. Y efectivamente vemosque se pue­

de evitar la desdiferenciación por medio de otro tejido que

actúa comoorganizador, pues los cultivos,en ciertos casos,pue­den influirse entre si actuando comoorganizadores de segundo

- 13­

grado. Ya se oitaron algunos casos. El epitelio y el tejido

conectivo de_eüapas post-enbrionaria vuelven a estado embrio­nario; estando los dos presentes en un mismocultivo 1a dife­renciación se mantiene. Si muere el conectivo la desdiferen­

ciación del tejido epitelial aparece (Champy).Drewcon riñon de laucha obtuvo un tejido indiferencia­

do,pero agregando células conectivas al cultivo. adquiere suscaracteres.

Finalmente los cultivos han sido utilizados para estudiarel período medio de autodiferenciación o morfogénesis irrever­

sible. Cultivos de ciertas regiones de un tejido,a distintasetapas pueden revelar si ha sido determinado.

-14­

C A P I T U L 0 II

MQDIFICACIQNES QE; CRECIMIENTO CELULAR P03 EFECTQ DE SUBS­

TANCLAE QUIMICAEA)General-¿gadgetwww­tencial de crecimiggtg_g_;njlgeggijgiyezaaa sob;g_glugrggimign:tg;

VELQCIDAQ DE CRECIMIENTQ

En primer lugar es natural.;pre­

guntarse, si la velocidad de crecimiento, encontrado para el

embrión entero y en condiciones normales, se mantiene en partes

aisladas y creciendo "in vitro". Pequeñostrozos crecen, en cul­tivos, proporcionalmente al crecimiento del organismoen totalo 1a velocidad de crecimiento depende del embrión?". Needham.

Esta pregunta ha sido resuelta por Cohny Murray al esta­

blecer que el factor de crecimiento reside, en gran parte, no

en la integridad del embrión, sino en las células . Con cora­

zón-de embrión de pollo de diferentes edades, midiendo el cre­cimiento a las veinte y cuatro horas de sembrado y por medio

de distintos cálculos por ej. dividiendo el area de crecimiento

por el fragmento original, encontró una curva que era paralela

a la de Minot. (Previamente, Murray, estableció en el embrión

la curva de Minot, para medida de velocidad de crecimiento enun organismo.)

Olivo y Slavick, 0da y Kamontambién con corazón, Norman

con higado, confirmaron todo lo anterior. La única excepción

la presenta el bazo, que tiene mayor velocidad cuando más edadtiene el embrión del cual se extrae el trozo. Pero este punto

requiere una nueva investigación.

SQBREVIDA

“Otra manera de estudiar la naturaleaa del im­

pulso de crecimiento, dice Needham,seria determinar la vita­

lidad, para cultivos "in vitro", de células de embriones

-15...

muertos en tiempos definidos”.

DeSpués de 78 horas de la muerte del animal, los teji­

dos de los fetos de conejos y conejito de la India eran cul­tivables. Esperiencia de Bianchini y Evangetisti. Otro, Bu­cciante incubó huevos de gallina de 6 a 12 días dejándolos

luego a 02 y 159. Encontrá que las células epiteliales eran

cultivables "in vitro" después de 25 dias, leucocitos e hi­gado solo retenian vitalidad de tres a cuatro dias y losotros tejidos ocupabanposiciones intermedias.

Needhamproponía en 1951 lo dicho anteriormente y agre­

ga "puede ser que se encontrara que, cuanto más joven es el

embrión sus células componentes permanezcan mas tiempo via­

bles después de su muerte como ser completo“.

ROFFO,(23Jéuatro años antes,en 1927 ya habia efectuado

una investigación sobre esta misma idea de Needham.Dice,

"comopodrá apreciarse por los resultados obtenidos,la muer­

te del sujeto no es sino un fenómenoaparente,prolongandose

la vida de los tejidos en un período de varios dias hastaque se inician los fenómenosde autolisis. Si se llevan es­

tos tejidos a un medionutritivo adecuado,antes de que es­te periodo comience,no solamente manifiestan signos de vi­

da sino que continuan reproduciendose. El potencial de cre­

cimiento se puede equiparar al que presentan los tejidos

tomados en.e1 organismo recientemente muerto,el que ha sido

sembradosimultaneamente para contralorear las experiencias".Estas se efectuaron en la siguiente forma: los tejidos

(de pollo) se conservan,después de muerto el anima1,en dife­

rentes condiciones que más adelante se detallan, durante var

riado tiempo; y luego se siembran comparando su crecimiento

de 48 horas con los controles con tejidos de mismotiempo

de cultivo,pero provenientes de animales recientemente sa­crificados. Los resultados fueron:

1233121.128.ds. ¿5.5122

-16­

corazón en Ringer y a 0%permaneciendo 14 días en esas condi

ciones,crece algo

corazón en Ringer y a Eaipermaneciendo 9 días en esas condi­ciones,crececorazón conservado dentro animal 202,10 dias en esas condi­

ciones,crece algopiel conservado dentro animal 209,5 dias en esas condiciones,crece

bazo conservado dentro animal 209,9 dias en esas condiciones,crece

estos 3 tejidos conservado dentro animal 08,25 dias en esas

condiciones,crece algo

1191.128._d.e_2.51225_d.e_agus;

corazón y bazo,sin sacarlos del anima1,a 09,en esas condi­

ciones; aún muestran signos de crecimiento a los 11 dias.

En las mejores condiciones experimentales,es decir, con­

scrvando los tejidos en el mismoorganismo,”experiencia quese encuentra más en relación con lo q1e sucede en 1a natura­

leza" y a baja temperatura,09,los tejidos de embriones de 15

dias conservan su poder de crecimiento hasta los 23 dias; los

de pollo de 2 días de nacidos solamente hasta los 11, 10 que

está de acuerdo con lo que suponía Needham.

Después de 25 dias de muerto el animal,el desarrollo

del tejido es igual en intensidad al que dan los de uno re­cientemente sacrificado.

El corazón y,1uego el bazo manifiestan una Supervivencia

mayor comparativamente aan 1a.pic1.

ROEFO(24L0nvestigó también,"si la influencia de los lí­quidos conservadores isotónicos eran capaces de intensifi­

car los resultados obtenidos,con la simple conservación sinagregado de líquido alguno".

'Corazán, bazo y piel de edbriones de pollo de 15 días

selponen en líquido conservador y dia a día se quita un trozo

á?­y se siembra.

Crecen bien hasta con 10 dias de permanencia en solución fi­

siológica: lCrecen bien hasta con 15 dias de permanencia en liquido de

Ringcr.

Crecen bien hasta con ll dias de permanencia en Locke Lewis

" ' " " 15 " " " " solución

Biedermann.

Crecen bien hasta con 10 dias de permanencia en plasma

De las experiencias se observa que los tres órganos en

un mismolíquido resisten el mismotiempo. Solamente la piel,

en la solución de Aman,pierde la propiedad de crecer en me­

nos dias que el bazo o corazón.

Los órganos mantenidos en liquidos no conservan su po­

tencial de crecimiento arriba de 17 días: en el animal 23.

Más que a la composición quimica de los liquidos,hay

que relacionar este últrmo resultado a fenómenode ósmosis

“Los órganos sumergidos sufren la inundación del cuerpo ce­

lularalo que altera la composiciónprotoplasmatica"."Sonestos factores que no se producen cuando la conservación

dc los tejidos se hace en el animal mismo".

EQTEEQIAL QB CRECIMIENTQ.

Cuanto más joven es un tejido

más probabilidades tienen todas sus esPecies celulares decrecer. En los tejidos viejos solo lo hacen los ccnjuntivos."Hay pués un factor éndógeno muy importante que se podria

llamar potencial de crecimiento. Este potencial es diferentepara todos los tejidos de origen epitelial o conjuntivo".Los epitelios pierden más pronto que los conjuntivos la fa­

cultad de proliferar "in vitro" especialmente si este pro­

1ifera primero; por eso el crecimiento acaba muchasveces

por ser conjuntivo, crece mas abundantemente que los otrostanto "in vivc‘ comoen cultivo. Solamente evitando cuidado­

-18­

samente todo resto de él, se han podido obtener culturas pu­

ras de iris o cartilagos; lo mismopara elementos nerviosos,

células endoteliales del higado y osteoblastos.Los tejidos epiteliales y conjuntivos son entre si an­

tagónicos.

Fischer cultivando sobre algodón, en medio líquido,transporte un grupo más o menos grande de células según las

dimensiones del hilo que corta y las traSplantá: observaque los muypequeños grupos de células no son fértiles.

En cultivos renales - trabajo de Policard - los islo­

tes de parenquima,aislados,viven, pero no son centros decrecimiento. Para Fischer y Harrison “las células emigra­das en último lugar son grandes elementos de vitalidad muy

reducida que quedan siempre independientes".

Todos estos hechos tienden a demostrar que las céluá

las de metazoarios no son independientes, que la unidad

biológica es el grupo de células, no la célula y tambiénexplica porqué no se puede obtener cultivos_como en bac­

teriologia ,a partir de un solo elemento.

TRAUMATISMQ ( 9 )

Si se corta un trozo de cultivo que

ya no crece,o se saca una parte del centro, aparecen nuevascélulas. "Sin que se agregue ningún producto artificial elsolo hedho de sacar un trozo pequeño de tejido provoca la

regeneración de un cultivoz; un crecimiento que no tendrialugar sin la intervención operativa".

Fischer y Parker han establecido que la mayoría de las

mitosis se efectuan en los bordes de los cultivos y que no

creen que sea debido a mejores condiciones de nutrición de

las células periféricas con resPecto a las centrales.

"De que depende esta diferencia de la frecuencia de ladivisión celular del borde y del centro del cultivo"? se l

pregunta Fischer y opina: que el borde no es sino el borde

-19...

de una herida y por lo tanto existe en los cultivos posibi­lidad de crecimiento ilimitado y las condiciones de esto

último son las mismas que las de regeneración de una herida.

Si en los cultivos la proliferación continúa por existir

borde fresco de herida, en el organismo se termina cuandohan reparado el defecto.

Fischer efectuó cortes en el centro de un? cultivo;

el número de mitosis es practicamente igual entonces en elborde exterior e interior y mayor que en las demáspartes

y se demuestra así lo dicho que obedece a las mismas leyes

que la cicatrización de heridas. "La única diferencia con­

siste en que el crecimiento del borde interior dura solo

tanto tiempo cuanto existe este borde y se termina exacta­mente comoen el organismo cuando la herida se haya cerra­do".

-fiiise agrega. a un cultivo que crece lentamente gotasde: solución de Tyrode,con el cual se lavó otro reciente­

mente oortado,aumenta el crecimiento,lo que demuestra quela herida moviliza substancias que tomanparte en 1a rege­

neración y hay razones para no suponer esta substancia de

tipo nutritivo.Hay observaciones "que hacen pensar que la destrucción

de células produce materias que estimulan ciertos procesos

del metabolismoen las células intactas, algo parecido alproceso catalitioo. Ello significa queno solo las célulasheridas empiezana crecer sino tambien otras intactas situa­das mas lejos. Estas substancias estimuladoras del crecimien­

to provocan, por lo tanto, una aceleración de división ce­lular y un rejuveoimiento de las células".

Cree Fischer que 1a intensidad de crecimiento y la re­

generacióngen las condiciones experimentales dadas,scn el re­sultado directo de la herida y que no es indispensable para

esa regeneración la presencia de células tisulares o leucoci­#95.

‘m‘

.Las células tumorales tienen con respecto a las normap

les lassiguienies diferencias;a) las del centro se encuen­tran cn permanente destrucción,lo que no ocurre con las nor­males. La destrucción "in vitro" es en algunos casos tan rá­

pida que impide su cultivo. b) Una herida no se cicatriza,

lo que se efectua en una cultivo.normal. "Parece también que

el crecimiento reparador se efectua en el cultivo carcinoma­

toso en otro lugar y no en el borde de la herida. c) En los

cultivos tumorales la diferencia de mitosis entre la perife­

ria y centro no es grandé,pues hay necrosis,lo que forma nue­

vos bordes de herida; se obServa,en gran número, células ne­crosadas cercadas por las sanas. d) En las culturas tumorales

hay diez veces más mitcsis que en las normales, pero desdeel punto de vista de la extensión local,es menoren los pri­meros a causa de la poca duración de las células.

El crecimiento ilimitado de las células tumorales según

Fischer, "ha sido provocado inicialmente,por el mismoproce­so fisiológico que la regeneración limitada del tejido nor­

mal;" son células tan lábiles que reaccionan con divisiónante factores que no influyen en las normales;" "obedecen alas mismas leyes que rigen el crecimiento normal.“

No son células exogenas, las mismas reglas rigen latransplantación de los dos tipos celulares y ni por medios

químicos ni inmunoquímicossehha podido establecer diferen­cias con las normales.

Otros autores opinan lo,mismc que Fischer. Lubarsch di­

ce "al cortar el tejido explantado, se hiere. Esta en dife­rentes oondiciones de 1a herida ordinaria del organismo",

está privada de la influencia nerviosa y de todas aquellasde la corriente sanguíneay linfática; recibe su nutricióndel medio inmovil.

-21u

"Hormonasde heridas (neoronas) emanandode células mar­

ginales cortadas del fragmento, probablemente aumenta la es­

timulación que causa la actividad de las células (en el cul­tivo)". Erdmann.

"Es probable que la concentración de necronas en el ju­

go embrionario comoalrededor del fragmento explantadc, Seael efectivo factor de crecimiento y por lo tanto el probable

crecimiento "in vitro"séa pasivo; el proceso de crecimiento.consistiCía. en división celular forzada, las mismasque henmos tratado de aparecer probable para las condiciones preva­lecientes "in vitochen el foco.

La similitud entre lo que Se supone acontece “in vivo"en y alrededor del foco y lo que se ha visto sucede "ithi­

tro", aparece tan grande,que uno esta tentado de llamar alos cultivos un foco artificial". Meyer.

Fardon y Sullivan (40 con cultivos embrionales no.1a­

vados obtuvieron mayor migración de células y mayor creci­

miento que con tejidos lavados varias veces en soluciones

salinas. Opinanque,para valorar las substancias estimulantesrespecto a su poder promotor de crecimiento, deben siempre

lavarse los tejidos.No se sabe, dicen, si estas substancias estïiulgdgranmson

secretadas comoresultado de la herida tisular; si son pro­ductos liberados directamente por las células embrionarias

vivas; c productos de células desintegradas. "Se cree queson segregadas mediante herida directa del tejido comotam­

bien de,células desintegradas."WLMGurwitsch se dedicó a estu­

diar los problemas que presentan los factores que rigen ladivisión celular. "Esta división es debida a causas intrín­

secas e inherentes a la célula mismac por el contrario afactores extrinsecos e independientes de ella". Sin negar

-22­

la existencia de los primeros,precisa la "importancia cansi­derable de los factores extracelulares en el determinismode

la dávisión celular. Y es ese el punto de partida en el des­cubrimiento de los rayos que él llama mitogeneticos."

Parece que existe una energia radiante de longitud de cn­

da determinada, emitidas por las células en mitosis,que actuancomoexcitantes de las otras cercanas que no lo están: son los

rayos nombrados.

Se ha tratado de relacionarlcs también con el fenómeno

organizador.

Sorin y Kisljak- Statkewitch,utilizandc raiz de cebollacomodetector de rayos,examinaron huevos de gallina.

Resultados negativos dieron: albumiña, el polo vegetal

de la yemadurante toda la incubación, el líquido amniótico,tejido del cerebro con embriones desde cinco dias, etc.

Resultados positivos} con la substancia inmediatamentedebajo del punto germinal, con la sangre y digestiones trip­sicas de la yema.

No emiten radiaciones los lugares adonde las divisdnnss

celulares son abundantes: glandulas genitales, foliculos linJfáticcs. Contrariamente el cultivo canceroso es muyactivo y

opina Gurwitsch que es debido a su fácil necrobicsis y a in­tensa glicolisis.

Los lugares necrosados las emiten y seria su origen laproteolisis.

"El capítulo que trata sobre las causas de 1a división

celular, escribe Doljanski, representa ahora un terreno des­

conocido." Ni lateorïa de Hertwig; ni la teoria hormonal de

Haberland de la división celular, ni los de Oarrel y colabo­radores "que se ocupan del problema de las causas dc la mul­

tiplicación celular "en vitro",han podidoaclarar la etiolo­gía de la mitosis". Ultimamente apareció Gurwitsch con su hi­

pótesis sobre una radiación mitogenética comofactor univer­sal de la división celular."

-23.

“Actualmente (6) nada nos obliga suponer que las mito­

sis,que se efectuan espontáneamenteen los tejidos normales,

deben tambien su producción a una radiación mitogenétioa, osea autoctóna. Pero, al considerar la radiación de G.,sólocomoun nuevo factor en la serie de otros factores ya cono­

oidos de la división celular (comolo son: la partencgenesis

artificial según J. Loeb, estimulación en el sentido de M.

Popoff; estimulo del desarrollo por irritación mecánica (Brachet), acción estimuladora de división celular producidapor enegia de radiación emitida (Lazarus, Barlow, Haecker)

etc,) , hay que reconocer su importacia especial, debida aSu expansión universal y al hecho de que ya no se trata de

una irritación exógena,sino de una estimulación de divisióncelular endógena,fisiológica."

DOLJANSKI(6 ) estudió "el rol de las radiaciones de

G. en los procesos de la multiplicación celular",consideran­

do que los cultivos son un material adecuado para la acciónde esas radiaciones,por encontrarse continuamente en acti­

vidad mitótica, por'su sensibilidad a las irritaciones es­timulantes etc.

El autor considera defectuosas las experiencias simi­

lares de Guillery,"quien cree determinar la acción estimu­ladora de la radiación emitida por el tejido embrional de

pollo y de la radiación propia de los tejidos cultivados

sobre los cultivos vecinos", de Jaeger,sobre "la acción per­niciosa de la radiación sanguínea sobre las colonias celu­lares" y de otros.

Comomaterial de experimentación usó troncos celulares

(que habian sido transplantados Varias veoesWpor permitir»

solo estos,por su crecimiento rcgular,una medición unifor­me") de fibro y osteoblastos,cuyas leyes de desarrollo han

sido más estudiadas, pertenecientes a embriones de pollo de8 a 10 dias.

-2Hr

El medio de cultivo: plasma heparinizado casi sin e3­

tracto embrmnnario,asi queda excluida 1a acción estimulado­

ra de este,-pues " hay poca esperanza de obtener un efectomitogenético sobre los cultivos que se encuentran en un me­

dio rico en extracto". Sin él,les cultivos reaccionan conun aumento inmediato de intensidad de crecimiento a una can­

tidad mínima de substancia estimuladora,lo que es de gran va­lor para la experiencia. (En otra serie de trabajos los efec­tuó sin extracto - métodode crecimiento inhibido-).

Comofuente emisora de radiación,solo aquellas que la

emiten fuertemente: trituración de planta de cebolla, sangre

de pollo y humana,extracto embrional,cultivos de diferentestejidos pto.

Para observar la sensibilidad del cultivo a la radia­

ción,se determinó "el aumento del número de células que se

encuentran en el proceso de división dentro de unos límites

definidos de la colonia celular" y "el aumentoc la dismi­nución de la intensidad de crecimiento de todas las célulasde un cultivo".

Se variaron las condiciones de la experimentación como

Ser la distancia al inductor, a diversas temperaturas, tiem­po de exposición,etc.

Los resultados han sido uniformes: no hay aumento de

multiplicación celular.El autor no quiere afirmar que los resultados negati­

vos "permitan formular conclusiones generales sobre la im­

portancia y alcance de la hipótesis de Gurwitsch". "Pero

para nosotros, dice, es importante haber establecido que,la explicación del aumentocelular y del estímulo de ore­cimiento de los cultivos tisulares "in vitro" por la hipó­tesis de la radiación mitogenética no puede comprobarse".

. -25*{B} Igfluencig sobre é; crecimiento celular Qe

substancias ¡gggioag

Bajo diversos nombres se conocen numerosas substancias

excito-formatrices: "auxetics", "blastines", "attraxines"; "ar­chusia" (Burrows), "desmones" (Fischer); "trophones". (a!)

Bisoeglie y Juhasz-Sehüffer las dividen en dos grupos (mu­

chas de ellas actuan en "in.vitro" e "in vivo" y algunas tienen

poder cancerigenqp intenso).

A)Substanoias duímioas comoacetona, ácido oleioo, cafeína,estrifinína morfina, cloral, nicotina, indol, ciertos derivadosdel alquitran etc. A estas substancias se les Puedeatribuiruna acción lipotrópica en el sentido de Overton y Hans Horst Me­

yer. En este grupo estan las proteosas de Carrel y Baoker.

B) Substanoias fisiológicas: a) hormonasde glándulas en­dócrinas b) substancias producidas por autólisis e) vitaminas d)trefonas.

En esta parte, los resumenes que siguen corresponden a di­

versos puntos de esta clasificación, (menoslas substancias no

existentes en el organismo) agregándose ademas otros de indu­dables relaciones con el crecimiento, comoson la naturaleza

del plasma, e1.sulfhidrilo, etc.I lQflEM929.2MBBIQEAElQiLREEQEAfi

El jugo embrionario y los leu­

cocitos contienen trefonas; los tejidos adultos carecen de ellas.Bajo este nombrese designan principios hipotéticos que son

capaces de mantener indefinidamente el crecimiento celular. Sin

estas no hay verdadero crecimiento "in vitro", sino una sobre­vida más o menos larga.

(3°)Estos nombres y otros que se citan mas adelante se con­

servan en el idioma original, por no existir palabra similar encastellano.

-2g,"Las trefonas, según Carrel; tienen un doble carácter :

el de hormczonasdel crecimiento según el sentido de Gley y

el de alimento facilmente asimilables. Por el solo, los extrac­tos de tejidos embrionarios contienen todos los elementos ne­

cesarios para la sintesis del citoplasma de las células vivien­tes, que puedenmultiplicarse indefinidamente".

Para Carrel rigen la proliferación celular en las dos con­diciones en que el organismohace valer sus capacidades plasti­

cas: en la ontogánesis y en la cicatrización de las llagas. En

este último caso son aportadas por los leucocitos. Su aislamien­

to tendría gran importancia para la curación de heridas, por lopronto para disminuir el tiempo de cicatrización. Ya esta ac­ción acelerante ha sido probada mediante el empleo de trefonas

embrionarias sobre llagas cutáneas de cobayca.=

Las trcfonas;a) no actuan solamente comocatalizadores, si­

no comoaltmcmt0.asimilable tambien, puesto que los gráficos decrecimiento muestran que hay un cierto paralelismo entre la con­

centración y la proliferación.b) No muestran diferencias las homólogasy heterblogas. Es

igualmente intensa la acción del extracto embrionario de pollo en

un fibroblasto de este animal como el de uno de CQÉGIQOo cone­

jo.

c) El calor las inactiva, los rayos X y el radio las des­truyen, 1a luz ordinaria y la agitación les es nociva. Pasan a­

través de un filtro de Berkerfeld, pero un Chamberlandlas re­tiene. Las membranasde colodio dejan pasar las trefonas y re­

tienen las proteínas del jugo embrionario; aquellas (trefonas)parecen estar fijadas en cierta manerasobre las globulinas.

d) El potencial oxi-reductor es independiente de sus pro­

piedadesBÉÉÉtO-formatrioes, pero con el envejecimiento espon­táneo hay un paralelismo entre la disminución del potencial y

la actividad. Se supone que la inactivación es debida a una

-2?_

oxidación de algunos constituyentes del extracto.

e) Más que ¿1 804 (HH4) 2, la precipitación con 002 con­

SGrvalas propiedades activantes de la fracción albúmina glo­bulina.

f) El jugo embrionario es inactivado por la digestión tri­psica., a

Por digestiones se ha observado lo que Sigue;

Más de 16 horas de digestión pepsica produce en el jugo

embrionario substancias tóxicas y desciende el coeficiente a2.2 . Pero 3 horas de esta última digestión hace el extractomás activo. Su coeficiente es dc 4.5 a 6.7 .

t nnn coeficiente o. N ta ¡}/N ¡mino

í De todo esto se concluye que la función trefona depende

de complejos moleculares ¿0 dimensiones moleculares compronp

aida. entre polipeptidos y albúminaa.Esta función no depende

de hidratos de carbono ni de lipoidoa.

g) El titulo en trefonas de un extracto leucocitario ytenor en hemolisinas naturales anticarnero son paralelas.La actividad dcl extracto respecto a la trefonas puede sertitulado por las hemolisinas.

