CONCEPTOS BÁSICOS DE ENZIMAS

ENZIMASCONTENIDOS

ENZIMAS. Generalidades. Cofactor. Coenzima. Clasificación. Principios de la catálisis enzimática. Características de la acción enzimática. Factores que regulan la cinética enzimática. Inhibidores enzimáticos. Modelo cinético de Michaelis- Menten. Enzimas alostéricas . Catálisis ácido- base, covalente, por iones metálicos. Zimógenos. Sistemas multienzimáticos . Distribución intracelular de enzimas.

GENERALIDADES

Las reacciones químicas se realizan en los seres vivos a gran velocidad, en condiciones muy moderadas de temperatura, pH, presión, etc., gracias a la existencia de catalizadores denominados enzimas. Las enzimas se caracterizan por su notable eficiencia y su extraordinaria especificidad.

La gran mayoría de las enzimas son proteínas, también existe ARN con actividad catalítica (ribozimas). Algunas enzimas son proteínas simples y otras, proteínas conjugadas asociadas con otra molécula no proteica, de pequeño tamaño, la coenzima o cofactor. En función de su naturaleza se denominan:

1. Cofactor. Cuando se trata de iones o moléculas inorgánicas. (Cofactores). Algunos cofactores entran a formar parte del sitio activo y son integrantes de la proteína enzima (metaloproteínas) ; otros al parecer, establecen un enlace entre la enzima y el sustrato.

2. Coenzima. Cuando es una molécula orgánica. Aquí se puede señalar, que muchas vitaminas funcionan como coenzimas; y realmente las deficiencias producidas por la falta de vitaminas responde más bien a que no se puede sintetizar una determinada enzima en el que la vitamina es la coenzima.

Fig. 3. Se observan ejemplos de cofactores.

Fig. 4 . Se observa el complejo holoenzima, constituido por todos los componentes antes nombrados. (Holoenzima )

HOLOENZIMA = APOENZIMA + COENZIMA Enzima total Proteína No proteínica Termolábil Termoestable

No dializa

Coenzimas comunes

Nombre Vitamina correspondiente

Pirofosfato de tiamina TIAMINAFosfato de piridoxal PIRIDOXINABiotina BIOTINAFlavina adenina mononucleótido (FMN) RIBOFLAVINAFlavina adenina dinucleótido (FAD) RIBOFLAVINANicotinamida adenina dinucleótido (NAD) NICOTINAMIDANicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP)

NICOTINAMIDA

Coenzima A ACIDO PANTOTÉNICO

Acido tetrahidrofólico ACIDO FÓLICOCoenzima B12 VITAMINA B12

CLASIFICACIÓN

Clase 1: Oxidoreductasas Clase 2: Transferasas Clase 3: Hidrolasas Clase 4: Liasas Clase 5: Isomerasas Clase 6: Ligasas

PRINCIPIOS DE LA CATÁLISIS ENZIMÁTICA

Las enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. En una reacción catalizada por una enzima:

La sustancia sobre la que actúa la enzima se llama sustrato. El sustrato se une a una región concreta de la enzima, llamada centro activo. El

centro activo comprende (1) un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y (2) un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción

Una vez formados los productos la enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reacción

Fig.1. Esquema de reacción enzimática. Se observan los distintos pasos de activación y sentido de la reacción.

CARACTERÍSTICAS DE LA ACCIÓN ENZIMÁTICA

La característica más sobresaliente de las enzimas es su elevada especificidad. Esta es doble y explica que no se formen subproductos:

1. Especificidad de sustrato. El sustrato (S) es la molécula sobre la que la enzima ejerce su acción catalítica.

2. Especificidad de acción. Cada reacción está catalizada por una enzima específica.

La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición.

El sustrato se une a la enzima a través de numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno, electrostáticas, hidrófobas, etc, en un lugar específico , el centro activo. Este centro es una pequeña porción de la enzima, constituido por una serie de aminoácidos que interaccionan con el sustrato. ( Mecanismo de acción)

FACTORES QUE REGULAN LA CINÉTICA ENZIMATICA

E + PESE + S

1. Efecto del pH. Al comprobar experimentalmente la influencia del pH en la velocidad de las reacciones enzimáticas se obtienen curvas que indican que las enzimas presentan un pH óptimo de actividad. El pH puede afectar de varias maneras:

o El centro activo puede contener aminoácidos con grupos ionizados que pueden variar con el pH.

o La ionización de aminoácidos que no están en el centro activo puede provocar modiicaciones en la conformación de la enzima.

o El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH.

Algunas enzimas presentan variaciones peculiares. La pepsina del estómago, presenta un pH óptimo de 2, y la fosfatasa alcalina del intestino un pH óptimo de 12.

2. La temperatura. Influye en la actividad. El punto óptimo representa el máximo de actividad. A temperaturas bajas, las enzimas se hallan "muy rígidas" y cuando se supera un valor considerable (mayor de 50:) la actividad cae bruscamente porque, como proteína, la enzima se desnaturaliza.

3. La concentración de enzima: Existe una relación lineal entre la velocidad de la reacción y la concentración de la enzima.

4. La concentración de sustrato: Para una determinada cantidad de enzima, la velocidad de la reacción aumenta al aumentar la concentración de sustrato. Al principio esta relación es casi lineal, pero luego la curva de la reacción asume una forma hiperbólica , se alcanza una meseta en la cual la velocidad es constante, esto ocurre a concentraciones de sustrato tales que posteriores incrementos no afectan la velocidad aparente. Aquí todas las moléculas de enzima están saturadas de sustrato y por lo tanto existe el complejo [ES].

