conservación de la gallina de chulilla
DESCRIPTION
Charla sobre el estado del programa de conservación de la Gallina de Chulilla. Diciembre de 2007.El programa se basa en caracterización productiva (huevos y crecimiento), caracterización genética con microsatélites y creación de un banco de semenTRANSCRIPT
ProgramaPrograma de conservación de conservación de una población de de una población de gallinas autóctonas gallinas autóctonas
valencianas: valencianas: Gallina de Gallina de
ChulillaChulilla
Amparo Grimal Proyecto INIA RZ2004-00040
IntroducciónIntroducción
Programa de conservación de una población de gallinas autóctonas valencianas: Gallina de Chulilla
•A. Alcaide población de animales de la localidad de Chulilla
•Consellería de Agricultura Pesca y Alimentación (V. García-Menacho y B. Peris) conservación
Cría a partir de huevos fecundados en:
Mas de Noguera (J. Pons)
Teularet (E. Mateu)
•Julio de 2005: llega al C.T.A. la población del Teularet
¿Edad? ¿Parentesco?¿Producciones?¿Censo?
Reunión 9-11-2004: malos antecedentes reproductivos
Teularet, 1ª incubación: 170 huevos 15 pollos (sobreviven 2♀ y 5♂)
Esa semana comenzaba otra incubación (sin datos)
Mas de Noguera, 2ª inc.: 140 huevos 18 pollos
Hay 20 animales jóvenes de 2 incubaciones
Programa de conservación de una población de gallinas autóctonas valencianas: Gallina de Chulilla
Objetivo 1Objetivo 1
Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla, definiendo su patrón
morfométrico y sus posibles variantes. Elección de reproductores
Objetivo 2Objetivo 2
Rejuvenecimiento de la población con vistas a su conservación in situ.
Propuestas de manejo para reducir las tasas de consanguinidad
Objetivo 3Objetivo 3
Conservación ex situ constituyendo bancos de semen y de células
blastodérmicas como un seguro de cara a posibles accidentes para permitir
su reconstitución y para el mantenimiento de la variabilidad genética en
caso de pérdidas parciales
Objetivo 4Objetivo 4
Caracterización genética parcial con una batería de microsatélites, no sólo
para el estudio de la variación intrapoblacional y sus aplicaciones, sino para
estudiar las posibles relaciones con otras poblaciones ya caracterizadas
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Objetivo 1Objetivo 1Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla, definiendo su patrón morfométrico y sus posibles variantes. Elección de reproductores
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Actividad 2: Elección de reproductores
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
•Medidas zoométricas (longitudes, ángulos): fichas
•Características fenotípicas (color, brillo)
•Información sobre los huevos
•Archivo fotográfico individual
•Caracterización productiva
•Control de puesta
•Curvas de crecimiento
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Caracterización básica
•Conformación ligera (tipo mediterráneo)
•Pluma negra (con reflejos verdosos)
•Cresta sencilla
•Orejilla roja o blanca rodeada de rojo
•Pata pizarra, 4 dedos
1389 g
1.194 g
20sem
2.100 g1.174 g554 g39,5 gHembras
2.800 g1.680 g717 g41,5 gMachos
Adultos16 sem8 sem3 díasEdad
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Gallina
•Negra o gira plateada
Gallo
•Variedades
•Negros (genotipo EE)
•“Giros” con esclavina plateada (alelos ER y S) o dorada (ER y s+) y plumas de color pajizo en la silla
Pollitos
•Apareamiento al azar: 91% negros con diferentes fenotipos
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Control de puesta
Gallinas salas (datos a fecha 31-03-06)
•Número de hembras: 30 gallinas
•Número de huevos: 1.817
•% Puesta: 43,33%
•Puesta media diaria: 12,8 huevos/día
•Puesta Anual Estimada: 155,68 huevos/gallina y año
•% Rotos: 1,01% (18 huevos)
•Peso medio: 57,52 g
•%S: 11,94%
•%M: 70,85%
•%L: 15,86%
•%XL: 0,5%
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Puesta Anual Estimada
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
10/11/2005
24/11/2005
08/12/2005
22/12/2005
05/01/2006
19/01/2006
02/02/2006
16/02/2006
02/03/2006
16/03/2006
30/03/2006
Huevos/
galli
na y
año
Control de puesta
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Peso medio del Huevo
52,00
53,00
54,00
55,00