(b) Un cultivo de leucocitos de 48 horas contienen en el

¡líquido! trefonas,lo que demuestran que lo seoretan;15 Carrel, Akamatsuy Heatan atribuyen a las ¿refonas

unaihipotétioa función hormonal, ademásde su nitrógeno ¿Sir

milable, aunque no hay hechos experimentales que demuestren

que lo son. Pero hay un cierto paralelismo entre ellas y las

hormonasextraídas del ovario, timo, tiroides, y supra-renales.

Estas aumentan la emigración celular, en menor grado y a fa­

vor de oxidaciones más activas; las trefonas estimulan losprocesos sintéticos.

"Qarrel recuerda.a justo título,que existen substanciasestimulantes para el crecimiento, manifestandg una acción más

-28­

o menos durable z esto último se opone netamente a la acción

de las trefonas¿ las únicas a mantener dg una Espera indgfi1giga la proliferación,"

El factor de crecimiento no es "más,probablcmente,que unaconjunción dc materiales nutritivos y una apropiada capacidad

para utilizarlos". (Carrel y Baker llegaron a la conclusión deque no había justificación para hablar de hormonade crecimien­to).(20) Por los estudios de Carrel y colaboradores se sabe que

las peptonas,pépyidos,aminc-ácidos, etc. que contribuyen a la

nutrición celular, no llevan a una proliferación comola delextracto embrionario. Los cultivos degeneran cuando se intro­

duce productos de hidrólisis proteica. Y lo mismopara otras

substancias, ácido nucleicc, deriVados hemoglobíniccs, glice­cola, glutación etc. "Se admite que estas substancias ayudaneficazmente al crecimiento de las células sin bastar por si

mismas. Se tiene pues la impresión que no conocemos todavia

el o los factores de crecimiento verdaderamenteesenciales y

responsables del equilibrio perfecto y normal del metaboliSmocelular" (20)

Hueper y sus colaboradores (ll) han trabajado sobre estemismo asunto. r

A ellos se les debe la observación del diferente compor­

tamiento entre cultivos frescos y ettahiliindós..El conjunto de la literatura sobre el efecto del calor en

el extracto embrionaric;.deja la impresión de que calentando

por 10' o 15’ a 709 C,esa substancia pierde sus cualidadesproliferativas.

Efectivamente calentando esa temperatura hay marcados camp

bios fisicos;y cultivos de fibroblastos frescos que no han en­

trado en contacto con extracto norma1,no crecen bién,degenerany mueren despues de nueve pasajes.

J

Tero fibroblastos estabilizadusfiü se mantienen bien en el

—29­

liquido que se calentó. La cepa fué llevado 29 veces.

Esto es comparable con una observación de Carrel y Fis­

cher sobre protcosas,obtenidas por hidrólisis parcial de lapeptona Witto.

Ellos solo obtuvieron buen crecimiento alimentando elcultivo con la proteosa,cuando aquel había sido cultivado,

en un principio,en extracto normal."Mientras el extracto embrionario calentadc evidentemená

te puede mantener el crcctniento celular por un período lar­

go,los teñidos expluntados necesitan el estimulo primario.da—do solo por el extracto normal,para continuar en condiciones

menos favorables“, Huepor.

Nohay evidencia que los extractos (los de diferentes

porciones del embrion) difieren en cuanto a cantidad de subs­tancia estimuladora.

Tiene su origen esta suposición en lo siguientetEl doscubrimiento de la hormona cstimuladora del creci­

mientp,en el lóbulo anterior de hipófisis,y lu afirmación deReiter y Gabor que los rayos aitogeneticus se producían ex­

clusivamente en la cabeza ¿e renacuajosgllevó u examinar la

cantidad relariva de substancias estimuladoraa decorGCimrento

en diferentes partos del cmbrion. Se hizo extractos de cuer­

pos, cabeza sin ojos, ojos.etc. de embriones de ocho dias yestos extractos fueron probados sobre cultiyos de fibroblas­

tos efltnhilizados =, es decir sobre CuïtíVQSquc habían alcan­

zado una proliferación uniforme después de dios pasajes,ycomparadosu crecimiento con testigos que contenían extracto

de embrión entero. Se llego a la conclusión ya dicha.

El jugo embrionario de pollo o de conejcien polvo o enextracto,fue probado en el crecimiento de renaouajos,por Car­

not. No hay influencia en la metamórfosis,pero el crecimien­to fué tres veces más grande quo en los testigos.

Poiblee supone,comoconeccuencia de sus trabajos,que el

—30—

factor de crecimiento puede encontrarse en huevos de equino­

dormos y es probablemente una proteosa.

Las células del organismo estan reunidas por

comunicacionesinter-celulares. Se producen,según Fischer,

por medio de ell» ,intercambio de substancias llamadas des­monas que "rigen las funciones somáticas generales de las

células y miSmosus funciones mas eSpecializadas".

Lewis y Lewis, Levivno admiten anastomosis "in vitro"

y para ellos serían substancias difusibles. Estas para Bu­rrows son de dos clases y les da el nombre de "ergusia" y

"archusia"3que provocan,uno la emigración y la otra 1a pro­liferación. La "ergusia" tendria la propiedad de disminuir1a tensión superficial y provocar comose ha dicho la emi-­

gración y es derivada de la "archusia% que no sería mas que

un producto de oxidaciones celulares "El tiempo de latencia

de los cultivos Corresponde?justamcnte @J.periodo durante el

cual?1a "a‘chusiaïproducida incesantemente por las células ,llega a una cierta concentración que acaba por desencadenar

el crecimiento." Unexcesotrae la necrobiosis dalculmivoiu',lo que conviene evitar con trasplantes y junto con la ergu­cia pueden determinar "in vivo" las modificaciones de tensión

superficial conducientes al cáncer".El rol de la "archusia" es activar el crecimiento.

Para otros3esta substancias, importantes para la multi­plicación celulargson secreciones endo-celulares no difusi­bles. Fischer supone que es el factor que impide los injer­

tos y los trasplantes heterólogos. Y en efecto son eSpecífi­oas de las células de la mismaeSpecie: los fibroblastos no

utilizan más que las desmonas de un miSmogénero de fibro­

blastos y las de estos no las podría utilizar,por ejemplo,una célula epitelial u otro tejido normal. Dos tejidos dife­rentes no pueden interpenetrarse y sus cultivos crecen juntos

-51­sin destruirse.

Pero un tejido cancerosc las utiliza,pertenezcan o_noa'un tejido homólogo o hctcrólogo. No conoce esPecificidad y

un cultiïo dc sarcomainfiltra tan bién uno epitelial cero unode fibrohlaafica.

Las influencias recíprocas de las células no es un can­

bio matcrial,piensan otros autores,síno una energia radianteque sigui las leyes.de la reflexión y es liburadn por reac­

ciones qufzicns exotérxicas (Gurwitsch). "Que se trate c no

de un cañbio de desmonas a través de plasmodurzas, la esti­mulación mutua de células en vía de proliferación no esta ne­

nos solidamcnte establecida; Pura proliferar indefinidamente

los cultiVOB tienengpucs,neccsidad de algo más que treíonasque son alimentos; les hace falta una acción trófioa y esti­mulante que se comunicadirectamente de célula a célula. La

cuestión es.saber si la acción.de tipo desmonaes debido a

un cambiode energía radiante; esto es tanto más justificadocuando que no se ha podido todavía aislar las deamcnas".

Cuandomás joven es el animal del cual provieneol plasma más alto es el indice de crecimiento. El factor de

crecimiento dube estar presente en dos partes, en la célulaprotoplasmática y en el plasma circulante.

A Carrcl y Ebeling se los debe estas observaciones,quio­encontraron _

nesAque la vclccidad de crecimiento,de una cepa estabilizada defifroblastos,de dos años.cra afectada por la edad de la galli­na de donde Se cxtraía el plasma.

Cuandomás viejo es el animal que da el suero, para el

medio de cultivo, las células de los embriones de igual edadcrecen más despacio.

La acción inhibidora,sobrc la multipliCaoión celular delsuero adulto,es debidagsegfir demostraron Carrel y Bakeroa cam­

bios en lipoidea y proteínas debido a la edad y probablemente

relacionado con el aumentode antitripsina.o

Con plasma de animal senil el crecimiento ea solo el 10%

del obtenido con uno de animal joven.

El suero de pollo de un año contiene elementos estimu­

lantes unidos a las globulinas, termolábiles a 569 y elemen­

tos inhibidores fijados a las albúminas, termoestables a 652.

Por el mismométodo empleadopara lo anterior, es decir’la ter­moprecipitación, se ha podido ver: cv; esas substancias juve­niles estimulantes disminuyen con la edad.

La precipitación fraccionada por 002 inactiva los sueros

jovenes. Si se estudia la acción estimulante de esos precipita­dos,se vé que el suero joven da un precipitado más activo.

"Estas ingeniosas investigaciones hacen ver que la ferti­

lidad del suero, comomedio de cultivo,corresponde a una sanaalgebrica dondeparticipan dos cantidades variables en senti­

do inverso. Esos dos tipos de substancias estan,pues,presentesen cualquier suero: solamente con 1a edad la substanciasezcito—

formatrices estan enmascaradas por sus antagonistas. Eso nosexplica,porqué el suero de un animal adulto ejerce ordinaria­mente una acción desfavorable".

Las substancias inhibidoras del suero parecen ser lipoí­des,porque el crecimiento aumenta 28%al 70%con relación al

suero normal,cuando se les extrae.

Si a la solución salina de Tyrode se le agregan lipoídesdel suero, cerebro o hígado y allí se cultivan fibroblastos,hayun ÜO%de crecimiento menos que en Tyrode puro y 20% menos que

en suero sanguíneo normal. Esta diferencia se expiica,segúnCarre1,por la combinación de una cantidad de lipoídes con pro­

teínas,quizás,euglobulinas.Para Schazillo la colesterina inhibe, la lecitina no.El plasma puede contener substancias estimulante81en cier­

tos estados patológicos: de sifilíticos, animales tuberculosos,grávidos o portadores de tumores.

El suero sanguíneo no contiene practicamente proteinas ca­

paces de mantener indefinidamente la proliferación celular.

Es interesante que antes de once días de edad,los tejidos

-33­

embrionarios de pollo crecen activamente en un medio salino

puro (solución de Drew). A los de mayor tiempo hay'que agre­

gar suero o plasma para evitar que se detenga 1a prolifera­ción.

El jugo embrionario no contiene lisina ni histfdina. Enel plasma senil,que detiene el crecimiento celular "in vitrcw

existen.

' Las substancias es­timulantes abundanen ciertos tejidos. El extracto de ovario

prgduce crecimiento abundante,perc no durable; las células mue­ren al séptimo pasaje. El extracto tiroideo provoca un creci­

miento mayor que el muscular,pero por poco tiempo: 6 pasajes.

Estimula tambien la cicatrización de llagas. El de bazo es con­siderable su poder,pero no comoel extracto de tejido cancero­

sc. El de higado inhibe los fibroblastcs,pero no las célulasepiteliales.

Dostejidos diferentes,a algunos milímetros de distancia;(método de culturas afrontadas) pueden proliferar los dos en

estos casos: 1) sobre el borde frontal, polaridad frontal; exis­te aquí un blastotrcpismo positivoi2) sobre el borde opuesto,polaridad distal; blastotropismo negativo que puede llegar aparar todo el crecimiento.

Puede crecer un fragmento de tejido A en el polo próximo

y el otro B en el polo distal. Hay entonces blastntrcpísmo po­

sitivo de B para A y negativo de A para B.

Se trata de substancias difusibles, queexnrmfimo no la

proliferación y puedenprovenir de tejidos normales, patoló­

gicos, procesos Íermentativos y de agentes pat686n05-°Las substancias estimulantes de tejidos adultos son aun

mentadaspor autólisis.

Un cultivo puede emplear ¡para la proliferación de nue­vos elementos, los productos autolizados del tejido inicial.Puede vivir por autofagia un tiempo, independientemente de lo

r_

-34.

que le ofrece el medio.

En un medio que contiene productos de digestión pepsioa

de hígado o hipófisis anterior de ternera,orecen normalmentelos fibroblastos de rata, proliferan bien durante tres mesos;los de pollo presentan rapidamente degeneración grasosa. Losproductos de proteolisis bacteriana dan excelente resultado

con cultivos de cartílago o carcinoma de ratón¡fibroblastosy tejido embrionario humano.

Conhigado de ternera o pituitaria digeridos, hasta cier­to punto, por pepsina,se obtiene un medio conteniendo un má­ximo poder promotor de ore cimient'oi

Cerrel y Baker inVestigaron la actividad promotora de cre­

cimiento de diversas substanciast digeridos de proteinas purasfibrina etc.

La yemadel huevo de gallina es inactiva para los culti­

vos y suponiungflarrel y Bakergque los lipoides que contienen

inhibe el crecimiento. Pero dializados obtenidos por Wright se

muestran similares a los dializados de jugo embrionario: en una

experiencia, yemade huevos,de 7 a 8 diasnsometidas al anteriorprocedimiento y probadas en corazón de 10 a ll días.hioieron

pasar el número de mitosis a más de 115 mientras que en los

controles era 14.RofÍo insistio "sobre las relaciones existentes entre 108

'extractcs frescos de órganos que acentúan el crecimiento oe­

lular y su tenor en colesterina“ "Los extractos de órganos c

tumores ejercen sobre 1a vida y desarrollo de los tejidos una

influencia que es función de su riqueza en lipoides: in vivoe in vitro los resultados son similares.

Un extracto de levadura,agotada por alcohol a 752,da unasubstancia termolabil que estimula el crecimiento de fibrcblusvtos. El alcohol a 952 arrastra substancias termoestables quetienen una acción favorable sobre los epitelios.

Los tumores y sus extractos contienen substanciaSIexcito­formatrices. El extracto de Rous es reversible: estimulzntee inhibidor del crecimiento. Drewa demostrado que el riñon

.35­

normal produce productos estimulantes, si la autolisis se hacea 37° y nc la produce a 0°; contrariamente a los tumores que a

0° las producen. a

n Otros autores creen que el poder exito formador reside en

la ausencia de un factor inhibidor, presente en los explantadosde tejidos normales.

los elementosneOplásicos sufren influencias inter-tisula­

res “in vitro" y producen a su vez substancias activas; pero losresultados obtenidos son divergentes,

Por medio de cultivos afrontados,se ha observado, que el

testículo y la tiroide favorecen, el bazo y riñón inhibe y el

higado es neutro con respecto al desarrollo del tumor, :

.Iarinov encuentra antagonismo entre timo y carcinoma derata; el lóbulo anterior de lajhipófisis estimula ed tumorderata e inhibe el de ratón,

BOFTOf Función éxcito-formadora del extracto de tumor enlas culturas de tejidos "in vitro" Bol, del Inst, de Med,Exper,

n° 28, Dic, 1931.5 ha encontrado en los extractos de sarcoma y

carcinoma substancias eficito-formadoras que responden a las con­

diciones asignadas por'Carrel a las trefonas,

La expernmentación se ha efectuado comosigue: tejidos,

corazón de embrión de pollo y sarcoma fusocelular de rata, Cómo

medio,plasma solo o con el agregado de uno de los siguientes ex­

tractos: embrionario, extracto de sarcoma o de carcinoma de ra­

ta,al 5 %»ambos(extracto activo o autolisado de la porción pe­

riférica o central del tumor), .Resultado: En medio de plasma solo el crecimiento es pobre;

en cualquier extracto, embrionario o de tumor, el crecimiento es

abundante y similar; cualquiera que sea de los dos tejidos culti­

vados, lo que demuestra que los tumores contienen substancias

¿fito-formadores tan potentes comoel extracto embrionario,

Enotra.serie de experiencias, estos tejidos fueron cultivados

en plasma con extracto de esos tumores pero sometidos,estos últimos.a distintos procedimientos químicos y fisicos ( calentados a diver­

sas temperaturas, filtrados, precipitados por 804 NH¿,602, etc.)

-35 bis­

Ias variaciones del crecnniento en esos medios han indicado,

que las substancias activas son termolabiles, retenibles por filetramiento, precipitables por SO4NH4etc,, Es decir, que las prce'piedades fisicas y químicas de esas substancias activas del sar­

comay carcinoma son semejantes a las prcpiedades fisicas y qui;

micas de las trefonas embrionarias,

BOFTOestudió también la acción de distintos productos ais­lados de los autolisados (dlbumosas,globulinas, polipeptidos,

peptonas, animo-ácidos, ácidos grasos, lipoides) sobre el creci­

miento y agragados al medio en distintas concentraciones para en;

contrar el limite de dilución que permite el crecimiento,

"Observase que los grupos formados por desintegración pro­

teica que se presentan más activos son los polipeptidos y los

amino-ácidos' " Debenígzcesariamente una acción más tóxica como

productasde última etapa en el proceso de autolisis" 'Üontraría­I

mente a otros resultadosel poder inhibidor disminuido lo danlos lipoides que permiten el crecnmiento en los tejidos observa­dos en diluciones muyconcentradas (44h)

Digestioneg de higado, Debe ser de gran importancia el des­

cubrimiento de Baker y Carrel,(2) quienes observaron que, en una.digestión pepsica de higado, los fibroblastos malignos del sarcofma10 de rata (de la fundación Crocker) proliferan indefinidamen­

te en ese medio,Se utilizó, comomedio de cultivo, el producto de diges-'

tión en total, sin aislar las diversas fracciones, ' para no re­mover las substancias de naturaleza desconocida que suplementa

los productos proteoliticos',Mcdificando la concentración de en?

zimas y del ion H, hidrolisando el higado con HDÉ,pepsina, trip­sina y eripsina, se consiguieron productos en que la cantidadde proteosas variaba de 0 a 56 % y en N presente (comogrupos

libres aminos) de 13%La 81 %,

De estas experiencias se concluyó que, la multiplicación

indefinida de los fibroblastos malignos del sarcoma 10 pueden ser

mantenidos, no solamente por las proteosas, sinó también, por los

menores productos de fraccionamiento,

-36­

En digestión tripsica de hígado y en los digeridos pepsi­

cos, se multiplican rapidamente y por largo periodo¿ los fibro­blastos sarcomatoscs de rata.

Hace decrecer el crecimiento de fibroblastcs normales mi­

grandesdel corazón embrionario de pollo, la destrucción de pro­teosas por digestión tripsica.

Los productos hidrolíticos del higado se pueden clasificar

en cuatro grupos respecto a su acción sobre fibroblastos sar­

comatosos: a)d1geationesconteniendo eo a 50%de proteosas y 19

a 55%de su N en la forma de grupos de aminos libres. Velocidad

de crecimiento lento,menor due en jugo embrionario o en digestio­needs higado anteriormente citados. Células en malas condicio­

nes,aunque conservan sus caracteristicas y crecen lentamente por6 semanas b) conteniendo 39% o menos de proteosas y 35% o mas

de N en la fonmadicha. Las células proliferan indefinidamente

y en condiciones normales,ccmo las cultivadas en jugo embriona­

rio c) Broteosas enteramente destruidas. 69%de N como amino

grupo libre y 13%de N en forma peptidaaque no fue posible hi­

drolizarlo. Las células proliferan indefinidamente, comoen ju­go embrionario o en digestivos pepsicos del grupo b. Se conclu­

yó,que estas preparaciones daban todas las substancias necesa­rias para el crecimiento de fibroblastos sarcomatososadespues

que los tejidos fueron cultivados por 102 días. Pero entre lascélulas había diferencias en su aspecto de aquellas cultivadas

en jugo embrionario ó digestivos pepsicos: pequeñas, ovaladas,

menos transparentes, etc. d) Hígado completamente hidrolizadopor HCl hirviendo. No hay crecimiento aunque se le agregue trip­tofano.

Parece ser que es esencialapara la vida de las células

"in vitro",c1 13%de N pepsico que queda de la digestión trip­sica.

De estas y de otras experiencias se han sacado hechos que

pueden resumirse en lo siguiente: no mantiene indefinidamenteel crecimiento de fibroblastos sarcomatosos 1a hidrolisis in­

Icompleta del hígado obtenida por pepsina o autólisis, con 357o

—3aa.

a 69%del N bitado; cuando las peptonas con todas destruidas

.no hay crecimiento y no parece haber duda que son necesariaspara la vida de laS'oélulas,pero las protcosas aunqueno re­queridas son utilizadas para el crecimiento y tambien son u­

tilizadas las peptonas, peptidos y aminoacidos."Los productos activos son debidos a acciones enzimati­

cas y ¿ón prefonmados en el higado“

La acción de los productos hidrolítioos del hígado so­

bre fibroblastcs normales de rata son los siguientes;a) no

proliferan indefinidamente,sinó un corto tiempoien digeri­

dos de hígado‘b) por 5 o 6 dias crecen tan rapidanente endigeridos tripsicos sin contener proteosas comoen digeri­dos pépsicos. El crecimiento decrece en el segundo pasaje.Lo mismoen fibrina hidrolizada en diferentes grados oedestina.

Se conoluye,que los menores productos de degradación

de las proteínas son tambienutilizados por las célulasnormales.

Cuandolas preparaciones son diluidas la acción toxicase reduce y los fibroblastos normales viven por largo tiem­

po y sin mostrar degeneración.

En resumen, produce ilimitada multiplicación de fibro­blustos sarcomatosos y proliferación temporaria de fibro­

blastos normales,una mezcla dc peptonas, pepticos y amino—

acidos,contcnicndo pequeña cantidad de proteosas,si estassubstancias provienen del higado,que contiene productos des­

conocidos,las cuales completanel efecto nutritivo de lassubstancias degradadas de las proteínas.

Estas diferencias nc pueden ser aun explicadas. Pero

las células ao sarcomaposeen gran actividad sluoolítica

en comparación con los fibroblasyós normales, por lo tanto el

medio es más ácido, aproximadamente PH 6.0; mientras el de losfibroblastos normales es PH 7.0. La actividad enzimatica varia

mucho entre esta concentración del ion H. Es probable que, mas

activamente que las normales, las células del sarcoma sinteti­

zen de peptidos y peptonas, el protoplasma. Ya demostraron a1­

gunos autores que la sintesis de proteifida,de productOd-proteo­líticos de albúmina. por tripsinagse efectua rapidamente a una

concentración del ión H bue varía entre 6:5 y 6.5;

Tambien puede ser que las celulas del Barcomatengan enzi­

mas que funcionan algo diferentes que aquellas de las célulasnormales.

"Estos hechos dan más luz en el mecanismo del crecimiento

de los tumores en el cuerpo. Todo proceso que trae digestión

proteica, comoacontece cuando tejidos muertos o heridos son

autolizados por las enzimas libertades o por maorófagos, pue­den suplir a los fibroblastos sarcomatosos con material nutri—tivo".

Y gRomEINAs Y SUBSTANCIAS DERIVADAS (37)

.¿Lmingganigga,flurrows y Neymann

encontraron gue son tóxicosgaún a bajas concentraciones. Los

amino-acidos preparados del huevo también lo son_(perc las pep—

tonas de yema de huevo y las proteínas no son nocivas).

Para Carrel y Ebeling,a la concentración de 25-30 mgpcr% de

medio de cultivo,son inocuos. Los fibroblastos humanospueden

crecer,largo tiempo,en una concentración de 525 mg. por %de

medio (Vogelaar y Erlichmann). La adición de mezclas de amino­

ácidos a jugo embrionario dializado apenas aumenta su actividad.