CONCEPTOS BÁSICOS DE CINÉTICA QUÍMICA

En una reacción de orden cero, la velocidad de formación del producto es independiente de la concentración de sustrato: v = k

En una reacción de primer orden la velocidad de formación de los productos es directamente proporcional a la concentración del sustrato: v = k [A]. Así, en la reacción:

sacarosa + agua

glucosa + fructosa

La velocidad de hidrólisis de la sacarosa es, en todo momento, proporcional a la concentración de sacarosa. Dicho matemáticamente, donde [A] es la concentración de sacarosa a cada tiempo (t) y k es la constante de proporcionalidad. Se dice que ésta es una reacción de primer orden.

Una reacción de segundo orden es aquella en la que la velocidad de formación del producto depende

de la concentración de dos sustratos (como en una reacción de condensación): v = k [A1] [A2]

del cuadrado de la concentración de un único sustrato (reacción de dimerización): v = k [A]2

En la tabla siguiente se resumen los distintos tipos de reacción, y la forma de calcular sus parámetros cinéticos.

ORDEN CERO PRIMER ORDEN SEGUNDO ORDEN

Expresión diferencial de la

velocidad

Ecuación integrada de la

velocidad[A] = -kt + [A]0 Ln[A] = -kt + Ln[A]0

Vida media (t1/2)

Representación [A] vs t Ln[A] vs t 1/[A] vs t

que da lugar a una recta

Signo de la pendiente

negativo negativo positivo

Significado de la pendiente

-k -k k

Significado de la ordenada en el

origen[A]0 Ln[A]0

[A]0 es b eb 1/b

CINÉTICA ENZIMÁTICA

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad

del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

 

Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

 

Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN

Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inical del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis (foto de la izquierda) y Maud Menten (foto de la derecha) desarrollaron esta teoría y

propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.

Para explicar la relación oservada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre:

 

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto, podemos afirmar que:

v1 = k1 [E] [S] v2 = k2 [ES] v3 = k3 [ES]

Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentración total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reacción) es:

[ET] = [E] + [ES]

Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

 

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción (Figura de la derecha). Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociación (v2+ v3):

v1 = v2 + v3

Además, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los productos es constante:

v = v3 = k3 [ES] = constante.Como v1=v2+v3, podemos decir que:

k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

Despejando [ES], queda que: , siendo , en donde la expresión (k2+k3)/k1 se ha sustituído por KM, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicación sobre las razones que hacen de la KM un parámetro cinético importante.

Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

v = v3 = k3 [ES] =

Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y KM son constantes. Vamos a

considerar dos casos extremos:

A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << KM) v = (k3 [ET]/KM) [S]. Como los términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, kobs, de forma que la expresión queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la reacción es un proceso cinético de primer orden.

A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuantra unido al sustrato.

Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad, (la fórmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:

 

Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide (Figura de la derecha). En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN

Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten ( Fotos )

desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas.

Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando la enzima libre:

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto, podemos afirmar que:

v1 = k1 [E] [S]

v2 = k2 [ES]

v3 = k3 [ES]

Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentración total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reacción) es:

[ET] = [E] + [ES]

Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción (figura de abajo). Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociación (v2+ v3):

v1 = v2 + v3

Además, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los productos es constante:

v = v3 = k3 [ES] = constante.

Como v1 = v2 + v3, podemos decir que:

k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

Despejando [ES], queda que:

, siendo , en donde la expresión (k2 + k3)/k1 se ha sustituído por KM, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicación sobre las razones que hacen de la KM un parámetro cinético importante. Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

v = v3 = k3 [ES] =

Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y KM son constantes. Vamos a considerar dos casos extremos:

A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << KM) v = (k3 [ET]/KM) [S]. Como los términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, kobs, de forma que la expresión queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la reacción es un proceso cinético de primer orden.

A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando toda la enzima disponible se encuentra unida al sustrato, y el KM es la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, esta constante es inversamente proporcional con la afinidad de la enzima por el sustrato. A mayor KM menor afinidad y viceversa.

Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad, (la fórmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:

ENZIMAS ALOSTÉRICAS

Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide (Figura de la derecha). En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

CATALÍSIS ÁCIDO BASE, COVALENTE, POR IONES METÁLICOS.

Una vez unido el sustrato, se pueden utilizar formas adicionales de catálisis por una enzima para ayudar a la rotura o formación de un enlace utilizando grupos funcionales catalíticos situados adecuadamente. Entre los mecanismos mejor caracterizados se encuentran la catálisis ácido base general, la catálisis covalente, y la catálisis por iones metálicos.Catálisis ácido base general: Muchas reacciones bioquímicas suponen la formación de intermedios cargados inestables que tienden a descomponerse rápidamente en sus especies reactivas constituyentes no pudiendo, de este modo, reaccionar. A menudo se pueden estabilizar los intermedios cargados (con lo que se cataliza la reacción) transfiriendo protones a o desde el sustrato o intermedio para formar una especie que se descompone en productos más fácilmente que en reactivos. Las transferencias de protones pueden utilizar sólo los constituyentes del agua o pueden utilizar otros dadores o aceptores débiles de protones.Catálisis covalente: Implica la formación de un enlace covalente transitorio entre la enzima y el sustrato. Consideremos la hidrólisis de un enlace entre los grupos A y B.

En presencia de un catalizador covalente (una enzima con un grupo nucleofílico X:) la reacción se transforma en

Esto altera la ruta de la reacción y sólo produce catálisis si la nueva ruta tiene una energía de activación inferior que la ruta no catalizada. Los dos nuevos pasos han de ser más rápidos que la reacción no catalizada.