56,00
57,00
58,00
10/11/2005
24/11/2005
08/12/2005
22/12/2005
05/01/2006
19/01/2006
02/02/2006
16/02/2006
02/03/2006
16/03/2006
30/03/2006
gra
mos
Control de puesta
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Categoría huevos
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
10/1
1/200
5
24/1
1/200
5
08/1
2/200
5
22/1
2/200
5
05/0
1/200
6
19/0
1/200
6
02/0
2/200
6
16/0
2/200
6
02/0
3/200
6
16/0
3/200
6
30/0
3/200
6
%
% S
% M
% L
Control de puesta
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Control de puesta
Pollitas (10 plazas entre 27-2 y 30-6)
•Edad al empezar el control:
•Entre 16 y 23 semanas
•Edad de entrada en puesta: 19 semanas (algunas 16)
Puesta semanal
0,00
0,501,00
1,50
2,00
2,503,00
3,50
4,00
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
edad
nh
uev
os
po
r p
oll
ita
y se
man
a
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Evolución del peso medio del huevo
35,00
40,00
45,00
50,00
55,00
60,00
65,00
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
Edad (semanas)
gram
os
Control de puesta
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Curvas de crecimiento
•10 animales por macho (lotes 8 a 16, 2 ♂ por lote)
•Control del peso individual (Francesch, 2006)
•Semanalmente hasta las 13 semanas
•15, 17, 19 y 21 semanas
•24, 28, 32, 52 y 72 semanas
•Animales en control: 156
•22 bajas en 1ª semana
•14 bajas resto de semanas
•9 sacrificios por coccidiosis
• TOTAL: 111 animales
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Pesos Lote 8
0
500
1000
1500
2000
0 5 10 15 20 25 30
semanas
gram
osCurvas de crecimiento
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Crecimiento Medio
0,00
500,00
1000,00
1500,00
2000,00
2500,003
d1
s2
s3
s 4s 5 s
6 s 7 s
8 s
9 s
10 s
11 s
12 s
13 s
14 s
15 s
16 s
17 s
18 s
19 s
20 s
21 s
22 s
24 s
28 s
32 s
semanas
peso
(g)
HMTotal
Curvas de crecimiento
Actividad 1: Caracterización morfológica de la Gallina de Chulilla
Objetivo 1: Caracterización morfológica
Actividad 2: Elección de Reproductores
•Al ser una población envejecida: poco % de eliminaciones
•Objetivo: 50♂ y 50♀, no emparentados
•Asignar aves en función de su aspecto:
•Dos lotes de 15 gallinas cada uno
•Testados 19 (+2) ♂
•Información molecular
Objetivo 2: Conservación in situ
Objetivo 2 Objetivo 2
Rejuvenecimiento de la población con vistas a su conservación
in situ. Propuestas de manejo para reducir las tasas de
consanguinidad
Actividad 3: Rejuvenecimiento de la población con vistas a su conservación in situ
Actividad 4:
Propuestas de manejo para reducir las tasas de consanguinidad
Objetivo 2: Conservación in situ
Actividad 3: Rejuvenecimiento de la población con vistas a su
conservación in situ
•Malos antecedentes reproductivos incubar TODOS los huevos
•Recogida de huevos desde el 27-7-05
•Sin restricciones de peso (sólo se eliminan muy sucios y rotos)
•Sin desinfección
•6 incubaciones con nacimientos entre el 28-8 y el 26-10-05
•Huevos almacenados hasta 14 días (Abad, 2003; Campo)
•Incubadora para 216 huevos y una nacedora
•Determinación de las fertilidades y mortalidad embrionaria por embriodiagnosis (50,77% mortalidad en últimas fases del desarrollo)
•Tras 6 lotes 214 pollitos (91% negros)
•SIGUIENTE FASE: lotes de medios hermanos
Objetivo 2: Conservación in situ
plumón
66,6722,2211,1188,787,978,07191L6
50,7727,6921,5476,785,165,2214328TOTAL
53,3326,6720,0080,587,570,56288L5
47,0617,6535,2968,583,156,93765L4
50,0050,000,0069,289,762,11829L3
0,0050,0050,0090,087,078,31823L2
50,0028,5721,4336,468,725,0832L1
Pollito formado
Polito con
EmbriónIncubabilidad
FertilidadNacidos (%)
Pollitos Nacidos
Nº Huevos
Lotes
Mortalidad embrionaria
Parámetros reproductivos en los 6 primeros lotes con apareamiento al azar
Actividad 3: Rejuvenecimiento de la población con vistas a su conservación in situ
Objetivo 2: Conservación in situ
Actividad 4: Propuestas de manejo para reducir las tasas de consanguinidad
•Primer objetivo: maximizar el censo efectivo
•Baja relación reproductiva
•Descendientes de todos los individuos
•Reemplazo de reproductores: selección intrafamiliar
•1 hijo por cada M y 1 hija por cada H
•Conservación asistida por marcadores
¿Qué propusimos? ¿Qué hacemos?