Los digeridos de fibrina dan buen crecimiento; menos fa­vorable los de albumina cristalin. de huevo y de casaina. Es­

to último se debe probablemente a que la caseína es pobre y la

albúmina de huevo no contiene glioina. Los productos de

desdoblamiento de la albúmina de huevo nc tienen gran poder,pero se acrecienta agregcndc glicina pura c ácido nucleicc

puro. Agregada a un medio pobre en ella (glicina),estimulael crecimiento.

La cistina, la cistcina, la arginina y la glutación sonestimulantes,8egún Hueper y RussellSy deducenqqucinfluyen

en la proliferación celular principalmente mediante suspropiedadesnutritivas capacificas.

Lcd fihrcblastos sarcomatcscs de rara,en digeat icneh de

huevo y oaseína, crecen muypoco,pero lo hacen mejor des­

pués de adicionarles glicocola,ó digmfiflmg'degelatina,que

es una proteina rica en glicina. Es pués,pafla los autores ,la glicoccla,ya sea en esta forma o en la forma pcptida,

un componenteesencial del medio de cultiva. Prueba tam­

bicngy esta observación es de gran importancia)que paraedificar su protoplasmalas células son capaces de utili­

zar los amino-ácidcs (La glicina,ccnsiderada cano no in—o

dispensablc en el alimentc,puede ser sintetizada en elcuerpo animal).

Los resultados de los estudios sobre la influencia de

estas substancias sobre el desarrollo de los cultivoS'scn

contradictorios; pero nc hay duda que son utilizados parala síntesis de prot0plasma.

Piensa Bakcr¡que,1a incapacidad de los fibroblastcs paura crecer en una mezcla de aminovácidcs es debido a la ausen­

cia de glutación y la carencia de poder sintetizador de las

células para ese compuesto.

Algunos autores encontraron que eran tóxicos,con lc que

están en contradicción con las observaciones de otros.

Muchos otros investigadores nc vieron aumento de masa

protoplasmática; pero con ello no se prueba que nc lo pue­dan utilizar. Probablementelas mezclas artificiales no

contenían todos los necesarios, tanto más cuanto que nc tc­

-40­

dos los amino-ácidos pueden ser sintetizados.Y los obtenidos a partir del huevo o del jugo embriona­

rio también han fallado con respecto al crecimientd, pero

se puede suponer que el medio¡aún conteniendo todos los in­dispensables,era inadecuado.

Vlés y Coulon,experimentando con 15.000 animales, in­vcstigaron el significado de los amino-ácidos en relación

con el cancer animal. Se comportaron diferentemente varios

de ellos. Ejercieron una fuerte acción inhibidora en el de­

sarrollo tumoral algunas mezclas,entre las cuales habianunas que contenían glicina. Lo mismoobservaron otros in­

vestigadores."En vista del hecho que los amino-ácidos pueden algún

dia mostrarse útiles en el tratamiento del cáncer humano,esaltamente deseable investigar extensamente su influencia en

el crecimiento "in vitro" de tejido humano,tanto normal co­mo patológico"

"El crecimiento de corazón embrionario de pollo "in vi­

tro" (43) es acelerado por las siguientes substancias a una

conccntración de 1:5 000,glicina, triptofano, beta fenilala­nina, ácido glutámico y prolina No es afectado por leucina,

scrina, cisteina, valina, alanina, arginina y glutatión; es

inhibido por cistinafi’fenilalanina, lisina'érhistidina.Debajo de la concentración l: 3H000los amino-ácidos

aceleradores son inactivos y sobre esa concentración inhibi­dores.

La 2.5 diquetopiperazinaacelera el crecimiento del CO­

razón embrionario en una concentración corre3pondiente a l:

5 OOOde glicina; afecta menos a menores concentraciones y

es inhibidor a una dilución de1:600 .Bromas-v

Aunque ( 2) no son medios completamente nu­

-11"

tritivos,causan proliferación de iibroblastos las proteosasde la peptona de Witte y los productos de desdoblamiento de

diferentes proteinas. Experiencias hechas con jugo embriona

rio demuestran,quela fracción proteica es la utilizada por

los fibroblastos y solamente proliferan poco tiempo con los

amino-ácidos,de ese jugo,u obtenidos por hidrólisis de profteinass

BAKERY CARREL,desdoblaran la peptona de Witte en he­

teroproteosa,<x y p proteosa y las probaron en fibroblastosde corazórcileembriónde pollo y en una cepa pura de fibroblas­

tos sarcomatosos de rata. La heteroproteosa se mostró inacti­

va, la ny'p proteosa hicieron proliferar rapidamentelos dostejidos,pero la células permanecenen mejores condiciones con

laCY'proteosa._Lapurificación de esta por repetidas precipi­taciones no hace decrecer su podereSÉiqqladofie crecimiento.

A igual concentración de N, ej. 17%de N en<qlproteosa,

17%en.p proteosa,17% en peptona control, los tres dan la mis­ma cantidad de tejido, es decir,en los mismosdias los culti­vos tienen igual area de crecimiento.

Las digestibnes de fibrina fueron separados en una

parte soluble y otra insoluble en HCl; las dos porciones con­tienen proteosas. Danbuen crecimiento tanto en fibroblastossarcomatosos comonormales.

La acción estimuladoïfia crecimiento, entonces, de las pro­

teosas, no es propiedad-especifica de una sola fracción, sinoque has células utilizan varias fracciones con diferentes pro­piedades químicas.

Las proteosas no mantienen la vida de las células indefi­

nidamente, pero producen crecimiento rápido por 8 6 lo dias.Para 1a nutrición completa de los fibroblastos se requiere

otras substancias de naturaleza desconocida.

ro e _uu

Desde los primeros tiempos de los cultivos se

«42­

.saba que las proteínas son más ó menos inertes.

Es interesante anotar que las digeeiLOBSdeproteinas Ve­

getales, cono edestina.y gluten,(contrariamente a los produc—.tos de desdoblamiento de la albúmina de huevo) tienen gran po­der de crecimiento.

u GRUEC-¡3 .2 .­

Varios autores han llamado la atención sobre la:

.impcrtancia del grupo SHpara la división celular. Rapkine,por

adición o supresión deiese grupo,suspende reversiblemente ladivisión del huevo de erizo de mar.

(35) Iá.glutat16n,o más bien,1os grupos sulfhidrilos son unosde los constituyentes importantes del jugo embrionario..Se

estima en 40 mgr por % de jugo,de SH expresado en glut'tiflfl.

Basandose (20) en las prepiedades del extracto embrionap

rio sobre los colorantes de oxi-redución,Sañks afirma que con­

tiene una gran cantidad grupos sulfhidrilos (M/10.000 a M/100). Con ello se explica el enormepoder reductor del jugo,pero este poder no corresponde a la capacidad total de reduc­

ción y por lo tanto afirma que,además del grupo SH, el ex­tracto contiene otras substancias reductoras y en particular

sistemas diastásicos deshidrogenantes,que ha demostrado porreacciones "in vitro".

Los grupos SHpueden actuar 00m0factor para establecer

en el medio un potencial y este seria función de la concen­tración.

Parece que pueden intervenir químicamente de una manera

directa,en diferentes sistemas,por su poder reductor. Enciertos casos, según Sachs,quien lo ha verificado,el SHdelextracto embrionario puede intervenir en la formación de áci­

do lactico a costa del pirúvico.Los —SHpueden actuar como co-diastasas y se ha podido

reemplazar (Lokmann)el co-fermento de la metilglioxasa por

el glutacion reducida—s

-4á+

Baker sugiere la idea que EL gluta‘ión actueqno solo re­

gulando la respiración y 1a reacción oxidación-reducción den­tro de las células, sinó tambiéngcreandoun potencial desea­ble de este mismo en el medio.

En cuanto a sus relaciones con el orecimientc.se ha ob­

servado que él glutatdón,combinada a cenizas de higado y a la

hemoglobina,favorece el crecimiento de fibroblastos normales

y sarcomatosos (Baker); y que con jugo embrionario deficiente

por dilución, agregandole esa substancia o cisteina,se obtie­ne un crecimiento comparable o algo superior al obtenido con

jugo normal. (35)

Ephrussi, Verne Soubiran, Pires Soares tienen experien­cias sobre este tema Siguen detalles de sus trabajos y desus opiniones.

EPHRUSSI(7) se pregunta si las substancias,que se ago­tan en el medio nutritivo durante el creoimiento,no son denaturaleza similar.

La reacción del nitroprusiato, llamada la reacción da.glutación,pone en evidencia el grupo SHdel glutatión y

aquellos fijados a la moléculaproteica (radicales SHfija­dos).

Efectuando esa reacción en diversos estados de creci­

miento,se la obtiene positiva cuando hay desarr6110;y a me'dida que se va deteniendo la reacción es menos inffinsa,hü9’ta hacerse negativa cuandola división se detiene.

El lavaje de cultivos de crecimiento activo debilita la

reacción positiva(y hay que recordar que el glutaüión es so­luble en agua)

Una prueba que la causa que detiene el crecimiento es el

agotamiento de substancias proteicas que suministran el r2 i­

cal SH,1a da al siguiente ensayo: se desnaturalizan las pro­teinas por ebullición en medioácido; la reacción es reforza­

da en aquello: cultivos de buen crecimiento y permanece nega­tiva en los de desarrollo detenido.

-44­

Otra prueba consiste en cultivar dos series de un mismo

cultivo por el método de crecimiento lento. Cuandoel desarro­

llo se detienu,se efectua la reacción del nitroyrusiato en una

de ellas,que u-rá negativa. Agregandoa la segunda serie extrac­to embrionariv,¿ue comose sabe es rico en SH,ol orecinlerto

vuelve a comenzary la reacción se hace positiva. Los cultivosf}en presencia de extracto embrionariq Onótodoclásico) a las tie;

ó cuatro semanas, aunque muestran aun reacción positiva al ni­

troprusiato, detienen su desarrollo. Hayque concluir, pues, quetiene otras causas esa detención del crecimiento, probablementela acumulación de substancias de desperdicio. n

“Si la detención del desarrollo de nuestros cultivos dice

Ephrussi, es debido al agotamiento de una categoria de proteí­

nas,capaz de dar SHpor desnaturalfgíón,se puede preguntar oo­

mo la regeneración de estos mismos cultivoa despues de un trau­matismo,es posible. El med109enel oúal esta regeneración se

produce,(plasma coagulada) está desprovisto de SH; los cultivarno lo contienen. Hay que hacer llamado aqui a una hipótesis ac­

cesoria que falta discutir".

VERNEY VERNESOUBIRAN(35) oultivaron "colonias estafiiliza­

das de fibroblastos que habían perdido su energía residual yprovenientes de corazones de embriones de pollo de 9 a lo días

de incubación",en plasma más jugo embrionario (en unos normalen otros calentado o jugo viejo) con o sin glutatión. Los cul­

tivos transplantados en mismomedio varias veces.

(Es de notar,para la interpretación de la experiencia, queel jugo embrionario se vuelve inactivo,con respecto al crecimi­

ento,por calentamiento<que ¿estruye el glutatión)o por conscrvavción de varias Semanas).

La adición de glutatión a plasma y extracto normal no au­

:Ïcnta el desarrollo, en razón,se supone, que ya contiene el ox”\

3raéfo grupos SHen cantidad.

-45­

Agregándoseloal extracto calentadc,un el cúal disminu­

ye la actividad de los oultivos,mejora el crecimiento,pero noiguala al obtenido en jugo normal. No hay duda que otras subs­

tancias se han destruido por el calentamiento (trefonas).Se ve disminuir la actividad de crecimiento en los teji­

dos cultiVaflos en jugo viejo y 1a adición de glutatián es ine­

ficaz para mejorarlos,con lo que se demuestra que el jugo aún

contiene esa substancia y 1a disminución de su actividad debe

estar en relación cOnla desaparición de otros compuestos,

En resumen para la actividad del jugo embrionario, al glu­tation no es factor suficiente,pero si necesario.

PIRES SCABES(20)trabajó con una substancia rica en SH,

la cisteina. Comotejidos usó testículo de cabayo de un mes

y corazón embrionario de pollo; comomedio de cultivoaplasma 4

extracto embrionario, plasma-tcisteina, plasma-textracto em­brionario-+cisteína.

Los cultivos con plasma extracto y cisteína son mejores

que con los otros medios. Se deduce de la experiencia que,es

causa de 1a fibrinolisis de los cultivos, 1a falta de SHjun­con otros factores,porque en los que contenían cisteina se re­tardaba este fenómeno.

Por comparación de experiencias, se concluye tambien que

el plasma, quitándole grupos SHal extracto embrionario,tie—ne un poder de oxidación muymarcado sobre él.

“Las experiencias que proseguimos, dice Pires Soares, nos

permitirán, quizás , considerar los grupos sulfhidrilos co­molos factores esenciales de la proliferación y del crecimien­

to de los tejidos. Los trabajos de Fischer, Fujino, Hammett,

Saunders, Waldsehmidt-Leitz, Mueller, Sturgis, Hueper, Russel,

Sachs y otros,que son particularmente sugestivos en esta mate­ria,refuerzan esa opinión."

.45;XLI Homem

-Las hormonas y su papeloen el crecimien‘o en"brionario rzsido objeto de muchosestudios. Varios autores

encontraron que producen efectos en la velocidad de creci­

niento,cono también en la morfología g con cultivos de cé­

lulas enbriomarias se ha obtenido ¿ejor resultado aun.Katsura,con extracto de tino agregado al nedio,obtu­

vo crecimiento más rápido de fibroblast s de embriones de

pollo. .BOFFO(25) ha encontrado que la insulina inhibe el

creci:iento,tanto normal comoneoplásieó . Solamente en can­

tidades tu; diluidas,0.26 unidades por 1i1,se observa algundesarrollo.(a')

Quervain refiere que fué informado por Carrelgprmvada—

mente,de iguales resultados,con extractos conteniendo hormo­na tiroidea. Pero las publicaciones de Garrel y sus asocia­

dos,solo hablan de que las proteosas de la tiroidea y de la

pituitaria dan buen resultado en crecimientc,pero sin ningu­na evidencia de efecto esQecifico endocrinal.

Los estudios sobre la influencia de la hormonatiroi­

dea son contradictorios. Por medios de cultivos afrontadas

Ebeling comprobóun efecto estimulante del epitelio tiroideosobre fibroblastos,en cuanto a crecimiento. Defluth en con­

diciones análogas lo niega. Oarre1,con extracto de la glán­dula sobre fibroblastos,observa estimulación. Seaura y tam­

bién Sato, con. tiroxina en el medio de cultivo,encuentranque a cierta concentración favorece, en otra mayor inhibe.Vogelaar y Ehrlichmann no ban encontrado acción de creci­

ïiento sobre fibroblastos humanosy no creen que la tiroxi­na pueda actuar directamente.

VERNEY ODIEQTE(30) han utilizado en el uedic de cul-v

tüma solución de tiroxina a distintas concentraciones y cu­

motejido,corazón de pollo de cultivos estabilizados es de­

cir,que han mantenido durante 15 días a 3 semanas por medioÏa') En consecuencia de esta observación, Gomesda Costa, de

Portugal, aplicó un tratamiento a base de una pasta con insu­lina.

-47­de trasplante). Tambiénutilizaron tejido nervioso. Noen­contraron diferencia en el crecimiento entre los cultivos

con o sin tiroxina. En otra serie de exyeriencias,se sirvie­

ron,cero medio para el tejide,de plasma,proveniente de un po­llo al cual se inyectó previamente tiroxina; en este esse se0915:;r6 aumento del area de crecimiento,cn comparación con

los testigos, un número mayor de nitosis y una densidad tam­

bién mayor de los elementos que invaden el medio,tantn en co­razón comoen tejido nervioso.

Hasta fl dias despues de Ia'ultina inyección el plasma

es estimulante; pasado ese tiempo se vuelve indiferente y"este retorno al estado indiferente se mantiene aunque se

continuen regularmente las inyecciones”. Mástodavía,"en un po­llo,que habia recibido durante tres semanas inyecciones dé­

biles de tiroxina y después se habia puesto en reposo,se haobservado que el plasma presentaba una ligera reacción inhi­bidcra del creciniento“.

Se supone que la tiroxina en el organismo vivo sufre

transformaciones que hacen al plasma cstinulante,pero luegoaparecen anti-hormonas con efecto inhibidor.

Im V'lugng.­Las vitaminas,aunque indispensables en la vida

entera, su necesidad es más pronunciada en la primer edad.

No esta esclarecido en todos sus aspectos la inrluen­cia de las vitaminas que rigen el desarrollo normal y el

crecimiento; pero es probable que en los cambios del tejidocelular tengan un rol importante y tanto mas tenga necesidadel organismo en ellas,euanto mas rapido se desarrollen los

procesos de vida; En oonecoueneia,pareoe probable, Que las

03'le maya:metabolismo,comoen el caso dé te; idas encrecimiento y cmbrionathmücl intercambio en vitsaunaa sea na­

yor.Burrows, Biseglie, Erdnann le atribuyen para el creci­

miento gran importancia.

-43­

La vitamina A fuó estudiada por Burrows,en 1126,y porBisceglie,ta1bión on el mismoaño. El primero llegó a 1a con­

clusión que es innibidora del crecimiento. Bisoeglie,con cul­

tivos de bazo e higadofgota pendiente,encontró que estimulaba,

pero sin precisar hasta que punto el factor A habia sido pu­rificado.

L. um“ puedereanimr Witivi. noribunc'LOs.En plasma heterólogo produce crecimiento débil y especialmen­

te de tipo conjuntivo. En plasma homólogo predomina el tipo

epitelial. Iaíáfífisñgxnmzacciónbien definidafil)Bisceglic,cemo se ha dicho,investigó la acción de las vitami­

yaacAlI B sobre el crecimiento de explantados hepáticos y deal medio de cul­bazos,de Qdmümfli recien nacidos agregando) )

tichsubstanoias nfifiuagamvi+Pqflggagos estimulan. La A en ma­yor grado y en los cultivos hopáticos con preferencia el te­jido epitelial.

Burrors supone que “el tumor se produce por una aiüwui.

vitaúïhoáisyedeeflirïflO fine.sigPB i : una acumulación local de

vitamina B o bien una desapa ición de 1a vitamina a produce

un crecimiento ilihitado del tejido tumoral".A lo mismollegóErdmann. N

Juhász-Schaffor'aumprobó' 1a aceleración del crecimiento

de cultivos por lahB y no pudo observar la inhibición por lavitamina A.

BAKER(l) trató de dilucidar si la vitamina A es necesa­

ria para la vida de los Íibroblastos. Utilizó a) carotenq queno influye en ol creoimionto;b) vitamina A relativamente pu­

rificada extlaída de un aceitc;o) vitamina A de la mismapro­cedencia pero muypurificada.

Las dos últimas fueron probadas en oultürus de fibroblas­toa,cepa de 23 años y otro nuevo derivado de un corazón.

Ia.A es hasta cierta concentración muyestimulante del

crocimiento,pasado el cual es tóxica.La adición de la vitamina evita la acumulación de grasa

.49r

en las células; viven y proliferan los tejidos mas tiempo enlos mediosartificiales;

El diverso grado de purificación no influye en los re­oultados.

Hosono‘mBISAWA(41) memwÓn 1a acción estimlanmde la vitamina D,para el crocimiento,en corazón de embriónde pollo.

La vitamina E fué estudiada por JUHASZ-SCHAFFER(12)

quien dice que,1a unidad de sensibilidad,con respecto a lafalta de esa vitamina,de los tejidos de embrióncs,de los re­

cien nacidos ¿y testiculares,hnee pensar que tiene un papelimportante en el desarrollo vital mascaracterístico de esestejiddï la multiplicación celular.

Ese es el origen del problema de si la vitamina E esti­mula el crecimiento de las células.

JUHASZ-SOHAFFERempleó como tejidos bazo;hígado;corazón

y .Yimeri‘estieíde embriones de pollo de 5 a lO días.

Comomedio,plasma dc pollo de un año y solución Locke

1:1,sin extracto,"porqueíggfitiene toda una serie de factoresde propagación celular,prinoipa1monte vitaminasgyeharia im­posible el analisis mas detallado de cada uno de los facto­

res" y gotas-do ¿coit0500mo fuente de vitamina E,es decir,

extracto etereo de'aoeite de trigo,que lg contienefgmtoaen unoscultivos -Ehotros el'extractc inactivado por autoclave.Ytodavia,otras series sin aceite.

Se observaron los cultivos al estado viviente y también

fijados y coloreados. La medida de la velocidad de creci­

miento se efectuó por medio de un metodo grafico,midiendo

las superficies cada 24 horas.(Este metodo consiste on el empleo de un aparato para

proyectar sobre papel los contormoscelulares crecidos ydibujar planimctricamente ol area.

Los resultados fueronsa)con respecto a la clase de có­

lulasyflreeimiento de naturaleza mixta,especialmento de cé­

-50­

lulas ccnjuntivas,perc tambien de otras células. El efecto oe­

timulador,pcr ciertas células) puede excluirse verosimilmente,porque, la mcrfolcgía,de lo que corresp0nde a la zona de inva­

sión, no muestra desviación con respecto a los cultivos ccntro—les.

Pero el autor hace notar que no utilizó cultivos puros,condición necesaria para estudiar los efectos sobre un tipo ce­lular determinado.

Conestos, cultivados sin interrupción, tal vez habría es­

pecifidad para ciertos elementos y agrega,"tambien nuestros co­nccimientcs,scbre el rol de los distintos componentesdel teji­

dc cancercso, podrían apoyar la opinión de que las células opi­teliales,de origen de tejido conjuntivo,no reaccionan uniforme­mente ante el estimulo de las vitaminas".

b) Con respecto al crecimiento; 3:1agregado de aceite ÍM'N

aumenta el crecimiento y prolonga la vida del cultivo; con elaceite inactivadc no se modifica ni en favor o en contra ese

crecimiento. Por lo tanto,debe atribuirse a los contenidos v1­tamíniccs el efecto propicio a la multiplicación celular. (Sihay otros factores que son destruidos por el calentamiento, noestá aI alcance de los conocimientos). No forman una zona uni­

forme las areas de crecimiento; en algunas partes esas zonas

son más grandes, especialmente donde la fuente de vitamina esdeslindada visiblemente por el trozo.

El autor discute esta parte del trabajo comosigue.Tanto el aceite de trigo inactivadc comoel activado es asimi­

lado uniformemente; pero solo aumenta.la fuerza de crecimientq

aquél, que en los experimentos de nutrición demostró que conte­

nía el factor E. Podria decirse, pués, que la vitamina E y efec­tc estimiladcr de crecimiento son equivalentes, pero no es así,pues los brotes de trigo contienen otras vitaminas; que canti­

dad contiene el aceite de trigo de esos otros factores no se oo­1100€.

-51.

Lc que las observaciones pusieron en evidencia, es quegexclu­vendo la vitamina Egla cantidad de factores vitaminioos no es

muy evidente y que,tratándose de la acción favorecedora de crew

cimiento de los aceites de trigo, la E debe ser puesta en pri­mera linea. ¡

Pero para la solución del problema seria necesario aislafiIL

í:¿r SUBSTANCIAS EXTRAÑÁS AL ORGQKISMBQ CANCERIGENAS E INHIBIDORAS2

Comoun agregado se citan algunas

substancias no existentes en el organismo, peregpor su impor­

tancia en la producción del cancer experimental, es interesan­te conocer su comportamientofrente a tejidos aislados y vivos.

La canccrización "in vitro" de células normales, por medio

de agentes bien definidos, es considerada un argumento de granvalor para la demostración de que el cancer es un mal celular.