Ciertos grupos funcionales de algunos cofactores sirven como nucleófilos en algunas enzimas para la formación de enlaces covalentes con los sustratos.

Catálisis por iones metálicos: Los metales, tanto si están fuertemente unidos a la enzima como si son captados de la solución junto con el sustrato, pueden participar de diferentes maneras en la catálisis. Interacciones iónicas entre un metal fijado a la enzima y el sustrato pueden ayudar a orientar a un sustrato para que reaccione o para estabilizar estados de transición de la reacción que estén cargados. Los metales también pueden facilitar reacciones de óxido reducción mediante cambios reversibles en el estado de oxidación del ión metálico.

ZIMÓGENOS.

Algunas enzimas se sintetizan en las células de origen al estado de precursores inactivos llamados zimógenos, proenzimas o pre enzimas. En la mayoría de los casos, estos precursores son proteínas simples que se convierten en enzima activa por un proceso de hidrólisis.

Agentes específicos, frecuentemente enzimas hidrolíticas, producen ruptura de la cadena polipeptídica del zimógeno, cambian la conformación de la molécula y le otorgan actividad catalítica.

Son proenzimas algunos componentes de los jugos digestivos, secretados como zimógenos por las glándulas originarias y activados al llegar a la luz del tracto gastrointestinal. Otras presentes en el plasma, son precursoras de enzimas proteolíticas que intervienen en el proceso de coagulación de la sangre.

SISTEMAS MULTIENZIMÁTICOS.Otro nivel de estructura enzimática importante en los procesos de regulación del

metabolismo es el complejo multienzimático altamente organizado. Se sabe que existen algunos sistemas enzimáticos metabólicos, no como moléculas independientes, sino en un estado de agregación o arquitectura que involucra varias enzimas diferentes. El complejo ácido pirúvico deshidrogenasa de la E. coli es uno que ha recibido considerable atención. Este complejo (P.M 4,8 millones) consta de tres enzimas diferentes, 24 moléculas de piruvato descarboxilasa (P.M 90.000) , 24 moléculas de dihidrolipoato deshidrogenasa (P.M 55.000) y 8 moléculas de lipoil reductasa transacetilasa(P.M 120.000). La organización molecular provee un mosaico de enzimas en el cual cada componente está dispuesto de modo de aportar un eficiente acoplamiento de las reacciones individuales catalizadas por estas enzimas. En otras palabras, el producto de la primera enzima se convierte en sustrato de la segunda enzima y así sucesivamente.

DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR.

Muchas enzimas asociadas al núcleo participan en el mantenimiento, la renovación y la utilización del aparato genético. La mayoría de las enzimas mitocondriales guardan relación con la producción de energía o con reacciones oxidativas que proporcionan la fuerza de inducción necesaria para muchas funciones celulares.

Las enzimas asociadas a los ribosomas favorecen la biosíntesis de proteínas. Las enzimas microsómicas son responsables de diversas reacciones de hidroxilación relacionadas con la biosíntesis de hormonas esteroideas y con el metabolismo o la inactivación de fármacos. Los lisosomas contienen enzimas que catalizan la destrucción hidrolítica de materiales que la célula ya no necesita. Se trata de un proceso de digestión intracelular. Las enzimas lisosómicas actúan normalmente a un pH más ácido que en cualquier otra localización celular. Las enzimas citosólicas catalizan el tipo de metabolismo de los carbohidratos conocido como glucólisis. Las enzimas responsables de la biosíntesis de los ácidos grasos son también citosólicas aunque, a diferencia de las que participan en la glucólisis, este sistema de enzimas se halla perfectamente organizado en forma de un único péptido de gran longitud que desarrolla las siete actividades enzimáticas necesarias.

CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten frente a [S]0) es una hipérbola (Figura de la izquierda). La

corresponde al valor máximo al que tiende la curva

experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la

Para determinar gráficamente los y Vmax es más

sencillo utilizar la representación doble recíproca

frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-

(Figura de la derecha). Es una recta en la cual:

La pendiente es KM/Vmax

La abscisa en el origen = 0) es -1/KM

La ordenada en el origen = 0) es 1/Vmax

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).

Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).

Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el número de centros activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio del enzima, o sea, el número de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.

 

MOTIVOS QUE HACEN DE KM UN PARÁMETRO CINÉTICO IMPORTANTE

La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante pór múltiples razones:

KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si KM = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2.

El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad. Este hecho tiene fácil explicación si tenemos en cuenta que KM se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma. Así, si KM es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).

La KM del sustrato natural es menor que la de los sustratos análogos. Si dos sustratos del mismo enzima tienen distinta KM, el que presente mayor KM tiene menor afinidad por el enzima, y la reacción transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor KM, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = Vmax.

Los valores de KM de muchos enzimas son próximos a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.

Cinética de la enzima

Cinética de la enzima es el estudio del reacciones químicas eso es catalizado por enzimas, con un foco en su tarifas de la reacción. El estudio de una enzima cinética revela el mecanismo catalítico de esta enzima, su papel adentro metabolismo, cómo su actividad es controlada, y cómo a droga o a veneno fuerza inhiba la enzima.