¡Más parques!
Testando todos los machos: Familias de medios hermanos
Sólo podemos asegurar el padre
¿Pruebas de paternidad?
Objetivo 2: Conservación in situActividad 4: Propuestas de manejo para reducir las tasas de consanguinidad
Familias de medios hermanos
•Dos lotes con 15 gallinas cada uno, vamos testando gallos
•Gallina almacena el semen del gallo durante varios días:
•3 semanas desde que recojo huevos de un ♂ y he retirado el anterior
•Lotes de pollitos cada 4 semanas
•Testados 19 ♂:
•Lotes 8 a 17: 10 lotes (cada lote 2 ♂)
•Incubándose huevos de dos machos más
•Valoración de los gallos:
•Fertilidad
•Crecimiento de sus hijos, puesta de las hijas.
•Reemplazo: sólo aseguramos paternidad
•Hembras: todas las que “cumplan el estándar”
•Machos: al menos 3 (por seguridad)
•Pruebas de paternidad
Objetivo 3: Conservación ex situ
Objetivo 3Objetivo 3
Conservación ex situ constituyendo bancos de semen y de células
blastodérmicas como un seguro de cra a posibles accidentes para permitir
su reconstitución y para el mantenimiento de la variabilidad genética en
caso de pérdidas parciales
Actividad 5: Extracción de semen
Actividad 6: Congelación de semen. Constitución del banco. Material macho
Actividad 7: Constitución de criobanco de células blastodérmicas. Material
Hembra
Objetivo 3: Conservación ex situ
Actividad 5: Extracción de semen
•Recogida de semen por masaje dorso-abdominal con “ordeño” de la cloaca
•Valoración en laboratorio:
•volumen, aspecto, concentración, motilidad masal
Objetivo 3: Conservación ex situActividad 5: Extracción de semen
•Prueba de inseminación en fresco•Dilución 1:1 •Diluyente IRTA ( Na glutamato, glucosa, Mg acetato, K acetato y PVP)
Objetivo 3: Conservación ex situ
Actividad 6: Congelación de semen. Constitución del banco. Material macho
• Dilución 1:1 con diluyente Lake 4º, 30 min
•Glicerol hasta el 11% (con solución Lake con 22% glicerol) 4º, 30 min
•Envasar en pajuelas de 0,5ml y congelar:
•De 4ºC hasta -35ºC a -7ºC/min
•De -35ºC hasta -140ºC a -20ºC/min
•Descongelación:
•Baño de agua, 4ºC, 3 min
•Resuspender pajuelas en medio Lake 7.1
•Centrifugar para eliminar el glicerol
•Resuspender pellets en Lake 7.1
Objetivo 3: Conservación ex situ
Actividad 7: Constitución de criobanco de células blastodérmicas. Material hembra
•Protocolo de Kino y col. (1996)
•Criopreservación de células del blastodermo en estadío X
•Donantes para constituir animales quimeras que mediante cruces de
machos y hembras quimeras darían animales de la raza de las células
criopreservadas
Objetivo 4: Caracterización genética
Objetivo 4Objetivo 4
Caracterización genética parcial con una batería de microsatélites, no sólo
para el estudio de la variación intrapoblacional y sus aplicaciones, sino para
estudiar las posibles relaciones con otras poblaciones ya caracterizadas
Actividad 8: Toma de muestras. Extracción de DNA
Actividad 9: Genotipado de microsatélites
Actividad 10: Filtrado y análisis estadístico