Se ha obtenido por diversas vias: Fischer,agregando al tro­

zo cultivado durante varios pasajes As 2 03; Carrel y Ebelingcon extractos de sarcomas provocados por substancias químicas (I):

Des Ligneros con 1!»2:5:—6: dibenzo-antracene; etc; canceriza­ción los cultivost(5) .

Varios de estos investigadores han podido comprobar la can­

cerizaciónfi injertando el trozo en experiencia a animales.en

los cuales han Conseguido, por esc medio,producir tumores¿HEARNECREECH(5) utilizó fibroblastos del tejido conec­

tivo envolvente de las costillasfide embrión de rata­Comomedio, las substancias a próbarse disueltas en SOlu­

ción de Pannett y Comptona‘Ph 7,4-7.5, plasma de pollo y extrafl­to.

Después de 24 o de 70 horas los crecimientos, fijados Y

¿filoreadcs o vivientes, dieran al microscopio los siguientes

resultados: 1:2:5:6 dibenzoantraoeno y ácido coleico ¡gumenta51 Crecimiento: no así el fenantrene fi ácido ooleico; y acenaf­

tene y ácido coleice, compuestos, estos dos últimos nocanoe­rígenos.

-92—

MAUER(42) trabajó con ciertos hidroearburos cancerigenos

(benzopirene; benzantracene etc.) agregados a cultivos de fibro­

blastos de embriones de 14 dias de perro, con objeto de ralacio­

nar los fenómenosobservados (degeneración grasosa, coagulación,

etc.) con los de las células malignas.

Se ha estudiado muchola acción de substancias orgánicas

e inorgánicas,

Hay numerosos compuestos que, a ciertas concentraciones,

son inocuos para los tejidos nonmales y solamente a mayores dilu­

ciones lo son para las neOplásicas_ BOETO(Ia biologia del ver­

de de malaquita estudiada en los cultivos de tejidos normales yneoplásicos, Bol, del Inst, de Med, Exper, t, VI, n° 22, p.357

1929) lo observó con el verde de malaquita; BOEFOy-CAIBAGNO

(Estudio biológico de los vanadatos de Na, K, NH4, Li, Rb,Cs,

Mgy Ca sobre el desarrollo de los tejidos normales y neOplásicos

"in vitro" Bol, del Inst, de Med, Exper, n° 25, Dic, 1930) con

las Sales del vanadio, a

En este último trabajo, se ha observado además, que la

acción toxica del vanadio es reforzada, en muchoscasos por el

cation, Así el mayor poder de inhibición lo da el vanadato de NHÁ,con menor porcentaje de V en la molécula, que otros, los cuales

son menos tóxicos.

De la misma manera, mezclas de dos sales, de un mismo

cation, no actuan con acción conjunta. Se explica, porque susmexclas forman una tercer sal con acción diferente a las que la

engendran,

Mayorpoder inhibidor tienen los vanado-cromatos,(RDETO

y CAICJiWD;Ebtudio biológico de los vanado-cromatos alcalinos

á de magnesia, sobre el deSarrollo de los tejidos normales y neo­

plásicos, Bol, del Inst. de led, ERper. N2 26, pág, 108, 1931.)

-52 bis­

Son tóxicos para los dos tejidos ensayados: corazón y sarcoma. El

cromoes el que acrecienta este poder. Efectivamente con los mis;

nos cationes, los vanadocromatos son más nocivos que los vanadatos,

En general, la célula neoplásica es más sensible que las nor;males a los mismos agentes tóxicos.

Uña idea la da el siguiente experimento (BDFTO,Pérdida de 1a

vitalidad por la acción fotodinámicade los tejidos sensibilizados,Experiencias en las culturas "in vitro" Bol, del Inst, de Med, EXpeI‘

n° 27, pág, 339, 1931,), La eosina y la eritrosina permiten el cre­cimiento del tejido nornal y neOplásico (corazón embrionario de po­

llo y sarcomafusocelular de rata).Irradiados los cultivos, en estosmedios, con rayos ultravioletas acontece: con una exposición de

hasta 30‘ a 40 cts, de distancia,el tejido normalprolifera inteny

sanente: solamente con exposiciones más próximas o de mayor tiempo

hay menor crecimiento, En cambio el sarcoma es inhibido en cual­

quier caso de eXposición,

Es un proceso de foto-sensibilización de colorantes fluo­

rescentes que, inativos de por si, son activos por influencia dela luz,

CAPITUIO III

EODIFICAOIONES DEI.CRECIHIENTO CELULAR POR EFECTO DE DIVERSOS

E”CTORES QUIMICOS, MODIFICACIONES QUIMICdS PRODUCIDAS POR EL

CRECIMIENIOCELULg

1.- AHÁEBQBIOSIS.(IV, vol, Za. sección 4, pág, 742)

Burrowshsestudiado la respiración "in vitro”.

Corazones embrionarios de pollo cm.diferentes presiones parcia­

les de 02,se comportan diferentenonte según el grado de desa­rrollo del pollo. Fibroblastos de embriones,de 4 y 5 dias,

crecen y laten durante 46 horas en N2y hasta 50 on 7.5% de

02. De 10 a 15 dias no crecen en N2 puro y solo durante 12

horas en 1.5% de 02. Burrows omitiócsobre estos fenómenosrla

hipótesis,que las células Jovenes tienen una fuente de ener­gia que falta en las más adultas y con 1a edad declina hasta

perderse la facultad de crecer en anaorobiosis.Wind confirmó este trabajo con un método on que obtenía

anaerobiosis ostricta. En esta condición celulas de corazóndo pollo,de 4 a 5 días,apenas se desarrollan. En 33.10"4 %de 02 la diferencia es más notable: las de lO días no ore­

cen; las de 5 excelentemente. 0bservó,además,quo si so sub­oultivan muchas semanas y se ponia de nuevo en condiciones

de anaerobiosis la diferencia,entre células de diferenteedad desaparecian: no habia diferencia en el crecimiento.

Los resultados de otros investigadores son:

Wright

Explantaciones de mioblastos (embriones pollos lo días)

mm Hg 02.

a)en 0.22%de glucosa,mitosis cesa en 18.6emigración cesa en 12.4

b) en 0.06% do glucosa,mitosis cesa en 14.6emigración cesa en 9.0

Sarcomade Jersen rata,aitosis cesa on 6.0Carcimona de lancha " " " 3.0

Ephrussi, Chevillsrd,Meyer,Plantefol con oxplantaciones.de fibroblastos de corazón de pollos de 8 días:1a mitosisa

pero no el movimiento,cesa en 7.0 .

-54­

"Estos hechos llevan a la consideración de la evidencia,

que se ha traido de tiempo en tiempo en favor de ia opinión;que durante los primeros estados embrionarios el crecimien­

to anaerobio es posible o puede ocurrir normalmente".

n mapas; 129.11 '

Además de Warburg y sus colaboradores, Shearer

examinó "in vitro" la respiración de tejidos de embriones de

pollo y llegó a dos conclusiones: primero,quc la velocidadrespiratoria de los fragmentos de la cabeza es mayor Quelos

de laparte/Pfigyeïágg sobre el significado de este resultado.Segundo, que on los dos casos,al aumentar el grado de desa­rrollo la velocidad declina y esta es otra observación agro­

gada a la idea,ya establecida,que en los embriones de polloel metabolismo disminuye con la edad.

E1 espesor del medioregulahasta cierto punto la difu­

sión del oxigeno. Burrows,guiándoso por la aparición de mito­sis y por la trasformación de la hemoglobina en oxihemoglobi­

na,establoce que un espesor de 0.2 a 013 mmes el mejor parabazo Cds a 0.? para el tejido eonjuntivo. Sobre este espesorno hay verdadero crecimiento de fibroblastos.

Pero los efectos de la anaerobiosis se corrigen por adi­ción de extracto embrionario y en profundidades mayores de0;? mmlos fibroblastos muestran mitosis normal.

En la rcacción,(glucosa.— acido­

1actico. 602 y H20)01 proceso oxidativo puede -qu6mar el aci­

\ do láctico, o ser menor 1a oxidación y acumularse.

%%%ÏíáánesdePasteur se sabe que las fermentaciones y las oxi­daciones no son independientes. Si una celula, que en anaoro­

biosis tormento el azucar; sepone en medio oxigenado; la res­

piración que se estabf ee disminuye o hace desaparecer 1afermentación.

Según Meyerhof existe en el músculo este ciclo.' l r

Hidrato de carbonu'SZZEg acido láctico

55

El fenomenol, es decir, el pasaje hidrato de carbono ácido

láctico,es anaerobio y espontáneo, El 2, la resíntesis, es aerobioy necesita energia,

Unarespiración, de cierta intensidad, no puede hacer desapare­

cer ácido láctico en cantidades grandes cualesquieras. Hayuna rela»

ción. fijada por la energia necesaria para que se efectúe la reaccid1

2. Esta fórmula se puede medir por el valor del cuociente'ct c des

reSpira01on

Cuandolas células, que tienen la propiedad de fermentar al

azúcar, pasan a medio acrobio, si la velocidad de fermentación es

grande y la respiración pequeña, aquella subsistirá, Este es el caso

de la levadura de cerveza, que forma tanta azucar en aero ccmo en

anacrobiosis,

Pero si la reSpiración es suficiente o grande la fermentación

desaparece en el oxigeno, como es el caso del Mucor Mucedode Pas­

teur,

Tejidos normales Nargelein ( III t,2, cap, XV,pág, 109) efec­

tuó sus trabajos en la forma siguiente:

Estudió la glucdlisis en distintas edades del embrión (rata), Co­

moel Ringer altera los tejidos embrionarios, utilizó suero de caba­

llo inativado y en algunas experiencias liquido amniótico, provenien­

te de grandes embriones, El Ringer, conteniendo 02%de glucosa y

2,5 10"2 moléculas de bicarbonato por litro, era isótonico con suero

de rata.

la medida de la glucolisis y de la respiración se efectuó mono­

métricamente y la glucolisis aerobia determinada por la disminución

del tenor en bicarbonato, que un corte de tejido producía en una

solución de suero y Binger. la duración de la experiencia 30',

_La_'. _an_'_ae.'_ro_“_bi_'_a,_deembriones de rata, en suero, á

38°,dió el siguiente resultado:L

Peso embrión

(más pesado I lo, láctico por hora en %de pesomayor edad) L seco de embrión,

10.6 7,5 3,0

4,89 10,8 4,3

2,48 15,1 6,1

1,87 14,5 5,80,47 32,0 13,0

0.30 26,3 10,6

N2 í '

siendo I acido lacticg fgrïadfi en N en mm?L mg, e31 o ora.

¿La_%lucolisis-Perobisï_embriones de rata, de algunos miligramosglucolisan en aerobiosis cuando están en solución Ringen a pesar de

su respiración, pero no en suero, En consecuencia, el Ringer los al­tara,

Los pequeños embriones, de l mm, o menos, glucolisan en aero­

biosis, en cualquiera de esos medios, Pero, midiendo el metabolismo

de los embriones conservados dentro del amnios, (para aproximarse

a las condiciones fisiológicas) la glucolisis es muychica o nula,basta para los embriones pequeños,

Si el saco embrionario es destruido, aparece glucolisis aerobia,tanto mayor cuanto más pequeños son los embriones,

De estas experiencias lo que se deduce es, que "in vivo“ no

debe haber glucolisis aerobia, cualquiera que sea el grado de evolu­

ción del embrión de rata, Lo que parece acontecer, es que, en los

primeros estados de evolución aquellos son muyfrágiles y se altepran cuando se trabajan en suero o en líquido amneótico.

Los resultados de otros autores (IV vol, II, Sección 4, pág,

768) sobre lo anterior son los siguientesá

warburg y Kudowitztrabajaron con fibroblastos, células epi­

teliales y células del corazón, A medida que crece en edad y por latanto en peso, el NCBcae; para 0,1 mgr, 50 y para 0,8 mgr, 14,

(NGR= glucolisis anaerobiótica)

(Khmanomidoempleó como medio suero y en otros casos Ringer

y embriones de pollo, El NGRsiempre fué mayor en 50% en el último

medio (Ringer); no cree que esta anomalía sea debido a alteraciones

del embrión, sinó a un efecto inhibidor del suero que no permite

la intensidad máximade producció%deláctico.)En general el NGRdecae con la edad y ha sido comprobada

con las siguientes experiencias higado de rata (Rosenthal y

Lasnitzki); riñón de rata (por los mismos); embrión de rata entere

y coreon de rata (Nagelein); placenta humana(Ioeser); higado depollo (Tamiya); corazón de pollo " in vitro" (Warburg y Kubowitz)_

embriones de pollo entero (Kumanomido);cristalino de rata y pla­centa (Fujita); placenta de rata (Adler).

Solamente se ha observado en un caso que el NGRaumente con

la edad: retina de pollo (trabajo de lamiya).

La proporción de la glucolisis aerobia puede aumentar o caercon la edad.

sube: higado de rata (Rosenthal y Lasnitzki)

cae: placenta humana(loeser)

embrión de pollo entero (Khmanomido)

Tejidos neoplósicos¡)(III, vol, I, cap, II, pág. 212) War­burg en colaboración con Posener y Nagelein trabajaron con enbriop

nes de tres a cinco dias incubación, La velocidad de crecimiento

es considerable y coincide con la velocidad de los carcinomas

nuevos (Blexner, de rata), lo que interesa a los autores, porque

estas experiencias sehicieron en comparacióncon tumores diversos,

La glucolisis en medio anaerobio

IN2 = mg 3 de GQ? ggggñdg en N3002 mgr, e e31 o, oras

fué por término medio 23,

El embrión forma 9%de StlpeSO, por hora, de ácido láctico

Pero la mismaexperiencia, en aerobiosis, da comoresultado_

que el embriónno forma el écidor'el oxi¿eno lo hace desaparecer,

En los tumores: si se llevan del B2,donde fermenta el azú­

car, al 02,1a glucolisis subsiste en gran parte.Si la actividad glucolitica es una propiedad de las célula?

en crecimiento, tanto el tejido adulto comoel embrionario debe

glucolisar, El reposo del primero es solo aparente y con métodossuficientemente finos_ se encuentra que los tejidos adultos glu­

\‘\\colisan.El tejido conjuntivo adulto tiene metabolismo muydébil‘ E;

el epitelial hay glucolisis anaerobia, lo que prueba que la pro­

piodad de tejido embrionario no desaparece, pero en el epitelio

58

en reposo es diez veces menor que en los epitelios de los tumores,

La glucolisis anaerobia es apenas mensurable,

Ademásde los tumores y del tejido embrionario hay un tercer

estado: el estacionario.

Resumiendodflos tejidos en estado embrionario presentan in­

tensa glucolisis, en anaerobiosis, Respiración del niságégál estadoestacionario presenta pequeñaglucolisis anaerobia phel de los tu­

mores con fuerte glucolisis anaerobia, Respiración pequeña en pro­porción,

(V capitulo VI-V, pág, 225 y 253) PriVando durante varias ho­

ras de GBa las células cancerosas, (24 carcinoma de Flexner, 72

sarcoma de Jersen) pueden ser trasplantadaS¡ Viven pués de la fer­

mentación, (Okamoto).

Puade vivir respirando sin fermentar: cortes cancerosos, en

Ringer dializado hasta desaparición de la glucosa, pero aereados,

presentan respiración y fermentación normal,

Del punto de vista del aprovisionamiento de la energia es

superior la célula cancerosa a la normal, pués mientras ésta tienesolamente la respiración, la otra tiene dos funciones: reapiracióny fermentación,

“Pudicnáola célula cancerosa vivir, "in vitro”,después de

muchashoras de privación de 02,¿.uede crecer,también,an esas con­

diciones y cual es la causa de la energia que asegura tal crecimiento?Wind trató de resolver el próblema por el método de los cul­

tivos, Eliminando lo más completamente el 02, creció durante 48

horas y por lo tanto a expensas de la fermentación, el sarccma de

Rous, el cual "no es más sensible a la falta de 02 que la levadura",

El mismo sarcoma, en cualquier tenor en GBdel medio, ( 95 á

04%)pero en medio pobre de glucosa, crece todavia con 0.007% de

glucosa, pero se detiene con cantidades menores de la misma,

Parece, en resúmen, que en medio privado de 02 las células

normales mueren, las de sarcoma y carcinoma viven durante días,

siempre que el medio tenga glucosa.Con ©2 viven las células cance­

59

rosas, pero sin fermentar,b) La glucolisis intensa de la retina ha dado lugar a dis­

cusiones, El crecimiento ilimitado del tejido maligno no puede ex"

plicarse por su glucolisis intensa, pués la retina de rata lo efec­túa con igual intensidad, (AunqueWarburg cree que "in vivo" este

tejido no debe producir láctico. La retina de rana, por ejempio,

menos sensible, no produce el ácido en presencia de UB,pero poseepoder glucolitico anaerobio considerable, Pentimalli replica, a suvez, que la glucolisis aerobia de la retina de rata es tan elevada

que no es suficiente la explicación anterior).IV vol, II, Sección 4, pág, 767) Los resultados de las expe—'

riancias sobre la retina son los siguientes:

Krebs encontró que la retina embrionaria tenia una glucolisisaerobia igual a 33 y es adulta 130

Tamiyatrabajó en glucolisis anaerobia (aves)

cmmtotal 002 engflg_ ; NGRmgmtejido por hora

FERde la retina en relación con la edad: 8 dias, 35; l5_dias, 45; nacimiento, 85; mayor/gn¿ida pcst-natal; adulto,130;

en la vejez parece bajar, 4 años, 90,Estos resultados demuestran, que en el momentode salir del

huevo, la retina embrionaria produce en anaerobiosis 2C)%de su

peso, por hora, de laciioo y al año en las mismascondiciones el

75 %.

1a rating posee, pués, intensidad glucolitica mayorque

cualquier otro tejido.c) BORFOy CORREA(27) Han efectuado experimentaciones en

tres tejidos: sarcoma fusocelular y adenocarcinomade ra­

.d-ÏGO­

ta y corazón de embrión de pollo; enth eultÍYQQdispuestos

en varios medios gaseosos; aire nitrógeno e hidrógeno y 01

002 formado reducido a 09 y 760 mmy referido a 100 gr. detejido,dosando la cantidad total de C02 producida en 48 decultivo.

Los resultados han sido lfigin acrobiosis los datos con­

cuerdan con los de Warburg. E1 corazón y el sarcoma acudan

cifras similares; el carcinoma menor cantidad de 002,10 queoe atribuye a diferente inten.idad de crecimiento del ulti­no. 29:Bn.anaerobiosis el corazón produce nayor cantidad de

002 que los otros dos tejidos. En este ambiente no hay creci­

miento y se atribuye el resultado a la fermentación tisular,que provoca la escisión de la.glucosa en acido láctico.

En aerobiosis (28) el 002 proviene de las dos reaccio­

nes energóticas fundamentales; 19 respiración; producto decombustión celular y 29,fermentación,que da 002 comoproduc­to final.

El 002 desprondido no informa,puós,sobre los anterioresprocesos independientemente.

En anaerobisis,el 002 proviene en su totalidad de lafermentación y si el corazón desprende en esas condiciones

una mayor cantidad,se atribuye a una mas grande actividad

fermentativa que los neoplasicos,en las condiciones de 1aexperimentación.

Grandes cantidades dosprondidas de 002 se relacionan

siempre con gran desarrollo del cultivo.

En anaerobiosis el desarrollo es pobre o nulq lo queindica cue "in vitro" la fermentación sola es insuficientepara quorhaya reproducción celular.m

’ l, ROFFOY CORREA(29) determinaron

también el cuociente respiratorio de corazón embrionario de

pollo sarcoma y carcinoma de rata,siendo ese cuociente mayorque la unidad en los neoplasicos,1.51 a 2.02,y menor en el

.afil»

corazón,0.79 y Ó;‘i. "La actividad fermentativa láctica eleva

da, caracter pzcdominonto on el metabolismo de los tejidos

neOplasicos,cxwlica con toda claridad tal anomalía.fl 0 L

En cl embrión de 90110,03 el 11 avo

dia'de inoubación,ol punto en ontogonia que comienza ia ser

notable el almacenaje del glucógeno.

Potvin y Araon examinaron dia por día el higado,histo­

quimicanentc’sin encontrar vestigios de 61 hasta el día indi­oado,o uno mas. El aumento es muy rapido después de 14 dias.

Hay otro canbio brusco en el dia 11. ¿En vitro? antes

de ese tiempo,1as celulas del hígado crecen comocpiteliales1

despues comofibroblastos. Y también después dc este día;pe­ro no antes; el crecimiento os inhibidogxgktraoto de levadu­ra,1o que acontece siempre con fibroblastos.

Este canbio,quo aparece regularnentc en ese tiempo,coin­cido con la inflexión y subida rapida de 1a curva del gluco­

I1m. . .H ./bvno H /j/

o 8 0.4 17/,W? fiS o ha 0.58 8 oo m o 0.2 /2; 2° s:m g I ‘ "d “—

H o- . o O vo o 15 179 ll IBTiempo de incubación

Es considerado significativo que,en injertos cerco-alan­toiaeos,el higado despues de este nisno dia 11 no crece.

Por medio de observaciones histoquimicas de ese órgano,explantado, Nordnann pudo ver que el glucógeno es sintetiza­do desde el día 9 en adelante y esa sintesis es independien­

te de la constitución del medio.

Krontowski y Bronstein con tejidos cn creciaionto han

hecho trabajos. Sobre gragncntos de 0.0s a 0.13 mg; por el

mótodo de Hagedorn_Jerson,han dosado azucar en bazo y riñon, ¿ , seco

y comprobado que por dia consumen 4 Jo su peso/para sus no­

.62.

cocidades energéticas,psra una proliferación muyactivaá}lfisreservas en azúcar son consunidaá en cuatro o cinco dins por

las células normales y on menor tiempo por las canccrouss;

Estos autores confirman la ley de warburg.segun la cua1,hohay crecimiento sin glucolisis y la glucosa es la substan­cia que da la energía de crecimiento.

Lc substancia blanca del encófalc consume 15%de azú­

omr en 24 horas, la gris 58 %; ol riñon 40%; el bazo 25 acet; los tejidos cancerosos 45 a 50%.Los fibroblastos de

lu cepa de Carrel queman 0.04 a 0.05 mgr. en dos diasjlos

ribroblnstos recientemente aislados de 0.06 a 0.07 mgr.

Durante los tres o cuatro primeros pasajes,el metabolis­modecrece como intensidad,y,cuando agotan las reservas del

trozo inicial,se vuelve estable. .Alcentrariq "in vivo" laintensidad del metabolismo decrece durante toda la embriogé­nesis.

EOFFO(26) mide la glucolisis por diferencia de 1a glu­

cosa existente ¿n el plasma,entes de poner e1.tejido y des­

pues de 24, 48 y 72 horas de desarrollq,por el método de Fo­

lin y los siguientes son algunos de sus resultad05¡Corazón Crecimiento +++48 horas Disminución % Glucosa

existente 35.14 i

Suprarrenal (¡mbrión 15 días) Crec-.1++48\horas Disminu­ción 7°Glucosa 36.79

Suprarrenal (embrión 15 días) Cree“ +++72 Diáminu­

ción % glucosa274.72

Bazo (embrión 10 días) Crec a+++48 "uk Disminu­

ción %glucosa 70.50 ‘(Riñon (embrión 18 días) Crer +++48 \Disminu­

ción % glucosa 42.26 a

Riñcn (embrión 18 días) ‘Crec.«+++72 Disminué

ción % glucosa 80.64

Hígado (embrión 18' días) Cree +++48 Disminu­

ción % glucosa 35a. 1-­Sarqoma fusooelular de rata Crec -+24 ilminue

ción % glucosa 50

Sarcoma fusocelular de rata Crec +++ ¿ü horas Lisminu­

O ps;. J glucosa 60

En un mismoórgano los resultados -ue-e‘ variïr hectant

así,en tres determinaciones diferentes,soï?c corazones con '«

gual crecimiento y a las 48 horas,se 'an ObtuÜidx 23%, 3%y

71%de disminuciózf, pero igualmente se observa q-:e hay órganos

que tienen rna glucolisis más pronu.siadalque otros. El quepresenta mayor poder gluóolítico es el bazo y le sigues en or­

u decreciente timo, oapsula suprarrcncl, riñon, híge o, tu­mor (surcoma fusocelular), corazón.