Las enzimas son proteína moléculas eso manipula otras moléculas - las enzimas substratos. Lazo de estas moléculas de la blanco a una enzima sitio activo y se transforman en productos con una serie de pasos conocidos como mecanismo enzimático. Estos mecanismos se pueden dividir en el solo-substrato y mecanismos del múltiple-substrato. Estudios cinéticos en las enzimas que atan solamente un substrato, por ejemplo isomerase del triosephosphate, puntería para medir afinidad con cuál ata la enzima este substrato y la tarifa del volumen de ventas.

Cuando las enzimas atan los substratos múltiples, por ejemplo reductase del dihydrofolate (demostrado a la derecha), la cinética de la enzima puede también demostrar la secuencia en la cual estos substratos atan y la secuencia en la cual se lanzan los productos. Un ejemplo de las enzimas que atan un solo substrato y productos múltiples del lanzamiento es proteases, que hienden un substrato de la proteína en dos productos del polipéptido. Otros ensamblan dos substratos juntos, por ejemplo Polimerasa de la DNA ligar a nucleotide a DNA. Aunque estos mecanismos son a menudo series complejas de pasos, hay típicamente uno tarifa-determinación de paso eso determina la cinética total. Esto tarifa-determinación de paso puede ser una reacción química o una a conformational cambio de la enzima o de los substratos, tales como ésos implicados en el lanzamiento de productos de la enzima.

Conocimiento del estructura de la enzima es provechoso en interpretar los datos cinéticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cómo los substratos y los productos atan durante catálisis; qué cambios ocurren durante la reacción; e incluso el papel del detalle aminoácido residuos en el mecanismo. Algunas enzimas se desforman perceptiblemente durante el mecanismo; en tales casos, es provechoso determinar la estructura de la enzima con y sin los análogos encuadernados del substrato que no experimentan la reacción enzimática.

No todos los catalizadores biológicos son enzimas de la proteína; RNA- catalizadores basados por ejemplo ribozymes y ribosomes sea esencial para muchas funciones celulares, por ejemplo El empalmar del RNA y traducción. La diferencia principal entre los ribozymes y las enzimas es que los catalizadores del RNA realizan un sistema más limitado de reacciones, aunque su mecanismos de la reacción y la cinética se puede analizar y clasificar por los mismos métodos.

Contenido

1 Principios generales

2 Análisis de enzima

3 reacciones del Solo-substrato

o 3.1 Cinética de Michaelis-Menten

o 3.2 Diagramas lineares de la ecuación de Michaelis-

Menten

o 3.3 Significación práctica de constantes cinéticas

4 reacciones del Multi-substrato

o 4.1 mecanismos Ternario-complejos

o 4.2 Mecanismos del ping-pong

5 Cinética de Non-Michaelis-Menten

6 cinética del Pre-constante-estado

7 Mecanismo químico

8 Inhibición de enzimas

o 8.1 Inhibidores reversibles

o 8.2 Inhibidores irreversibles

9 Mecanismos de la catálisis

10 Notas al pie de la página

11 Referencias

12 Lectura adicional

13 Acoplamientos externos

Principios generales

La reacción catalizada por una enzima utiliza exactamente los mismos reactivo y produce exactamente los mismos productos que uncatalysed la reacción. Como otro catalizadores, las enzimas no alteran la posición de equilibrio entre los substratos y los productos.[1] Sin embargo, desemejante de reacciones químicas normales, las enzimas son saturables. Esto los medios como más substrato se agregan, la tarifa de la reacción aumentará, porque sitios más activos se ocupan. Esto puede continuar hasta que toda la enzima se satura con el substrato y la tarifa alcanza un máximo. Las dos características cinéticas más importantes de una enzima son cómo la enzima rápidamente se satura con un substrato particular, y la

tarifa máxima que puede alcanzar. Sabiendo estas características sugiere lo que hace en el ambiente de la célula y puede para demostrar una fuerza de la enzima cómo la enzima responderá a los cambios en estas condiciones.

Análisis de enzimaArtículo principal: Análisis de enzima

Análisis de enzima son los procedimientos del laboratorio que miden el índice de las reacciones enzimáticas. Porque las enzimas no son consumidas por las reacciones que catalizan, los análisis de enzima siguen generalmente cambios en la concentración de substratos o de productos para medir el índice de la reacción. Hay muchos métodos de medida. Spectrophotometric los análisis observan el cambio en absorbencia de la luz entre los productos y los reactivo; los análisis radiométricos implican la incorporación o el lanzamiento de radiactividad para medir la cantidad en un cierto plazo hecha producto. Los análisis Spectrophotometric son los más convenientes puesto que permiten que el índice de la reacción sea medido continuamente. Aunque los análisis radiométricos requieren el retiro y cuenta de las muestras (es decir, son análisis discontinuos) son generalmente extremadamente sensibles y pueden medir niveles muy bajos de la actividad enzimática.[2] Un acercamiento análogo es utilizar spectrometry total para supervisar la incorporación o el lanzamiento de isótopos estables como el substrato se convierte en producto.

El uso más sensible de los análisis de enzima lasers enfocado con a microscopio para observar cambios en solas moléculas de la enzima como catalizan sus reacciones. Estas medidas cualquier cambios del uso en fluorescencia de cofactores durante un mecanismo de la reacción enzimática, o de tintes fluorescentes agregado sobre sitios específicos del proteína para divulgar los movimientos que ocurren durante catálisis.[3] Estos estudios están proporcionando una nueva vista de la cinética y de la dinámica de solas enzimas, en comparación con la cinética tradicional de la enzima, que observa el comportamiento medio de poblaciones de millones de moléculas de la enzima.[4][5]

A la izquierda se demuestra una curva típica del progreso para un análisis de enzima. La enzima produce el producto en a linear índice inicial al principio de la reacción. Más adelante en esta curva del progreso, la tarifa retrasa mientras que el substrato se utiliza para arriba o los productos acumulan. La longitud del período inicial de la tarifa depende de las condiciones del análisis y puede extenderse a partir de milisegundos a las horas. Los análisis de enzima se fijan generalmente hasta el producto una tarifa inicial que dura sobre un minuto, para hacer medidas más fáciles. Sin embargo, el equipo para los líquidos rápidamente que se mezclan permite medidas cinéticas rápidas en índices iniciales de menos de un segundo.[6] Estos análisis muy rápidos son esenciales para la cinética del pre-constante-estado que mide, que se discuten abajo.