Objetivo 4: Caracterización genética
Actividad 8: Toma de muestras. Extracción de DNA
Toma de Muestras
•Muestras de sangre de todos los animales 78 muestras
•Punción en vena del ala
•Jeringas de 2ml
•Almacena en Vacutainer con EDTA
Objetivo 4: Caracterización genéticaActividad 8: Toma de muestras. Extracción de DNA
Extracción de ADN
• Metodología:
a) Aplicación del protocolo de extracción
b) Electroforesis horizontal con gel de Agarosa
• Comprobar si hay ADN
• En cada pocillo: 10 µl muestra+ 3µl Azul (Ficoll, Azul Bromofenol, Xylenocianol)
• Correr el gel a 100v, 30.45 min
c) Cálculo de la concentración de ADN
• Homogeneizar concentraciones
• Alicuotar
• Congelar
Objetivo 4: Caracterización genéticaActividad 8: Toma de muestras. Extracción de DNA
Protocolo de extracción
1. REAL PURE SPIN KIT
•200-300 µl de sangre total
•No funcionó, se coagulaba la sangre en el paso 2 (pruebas, protocolo de tejidos):
•Tras incubar 200µl de sangre, 10 min a 70ºC, con 200µl de Tampón de Lisis/unión y 20 µl de proteinasa K, añadir 100µl de Isopropanol
•Causa: Las aves tienen los hematíes nucleados.
2. PROTOCOLO DE ANGUILAS
•40 µl de sangre total
•Reactivos:•Tampón de Lisis I (Tris-HCl, EDTA)•Tampón de Lisis II (Tris-HCl, EDTA, SDS)•Proteinasa K•Solución de precipitación (NaCl)•Isopropanol•Etanol•Tampón de Elución (500µ)
Objetivo 4: Caracterización genéticaActividad 8: Toma de muestras. Extracción de DNA
Concentración de ADN
•Dilución 1:100 (10µl de ADN nativo + 990 µl de TE)
•Espectrofotómetro: A260 no coincidencia de lecturas sucesivas
•Bioespectrofotómetro (lee a 230, 260, 280 y 320; y calcula la concentración)
•Concentración media: 199,11 µg/ml
•Recorrido: 56,8 – 622,5 µg/ml
•Cantidad neta media: 95,57 µg
•Recorrido: 27,26-298,8 µg
•Igualar concentraciones a 50 µg/ml
•100µl de ADN nativo + TE hasta conseguir 50µg/ml
•Congelar ADN nativo
Objetivo 4: Caracterización genética
Actividad 9: Genotipado de microsatélites
•FAO (2004) batería de 30 microsatélites, en 7 multiplex:
•1: ADL0278, ADL0268, LEI0094, MCW0248, MCW0216
•2: MCW0081, MCW0034, MCW0069, MCW0222, MCW0295
•3: MCW0111, MCW0037, MCW0016, LEI0166, LEI0234
•4:MCW0183, ADL0112,MCW0014
•5: MCW0165, MCW0020, MCW0123, MCW0104
•6:MCW0078,MCW0067,MCW0330,MCW0098
•7: MCW0206, MCW0103
•Sin información: MCW0284, LEI0192
•Proyecto AVIANDIV: 22 microsatélites, 52 poblaciones europeas
•Objetivo: caracterizar genéticamente la población (heterocigosidades, equilibrio H-W), cálculo de distancias genéticas con otras poblaciones
•7 muestras testigo del proyecto AVIANDIV y 24 muestras de Castellana Negra
Objetivo 4: Caracterización genéticaActividad 9: Genotipado de microsatélites
PCR
•Reactivos: 50 µg/ml de ADN, primers 20µM, Master Mix (Taq, dNTPs, Cl2Mg), H2O
•Volumen:20 µl
•Termociclador:
•2 min, 94ºC
•35 ciclos de amplificación:
•1 min 94ºC
•1 min 60ºC (58º, M4)
•1 min 72ºC
•10 min 72ºC
•4ºC, almacenar (congelamos)