¡a glucolisis producida esta en relación con determina­

o órgana?. Para la interpretaoi/ de los resultados anterio­p;

rcs,huv que hacer inte"venir el 'a tor crecimiento y a la in­tensidad Lc él deben a‘ribuirsc tr; diferencias de la glucclim

sis,mas que a la especi icidad le tejido. Unaprueba lo da lascii*as altas del bazo o? relaciín son las del hígado 'Ïn vi­

tro" este da escaso deSnrrollog el bazo,contrariamente, da exu­

ber.Lte,tres voces mayorgsi se r.fi‘re al volumen¿cl tejido dc­sarzollado.

La reprodución CCÏM1ÏÏ, según ptrece, es la que regula la

combustión de la gluc sm.

mmmLos experimento: de Loeb mostraicr la gran Sl nifioaoión

“de los iones H y OH¿era los procesos vitales y en particularpara la división celular.

El primer experimento,en que SL estudiaron las :elacien\sentre el crecimiento celular y la r.acción ¿el me ¿Cgfué flecha

por HOTSen 1913. Cultivó sarcoma de gallina y xíbrcblastüs dc

corayín y venaInn un medio compuesto de plasma y solución dc

tornmsol. Observó que en donde se ven puntos rcjcs aparece pron­

oo el crecimiento celular. Cuandomás rápido el csecimionto ma­

yor es la formación de ácido y su acumulación pled” SLI resis­

tiia por la célula durante un tiempo,porque el .esarr ""0 puede

.642?

ser visto,a pesar de él. E1 autor opina que la .ormación de

ácido es característico del crecimiento de tejidos.

FISCHER(8) se propuso conocer, con respectg al creci­

miento de una cepa de fibroblastos cultivaCos "in vitro" lar­

go tiempo, el rol de la concentración del ion H del media.

Los fibroblastos usados derivaban de cwrazón de pollo,

fresco; de cepa de tejido conectivo de uno a dos ¿eses y de

otra cepa de nueve años de cultivo. Usó buffer de SÜrensen (y

demostró primeramente que este no tiene influencia sobre la ve­

lociuaa de crecimiento). Comoel fin de los experimentos era el

estudio, para diversas generaciones, de la mismaconcentración

de H, el cultivo se dividia en dos partes en cada pasaje: unocomocontrol y otro en el medio experimental calculándose elcrecimiento.

Los resultados fueron: la velocidad de crecimiento tiene

su máximoen‘fH 7.4-7.8. Esta velocidad decrece rapidamentecuando se aumenta la concentración de H o de OH. Estos re­

sultados fueron los mismoscon diferentes ácidog ¡Los anionesparecen no tener influencia.

"Si la serie de experimentos era repetida llevando los fi­

br“blastos a un nuevo medio,conteniendo la mismaconcentración

de H que la usada en el culttya preliminar,se observa que elabsoluto aumento del nuevo crecimiento es cada vez menon en el

medio más ácido o más alcalino".

En un medio conteniendo 1a misma concentración de H, si­

guiendo generación tras generación el crecimiento de fibroblas­

tos,se observa que la proliferación se detiene en el sexto pa­

saje a la mayor acidez'PH5.5. A mayor aloalinidad los fibroblas­tos muestran mas resistencia,pero en la mas altaIPH 8.5,crecie­

ron alrededor de 8 a 10 pasajes. j

Las diferencias morfológicas de las célulag debidas a lavariación del medio,no son importantes; muestran solamente másvacuolos en el medio ácido que en el medio alcalino.

LEWISy FELTON(15) Utilizando como medio solución Locke­

Lewis, metodos colorimétricos, cultivos de tejidos conectivos

provenientes de embriones de 5 a 14 días de incubación,ebtie­ne estos resultados:

en‘?H 4.0 a 5.2 no hay mayor crecimiento’pero en general’cuan­do más joven es el tejido embrionario hay.uayor purcenttje de

crecimiento en medio de (en,bajo.

A'PH 6.0 crece al 71%de los cultmbs.; a ïh 7.0 el 88%;

a’en 8.0 el 89%; y a’PB 9.o el 81%. l

Tejido embrionario de 11 o más días,no crecen en'PH 6.0.El desarrollo de‘PH9.0 es pobre.

ObServaron además que el cultivo modifica el medio, a pe­

sar del buffer (mezclas de HCl y NaOHen solución Locke-Lewis).

De tres a cuatro horas despues de sembrado pasa el‘PH de 8.2 a

6.8 y 7.2. De9H.9.0 a‘?H 7.6 - 8.0 y aunque no se hicieron

suficientes ensayos para ccnfirmarlos,parece ser’que cualquie­ra qee fuera l: concentración de H inicial,el cultivo con buen

crecimiento tiende a ser neutro, los que no crecen ligeramenteácieou y Los que después de un crecimiento abundante degeneran

¿un ligeramente alcalinos.

Ha] contradicción entre este trabajo y el de Rous,pero losexplica por la diferencia del medio empleado: plasma, Reus;

Lodke- Lewis,los autores.La concentración del ion H optimo, para tejido conecti­

vo de embriones de pollo de 9 días,es 6.8 - 7.0.

Los autores se preguntan,porque no es este optimo del va­lor del de la sangre adulta del mismo animal. Suponen que (aun­

que no se probaron suficientes cultbnnc a un‘HUdado para deci­

'ïfr el asunto) 89m2". prob able. quea’Im 7.4 (ple esezclïela sangre)

lo mismoque an?) 6.8 7.0,haya crecimiento, si se tiene ercuenta el large margen en que los cultivos crecen. Sin embargo

hay que recordar que se trata de tejido embrionario, probable­mente más capáz que las celulas adultas de adaptarse a ambien»

tes experimentales. Esto se explicaría por la amplitud de limi­tes de le concentración del ton H en que pueden crecer las cé­

lulas. Ye.se dijo,que- en medio mas ácido, el porcentaje decrecimiento es mayor cuando mas joven el tejido embrionario.

Ln ln yema hay gradual neutralización a medida que so desa­

rrolla el embrión, pasando desde el día l al 23 de 4hït1.c e

‘PI 6.4. Suponiendo esto cierto, un embrión de 9 dias se desa­rrolla en un medio mas ácido que uno de mayor edad y en un ne­

dio menos ácido que otro mas joven.

MENDELEEFF(18) emplea pieldgobGYD de embriones de mitad

o dos tercios a término. Inyectando a un cobayo 2 cc de :rotei­

nas heterogenecsel ‘PHdel suero baja. y pasa por una Suriu ora-­

cilaoiones do 9H;persisgentes durante semanas. Basado en este

fenómeno,preparó sueros de reacciones diferentes; obtuvo el me­jor crecimiento en Ph 5.2 a 6.6

Suero fresco de cobayu nuevo PH 7.6 crecimiento ++

" 24 horas despues de inyectar 2 cc leche;PH 7.4 cre­cimiento ++

S ero 4 dias despues de inyección ’PH7.2 crecimiento +++n 7 n n u n n 6.6 n ++++

” 24 horas despues 22 " 5.2 " ++++

Concluye de sus experiencias que "el crecimiento celular

está en relación directa con el valor del TH del medio y que

una.‘g&ída.de este valor favorece la proliferación celular".

Por otra partdïbejar el‘Ph.por medio de ácidos fuertes

muydiluidos no da crecimiento análogo‘ al obtenido por los mó­todos de Mendéléeff5(plasna y suero,de THbajo,obtenido de unanimal al que se le provoca el choc anafiláctico) que es supe­rior.

(El‘?h normal de la sangre venosa esnlgo alcalinaflos li­quidos intersticiales son neutros o alcalinos, es interesantehacerlo notar).

Ebeling supone que la acción del extracto embrionario se

debo, en parte, a que disminuye el'?H.

En cuanto a la cmbriología, para Mendéléeff, la embriege­

.67»Louis evoluciona por la acidificación ¿e los humoros. La pruli»

furación celular,tantc "in vitro" como"in vivofi soria ¿chidoa noidificaoiones. Y todo esta ¿o acuerdo con las observacio­

nes ¿cágguzctti,qui n comprobóla evolución del amarillo Col

huy o, ¡cado el punto dc vista de su'Ph.

MIHAIÏK(19),1o 3131: que Sankarar,ufinaror la: investi­

gaciznos de Lewis y Felton,buscando, no c; creci.itho pysibloeL u: amplia escala dc-fH,sino ol optinc de cada tejido. Mi­halik 5‘ asegura primero que el buffer rc es tóxicoi los de

Clark no lc s::,scgún Lewis)y para el c¿sc particular del te­jido nerviOSO;lc demuestra Sombrandouna serie en solución Lc­

ckc-Lewis sin dextrosa o pcptcza ni buffergquO'Ph es 6.8 y 0­tra serio de la mismasolución pero con 10%de buffer'rh 6.8.Ho encuentra diferencia en el crecimiento de los cultivos de

las ios series.

n número de cultivos e: eso ncdic5con‘?h graduado desde

5.4 a 8.4,nostrarcn su xojor desarrollo 3‘?H6.6-6.8.

A‘Ph 5.6 y 8.2 no se observa desarrollol

Asi comolo notaron Luwis y Feltoq el cultivo tiende a lle­var el medio a su-fih óptimo:

‘ïa ¿el medio 6.2,a las 24 horas 6.4,a las 49 horas 6.6,7.6 n n n 7.2 n n n 6.8

Confirzó tazbien el trabajo de Lewis y Fclton,cs1 tejidoconectivo,encontrandc comoóptimo ?H.6.G-1.0 y limite 5.6 y8.8

SANKARAN(35) Busca el óptimo de‘?H.para creciziento ¿o

filroblastos ¿e _allo. Lleva la :echu de plasza y extracto al

Ph ¿eseadc con buffer Sorensen;(fosfato ácido Cc potasio y N;CH)ox3:ina poricdicancnte el desarrollo y con ayuda de un di­

oroscopio y una cámara lúcida mide sobre papel el aumento

'Ph area Ln diferentes periodo0 horas 12 horas 56 horas 60 horas 80 hwrns

6.6 588 1.413 2.088 2.088 "

6.8 706 1.475 2.695 4.134

/\

nicas y

aaa»0 fluTQS 12 horas 36 horas 60 horas 80 horas

7.2 613 1.958 3.000 5.713

7.¿ -625 1.207 3.765 6.175 11.555

8.0 577 700 1.900 4.700

31‘?“ óptimo es,puos,7.4Conoel desarrollo del tejiflo hace variar el medio,an c­

tra serie dc experiencias,miñc el ïh simultaneancnte con el cro­citzi 02:1:o.

Su técnica consigue en cubrir el coágulo con buffer p ex­

tracto H lospues dc "60 horas de inoubación,1os líquidos sc 31­.an C’ï gigcias cstírilus,para :eñir su TH; nuevo líquido se

agrcgw v Su efectua una medida 12 horas después“. Trabaja concluctrofios ¿e vidrio.

rn con te­H ¿el buffer H del medio H del ECCiO19 jiúo 72 hsin tejido con tejido,60 horas6.776.5 7.0 6.53

30'?» ¡8.1.Hay¿91"ficaoi6n progresiva ¿el :cüio

creciaionto Promediofudel midio con“Ph mediosin ïojido

o 4: 60 72 hórás

6.6 7.0 800 849 2.195 2.195 6.88

6.8 7.25 450 4.803 7.100 7.500 7.16

7.4 7.82 450 4.890 3.800 12.000 7.61

8.00 8.00 230 1.485 1.710 1.710 7.91

Alrh 6.6 el crecimiento cesó a las 60 }: as; a‘Pn 6.8 ¿cb­

pués de 72 horas; axPH 7.4 mucho después Ce 72 horas; a‘PH ¿.Cnuevazentc es inhibido a las 60 horas.

"El creciïiento Cel fibroblnstos es inhitiïo,después de 60

horas,a variaciones de‘?h a aíbos lados ¿e 7.4 - 7.6,tnnto enel alcalino comoen el áciúo".

Entro las experioncias de Mihálik y las ¿e Saakaran hay un:

contardicoión: para cl primero al tejido modifica el vaio,yasua hacia lo ácido o aloalino,tcnliendo alóptimo; para Sankara1se acidifica siempre. Sc podrían explicar por GÏÍJÏGRGÉTJde tác­

uodios de cultivos. Sankaran al sacar >i liquido que

¡69...

sdbrenada,no toma,ya,en cuenta,el 002 emitido por el tejidqque satura el ambiente de la capsula y en parte debe estar di­

Suelto en el plasma,debido a su presión. Por otra parte,Lcwisy Felton hacen notar que en el plasma no difunden bien los io­nes.

KRONTOVSKIy RADZIMOVSKA(14), LEWIS y MICHAELIS (16), RAD­

ZIMOVSKA(21), tienen grabajos sobre influencia de Ph y la nap

turaleza del buffer en la vida de los tejidos. Radzimovskaha

hecho notar y da su teoria al respecto,que los ácidos orgánicosson más tóxicos que los inorgánicos.

CARREL(4) y RUBINSTEIH(52),con metodos eléctricos, obser­

varon la modificación del pu del medio,produoidapor la activi­dad sola del tejido, sin agregado de buffer o substancia algu­na.

Con tejidos neoplasicos tienen trabajos ROFFOy DEGIORGI

(30 y 31) y CHAMBERSy LUDFORD (59)

ROFFOy DEGIORGI(30 y 31) Utilizando el método colorimé­

trico, con cultivos de corazón de embrión de pollo y sarcoma

fusocelular de rata, en un medio compuesto de plasma y rojo cre­

scl al l por 5.000 en partes iguales, comocontroles este mis­

memedio sin tejidos; observando los cultivos,de tiempo en tie:­

po,12 horas,24 horas,3tc.,n0tan que‘?n del medio ileïïialnÓOEQQF

cia mayor :cidez,a medida que se acentúa el crecimiento,mientraslos controles permanecenconstantes.

CHAMBERSy LUDFORDcon células de tumores de rata,(saroo­

ma, carcinoma mamarioetc.)-mediante inyección intracelular de

colorantes,(rojo fenol y purpura de bromocresol) observ6;a%« 1)

ellfh del citoplasma queda entre 6.4 y 7.0 y el del núcleo arri­ba de 7.2;b) herida en el núcleo nc produce ácido dentro de el,

pero el citoplasma herido produce acidez,que hace bajar su'?H a5.8 o menos.

En todo esto no hay diferencia entre células normales o tu­morales

Los cultivos de tejidos de animales adultos son mons resis­

¿Ryu

tcntes que los embrionarios y no sorportan un cambio de mediotan bien.

En solución Locke,con 1%de dextrosa,los tejidos de em­briones viven solo unos diaa pero los adultos no pueden desaprrollar.

La influencia de la concentración de H del medio sobre te­

jidos adultos ha sido estudiada por Bálint y Weiss,usando bazode conejo.

Debajo deng 7.3 no hay migración celular. Más alcalino

que Ph 9.5 no hay formación de fibroblastos. El óptimo es8.1.

Comparándoloscon tejidos enbrionarios,se obServa,que re­sisten menosun desplazamiento hacia el lado ácido. FisCher en­

contró crecimiento aIfiI 5.5. Bálint,con los adultos,no 10 encon­tró debajo de pH 7.3. Pero en lado alcalino es la inversa.

Límite de embrionariospE 9.2" " amfljos " 9.5

"Sumariandolos experimentos,se encuentra,que un despla­

zamiento de la reacción del medio nor:al,en una dirección áci­da,detiene la proliferación y diferenciación de las células de

cultivos de bazo,de animales adultos; desplazamiento en el lado

alcalino aumentaesa proliferación y diferenciación,hasta unpuntc,sobre el cual,ojerce una influencia retardante".

Del oonjunto-de-estas-e;periencias ¿á deduoe’que cuando

más joven es el embrión: sus tejidos se desarrollan mejor enmedios tanto más ácidos.

Y que cada tejido debe tener un pH óptimo particular paracada uno de ellos.

Un trabajo sobre potenciales

de oxi-reducción es debido a HAVARDy KENDAL(10). Hacen notars

primero,que hay un númerode datos contraditorios en los tra­

bajos efectuados sobre anaerobiosis: sarcoma de pollo de Reus

crece, corazón de embrión de pello de 10 días no crece en anue­

-71­

robisosis. (Wind)

Células malignas le dividen a menor presión de oxígeno

que las embrionarias normales (Wright).

Y en oposición a esto: células malignas sobreviven menos

u bajas presiones que las normales (Fischer)

“Se nos ha ocurrido,dicen Havard y Zendal,la posibilidad,

que crecimiento y división de tejidosyen esos experimentos,pu—dieran estar gobernados más directamente por el potencial oxi­

reductor del medio_de cultivo,que por le concentración de 02en 1a faz gaseosa";

Se proponencorrelacionar crecimiento y di'isión,de cora­zón de embrión de pollo,con el Eh del :cdic. Posteriormente,pien—san hacer lo mismocon células de tumores.

Sus resultados fueron: crecimiento y división,se estudiócuando el Eh era mantenido a diferentes niveles. Cuando¿ás ba­

jo el Eh más pobre el crecimiento del cultivo;

le :itosis cesa entre Eh+ 20 mv y - 30 mv; la migración cesaen Eh — 30 mv.

El líquido amniotico,con reapecto al em­brión,es en un princ'pio Hipertónico,luego isotónioo y por úl­timo hipotónico. "El embrión parece ser independiente del ambi­

ente". Las celulas embrionarias de pollo,"in vitro? soportan,por un tiempo5medioshiper e hipotónicos. Para largo crecimien­

to les es necesqrio medio isotónico. La presión osnótica afecta

solamente la migración celular; para Hoguey Willuer;pero no lamultiplicación,según Lambert y Ebeling.

La dilución del plasma con agua destilada da un crecimien­

Tc acelerado (Ebeling, Ruth etc.). Los medios ligeramente hipo­

tónicos son favorables,como el ClNa al 0.5%¡;en un hipertónico,ejemplo ClNa al 1.8% no hay actividad celular (Hogue). Estos

hechos han sido confirmados para los uonocitos y leucocitos" y

de ello resulta que,desde el punto de vista de su presión osmo­tica el tlasma san uineo no es el me'or medio de cultivo"., _ 8 J

._72_

BRUESy MASTER(3) utilizaron, corazón de pollo y rata

e:brionaria,sarcoma de hauoha 180 y tumor de Walker 256.

En medios de distintas presiones osmóticas,no hay dife­rencia entre fibroblastos normales y malignos,en cuanto a e?lasticidad o tensión superficial."La ocasional fragilidad de

los macrófagos esféricos,en xeúios hipotónicos,no han sidoobservadas en ningún fibroblasto."

El crecimiento y nigraoión,de1 sarcoma 180,es más afec­tado que los tejidos ezbrionarios de pollo por cambio de to­-icidafl del medio,en ambasdirecciones.

Segúnciertos investigadores’una dis­minución de la tensión superficial,en o alrededor de las célu­las Vivientes,puede acelerar su crecimiento.

MANGERy HOCHE(17) utilizaron jabones para producir esa

disuinución de la tensión y a‘?H diferentes,por la influenciade esto último sobre el crecimiento y sobre la constitución de

las soluciones de jabon.

Emplearon,co:o tejido,corazoncs de embriones de pollo de7 a 8 días.

Comomedio, plasma homólogo (sin extracto, para evitar su

accion aceleradora de crecimiento) + buffer, o plasma homólogo-+buffer-+oleato de Na.

Algunos Ce sus resultados:

Th=5 . 7

ldía 2 dias 5 días

cultivo sin jabon 5,25 3,25 3.8

con " 5.2 4,25 433

.25.

siendo 2icrecimiento regular; 4,bueno; 6,sobresaliente."La influencia de Ph en de sumaimportancia para el cre­

cimiento. Se observa sobre todo en los cultivos tratados sinjabon".

Se acelera esa proliferación al agregársele. (En diver­

soi ngiEngglgÁ94 el oleato es inhibidor.‘ __.__.a____;'v ' ROFFO(22) ha referido resultados "que tes­

timonian la importábia que tiene la colesterina cn el terre­

no canceroso". Hansido elementos suficientes, diceï(para quedesde los primeros trabajos diera a ese factor la mayor impor­

tancia, tanto en la génesis de los tumores comoen la prepa­ración del terreno canceroso)1as observaciones de orden cli­

nico y etnico relacionado con la constancia del siguiente fe­nómeno:hipercolesterinea muyacentuada en los tejidos neoplap

cicos en relación con los normales e hipercolesterinemia que

lo acompaña, que ya Se manifiesta en forma neta en estados pre­cancerosos.

"Las investigaciones modernas sobre el proceso celular dan

1a mayor importábia,en su desarzllo,al metabolismo de lOs li­

poides". Entre estos, la que parece desempeñarun papel pri­

mordial en el intercambio celulan regulando la permeabilidad

de las membranasy aún el crecimiento de los tejidos,es la co­lesterina.

Utilizando comotejido neoplasico,e1 sarcoma fusocelular

de rata y comonormales,corazónï y pulmón de embrión de pollq

sc ha dosadgfgarte del plasma y luego en otra cantidad en quese cultivó durante un tiempo el tejido en estudio la coleste­

rina,por el método de Gringaut.

La cclesterina disminuye en el medio cultivado,aparecicn­do la máxima disminución con el sarcoma y la menor disminución

con cl.corazón.

"Esta experiencias son un exponente de la estrecha relaciónentre el crecimiento celular y la adsorción de la colesterina".

Nose puede precisar,aún,si “se trata de una función relacionada

-74,.

con la nutrición protoplasmática o de una función puramente

de la membranacelular". Pero se sabe bien,que de la semiperp.méabilidad de la membranadepende el metabolisma de la célu­

la. Y a la colesterina se le atribuye importancia grande en

sus relaciones con la permeabilidad celular."Estas consideracines dan particular interés a la fun­

ción de la membranaen su relación con el contenido de coles­

torina, especialmente en su función de permeabilidad y se com­

prende facilmente que una,variación en la concentración coles­terínica puede traer involucrada una modificación en el qui­mismocelular.

Los resultados,que muestran una relación entre crecimien­

to y colesterina,se interpretancomo un fenómenode nutriciónen dependencia con una aflsorción de la membranacelular.

De,ahí,que a mayor crecimiento de celulas mayor adsorciónde colesterinn del-medio en que estas se desarrollan".

GR¿fi¿5

Szantroch "llamó laatención sobre la necesidad de

un estudio,detenido,de la cuestión,de la distribución morfo­lógica de las materias grasosas en los cultivos tisulares enrelación con la edad y tambien con las propiedades morfoló­

gicas y funcionales( por ej. células musculares epiteliales,hepáticas etc.) de los elementos cultivados".

Comprobóque en tejidos diferentes,pero de embriones de

una mismaedad, 5 a 7 días, "la grasa,contenida en las célu­

las nuevas recien crecidas,presenta un tenor específico parael tipo de células correspondiente, un tenor ya dado y deter­minadopara el tipo celular de tejido".

Rix,en difierente clase de células,ha observado,parcia1­mente,diferencia de distribución ej. los endotelios hepáticosy las células epiteliales se comportandiferentemente.

Levi,basándose en la observación de Szantroch,(con rela­ción al tipo de células existe especificidad en el tenor y

¿1'53­

distribución de grasas) dice,que "ese hechofacilita la iden­

tificación de las diversas células en la zona de movimiento".Skowrony Keller:"existe una notable y constante especi­

ficidad en cierto tipo celular,en cuanto al tamañoy distri­bución de grasas."