La mayoría de los estudios de la cinética de la enzima se concentran en esta parte inicial, linear de reacciones enzimáticas. Sin embargo, es también posible medir la curva completa de la reacción y caber estos datos a un no linear ecuación de la tarifa. Esta manera de medir reacciones enzimáticas se llama análisis de la progresar-curva.[7] Este acercamiento es útil

como alternativa a la cinética rápida cuando la tarifa inicial es demasiado rápida medir exactamente.

reacciones del Solo-substrato

Las enzimas con los mecanismos del solo-substrato incluyen isomerases por ejemplo triosephosphateisomerase o mutase del bisphosphoglycerate, intramolecular lyases por ejemplo cyclase del adenylate y ribozyme del hammerhead, un lyase del RNA.[8] Sin embargo, algunas enzimas que tienen solamente un solo substrato no caen en esta categoría de mecanismos. Catalase es un ejemplo de esto, pues la enzima reacciona con una primera molécula de peróxido de hidrógeno el substrato, se oxida y después es reducido por una segunda molécula del substrato. Aunque un solo substrato está implicado, la existencia de un intermedio modificado de la enzima significa que el mecanismo del catalase es realmente un mecanismo del ping-pong, un tipo de mecanismo que se discuta en reacciones del Multi-substrato sección abajo.

Cinética de Michaelis-Menten

Pues las reacciones enzima-catalizadas son saturables, su índice de la catálisis no demuestra una respuesta linear al substrato de aumento. Si el índice inicial de la reacción se mide sobre una gama de las concentraciones del substrato (denotadas como [S]), la tarifa de la reacción (v) aumenta como aumentos [S], como se muestra a la derecha. Sin embargo, como [S] consigue más arriba, la enzima se satura con el substrato y alcances de la tarifa Vmáximo, la tarifa máxima de la enzima.

Modelo cinético de Michaelis-Menten de una reacción del solo-substrato se demuestra a la derecha. Hay una inicial reacción bimolecular entre la enzima E y el substrato S para formar el enzyme-substrate ES complejo. Aunque el mecanismo enzimático para reacción unimolecular la reacción puede ser absolutamente compleja, allí es típicamente un paso enzimático de tarifa-determinación que permite que el mecanismo sea modelado como solo paso catalítico de la constante de la tarifa k2.

    (Ecuación 1).

k2 también se llama kgato o el número del volumen de ventas, el número máximo de las reacciones enzimáticas catalizadas por segundo.

En las concentraciones bajas del substrato [S], la enzima existe en un equilibrio entre la forma libre E y el enzyme-substrate ES complejo; el aumento [S] aumenta además [ES] a expensas de [E], cambiando de puesto el equilibrio obligatorio a la derecha. Puesto que el índice de la reacción depende de la concentración [ES], la tarifa es sensible a los cambios pequeños adentro [S]. Sin embargo, en muy arriba [S], la enzima se satura enteramente con el substrato, y existe solamente en la forma del ES. Bajo estas condiciones, la tarifa (v≈k2[E]tot=Vmáximo) es insensible a los cambios pequeños adentro [S]; aquí, [E]tot es la concentración total de la enzima

cuál es aproximadamente igual a la concentración [ES] bajo saturación de condiciones.

Ecuación de Michaelis-Menten [9] describe cómo la tarifa de la reacción v depende de la posición de substrato-atar equilibrio y la constante de la tarifa k2. Michaelis y Menten demostrado cuando k2 está mucho menos que k-1 (llamado asunción del equilibrio)[10] podían derivar la ecuación siguiente:

    (Ecuación 2)

Esta ecuación de Michaelis-Menten es la base para la mayoría de la cinética de la enzima del solo-substrato.

La constante de Michaelis Km se define como la concentración en la cual el índice de la reacción enzimática es medio Vmáximo. Esto puede ser verificada substituyendo [S] = Km en la ecuación de Michaelis-Menten. Si el paso enzimático de tarifa-determinación es lento comparado a la disociación del substrato (k2 << k-1), la constante de Michaelis Km es áspero constante de la disociación del complejo del ES, aunque esta situación es relativamente rara.