Objetivo 4: Caracterización genéticaActividad 9: Genotipado de microsatélites
SECUENCIADOR
Secuenciador CEQTM 8000 Beckman Coulter
•Placa, en cada pocillo:
•10 µl PCR
•30 µl SLS (Sample Loading Solution)
•0,2 µl DNA Size Satnadard Kit-400
•Aceite mineral
•Placa con Tampón
•Jeringa con Separation Gel-LPA I
Interpretar la lectura del secuenciador
Objetivo 4: Caracterización genéticaActividad 9: Genotipado de microsatélites
SECUENCIADOR
0
2 5 0 0 0
5 0 0 0 0
7 5 0 0 0
1 0 0 0 0 0
1 2 5 0 0 0
1 5 0 0 0 0
1 7 5 0 0 0
1 3 5 1 4 0 1 4 5 1 5 0 1 5 5 1 6 0 1 6 5
M 3 . 6 0 . D 0 9 _ 0 6 1 0 2 3 1 4 F B
S i z e ( n t )
Dye S
ignal 134.68
136.68
136.83
137.73
137.96
138.96
139.04
140.07
140
141.18
142.15
142.27
143.33
143.39
144.43
145.52
145.58
146.61
147.65
147.72
148.74
148.82
149.91
150.81
151.87
152.96
153.51
153.95
155.68
156.79
157.77
160
Verde: MCW 0016
Negro: MCW 0037
Objetivo 4: Caracterización genéticaActividad 9: Genotipado de microsatélites
SECUENCIADOR
0
2 5 0 0
5 0 0 0
7 5 0 0
1 0 0 0 0
1 2 5 0 0
1 5 0 0 0
8 0 8 5 9 0 9 5 1 0 0 1 0 5 1 1 0 1 1 5
M 3 . 3 6 . D 0 6 _ 0 6 1 0 2 3 1 4 F 7
S iz e ( n t )
Dye S
ignal
79.11
79.86
80
80.81
82.84
84.77
86.73
87.47
88.37
90
99.22
100.23
100
101.28
102.27
110.92
MCW 0111
Objetivo 4: Caracterización genéticaActividad 9: Genotipado de microsatélites
RESULTADOSAmplifican 21 microsatélites
•Probando los que no amplifican con más ciclos de PCR
•Problemas con algunas multiplex y testigos
•Analizando los testigos
12LEI0192s/i
39MCW0206, MCW01037
73MCW0078, MCW0067, MCW0330, MCW00986
68MCW0123, MCW01655
69MCW0014, MCW01834
65MCW0111, MCW0037, MCW00163
21MCW0295, MCW0069, MCW00342
36MCW0278, MCW0216, MCW0248, LEI00941
Muestras analizadasAmplificanMultiplex
Objetivo 4: Caracterización genéticaActividad 9: Genotipado de microsatélites
RESULTADOS PRELIMINARESMultiplex 6
0,0161
0,3468
0,0565
0,5645
0,0161
Frecuencia
254
255
256
257
258
0,0078
0,1405
0,0859
0,0078
0,0234
0,1016
0,0156
0,0625
0,4063
0,1484
Frecuencia
256
257
258
259
268
269
276
277
288
289
0,2031
0,0156
0,4766
0,0938
0,1953
0,0156
Frecuencia
171
172
173
174
177
178
0,0859
0,0859
0,1172
0,6250
0,0703
0,0156
Frecuencia
134
135
138
139
140
143
F(255-257)= 0,5484F(257-288)= 0,2031F(171-173)= 0,3125F(139-139)= 0,4844
Ho: 0,3710
Hoe: 0,4426
Ho: 0,2656
Hoe: 0,2294
Ho: 0,25
Hoe: 0,3158
Ho: 0,6094
Hoe: 0,4243
Alelos (5)Alelos (10)Alelos (6)Alelos (6)
MCW0098MCW0330MCW0067MCW0078
Objetivo 4: Caracterización genética
Actividad 10: Filtrado y análisis estadístico
Villafr
Chulilla0
Bresse
Castell
•Calcular
•Frecuencias alélicas
•Heterocogosis observadas y esperedas
•Equilibrio H-W
•Distancias genéticas
•Nei
•Cavalli-Sforza
•Reynolds
•FST
•Genepop, Phylip, Dispan, Biosys-1, etc.
ProgramaPrograma de conservación de conservación de una población de de una población de gallinas autóctonas gallinas autóctonas
valencianas: valencianas: Gallina de Gallina de
ChulillaChulilla
Amparo Grimal Proyecto INIA RZ2004-00040