Pero Zweibaunestá en contradicción,sosteniendo que la

cantidad y tamaño de las gotas dependen de muchas causas,como

ser,el estado del tejido y el estado físico-químico del cito­plasma sujeto a la influencia de las condiciones externas.

SZANTROCHy ZAKRZEWSKI(34) trataron de comprobar si las

células sarcomatosas,con respecto a la distribución y tenorde las grasas morfolmgicamentevisiblegtienen síntomas carac­terístioos.

Utilizaron tronco de sarcoma de rata de Jersen,cultivadopuro durante tres años y comprobadasu malignidad por repeti­

das implantaciones en animales.

Las disparidad de las primeras observaciones (en unas, pre­

sencia y en otras,ausencia de grasa en las células."in vitro")los llevó a comprobar,que la aparición precoz de gotas de gra­sa en las células sarcomatosas se observa en los cultivos‘cuan­

do el plasma empleado comomedio pertenece a un animal viejo o

es recientemente extraído; cuando se le guarda más de 6 lías;

si pertenece a animales cuya sangre (por razones desconocidas)

no sirve para cultivos; cuando se cometenerrores técnicos(a­plastamiento de explantados eto.) al cultivarlos o se mantienenesos cultivos a más de 38°.

La absoluta ausencia de granulos grasos morfologicamente

visibles es característico para las células del sarcomade Jer­sen. Cultivadas en ideales condiciones no la contienen. Su in­

dice de grasa (débil, fuerte) es un buen indice para juzgar lacomposición justa del medio y el estado de las células sarcoma­tosas.

Sontrariamente,los tejidos normales embrionarios son menos

resistentes, se llenan de grasa muchoantes. En cultivos cardía­

¿fi&=l.

cos de 6 días su adiposis es total: las células están comple­

tamente 1lenas de gotas de grasa, no están delineados clara­

mente los contornos celulares y sus nucleos.Los cultivos de sarcoma de la misma edad no la contienen.

Teniendo en cuenta que 19 "las células normales presentan

siempre un contenido específico, aunque de cantidad variada’degrasa visible"; 29 los sarcomas cultivadas en medios adecuadosno contienen y 39 que estas mismas,en ciertas condiciones,(com­

posición no adecuada del medio) si, la presentan, se llega a 1aconclusión que el engrasamiento de células no es consecuencia

de lesiones de naturaleza general; sino,mas bien,está relacio­nado con una falta o un exceso de ciertas substancias de impor­

tancia capital para el metabolismode grasas.

Parece depender, el experimento con cultivos sarcomatosos,de que estas substancias influyen sobre las células desde el me­dio.

Por otra parte, las células normales de tejidos diferentesy las del mismotipo de tejido,pero de diferente edad y función,tienen grandes desemejanzasglo que hace pensar que las células

poseen,además de estas substancias supuestas, que comofactores'

exógenos influyen en el metabolismo de grasas, tambien fac­

tores endógenos,queen 1a distribución caracteristica de grasastienen rol primordial.

-77.D I F E R E N O IÁA 0 I 0 N 0 E L U L A B

Diferenciaeión. La mayor parte de los conocimientos quese tienen sobre organizadores son originados en experienciascon transplantes. Se sabe que el organizador a) no actua sola.

mente sobre su mismaespecie. Injertos de el pueden provenir

hasta de géneros; familias o sub clases diferentes. b) Su in;

fluencia no es peculiar del labio del blastdpore; otros teji;dos pueden ser injertados en el y usarse comoorganizadores

después de ser “infectadot. e) Requiere tiempo para extender

su influencia. Gerc¿d%l,el eetoderma puede estar determinadopara transformarse en cuerda dorsal y mas lejos permanecer in­diferenciado aún. d) Su influencia exige continuidad. Etc.

Los cultivos “in vitro“ han aclarado algunos puntos so­

bre diferenciación.(ya se citaron varias obserVaeioneezpag.

12).Ademas¡por este mótodb se ha puesto en evidencia el si­

guiente hecho,qu: parece indicar que la diferenciación es in­dependiente de toda influencia nerviosa y vascular: el bos­

queJo que produce el revestimiento epitelial del laberinto,(estudiado por Fell en su desenvolvimiento) de embrión de 3

dias;produce,despuós de lo ó 12 dias de cultivo,todos losconstituyentes de origen opitelial del laberinto auditivototalmente diferenciado. Presentan caracteres histológicos

normales, el organo de Corti,las areas sonoras ete. asi de­sarrollados.

De su naturaleza Ííeieo-químiea se conoce muy poco. En

trozos nmaceradba la región del organizador encontró Spef

mannel poder induetor " No significa este que la laterali­dad del organizador es estereoquimica mas que\citológiea?"

Needham.La sequedad no anula su propiedad,pero si,el frio."La Naturaleza del organizador permaneceinoierta,poro

si esgeomeaparece muyprobable,algo de la especie de una

hormona,un extremadamente significativo puente va ha serpuesto entre los procesos Íísiccaquímicos m sus manifesta­

o 7B .

ciones morfológicas. Aqui,ol hallazgo de Mark,que las regio­nes del organizador narcotizadas inducen perfectamente bien,es de muchasignificación. Hace añcs hubiera sido dificil,

sino imposiblo,concebir una vitamina cristalizada;pero deobtensiín.del ergostenol irradiado hamdeeyirtuadc—talCreencia,

aunqueqelflcambioocurrido por irradiación sea aún Obscur0¡pero

sq es aventunade suponer que,en unffumuro más o menos remate,

se logra obtener el organizafiorhenim amada cristalino... ' n

.. Los bioquímicos sienten que Las rolaciones,entre losprocesos fisico-quimicos y diferenciación y creeimiento.sontan cercanos comopara indicar que las conex;iones causales

entre ellos va ha ser revelado en el futuro ". Needhmm.Crecimiento; diferenciación z respiración. Puede exis­

tir crecimiento sin diferenciación. manteniendohuevos fér­

tiles a la temperatura ambiente,antes de incubarlos,hay sc­1amente crecimiento. Incubandolos entraflorxy 272 hay divi­sión celular pero no organización.

Tambiénse puede ver crecimiento sin diferenciación en

células embrionarias explantadas.

La respiración puede ser separada del crecimiento,segunexperiencias de warburg y calculos de Brody. Una cierta do­

sis de rayos X,sin cambiar 1a respiración ni la fermentación,

puede parar el desarrollo de un embrión de pollo (Hubert).

Dosis mayores,dejando la fermentación inalteradageliminancrecimiento y respiración.

Diferenciaeión z guimiea. 0diettc estudió la influenciade los anincgácidos en la formación de fibras elásticas "in

vitrog utilizando glutatión y diez diferentes amino-acidosen varios tejidos embrionarics de pollo. Eneontró gue sepueden dividir en tres grupos. E1 primero estimula la forma­

ción de fibras elasticas y el crecimiento de los cultivos;el segundo no influye en ninguno. El tercero decrece el cre­

cimiento y 1a formación de estas fibras.En el primero esta la glicocola.

-159 H­

Son.estas observaciones de 0diette,1aa primeras que mues­tran que pueden comportarse diferentemonte varios amino-áci­

doo y en la diferenciación de tejidos "in vitro" pueden serdecisivos.

Con excepción del ácido glutámiec,todos los ¿mino-áci­dos faborablea al crecimiento reducen ciertos compuestosdelHg. Estos hechos indican la significación posible que los

aqino-ácidoc;influyendo ol potencial cai-reductor del medio,pueden tener para el crecimiento y la diferenciación.

Las vitaminaa,según algunos investigadores,pueden es­timular ciertos tejidos con preferencia a otros.(Bisceélie),

'Yaeanotaron.tambión; ciertas opiniones de Juhaaz-Scha­

-80­

CÁPITUID V,

PARTE EÏPE‘RIMENTAL

MODIFICACIONESde la

RESERVA ALCALINL

del medio dc cultivo, provocadas por elC R E C I M I E N T 0

de

T'E J I D 0 S BIO R M A.I.E S Y NZE0 P I.A.S I C 0 S

“ I N V I T R 0"‘

El objeto de la osperimentación ha sido,observar lasmodificaciones que, en la reserva alcalina, produce el cre­

cimiento celular "in vitro", (método de Harrison - BurrowsCarrel,modificada por Roffo.) dejando actuar libremente el

cultivo, sin intervención alguna sobre su metabolismo y de­sarrollo celular o agregado de substancias modificadora deestas.

Se ha utilizado los siguientes órganos: corazón, híga­do y bazo de embrión de pollo y sarcoma fusocelular de rata.

El medio de cultivo: plasma de pollo diluido y extractoembrionario.

T E C N L C A

La técnica ha sido de tallada por Roffo A.H quien dice;;

"se esteriliza una caja en el autoclawe con todo el material

de vidrio que se emplea en las manipulaciones.

Está cubierto por una tapa de vidrio". "En las paredes

hay dos aberturas con mangas donde el operador introduce sus

manos,con guantes esterilizados, de manera,que una vez .cerra­

das,se trabaja en una caja completamenteesteril"."Como reci­

piente para los cultivos,he empleado siempre ventajosamente

saleros cuadradosde cristal". San estos unos recipientes de

paredes gruesa,con excavación esferica de unos 3 centímetrosde diametro. Se colocan sobre la tapa pequeños trozos de teji­

do. eye se cubren con la mezcla de plasma y extracto, que se

introduce con una pipeta a través de un orificio". "Se espera

la coagulación y enseguida se da vuelta la tapa colocándola so­

bre el salero en el cual se ha puesto una gota del líquido deRinger para mantener la humedad.Cuandolos saleros están lis­

tos,se les retira al exterior a través de una puerta lateraly se cierra con parafina " ROFFO. LA CULTURIDE TISSUS NEOPLA­

SIQUES IN VITRO.NEOPLASMES-SEPTEMBRE-OCTUBBE et.NOVEMBRE—DE—

CEMBRE, 1935.

Comoes necesario,por razones después explicadas, agre­gar a cada tapa de salero contidades exactamente medidas de

plasma, lo que es dificultoso hacerlo desde el exterior en laforma antedicha, se encontró más conveniente introducir en la

caja: la cantidad necesaria,manteniéndolo líquido por mediode hielo, es decir colocando el frasco con plasma dentro deun termo pequeño con hielo y cuya envoltura metálica exteriorha sido esterilizada.

Se introduce todo lo necesario: el extracto, el Ringer y

los embriones,saoados del huevo por medio de pinzas esteriles,con la mayor asepsia o los tumores extirpados con la mismapre­caución.

El extracto se obtiene macerando el embrión, agregando Bin­

ger y utilizando 1a parte liquida después de oentrifugada.

El plasma de pollo, homólogopara los tejidos.normales y

heterólogo para el sarcoma, presenta diversas ventajas, entre

ellas, su resistencia a la fibrinolisis de los tumorescance­rosos y que ha hecho tan dificil su cultivo. Se emplea diluído,

con Ringer (los plasmas puros son inadecuados) y proveniente de

sangre de animal joven, pués a medida que aumenta la edad es mas

desfavorable el crecimiento celular. No se ha agregado ningún

anticoagulante o substancia cualquiera, (para evitar accionessobre el cultivo o el plasma), y utilizándolo conforme se ha

-32­

comprobado su esterilidad, o a lo sumomuypocos dias después,

(es decir entre 2 y 4 dias después de la extracción del animal)5lo mismoel extracto anbrionario,que se empleó recientemente /

preparado al efectuarse el sembrado de los trozosyó con 24 ho­ras más o menos. Tanto este como el plasma están asi en mejores

condiciones2 que con larga conservación.

La sangre extraída esterilmente, diluida al medio, o un po­

oo más diluida con solución de Ringerq (CO3HNa0.3. grs., 011139.­

grs., 01K0.42 grs y 01203 0.24 grs. por litro) se oentrifuga.El plasma así obtenido {se mezclan bienCsi pertenece a varios

animales,ya que 1a reserva alcalina tiene que diferir algo entre

los Éïggg% pollos¿ _Igualmente se mezcla aunque provenga de un

mismoanimal,porque las diferencias de las diluciones con que

uno puede haberlo extraido, si no lo hace de una sola vez, pue­de introducir tambien variaciones) y se utiliza.g;_gigmg_plagmg

1 gg mismgextracto para todas las series de testigo y tejidosque se van a comparar. (Se utiliza el mismoextracto porque la

concentración de este_ influye sobre el crecimiento).A cada tapa se le agrega una misma cantidad de extracto

medido con jeringa graduada al vigésimo y luego plasmaotambien

medido en igual forma. Y los mismos para el Ringer del interior

de los saleros. Los que serán testigos sin tejido, los otroscon un mismo número de trozos.

Las proporciones generalmente utilizadas han sido 0.300

plasma, 0.15co de extracto y 0.15co de Ringcrgpor salero y 6trozos de tejido.

Las razones que se han tenido para tomar estas medidas

efiprciales se explicará más adelante. (ver; Variaciones de losvalores,-de la reserva alcalina por modificación de las pro­

porciones de los componentesdel cultivo a,b,o,d,akbficfi)Preparando de esta manera una serie de saleros testigos

\j tantas otras series de igual número comotejidos se vayan

-83­

a comparanjpuestos en estufa 370,56 saca día a dia el núme­ro necesario separando los que presente infección o mal cre­

Cimiento y efectuada la observación micr6s00pioa,se quitan conpinza los trozos de tejido y se reune el contenido total devarios saleros (coágulo y liquido interior) Hasta obtener una

cantidad algo superior(0.500 aproximadamente de mas) a lo quese va a introducir en el VanSlyke,batiendose hasta licuarlo

y que pueda pasar por los orificios de las pipetas graduadas.Se trasvasa a ampolla de decantación,saturandose cdh aire con­tenido 5.5% de CO2.

La saturación con mezcla de aire 002,por desplazamiento

del aire de la ampolla mediante aire alveolar del operador,dió

poco resultado por las diferencias de tensión.j Aunquela saturación con aire alveolar no da grandes e­

rrores,"1a composición no es naturalmente tan constante 00m0la obtenida cuando se usa una mezcla analizada de gas..."

(van Slyke y G.E.Cullen The Journal of Biolégal Chemistry vol30-1917) Se saturo por medio de la mezcla obtenida en un apa­

rato mezcladondespués descripto. Para saturar el plasma se ha

agitado la ampolla 10 minutos, mayor tiempo que el indicado porel método Van Slyke.

Por último,lavado el aparato, quitado el aire de este yde la mezcla agua alcohol octiliccose introdujo 2cc de plas­

ma, 0.500 de agua. alcohol y 05cc de SO4H2al 579cantidad. esta

última,que se ha comprobadosuficiente para descomponer todos

los carbonatOSgpuesto que el plasma toma reacción ácida al

tornasol. \\ \Es necesario medir el CO2liberado-variasxyeces,previap

mente bien agitado,porque por razones desconocidas no se 11--M

bera el máximorápidamente. Ejemplo; primer medida 0.49 se­

gunda medida 0.49¡teroera medida 047,0uarta medida 0.52,quin—

ta medida 0.51 y esto a pesar de haber sido cada una de ellasobtenida después de numerosa agitaciones y de igual número de

veces. En otros Casos ha habido mayor uniformidad.EJempo; CC2

las

.áá.igual a 0.46 0.46 0.46. Se ha tomado comoregla efectuar nume­

rosa lecturas hasta que permanece constante o por los menoefiheta

últimas lecturas scan de menorvalor que las anteriores, como

el primer ejemplo, con lo que se asegura uno que ya se ha ob­

tenida el máximode desprendimiento y que no hay entrada de ai­

re. La lectura es naturalmente el númeromáximo,corregida a 0oy 760?mperono se consideró necesario la corrección de-solubi­lidad.

Se ha encontrado nuohoe inconvenientes al utilizar recipi­

entes grandes,conteniendo todo el material necesario para efec­tuar un dosaje. una infección de uno de ellos inutiliza toda

una experiencia y hace perder gran cantidad de tejido y plas­

ma. Para ponerse a resguardo de estas inyecciones parciales ypoder llevar la experiencia durante los dias necesarios, ha­bria que preparar varios recipientes nás,de reserva,oon el con­

siguiente gasto de trabajo y material. Además,llevando cada

uno muchos trozos, que desde luego no presentarán el mismo

orecimiento,no es posible selecionarlos, conolos ealeroquuesiendo muynumerosos y conteniendo cada uno poco tejido se pue­

den apartar los inadecuados.Además,distribuyendo en estos_pe­

queños saleros, cano se ha explicado, tomand: un número para

cada medida, la pérdida de algunos por infección u otra causa,no afecta mayormentetoda esa medioión.No es necesario,tampoco,

una gran cantidad de saleros; bastan 6 mas o menos para cada

determinación; es decir.(con algunos maspara reserva) se lle­ga comodamenteal tercer dia con unos 25 de testigo y otros tan­

tos para cada tejido.

Los recipientes, mas comodospara efectuar las medidas que

con los saleros, pero no mas exactos, estan formados por dos viw

drios de reloj de lO cts. de diámetro, uno de los cuales llevael Ringer el otro,adosado,para formar un recipiente cerrado yentre medio un vidrio plano circular de menor diametro, que llem

vara el coagulo en su parte inferior, es decir frente ai Linger»

.35;Las proporciones han sido las mismas que para los sulercs;

200 de plasma,lcc de extracto,lcc de Ringer para cada recipienvte, es decir,2alql y en los cultivados además40 trozos (expe­riencias 7 y siguientes).

Las anotaciones de los crecimientos se han hecho comosi­

gue y que es la forma acostumbrada. Comoes una medición relap

tiva, con el solo fin de ver si hay aumentode un dia a otro,

se ha considerado dividido el campodel microscopio en 4 par­

tes (siempre con el mismoaumentopara todas las experiencias).Al total del campocubierto por las nuetas células corresponde

++++ ; mitad del campo++ ; cuando las células recien aparecen,crecimiento incipiente etc.

Cuandoes crecimiento en superficie se puso crecimiento fi­

no; cuando hay diversas capas de células, crecimiento espeso.Ademásse anotó cualquier fenómeno comolicuación del plas­

ma,etc.VARIACIONES DE LOS VALORES DE LA RESERVA ALCALINAFoñ'm'o'ñIFïc-¿ETQNppp; " _"_" "'­" ' COMPONENTE D

’l z i de e t v r a " e

Siendo en resúmen toda la experiencia una comparación, losdetalles han tendido a ese fin por los siguientes medios; la pc­ner en la mas absoluta igualdad de condiciones testigo y culti­vos?entre si y con los que se le comparana diversas horas?etc;

2g dependiendo los valores de la reserva alcalina de muchosfacu

tores, fijar todos estos y dejar solamente depender esas varia»

ciones numéricas del crecimiento celular, que esÏprcpósito deltrabajo. Estas dos condiciones se han alcanzado poniendo/T%ualcantidad en cada salerc o recipiente a compararseáel plasma,

Finger, extracto y númerode trozos. Las razones son las siguien­te;

a) Se puede reunir el contenido de cualquier número de sa­

leros sin que varian las proporciones de sus componen»

tes,pudi¿ndose desechargasialos que presentan infección

-86—

b) Se ha observado que,ha medida que se efectúa el creci­

miento del tejido el coagulo pierde líquidc,e1 cual seagrega al que existe en el interior (Experiencia l BA,

ZO, a las 28 horas, 1.400; 52 horas 1.100; 75 horas 0.5

cc) Estas diferencias no siempre son tan marcadas depen­

diendo de la clase de tejido y del estado del cultivo.

Lo que no sucede con el testigo, por lo menos apreciablemente

(experiencia 2 testigo,a las 22 horas 1.600; 46 horas 1.400; 72horas 1.7cc) y si en algunos casos son estas diferencias algo

mas marcadas(experiencia l testigo,a las 28 horas 1.800; 52 ho­ras 1.3cc; 75 horas 1.5cc) nunca lo es tanto comolos cultivos

ni tampoco son progresivas con el tiempo y dependen de errorestécnicos solamente.

A los cultivos se le suma, a estas variaciones poco gran­

des, unas mayores que tienden a disminuir cada dia mas la can­

tidad del coagulo.

La composición del coagulo testigo y del sembrado ya no sm:

similares. Conteniendo el testigo un plasma mas diluido ya no es

posible efectuar una comparación; por esc se hace necesario 19­

mar en conjunto cgggulg y liguidg del interigr y en consecuencia

se hace necesario medir el Finger que humedaceel ambiente delsalero.

c) Variando los valores du la IGSGTVHalcalina según la dilución

del plasma, es necesario agregarscle el extracto en una propor­ción constante en todas las series a compararse. En esta forma

la proporción plasma diluido, extracto y Ringer de cada salerces absolutamente igual.

La relación plasma extracto igual a 2:1 se ha tomado sola­

mente por comodidad. Pudiendc extraerse el plasma o prepararse

el extracto mas o menosdiluido, dentro de cirtos limites, esobvio que esta proporción puede modificarse. ¿l'pcner en abso­

luta igualdad de condiciones cada uno de los saleros cualquie­

ra que sea el número del contenido de ellos que se reunan para

efectuar una determinación, permanecen siempre esos componentes

en la mismaproporción. En esta ceso particular plasma, extracto,

-33­Ringer,igual 2:1:1, en casi todas las experiencias.

d) Suponiendo que la diferente cantidad de trozos y su di­

ferente tamañopuedan influir en los valores de la reser

va alcalina,se dispuso en cada salero un mismonúmero yde igual tamaño practicamente.

Otras modificaciones nan tenido diferente objeto.

A voluntad del experimentador, la curva de las variaciones de la

RApueden tener sus valores mas o menos distantes,en magnitudes

numericas,de los de 1a curva del testigo y a modificaciones delcrecimiento se podran observar modificaciones correlativas,tam­

bien mas o menos grandes,de esa RA.

Pero si se guarda la condición de que sea el crecimiento

celular el único que la modifica,resultarán curvas que se puedenobtener con diferente aumento,pero absolutamente semejantes. La

forma y no las magnitudes es lo que interesa. (La experiencia 6,

corazón, ha dado los siguientes valores con respecto al testigo;

27 horas 0.04,51 horas 0.04, 76 horas 0.00 Modificando 1a con­centración del Ringer pudieran haberse obtenido valores dobles

o triples Ej; bajadas de 0.08,0.08 y 0.00 respectivamente. En

este segundo caso la curva sería mas clara, con valores numeri­

cos mayores,pero seria semejante a la otra, puesto que han depen­

dido de un mismofactor, el crecimiento.

Es indudable gue hay interés en obtener curvas ggn valoresrand ara ue e tos no ucdan c nfundir e v r acio ­

bidas a errores.ConGirarobjetose Wisin-3m:

a)Considerando que las modificaciones de la RAdel cultivo

con respecto a 1a del testigo deben ser proporcionales e

la cantidad de tejido que actúa, se puso el máximode tro­

zos que pudieran ponerse, sin que sus crecimientos se es­

torben, 14 por superficie formada por lco de coagulo; es

decir, 6 trozos por salero o bien 40 en los recipientesgrandes.

-88­

Para tener esa certidumbre debian haberse hecho experien­

cias,en que,en igualdad de todas las condiciones, especialmen­

tel; crecimiento.solo variara la cantidad delxposos, observan­do entonces las modificaciones de la R4.No se ha hecho esto, penro es presumible la suposición anterior.

Pero debe hacerse notar,que se ha observado que los trozos

que no crecen tampoco actúan sobre 1a RA,solamente lo hacen por

intermedio de su crecimiento. Por lo tanto lo anteriormente di­

oho debe modificarse diciendo,que se ha supuesto que la modifi­

cación es proporcional al número de trozos, pero teniendo ore­cimiento.

b) Introduciendo mayor cantidad de plasma en el Van Slyke,

200, que en realidad,por las diluciones explicadas,contiene a—proximadamente 0.5cc de plasma puro. Efectivamente en esta for­

ma han dado valores, en el testigo, alrededor de 0.46 y en elcultivo 0.34. Con lcc de plasma los valores hubieran sido 0.28

y 0.17 respectivamente.