La situación más normal donde k2 > k-1 a veces se llama Briggs-Haldane cinética.[11] La ecuación de Michaelis-Menten todavía sostiene bajo estas condiciones más generales, como puede ser derivado de aproximación de estado estacionario.[10] Durante el período de la inicial-tarifa, la tarifa de la reacción v está áspero la constante, indicando que [ES] está semejantemente la constante (cf. ecuación 1):

Por lo tanto, la concentración [ES] es dada por el fórmula

donde la constante de Michaelis Km se define

([E] es la concentración de la enzima libre). Tomado junto, el fórmula general para la tarifa de la reacción v está otra vez la ecuación de Michaelis-Menten:

La constante de la especificidad kcat / Km es una medida de cómo una enzima convierte eficientemente un substrato en producto. Usar la definición de la constante de Michaelis Km, la ecuación de Michaelis-Menten se puede escribir en la forma

donde [E] está la concentración de la enzima libre. Así, la constante de la especificidad es una eficaz constante second-order de la tarifa para la enzima libre a reaccionar con el substrato libre para formar el producto. La constante de la especificidad es limitada por la frecuencia con la cual el substrato y la enzima se encuentran en la solución, tan arriba como 1010 M−1 s−1.[12] Notable, esta tarifa máxima es en gran parte inafectada por el tamaño del substrato o de la enzima.[13] El cociente de las constantes de la especificidad para dos substratos es una comparación cuantitativa de cómo es eficiente la enzima consiste en convertir esos substratos. La cuesta del gráfico de Michaelis-Menten en la concentración baja del substrato [S] (cuando [S] << Km) también rinde la constante de la especificidad.

Diagramas lineares de la ecuación de Michaelis-Menten

Vea también: Diagrama de Lineweaver-Burk y Diagrama de Eadie-Hofstee

Usar una clase particular interactiva de la cinética de Michaelis-Menten en la universidad de Virginia,[α] los efectos sobre el comportamiento de una enzima de variar constantes cinéticas pueden ser explorados.

El diagrama de v contra [S] arriba no es linear; aunque inicialmente es linear en el punto bajo [S], se dobla encima para saturar en el colmo [S]. Antes de la era moderna de curva-guarnición no lineal en las computadoras, este nonlinearity podía hacerlo difícil de estimar Km y Vmáximo exactamente. Por lo tanto, varios investigadores desarrollaron las linearizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten, tales como Diagrama de Lineweaver-Burk, Diagrama de Eadie-Hofstee y Diagrama de Hanes-Woolf. Todas estas representaciones lineares pueden ser útiles para visualizar datos, pero ningunos se deben utilizar para determinar parámetros cinéticos, pues el software es fácilmente disponible que tiene en cuenta una determinación más exacta cerca regresión no lineal métodos.[14]

Diagrama de Lineweaver-Burk o doble el diagrama recíproco es manera común de ilustrar datos cinéticos. Esto es producida tomando recíproco de ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten. Como se muestra a la derecha, ésta es una forma linear de la ecuación de Michaelis-Menten y produce una línea recta con la ecuación y = mx + c con a y- intercepción equivalente a 1Vmáximo y x- intercepción del gráfico que representa -1/Km.

Naturalmente, ningunos valores experimentales se pueden tomar en la negativa 1 [S]; el valor límite más bajo 1 [S] = 0 ( y- la intercepción) corresponde a una concentración infinita del substrato, donde 1/v=1/Vmáximo como se muestra en la derecha; así, x- la intercepción es extrapolación de los datos experimentales tomados en las concentraciones positivas. Más generalmente, el diagrama de Lineweaver-Burk sesga la importancia de las medidas tomadas en las concentraciones bajas del substrato y, así, puede rendir estimaciones inexactas de Vmáximo y Km.[15] Un método que traza linear más exacto es Diagrama de Eadie-Hofstee. En este caso, v se traza contra v/[S]. En la tercera representación linear común, Diagrama de Hanes-Woolf, [de S]/v se traza contra [S]. La normalización de los datos puede ayudar generalmente a disminuir la cantidad de trabajo experimental y puede aumentar la confiabilidad de la salida, y es conveniente para el análisis gráfico y numérico.[16]

Significación práctica de constantes cinéticas

El estudio de la cinética de la enzima es importante por dos razones básicas. En primer lugar, ayuda a explicar cómo las enzimas trabajan, y en segundo lugar, ayuda a predecir cómo las enzimas se comportan en organismos vivos. Las constantes cinéticas definidas arriba, Km y Vmáximo, sea crítico a las tentativas de entender cómo las enzimas trabajan juntas para controlar metabolismo.

La fabricación de estas predicciones no es trivial, incluso para los sistemas simples. Por ejemplo, oxaloacetate se forma cerca dehydrogenase del malate dentro de mitochondrion. El Oxaloacetate se puede entonces consumir cerca synthase del citrato, carboxykinase del phosphoenolpyruvate o aminotransferase del aspartate, alimentando en ciclo del ácido

cítrico, gluconeogénesis o ácido aspartic biosíntesis, respectivamente. Pudiendo predecir cuánto oxaloacetate entra qué camino requiere el conocimiento de la concentración del oxaloacetate así como la concentración y la cinética de cada uno de estas enzimas. Esta puntería de predecir el comportamiento de caminos metabólicos alcanza su expresión más compleja de la síntesis de cantidades enormes de cinético y expresión del gene datos en los modelos matemáticos de organismos enteros. Aunque esta meta es lejana en el futuro para cualesquiera eukaryote, las tentativas ahora se están haciendo de alcanzar esto adentro bacterias, con los modelos de Escherichia coli metabolismo ahora que es producido y probado.[17][18]

reacciones del Multi-substrato

las reacciones del Multi-substrato siguen las ecuaciones complejas de la tarifa que describen cómo los substratos atan y en qué secuencia. El análisis de estas reacciones es mucho más simple si la concentración del substrato A es la constante guardada y el substrato B variados. Bajo estas condiciones, la enzima se comporta justo como una enzima del solo-substrato y un diagrama de v por [S] da evidente Km y Vmáximo constantes para el substrato B. Si un sistema de estas medidas se realiza en diversas concentraciones fijas de A, estos datos se pueden utilizar para resolverse cuáles es el mecanismo de la reacción. Para una enzima que tome dos substratos A y B y les dé vuelta en dos productos P y Q, hay dos tipos de mecanismo: complejo y ping-pong ternarios.

mecanismos Ternario-complejos

En estas enzimas, ambos substratos atan a la enzima al mismo tiempo para producir un complejo ternario de EAB. La orden del atascamiento puede o ser al azar (en un mecanismo al azar) o los substratos tienen que atar en una secuencia particular (en un mecanismo pedido). Cuando un sistema de v por [S] las curvas (A fijada, B que varía) de una enzima con un mecanismo ternario-complejo son trazados en a Diagrama de Lineweaver-Burk, el sistema de líneas producidas se intersecará.

Las enzimas con los mecanismos ternario-complejos incluyen glutathione S - transferase ,[19] reductase del dihydrofolate [20] y Polimerasa de la DNA.[21] Los acoplamientos siguientes demuestran animaciones cortas de los mecanismos ternario-complejos del reductase del dihydrofolate de las enzimas[β] y polimerasa de la DNA[γ].

Mecanismos del ping-pong

Como se muestra a la derecha, las enzimas con un mecanismo del ping-pong pueden existir en dos estados, E y una forma químicamente modificada de la enzima E*; esta enzima modificada se conoce como intermedio. En tales mecanismos, los lazos del substrato A, cambian la enzima a E* cerca, por ejemplo, transfiriendo a un grupo químico al sitio activo, y después se lanzan. Solamente después que el primer substrato es lazo lanzado del substrato B de la poder y reacciona con la enzima modificada, regenerando la forma sin modificar de E. Cuando un sistema de v por [S] las curvas (A fijada, B que varía) de una

enzima con un mecanismo del ping-pong son trazados en un diagrama de Lineweaver-Burk, un sistema de líneas paralelas será producido.

Las enzimas con los mecanismos del ping-pong incluyen alguno oxidoreductases por ejemplo peroxidase del thioredoxin,[22] transferases por ejemplo cytydilyltransferase del acylneuraminate[23] y proteases del serine por ejemplo trypsin y chymotrypsin.[24] Los proteases del Serine son una familia muy común y diversa de enzimas, incluyendo digestivo enzimas (trypsin, chymotrypsin, y elastase), varias enzimas del cascada de coagulación de la sangre y muchos otros. En estos proteases del serine, el intermedio de E* es una especie de la acyl-enzima formada por el ataque de un sitio activo serine residuo en a enlace del peptide en un substrato de la proteína. Una animación corta que demuestra el mecanismo del chymotrypsin se liga aquí.[δ]

Cinética de Non-Michaelis-MentenArtículo principal: Regulación de Allosteric

Algunas enzimas producen a sigmoideo v por el diagrama [S], que indica a menudo atascamiento cooperativo del substrato al sitio activo. Esto significa que el atascamiento de una molécula del substrato afecta el atascamiento de las moléculas subsecuentes del substrato. Este comportamiento es el más común adentro multimeric enzimas con varios sitios activos que obran recíprocamente.[25] Aquí, el mecanismo de la cooperación es similar a el de hemoglobina, con el atascamiento del substrato a un sitio activo que altera la afinidad de los otros sitios activos para las moléculas del substrato. El cooperativity positivo ocurre al atar de la primera molécula del substrato aumentos la afinidad de los otros sitios activos para el substrato. El cooperativity negativo ocurre al atar del primer substrato disminuciones la afinidad de la enzima para otras moléculas del substrato.

Las enzimas de Allosteric incluyen el tRNA-synthetase mamífero del tyrosyl, que demuestra cooperativity negativo,[26] y bacteriano transcarbamoylase del aspartate [27] y phosphofructokinase [28] , que demuestran cooperativity positivo.

Cooperativity es asombrosamente campo común y puede ayudar a regular las respuestas de enzimas a los cambios en las concentraciones de sus substratos. Las enzimas positivas de las marcas del cooperativity mucho más sensibles a [S] y sus actividades pueden demostrar cambios grandes sobre una gama estrecha de la concentración del substrato. Inversamente, el cooperativity negativo hace las enzimas insensibles a los cambios pequeños adentro [S].

Ecuación de la colina [29] es de uso frecuente describir el grado de cooperativity en non-Michaelis-Menten cuantitativo cinética. El coeficiente derivado de la colina n mide cuánto afecta el atascamiento del substrato a un sitio activo el atascamiento del substrato a los otros sitios activos. Un coeficiente de la colina de <1 indica que el cooperativity negativo y un coeficiente de >1 indica el positivo cooperativity.

cinética del Pre-constante-estado

En el primer momento después de que una enzima se mezcle con el substrato, no se ha formado ningún producto y no intermedios exista. El estudio de los milisegundos próximos de la reacción se llama cinética del pre-constante-estado. la cinética del Pre-constante-estado por lo tanto se refiere a la formación y a la consumición de los intermedios del enzyme-substrate (tales como ES o E*) hasta su concentraciones de estado estacionario se alcanzan.

Este acercamiento primero fue aplicado a la reacción de la hidrólisis catalizada cerca chymotrypsin.[30] A menudo, la detección de un intermedio es un pedazo de evidencia vital en investigaciones de qué mecanismo sigue una enzima. Por ejemplo, en los mecanismos del ping-pong que se demuestran arriba, las medidas cinéticas rápidas pueden seguir el lanzamiento del producto P y medir la formación del intermedio modificado E* de la enzima.[31] En el caso de chymotrypsin, este intermedio es formado por el ataque del substrato por nucleophilic serine en el sitio activo y la formación del intermedio de la acyl-enzima.