No se consideró nCCesario introducir una mayor cantidad,loque lo permitía la graduación del aparato¡porque las diferen«cias eran ya bien visibles.

c) Por último cuando mayor sea la cantidad de Ringer delinterior del salero menorSerán las diferencias entre el tes­

tigo y cultivo.

Efectivamente en dos experiencias de oorazón,del mismo

tiempo de cultivo, igual crecimiento y cantidad de tejido, pe­ro uno de ellos-con 0.5cc de plasma 0.15xhe extracto y 0.15ode

Ringer y el otro con las mismas cantidades menos el Ringer que

estaba en la proporción de 0.253y sus correspondientes testigos,

respectivamente con esas dos formas de preporciones, las dife­

rencias entrc testigo y cultivo fueron 0.100 al primer día y

0.1cc a los dos días en el primer caso, y en el segundo paraI

los mismos tiempos 0.04 y 0.04 (Experiencias N9 2 y 6). Lo que

es fácil preverlo; en la primer experiencia,para obtener los200 necesariosgse utilizaron ó saleros,habiendo actuado,por lo

49­tanto,30 trozos. En el otro bastaron 4,con un total de 24 tro­zos.

Usando porta y cubrebobjetos comorecipientes,en vez de sa.

leros,la pequeños de la excavación, no permite que seque en elambiente y hace innecesario el Ringer. Pero estos no presenta

mayorventaja sobre los saleros.¿zaragg

El aparato mezclador se ha armado de esta forma. Consta

de 3 recipientes (¿,B,C,) con boca en la parte inferior. Dos

de capacidad para varios litros (¿,0) y uno de ellos marcado

cada lOOcc (C);el terceroade menores dimensiones (B),con dosbocas en la parte superior o un tapon perforado en dos partes.

Por uno de ellos se le adapta una ampolla de decantaoión ci­

lindriea (D),que tambien se gradúa, por el otro un tubo acc­dado (a) al que se le agrega una llave (b). Tubos gruesos en

igual forma, es decir acodados, llevan las bocas inferioresde los tres recipientes.

Los recipientes (AyB), unidos por medios de cilindros de

goma, pueden poner en comunicación sus contenidos o interrum­

pirselos poniendo en posición horizontal (posición c'y d) o

vertical (posición o; y dÜlos tubos caodados.Se llena con agua la ampolla (D) y es indispensable que

la parte tubular (p) contenga una columna de agua, lo que se

hace por succión; no hay salida de liquido mientras permanez­ca cerrada la tapa superior (e). Adaptada la ampolla (D) al

recipiente (B), interrumpiendo las comunicaciones que entren a

(A y B), se agrega un poco de agua a (A) y se llena completa­

mente (B). El resto del aire,que permanece en el tubo acodado,

(a) es expulsado abriendo (e),lo que deja caer agua de (D).

Cerrado (e y b) se tiene el recipiente completamentelleno,sin entrada posible de aire.

En comunicación la llave (b) con un recipiente de carboni­

cc y tambien de comunicación (a y B),el 002 entra por su pre­

sión y por arrastrc,ya que cl nivel de (B) es superior al (A).

5-0!

-90­

Conviene que los tapones de (B) ajusteimuy fuertemente,para e­vitar entrada de aire cuando pasa el 002 con poca fuerza y por

arrastre,o inversamente,que salten cuandoentra a presión.Cuando el nivel de (B) es inferior a1 de (A) se termina

la operación,cerrando (b) e interrumpiendo las comunicaciones

entre (A y B). En esta forma el recipiente contiene 002 abso­lutamente exento de aire.

Para llevar el gas a presión atmosferica, nuevamenteen

conexión los dos recipientes,(B en nivel inferior a a para e­vitar entrada de aire) se deja escapa 002 por (b )hasta que

se igualan los niveles.

Quitada la llave (b),se adapta al tubo (a) uno de gomacon un tubo acodado a su extremo (g) y se imterrumpen las co­

municaciones (A y B).

Abriendo la tapa (e),la caida de agua desplaza el CO2queexpulsa a su vez el aire de este tubo y vidrio acodadc (g), lo

que es fácil vor,cuando así se ha efectuado, haciendo burbu­jear en agua de barita o hidroxido de Ca y especialmente obser­

vando si hay buena salida de 002. Los diametros de los tubos

(a y g) deben ser mayores que el que forma el agua al caer por

(p),para que pueda ser desplazado comodamenteel mismo volumen

de gas que el volumcn33guaentrante. Si no se observa esta pre­caución, puede fluir melestaddoasu salida y por lo tanto a di­versas presiones.

El tercer recipiente (C) con un tapan con dos perforaciones_

uno,con tubo (K),para entrada ¿e aire, el otro comunicandocon

(B) introduciendojfg). ¿l tubo inferior se lo adapta otro rec­to (j) y se le mantiene cerrado por medio de una pinza (t) que

ajusta la gomaque los une y se llena completamente de agua el

recipiente.Para efectuar la mezcla carbonica aire se saca (t) dejan­

do caer el agua y se abre simultaneamente (e). Por (k) entra

aire y la entrada de agua desde (D) empuja el 002 a traves de

.‘

-9fn(g) (Las comunicaciones A Y B interrumpidas, naturalmente).

Previamente por diversos ensayos y una vez para siempre,

conectado (B y C) cano se acaba de explicar, se graduada la

abertura de la llave (n) de la ampolla (D) con respecto a la

abertura (j), de manera que para cada litro que por (j) sale,

la llave (n) permite pasar 5500 de agua.pantidad que se leenen las graduaciones que llevan (D y C).

Una precaución que hay que tomar y que sin ella puede fal­

searse toda la mezcla, es procurar que quede una columna de a­

gua en el tubo inferior a la llave (n) y sin burbujas de aire

en esta llave seniabierta; lo que se consigue dejando escurrirlíquido al abrir y cerrar alternativamente (e) e inclinando elrecipiente (B) para que estas burbujas pasen a la parte supe­

rior de (D). Si permanecen en la llave o no se forma columna

la salida del agua y por lo tanto la de carbonico es disconti­nua o insuficiente.

Conviene eliminar llaves entre (a y g); lo mismose uti­lizaron t bos en vez de llaves para la parte inferior de (C).

Se han hecho todas las uniones por medio de tubos de goma y

vidrio. En esta forma La entrada del 002 a (C) y salida de a»

gua de este mismorecipiente se efectúa por abertura fijas, lolo que no se consigue siempre con estas llaves de construccióndefectuosa.

Para saturar la anpolla con plasma, se pinza entre (a y g),se desconecta (B) y se conectan los recipientes (A y C) por la

parte inferior,siendo naturalmente superior el nivel de (A).Dejando pasar un poco de la mezcla aire oarbonico para elimi­

nar el aire de (k),se adapta a (k) la ampolla y se hace pasar

un volumen un poco mayor que el que abarca la ampolla.

El pasaje de carbonico es provocado por los desniveles de

(A y C).

Para tener la seguridad que pasa la mezcla por la ampolla,

si así sucede, tapándola a esta, se oeserva que el agua que en

(C) deja de subir,a pesar del ezpuje que le comunica el desni­

—9L

vel. Si continuara la subida sería indicio de una perdida porpor otro lugar.

No se ha preparado una gran cantidad de mezcla, sino una

cantidad suficiente para la experiencia de un solo dia, porqueestas mezclas guardadas por algún tiempo no quedan perfectamen­

te homogeneas. Van Slyke,dice "el análisis tiene que ser repe­tido cada pocos dias, porque el contenido de 002 del gas algu­

nas veces cambia inexplicablemente" VaN SLYKE¿ND CULLEN.THE

JOURNALOF BIOLOGICALCHEMISTRY. VOL. 30-1917". Pero Se ha to­

madola precaución de que el testigo y los cultivos, que Se le

comparaban fuesen saturados de una sola vez. Es decir,que seprepara el recipiente (C) con la suficiente cantidad de mezcla

para las ampollas que se van a utilizar ese día, la que es per­

fectamente homogenea, lo que pudo comprobar saturando dos par­

tes de un mismo plasma con dos porciones de la minha.momclo

(experiencia 4,75 horas).Y no se saturan algunas y luego de efectuar otra mezcla

las restantes que Se le van a comparar. Esta precaución se ha

tomado, a pesar que la llave (n) ha quedado fija y graduadacon respecto a 1a salida de agua por (j)1que por otra parte

es invariable, en la presunción que un accidente,no obServado,hiciera diferir las dos mezclas; con lo quo no se podria ya has

cer comparaciones entre los plasmas.

-93.

APARATOPARA MEZCLAR GASES'

-94...

B R V ’ .

a) A pesar que se agregan a cada salero las substancias

medidas con toda precaución o se utilizan recipientes grandes

con cantidades mayores, y en los que es imposible tener erro­

res de medida, no se consigue recoger las mismas cantidades que

se ponen. En la experiencia L (es uno de los tantos ej;) en quecada salero llevaba 0.3cc de plasma90.l5cc de extracto y 0.150c

de Ringer o sea Scc en total por cada 5 saleros,se consiguió

juntar las cantidades alli indicadas¡2.4 c,c1.6«c,c2.3°%tc.

En experiencia 95en que cada recipiente llevaba 20o de plas­

ma,1cc de extracto y lcc de Ringeraes decir,4cc en total por re­

cipientegse obtuVo335°? Bdlcf, 3.10€ 3.00cc '351CC, 2,2cc,étc.)

Estas diferencias se deben a pequeñas cantidades, imposi­i

bles de tomar, que van quedando en los recipientes; trozos muychicos de coagulos adheridos a los tejidos cuando se sacan...

Y al utilizarse saleros,a lo anterior se agregaron otrosvPara no extremar medidas, que causaría errores mayores, ee han

formado coagulos con cantidades no muy pequeñas; por el tamaño

de estos coagulos pueden haber pérdidas por los bordes,si no Setiene gran cuidado.

Aún con esta última desventaja,las cantidades tomadas dulos saleros no varían,entre si,mucho mas que la de los recipien­

tes grandes, comose ve por los números anteriores y presentan

los primeros, sobre estos, siempre ventajas, ya citadas.Es indud'ble que se toman los contenidos con todo genero

de precauciones; procurando quitar la menor cantidad de coagu­

lo junto con el trozo, absorbiendo con pipetas los liquidos delos recipientes....

Estas diferencias,entre las cantidades conseguiias,no suacentúan preferentemente en el plasma cultivado, o en el tbbti­

go (experiencia 1 2€ día: testigo menor cantidad 1.60c; culti­

vo mayor cantidad 2.5cc - Experiencia 9 29 día ¡testigo mayor

cantidad 31.00; sarcoma menor cantidad 2.200) ni dependen

del tiempo de cultivo (experiencia ó corazónsler dia ¿.5cc,

-95­

29 día 2.3cc, 3er dia 2.50c), con lo que no hay peligro de e­

rrores sistemáticos.Para tener la evidencia que estas diferencias no dan erro­

testigo 75 h)res,se ha tomado (experiencia d¡ al azar un mismonúmero de sa»leros, 5, y comopertenecían a 1a miamaexperiencia y al mis­no tiempo de cstufa,estaban en toda otra igualdad de candicio­

nes. Sus totales recogidos eran, 20o y 2.400. Se saturaron condos porciones de una mismamezcla de carbcnico aire (para

tener la certidumbre tambien de que esa mezcla es homogenea).

Sta RLcorregidos a presión y temperatura normal difirieroren 0.0100.

Estas mediciones,entre cantidades dc igual númerode sa­

lercs,sc hanefectuado en todas las experienciasgpara tener

Siempre una idea del error,(a 0.4cc correspondió en la RA0.010C

no háaiendo obstaculo, una vez medido, se agrega el contenidode otros hasta tener 1a cantidad cómodapara trabajar en el van

Slyke.

(Estando todos los saleros de toda 1a experiencia en igual­

dad de medidas, no es necesario que 1a cantidad que se introdu­

ce en el aparato provenga, testigo y cultivo, cada uno de es­tos de igual númerode saleros).

Las diferencias entre las cantidades puestas y las encon­tradas han oscilado alrededor de lcc dedisminución. Comoesta

disminución aparece tanto en el cultivo comoen el testigo no

introduce errores en la comparación. Es decir,que no se toma

en cuenta las diferencias entre cantidades puestas y recogidas,sino las variaciones entre estas últimas.

Aunque se debian haber tomado mayor número de pruebas,pa­

ra tener la seguridad, 1a rigurocidad de las medidas y las pre­cauciones tomadas para juntar los contenidos de los recipien­

tes, no hacen presumir mayores errores debidos a estas varia­ciones.

b) Cuandose utilizaron recipientes grandes se ha posadoel total del tejido empleado, calculando 1a cantidad que co­

-96­responde a cada uno por división.

Pesar independientemente el contenido de cada recipiente

no es práctico (y desde luego imposible cuando se trata de sa­

leros que llevan pocos trozos)¿l extremar el número de pesadas

se introducen errores debidos a diversas manipulaciones; lo quegana en exactitud de peso se pierde con creces en otra forma;

no se tiene nunca el peso real; pesar el tejido no tiene uti­

lidad pues. Ademas,hayque recordar que se ponen los trozos en

igual número, de muy pequeño tamaño y practicamente del mismo

grandor; este es indudablemente la mejor manera de proceder.

Se tiene igualdad dc peso (lo que es de gran importancia) pormedio de estas últimas condiciones.

Para el conocimiento del número del peso no es necesario;porque no es el fin de este trabajo hacer comparaciones entre

los tejidos,deade el punto de vista de la relación RAy unidadde peso; el conocizientogen este caso,de la cantidad de tejidoshubiera sido esencial.

Lo que se necesita es igualdad,pero no magnitud de peso

y esto se obtiene en la forma anteriormente dicha.

c)En algunas experiencias,como la 5, la RAdel testigo ha

permanecidoigual,practicamente,durante los dias en considera­ción, dentro de pocos centésimos ¿e diferencia,(28horas 03295,

51 horas 0.315, 76 horas 0.318) Los mismos en la 4,1a 7,1a 10,

la 12. En las otras ha variado. Pero es de notar,que de los tres

tiempos observados, dos han permanecido constantes y el tercero

no coincide en las experiencias entre ellas, ni en el sentidode 1a variación, ni en el dia(experiencia 9B;0.34 0.34 y a las70 horas 0.30. Experiencia 8 ;49 horas 0.33; 72 horas 0.324;

97 horas 0.37. Experiencia 1; primero y tercer dia 0.3439egun­

do dia 0.41. Experiencia 2 gsegundo y tercer dia 0.56 y 0.37;

dia 1. 0.44. Experiencia 6; Segundoy tercer día 0.32,dia 1.0.28 etc).

Debe suponorse,entonces,que esta variación no corre pende

a una modificación del plasna, sinó una diferencia en el percan­

-9;teje de 002 con respecto al de las mezclas dc los otros dias.

Comola comparación del testigo con aus correspondientes

cultivos se hacen con una sola mezcla, sin volver a cargar el

aparato y que se ha comprobadohomogenea, esa variación,tanto

en sentido comoen magnitud,es igual para'todos aquellos y Porlo tanto no introduce error en la modificación debido al tejido.

Por otra parte,si fuera una variación real del plasmayloque no es presumible, comose ha empleado el mismopara testi­

go y cultivo, tendría que WEBIÜCUÏtac ien en el de estos últi­

mos y en todo Sentido dando igual modificación. Por lo tanto la

debida al tejido soria independiente de la anterior.

b) Bs necesario disponer un número suficiente de salerospara efectuar los trabajos continuadamente durante los dias que

se quieran llevar las observaciones. Construir las curvas de las

modificaciones biológicas en función de creciniento, efectuan­

do dosajes parciales, unos a ¿eterninadas horas y luego en o­

tre serie de ensayos independientes, anotar las producidas enotro tiempo mayor, no es conveniente. En dos experiencias efec­

tuadas al tercer día¿en una, el cultivo hizo bajar la RLcon

respecto al testige,en le otra fue superior.(experiencia l y 5)Estas diferencias son dificilnento explicables,efeotuadas

por medio de ensayos parciales; no se tiene en esta iorua ante­cedentes de las nodificaiones que hubieran producido anterior­

mente y de la form; particular que hubiera tomado esa curva,

porque,aún en las mas rigurosas condiciones experimentales ¿e

igualdad,los gráficos de las modificaciones puedendiferir enun mismotejido, dependienüo del estado del cultivo en esa ex­periencia particular.

-98­P R o T o c o L ora

v'PEnIENeiA 1

28 horno

Temperatura y presión del día 18° 758 mm

Testigo

Coagulos de 5 ealeroe total 1.8 oc.

Contenido total de ealero(coagulo y

Ringer de 5 ealeroe) total 2.4 cc.

002 leído en el Van Slyke en Zoo. 1 . lectura 0.38,

Lectura máxima a 0° y 76o mm 0.348...

Bazo

Crecimiento [ífá (plnema licuado alrededor deuno de loa trozom.

Coagulosde 5 aaleroa total 1.4 oo.

Contenido total de saleroa(coegulo yFinger de 5 seleros) total 2.5 cc.

002 leido en el vnn Slyde en 200. 19 lectura 0.28ze o.2e,5e 0.28.

Lectura a ogyeomm 0.256..Sabores

Temperatura y presión del día 16° 765mm

Testigo

CoaguJoSGe5 oaleroS total 1.3 cc.

Contenido total de auleroe(congulo yRinger de 5 eeleros) total 1.6 cc.

002 leído en el Ver Slyke en 200. lE_lectura 0.44;2Q 9.43, 390.44.

Lectura a 09 y 760mm 0.41...

Bazo

Crecimiento f//} eopeeo(el plasma licuado alre­dedor de 4 trozos).

Coagulofide5 salercs total 1.100.Contenido total de-5 saleros(ooagulo y ­

Binger) total 2.3 cc.002 leído en el Van Slyke en Zoo. 1a lectura 0.88

2a o.37,53 0.37€.Lectura a 09 y 760mm. 0.554

75 horas

Temperatura.ï presión del día 169 762mm

Testigo

Bazo

Nota

Goegulosde 5 eeleroe total 1.5

Contenido total de 5 celeron (ooagulo y Finger) Ïotal. .800

002 leído en el Van Slyke lavleotura. 0.37,.29-0.57,' 39' 0.37

Lectura a 09 y 760 mm 0.344....

Crecimiento plasma licuado alrededor del tejido;

las células del crecimiento ya no se ven;degeneradouna colonia de infección muypequeña.

Ooagulosde 5 aaleroe (uno de los 5 saleroe con 88 horas

de eatufa) total 0.500Contenido total de 5 saleroe (ooegulo y Binger)total

1.800

002 leido en el Van Slyke en 200 primera lectura 0.27;2a 0.29; 5 0.30; 4a 0.295

Lectura a 09 y 760 mm 0.2799..

Bazo de cnbriones de 14 y 16 dias

Cada ealero contenía 0.500 de plasma diluido, 0.1500a

de extracto, 0.1500 de Finger.4 trozos de bazo por calera.

:NOGAALasdemás experiencias,lleVan la misma forma deanotación.­

"EXPERIENCIA 2

22'horas

Testigo

Coáguloa de 5 salerosContenido total de 5 saleroe

002

.A 02 y 760

Corazón

Crecimiento

179 y 761 mm

1.600

2.200

0.46 0.46 0.48 0.47

0t443..

unos no crecieron,otroe crecimiento in­cipiente, el resto J

Coáguloe de 5 ealeroaContenido total de 5 ealeroe

002

A 00 y 760

HígadoCrecimiento O

Coáguloe de 5 Boleros

Contenido total de 5 ealeroe

002

A 09 y 760

46 horas

Testigo

Coágulos de 5 ealerosContenido total de 5 saleroe

002

A 09 y 760

Corazón

Crecimiento ¿fiar

Coágulos de 5 saleroeContenido total de 5 Boleros

002

A 09 y 760

Hígado

200

2.500

0.37 0.34 0.57 *\_

0.342 OOO

Bco

2.8000a58 0.37 0.37

0.351..

199 y 757 mm

1.400

Zoo

0.37 0.40 0.390.364...

1.800

2.700

0.88 p.27 0.29 0.29A 0.264.“L

Crecimiento; incipiente,otroe #,algunoe 0 y todos cre­cimiento pooo espeso (pocos trozos conplasma licuado a su alrededor)

-lOl­

coágulos de 5 ealeroa 1.1 coContenido total de 5 saleroa 2.200

002 0.32 0.31 0.82

A oe y 760 0.291,.72 horas

209 y 752 mm

Testigocoágulos de 5 ealeroa “11.700

Contenido total de 5 saleroe Bco

002 0.595 0.42 0.41 0.39

A 09 y 760 0.578...Corazón

Crecimiento; igual al de 46 horasOoáguloa de 5 saleros 1.100

Contenido total de 5 aaleros 200002 0.30 0.31 0.32 0.30

A 02 y 760 0.288...

NOTA: Cada galera contenía 0.300 de plasma diluido,0.lóccde extracto y 0.15 de FingerCada aalero con cultivos de corazón contenían 5 trozos

W I h fl fl H ll 6 nD- n - Q- . o q-—d

-102­

EXPEDIENOLg 3

27 horas209 y ‘760 mm

Testigo

Ooágulos de 4 saleroe ‘s 0.900

Contenido total de 4 saleroe 2.800

CO2. 0.28 0.28 0.30 0.29

l 09 y 760 0.273...Baza

Crecimiento; # fino (plasma licuado alrededor dealgunos trozos)

Coáguloa de 4 saleroe 0.7oo

Contenido total de 4 ealeroa 8.600

ooz 0.24 0.24. 0.24 0.26 0.25

A on y 766 0.236.“

Testigo “ulbom i99 y 760mmCoágulos de 4 saleroa 0.800

Contenido/Égtïlsaleroa 200002 0.2.7 0.27 0.30 0.80 0.29

.A OR y 760 0.29d...

Bazo

Crecimiento; plasmaliqmqkp alrededor de los trozos.Coáguloe de 4 Boleros 0.600contenido Total de 4 saleros 8.500

002 0.55 0.35 0.54 0.36 0.36

A oo y 760 0.32976 horas

188 y 763 mm

Testigo

Coáguloa de 4 ealeroe(2 sale 8896 horas de estufa)total 0.700Contenido total de'4.saleros 2.100002 0.25 0.25 0.26 0.26

A og y 760 0.240....

Enzo Crecimiento; gig}. (En general no eepeaogplaemalicuado alrededor de algunostrozos)

01,03­

Ooáguloa de 4 saleros o;7bototal

Contenido/do 4 aaleroa 200002 0.49 0.49 0.47 0.52 0.51

A oc y 760 0.480...

Cada aalero contenía 0.300 de plasma diluido,0ü500'deextracto y 0.2500 de agua en el interior de los sa­loros.Cada ealero con oultivo;oontenía 4 trozoaBazo de embriones de 16 días.­

-104­

EXPERIENCIA 4

27 horas16° y 765mm

Testigo

Ooágulos de 5 saloroa (Los totales no fueron anotados)Contenido total de 5 saleros ' " " "

002 0.39 0.405 0.40

A 0° y 760 0.378...

Hígado.0reoimiento o en?%gcostrozos incipienteCoáguloa de 5 aaleros (Los totales no fueron anotados)Contenido total de 5 aaloros " "

002 0.38 0.38

A 0° y 760 0.354...

Baza

Crecimiento: ##fiá finoOoáguloa de 5 ealeros “¡1.900

Contenidoígga% aaleroa 2.700002 0.53 0.35

A 0° y 760 0.308...52 horas""“”' 16° y 761mm

Testigo

Ooágulos de 5 saleroa 1.500

ContenidO/dgtglsnloros 2.200002 0.42 0.425 6.425

A 0° y 799 0.594...

Hígado

Crecimiento; o plasma licuado alrededor de los trozosCoágulos de 5 saleros tot’l 1,700

00ntenidoÉÉgag saleros 2.700002 0.39 0.45

A 0° y 760 0.417.0n

Bazo

crecimiento;++++_.finoOoágulos do 5 snloroa 0.900

Contenido/dgtñlsaloros 2.00

-105­

002 0.30 0.52 0.52 0.51

A 0° y 760 0.29775 horas

Testigo 16° y 757mm

Goágulon de 5 snleroa 2 oo

Gontenido t otai de 5.sa1eros 2.4 oc

.02 0.45 0.45

A 0° y 760 0.415..4

Testigo_ l

'¿áágulos de 5 saloron 1.2 co

aontonido latal'db 5.3aleros 2.09002 0.46 0.46 0.46

A 0° y 760 0.424..

Bazo

Crecimiento; ttttíünz.oáguloa de 5 saleros 9.8 oo

lfióntcnido total de ¿osaleros 1:6 co002 0.34 ¿.34

A o° y 760 0.514“­

NOTA:_0adaealcro aontenía 0.5 oo de plasma diluido,0.15 óode extracto y 0.15 de Binger.—

Bazo de embrión dé 16 días.­

-106­

EXPERIENCIA 5

28 horas

TestigoCoágulosde 5 salerosContenido total de 5 saleros

002

A09 y 760 mm

crecimiento f! finoCoágulosde 5 salerosContenido total de áïfialeros

002

.A 09 y 760 mm

51 horas

TestigoCoágulosde 5 aaloroo

Contenido ÉOÜAILÓQ5 aaleros

002

A 02 y 760 mm

Bazo

Crecimiento

Coágulosde 5 saloros

Contenido total de 5 saleros002

A 02 y 760 mm

76 horas

TestigoOOÉguloSde 5 saloros

Contenido total de 5 aaleros

002

A 09 y 760 mm

229 y 755 mm

1.200

200

0.525

0.295...

1.500

2.800

0.26 0.250.252...

0.26

219 y 753 mm

1.800

2.300

0.35 0.34

0.514...

¡f y ¡ff Íino,plaama licuado alrededor detrozos.­‘1.loo

l I1.800

0.31 0.31 0.131

0.278...

239 y 749 mm

0.700

1.900

0.355

0.318,.a0.35 0.35 0.36

Baza - 2.07­

Crecimiento, igual al do 51 horas.­Ooágulosdc 5 maloros 0.800

Contenido/ágtglaaleros 2.400002

A09y760m0.30 0.305 0.29 0.29

0.269...

dada sqloro contenía 0.300 de plasma diluido,0.l5ec doeXtráctó y 0:15cc.de Ringer.­Bazo de embrión de 16 díaa.¿

-108—

EXPERIENCIA 6

27 horas20° y 757 mm

Testigo

.GoáguIOSdo 4 saleros .0.6 oo. totalContenidO/ dev4 saleros 2.2 oo002 0.51 0.31 0.31 0.31

Corazón

Crecimiento (2 trozos no crecieron)Goáguloa de 4 saleros 1.2 co

_ totalGenten1d0/de 4 aaleros 2.5 oo

S} I

602 0.27 0.27 0.27 0.a?A 09 y 760 mm . 0.244...

2u44523yï 219 y 755 mm ._«Testigo

'ÓoáguIOSde4 saleros 0,566tataí 1 ­ContenidO/ a. fifihergg ¿.4oo

002 0.56 0¿55 0435 0¡54

A 0° y 760mm 0.523 ...

Corazón

Crecimiento ¿ff

GoágulOSde4 saleros 1.200tContenidO/ Séaí silence 2.300002 0.51 0.315 0.515

A 0° y 760 mm 0.233...

76 horas23° y 750mm

TestigoOoágulosde 4 saleros 1.00

. fiotíl 2 5Contenidg,ee oalerca . co002 0.36 0.565 0.55

A oo y 760mm 0.323...

Corazón

CrecimientO' f}; (Un trozo no creció)

Ooágulesde 4 saleros 1.500ot, _

Contenido/tae ¿341sala-(.3 2.oeo

NOEA:

-109­

A o° y 760 mm 0.318."..­

Oada salero contenía 0.300 de plasma d11u1d0,0.15de extracto y 0.2500 de Finger.­Oorazón de embriones de 14 a 16 días}­Los saleros cultivados,contenian 5 trozos.­

-llO­

EXPERIENC IA '7

Todas las exporioncias,en adelantc,oetan en oapsulaagrandes quo contienen zoo de plasma diluido, leo de extrao­

to y loc de Ringer.

Testigo

Ooraáfin

Baraona

Testigo

Corazón

24 horas

Temperatura y presión del dia 25°y 756 mm

Finger 0.5 oo

Total (l ooágulo y Ringer) 2.9 co

002 de 2 oo leído en el Van Sly150_34 y 28‘91345

Lectura.máxima a 0° y 760 mm l 0,30'7....J Y

Crecimiento ¿"í

1 colonia de infección pequeña; se observan glóbulos.Binger 0.5 co

Total (l coágulo y Binger) 3 co

002 de 2 co 15 0.25, 23.0.25

Lectura máxima a 0° y 760 mm 0.223...

Crecimiento incipienteFinger 0.4 oc

Total (l ooágulo y Ringor) 3.2 co

002 do 2 oc la 0.27, 23HO.28, 3° 0.26

Lectura máxima a 0° y 760 mm 0.249

47 horas

Temperatura y presión del dia 26° y 756 mm

finger 0.3 ccTotal (1 ooágulo y Finger) 5 co

002 de 2 co 1? 9.34; 29 0.34lectura máxima a 0° y 766umm 0.298...

Crecimiento H“muy fino

(se observan glóbulos)

Binger lco

Sarcoma

Testigo

Sarcona

-lll­

Total (1 coágulo g Ringer) 5 cc

002 (le 2 cc 1Fl 0.245; 2°" 0.23

Lectura maxima a OPy 760 mm 0.215...

Crecimiento Á! y 8 trozos de é

(plasma lleno de cólulac;aapecto menoolimpio ue elde 24 h.3

Binger 0.6 cc

Total (l coagulo y Finger) 2.9 cc

002 dc 2 cc 1a 0.25; 2“ 0.25

Lectura a 0° y 760 mm 0.219...96 horas

Temperatura y presión del día 27° y 754 mn

Binger 0.5 cc

Total (1 coágulo y Binger) 3 cc

002 de 2 cc 1“ 0.34, 2“ 0.36; 39‘ 0.33

lectura máxima a OP y 760 mm 0.513-oo

Crecimiento ¡fé espeso

(plasma lleno de células pero aspecto limpio)Finger 1.3 cc

Total (coágulo y Bingof) 3.00

002 de 2 cc 13 0.54; 23 0.33

Lectura máxima a 0° y 760 nn 0.29­

Oada cápsula cultivada con corazón contenía 40 trozossarcoma

excepto la utilizada a las 96 horas que contenía 55Peso de cultivo utilizado para el total de cápsulao

(oarcoma)

0.2692 gr. Termino sodio de cada cápsula 0.2692j/. 4:0.0675

Pcao de cultivo utilizado para el total de capsulasCorazón)

0.4862 gr. Termino medio de cada cápsula 0.4862j/. 4:0.1215

-112­

4 cápsulas para corazón, 4 para sarcoma y 4 païa toa­' tigo.Cada cápsula contenía 2 co do plasaa diluido, 1 oodo extracto y 1 oo do Bingor.A laa 72 horas ol orocizionto del sarooaa ora de

esposo y 01 corazón esposo do í/ y algunoa ¡KK

NQT¿;Lasexperiencias siguientes,11evan la mismafor­ma de anotación que las anteriores.­

-113­

EXPERIENCIA 8

49 horas19° y 761 mm

Testigo

Finger 0.300Total Soc

002 0.36 0.36

A 0° y 760 0.329 ...

Sarcoaa

Crecimiento i f'

Bingor 0.700Total 5.100

002 0.25 0.25

A 0° y 760 0.228...

Corazón

Crecimiento f f

Finger 0.600Total zoo

002 0.25 0.25

A oP y 760 O¿228...

8 horas—__"‘ 2105 y 7563:)

Testigo

Finger 0.200Total 5.200

002 0.36 0.36

A 0° y 760 0.324

Sarcoaa

Crecimiento -# J espeso

Finger 0.900Total 3.106

002 0.31 0.51

A 0° y 760 0,27%,...

Corazón

Crecimiento f f

BingorTotal

002 ‘

A 0° y 760

Testigo

BingorTotal

002

.A 0° y 760

Saroona

NOTA

Orocinionto

FingerTotal

002

A 0° y 760

H

-ll4—

.97 horas

0.400

3.200

0.27 0.26 0.270.243...

210 y 757

0.41 0.41

004.35

El corazón,llovaba 26 trozos por cápsula" sarcoma

0.200

2.800

0.369...

1.400

5.400

0.44

0.596...

alrededor de 30 trozos por cápsulaPeso total del tejido empleadopara 4 oápaulaa-Oorazón­

4 II0.2504 gr.-Sa.rco:n­0.1852 gr.

Término medio por cápsula del poso del tejido-Corazón­" fl

0'. 0626 gr.-Saroona­o. gr.

Oorazón de embriones do 14 Gian.­

“d‘ó - . _ —nun-L­

Testigo

Hígado

FingerTotal

002

A 0° y 760

Crecimiento

BingerTotal

002

A 0° y 760

Corazón

Crecimiento

FingerTotal

002

A 0° y 760

Sar002a

Oreciniento

FingerTotal002

A 0° y 760

Testigo

Hígado

BingerTotai002 \

A OP y 760

Crecimiento

Finger

-115­

EXPERIENCIA 9

25 horas21° y 758 un

0.500

5.500

0.56 0.58 0.370.343...

O

0.900

3.100

0.28

0.253...0.27 0.28

incipiente0.400

8¡1cc

0¿23 0.24 0.24

oo oJ

0 y en nlgunoe‘trozos incipienteO¿Gcc

Soc

0¿27 0827 0.28 0.28

0.253...

¿9_Q922224° y 757 nn

1.503

3.190

0.38 0.39

0.546...0.59

f fino

-116­

"K Total 300

002 0.29 0.29

A 0° y" 760 0.257...

Saroona

Crecimiento 'fnf' (de 10 a 15 trozon;sin creeiziento)

Finger 0.800

Total 2.200002 0.25 0.26 0.26

A 0° y 760 0.231...

79 horas26° y 755 nu

TestigoBinger 0.600Total 2.800

002 0.345 0.545

A 0° y 760 0.302...

Hígado

Oreoiuicnto degenerado

Ringor 2.500Total 5.100

002 0.36 0.37 0.36

A 0° y 760 0.524...Corazón

Crecimiento í fi. :Iuy fino

Finger 1.300Total 3.100

002 0.38 0.37

A 0° y 760 0.55Baraona

Crecimiento 7‘.71 algunou 0

Finger leñeeTotal 2.409

002 0.54 0.3.5 0.34­

A0° y 760 o._

-117­E1 ocluzdn llevaba 80 trozos por cápsula" hígado " 27 n n w' sarcoma " 28 ” " "

Poao total dol tejido ozmloadopara 4 cápsulas-Corazón­O.4296 gr.

u I a n N " 4 " -Híga.do­' 0.5618 gr.

” " " " 4 -Sarooma­o. gr.Embrionea de 14 dinn.­

-118­

JKZEEWIENCIA 10L

Zé horac22° y 756 nn

Testigo

Bingo: 0.500

Total 8.200

002 0.41 0.41

A 0° y 760 0.367...Sarcoma

Crecimiento % f

Ringcr 01500

Total 3.20c

002 0.25 0.26

A 0° y 760 0.233...

¿Lima21° y 755 mm

Testigo

Hingcr 0.300

Total 3.100

002 0.38 0.38

A 0° y 760 0.341%.

Sarcoma

Crecimiento f fino aspecto degenerado

Bingo: lcc

Total 2.700002 0.26 0.26

A 0° y 760 0,253...Corazón

Crecimiento 14 esposo y 10 trozos w' espeso thlplasma se observan globuloe rojos

Ringor 0.700

Total 2.800‘

002 0.50 0.30

A oo y 760 0.269...72 horno

210 y 755 mm

-119­

Testigo

Finger- 0.100Total 300

002 0.38 0.39 0.39

A 0° y 760- 0.350...Corazón

Crecimiento 9 trozos (lo 24.94%:ol resto de 73111108 os­peaoa otros no.­

Binger 1.700

Total 3.100

002 0.23 0.28

A 0° y 760 0.260...

ngggz Peso total del tejido empleado para 4 oápsulas-Sarooma­0.2572 gr.

" 4 ' -00razón­0.4806 gr.

Corazón do embriones do 20 días.:

-120­

KPERIENCIA 11

24 horas25° y 751mm

Testigo

Finger 0.300Total 2.900

002 0.46 0.46

A 0° y 760 0.403...Sarooma

Crecimiento á fiFinger 0.300Total 2.900

002 0.32 0.51

A 0° y 760 0.280...

48 horas26° y 750 mm

Teotigo

Binger 0.500Total 2.800

002 0.45 0.46

A 0° y 760 0.400...Sarcoma

Crecimiento 1/3 del número de trozos ¿é el reatorÉ

Bingor 100

Total 500

002 0.33 0.34 0.35 0.53

A 0° y 760 0,364...72 horao’“‘“‘ 25° y 755mm

TestigoFinger 0.300

Total 5.100002 0.58 0.59

A 0° y 760 0.347...

Sarcomn

Crecimiento 0

Finger 0.500

Total

002­

A 0° y 760

Cada cápsula

-1?l­

0.23 0.24

llevaba alrededor de 54 trozos.­

300

0.215...

Testigo

Ringerïotal002

A 0° y veo

Corazón

Greci2iento

RingerÉotul

002

A 0° y 760

Eeetigo

Binger

Total002

A 0° y P60

Corazón

4.22-r

BSPERIENCIA 12

JD horas28° y 754m2

0.6 oo

5 00

0.56 0.37 0.35

ooo

inoipiente(ue observan globulos r ­Joa en el plasma.­

0.7 co

5.2 oc

0.25 0.24 0.230.207

43 horaa fl29° y 753mm

XQ.5 oo

g;loc0.54 0345 8\55

0.2g9...\

\\

Crecimiento ¡.; Iino.-(So observan glóbulos ro;

FingerTotal

002

A 0o y 760

Testigo

FingerTotal

Corazón

Jos;_)1.100

2.900

0.26 0.245

0.223...72 horas

31° y 753mm

0.300

300

0.38 0.36 0.37'0.323...

-123­

Crecimiento ¡HA- eE-Lom (Se observan glóbulos rojos)

Singer 1.500

Total: 2.3uo002 0.44 0.47 0.44

A o°y 760 0.399...96 horae

Corazón

NOTA:

Crecimiento Á/ÉÁ¿espeso DegeneradoCada cápsula llevaba 27 trozos

1)Él crecimiento celular hace disminuir 1a reserva alcalina

del plasma que contiene tejido con respecto a1 plasma testigo.

El Valor numérico de esta disminución puede hacerse variar

a voluntad,modificando las condiciones experimentales.Fijada la magnitud de estas modificaciones para toda una

determinada experiencia,quedan las particularidades del crecimienw

to comoúnica causa de variación¿Se observa,entonces,lo siguiente;

2)Algunos tejidos,como el bazo y el corazón,inician su creci

miento visible muyrapidamente¿(menos de 24 horas).

El sarcoma es más variable;puede iniciarlos antes de las24 horas comotambién alrededor de las 48 horas.

E1 higado tarda siempre más de 24 horas,como puede obser­

Varse con las experiencias 2 y 9.

Las determinaciones efectuadas en el higado y en algunos

casos de sarcoma/revelan,que la disminución de 1a reserva alcalinaes previa al crecimiento del tejido (Exp.2 y 9-higado-).

3)A partir del primer dia la RApermanece«cunetantapdurante

2 6 3 días.

4)Luego aumenta la RA,progresivamente hasta‘áfiífifiínangualar6 sobrepasar los valores del plasma testigo.

5)En un pequeño porcentaje de experiencias no se observa eso

ta estabilización,habiendo aumento de 1a RAen el segundo dia con

respecto al primero (experiencias 3 y 12).

Dependedel estado del cultivo,como lo prueba el hecho que

fué observado también en el bazo,que es el que precisamente mantiee

ne más tiempo su equilibrio.(Ho se hicieron suficientes experien­cias para comprobarlo en todos los otros tejidos,pero es evidente

que asi puede suceder.6)En algunas experiencias estas estabilizaciones dan cifras

muyconstantes)variando apenas entre cantidades comprendidas desde

-125­

de 0.0100 o de 0.0200 ej. (experiencia 2, corazón, dis­

minución con respecto al testigor22 horas 0.100; 46 horas 0.100;72 horas 0.09cc.)

En otras,oscilandentro de centésimosxgjm( exp. l, bazo,disminución con respecto al testigo;0.09, 0.056, 0.065)y sinmggïrgral microscopio ninguna particularidad que las in­terprete. Seoonsideranequilibrios porque estas oscilacionescaben dentro de errores aceptables; su disminuciones o aumen­

tos son muypequenos en comparación con la generalidad de las

experiencias (exp. 9 sarcoma, 2do dia disminución de 0.115; 70

horas iguala al testigo); no tiene una orientación determinadacomoen la experiencia 8 (sarcoma) que varia dentro de valores

no muygrandes,pero siempre en aumentohacia el del testigo.5) E1 bazo es el que mantiene mas largo tiempo este equi­

librio; sobre q experiencias,en 3 no se notaba.á% tercer diaindicios de subida en la RAaEn el corazón sucedió esto 3 veces

(experiencias 2,8 y lo). Sarcoma, una Vez. Del higado se hicie­

ron pooasexperiencjas pega hacer porcentajes.O) La fi 31 se mantiene en equilibrio mientras hay cre­

cimiento visible ej. (experiencia 6, 76 horas, RAalta; cre­cimiento detenido desde las 51 horas. Experiencia 9, sarcoma,

70 horas,RA ya muy alta; crecimiento detenido después de 46

horas. Experiencia 9, higado, 70 horas,RA muyalta;crecimiento

en decadencia después de 46 horas) o dura mas después de cesar1a proliferación ej.'(experiencia_4, bazo, Ser dia RAen equi­librio; crecimiento detenido después del primer dia. Experien­

cia ll, sarcoma, 72 horas RAen equilibrio; crecimiento en de­cadencia después de las 48 horas) pero ngngg_gggggta_gign1;as;ngx

_prgliggrggién, 'Hubouna sola excepción inexplicable-experien­cia 12 sobre el total; pero es de observar,que al 4to dia pre­

sentaba degeneración grasa

NOTA.Algunas experiencias aisladas efectuadas en diversos cul­

tivos demuestran que en ingualúad de peso el bazo produce una

mayor disminución ¿e le RA, El escaso número de experiencias re­

alizadas impiden, por ahora, generalizar esta afirmación

-126­

DL‘2‘CUSJ'QHmv. ¿gs ¿LISUL'Z“Jos

Sobre reserva alcalina en cultivos,norbdflfigggfgágfifigggggbadocitado en la bibliografia mundial.

Recordando las relaciones existentes entre RAy concentra­

ción del ion H,esinteresante comentar los resultados obtenidos en

las experiencias efectuadas sobre pH "in vitro".

El conjunto de estas últimas pueden clasificarse en varios

grupos: a) pHintrecelular,b)modificación es del pHdel tejido c)relaciones entre pHy naturaleza quimica del buffer con relación

a la vida de los tejidos, d) influencia del pH del medio sobre el

crecimiento,e) modificaciones del pHdel medio por efecto del cre­cimiento.

En los dos grupos últimos,existen algunas experiencias que

pueden relacionarse con el presente trabajo y a los cuales se ana­lizará.MIEALIK(19)prepara medios de cultivo a diversos pH,desde 4.8 a

más de 7.8 y alli siembra,observando las modificaciones por el méu

todo colorimétrico.

Los tejidos cultivados en medios con pH 6.6-6.8 presentan

el mejor desarrollo;luego,eseng es su óptimo.

Cualquiera que sea el pH inicial,cae o sube,a pesar del

buffer,para alcanzar en más o menos tiempo ese óptimo.

Si el pu inicial no es muyalejado del óptimo,empieza un

equilibrio desde el segundo dia.Si coincide con el valor óptimose mantiene estable desde un principio.

RUBINSTEIN(32) dice"después de 24 horas se puede comprobar una

caida marcada que varia con los cultivos;parece que depende de la

velocidad del crecimiento y puede ser también de la naturaleza del

tejido cultivado.Después la caida del pH se moderapara llegar a

una especie de qquilibrio o mostar pequeñas oscilaciones."

" En los cultivos envejecidos,parece que el pHpuede algu­

nas veces subir un poco."

-127­

CONCLUSIONES

I)Bn el plasma conteniendo tejido,se obtiene una disminu­

ción de la reserva alcalina dentro de las primeras 24 horas.

Esta disminución no se observa en el plasma testigo,e3

decir,sin tejido.2)A partir del primer dia y mientras dura el crecimiento del

tejido,1a RAqueda estabilizada.3)La RAaumenta al detenerse la proliferación celular o po­

co tiempo despuéa.En algunos casos,el aumento iguala y hasta puc­

de sobrepasar el valor original44)Los gráficos,construidos mediante los datos obtenidos con

diferentes tejidos muestran curvas similares. 2 t!

E4/

W”

-123.

BEEQMEN DE LOS PBQIOCOLOS

Plasma diluido,extracto y Ringer = 23121

T B T C H

Trozos(a) 4 5 6

l día 0.348 0.256 0.443 0.341 0.351

2 " 0.410 0.354 0.364 0.264 0.291

3 " 0.344 0.280 0.378 0.288 e.fi¿¿

Experiencia l Experiencia 2

T H B T B

Trozos1 dia 0.378 0.354 o.áb8 0.295 0.2322 " 0.394 0.418 0.297 0.314 0.278

3 “ 0.425 ----- 0.314 0.318 0.292

Experiencia 4 Experiencia 5

T C S T S . C

Trozos(89 40 40 30 261 día 0.307 0.223 0.249 . . . . . . . . . . . . . -­2 " 0.298 0.215 0.219 0.329 0.229 0.229

3 u ---.- . . . . . . . . -- 0.324 0.279 0.2434 " 0.313 ----- 0.295 0.369 0.396 ----­

Experiencia 7 Experiencia 8

T H c-' s

Trozos 27 30 gg_1 dia 0.343 0.253 0.216 0.253

2 " 0.346 0.258 -:--- 0.231

3 " 0.302 0.324 0.333 0.307

Experiencia 9

NOTA:(a) número de trozos por salero.­

(a!) ll ll il cápsula .­

T S T S T C

Trozos 34 27

1 dia 0.367 0.233 0.403 0.280 0.320 0.2072 " 0.341 0.233 0.269 0.400 0.304 0.296 0.223

3 " 0.350 ----- 0.347 0,214 32 9

Experiencia 10 Experiencia ll Experiencia 12

Plasma diluido 0.acc,extracto 0.15cc y Ringer 0.25cc

T B T g

Trozos ________á___ _Ú____._____1 dia 0.223 0.236 0.281 0.2442u3 " g¿g4o 0,480 Q¿323 Q¡318

Experiencia 3 Experiencia 6

NOTA.los gráficos se han construido de la siguiente forma: Tomando

comovalor la Ra del plasma del primer dia de experiencia, se ha

trazado una recta, Es decir, sin tener en cuenta las pequeñas os­

cilaciones experfimentalesde ese plasma (testigo),

Se ha construido la curva del plasma cultivado,tomando los

valores que dan la resta de las dos reservas alcalinas (plasma tes­

tigo y plasma cultivo)que se están comparando,

Enlos gráficos la linea discontinua es el testigo,

Si." III¡#difl ___aii-555255132535

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Trazo de tejido sin crecimiento.

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Cultivo de sarcoma fusocelular de rata. 48 horas de

crecimiento, «y.

1

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