En la figura a la derecha, la enzima produce E* rápidamente en los segundos primeros de la reacción. La tarifa entonces se retarda mientras que se alcanza el estado constante. Esta fase rápida de la explosión de la reacción mide un solo volumen de ventas de la enzima. Por lo tanto, la cantidad de producto lanzó en esta explosión, demostrada como la intercepción en y- el eje del gráfico, también da la cantidad de enzima funcional que esté presente en el análisis.[32]

Mecanismo químico

Una meta importante de la cinética de la enzima que mide es determinar el mecanismo químico de una reacción enzimática, es decir, la secuencia de los pasos químicos que transforman el substrato en producto. Los acercamientos cinéticos discutidos arriba demostrarán en qué tarifas intermedios se forman e inter-se convierten, pero no pueden identificar exactamente cuáles estos intermedios son.

Las medidas cinéticas tomadas bajo varias condiciones de la solución o en las enzimas o los substratos levemente modificados vierten a menudo la luz en este mecanismo químico, pues revelan al paso o a intermedios de tarifa-determinación en la reacción. Por ejemplo, el romperse de a enlace covalente a a hidrógeno átomo es un paso la tarifa-determinación común. Cuál del hidrógeno posible transfiere es determinación de la tarifa puede ser demostrado midiendo los efectos cinéticos de substituir cada hidrógeno por deuterio, su establo isótopo. La tarifa cambiará cuando se substituye el hidrógeno crítico, debido a un primario efecto cinético del isótopo, que ocurre porque los enlaces al deuterio son más duros entonces romper enlaces al hidrógeno.[33] Es también posible medir efectos similares con otras substituciones del isótopo, por ejemplo 13C12C y 18O16O, pero estos efectos es más sutiles.[34]

Los isótopos se pueden también utilizar para revelar el sino de las varias partes de las moléculas del substrato en los productos finales. Por ejemplo, es a veces difícil discernir el origen del oxígeno átomo en el producto final; puesto que pudo haber venido del agua o de la parte del substrato. Esto puede ser determinada sistemáticamente substituyendo el isótopo estable del oxígeno 18O en las varias moléculas que participan en la reacción y la comprobación para saber si hay el isótopo en el producto.[35] El mecanismo químico puede también ser aclarado examinando la cinética y los efectos del isótopo bajo diversas condiciones del pH,[36] alterando los iones u otro del metal limite cofactores,[37] por mutagénesis sitio-dirigida de los residuos conservados del aminoácido, o estudiando el comportamiento de la enzima en presencia de los análogos de los substratos.[38]

Inhibición de enzimasArtículo principal: Inhibidor enzimático

Los inhibidores enzimáticos son las moléculas que reducen o suprimen actividad enzimática. Éstos son cualquiera reversible (es decir, el retiro del inhibidor restaura actividad enzimática) o irreversible (es decir, el inhibidor hace inactivo permanentemente la enzima).

Inhibidores reversibles

Los inhibidores enzimáticos reversibles se pueden clasificar como competitivos, uncompetitive, no competitivo o mezclado, según sus efectos encendido Km y Vmáximo. Estos diversos efectos resultan del inhibidor que ata a la enzima E, al enzyme-substrate ES complejo, o a ambos, según las indicaciones de la figura a la derecha y a la tabla abajo. El tipo particular de un inhibidor puede ser discernido estudiando la cinética de la enzima en función de la concentración del inhibidor. Los cuatro tipos de producto de la inhibición Lineweaver-Burke y Eadie-Hofstee diagramas[39] eso varía de maneras distintivas con la concentración del inhibidor. Para la brevedad, se utilizan dos símbolos:

      y      

donde Ki y Ki sea constantes de la disociación para atar a la enzima y al complejo del enzyme-substrate, respectivamente. En presencia del inhibidor reversible, la enzima evidente Km y Vmáximo convertido (α/α')Km y (1/α')Vmáximo, respectivamente, como se muestra abajo para los casos comunes.

Tipo de

inhibiciónKm evidente Vmáximo evidente

Ki solamente () competitivo

Ki'solamente () uncompetitive

Ki = Ki' () no competitivo

Ki ≠ Ki' () mezclado

Regresión no linear ajustes de los datos de la cinética de la enzima a las ecuaciones de la tarifa arriba[40] puede rendir las estimaciones exactas de las constantes de la disociación Ki y Ki.

Inhibidores irreversibles

Los inhibidores enzimáticos pueden también irreversible hacer inactivo las enzimas, generalmente covalente modificando residuos activos del sitio. Estas reacciones siguen decaimiento exponencial las funciones y son generalmente saturables. Debajo de la saturación, siguen primera orden cinética con respecto al inhibidor.

Mecanismos de la catálisisArtículo principal: Catálisis de la enzima

El modelo favorecido para la interacción del enzyme-substrate es el modelo apto inducido.[41] Este modelo propone que la interacción inicial entre la enzima y el substrato es relativamente débil, pero que estas interacciones débiles inducen rápidamente los cambios del conformational en la enzima que consolidan el atascamiento. Éstos conformational los cambios también traen residuos catalíticos en el sitio activo cerca de los vínculos químicos en el substrato que será alterado en la reacción.[42] Después del atascamiento ocurren, unos o más mecanismos de la catálisis más bajo la energía de la reacción estado de la transición proporcionando un camino químico alternativo para la reacción. Los mecanismos de la catálisis incluyen catálisis por la tensión en enlace; por proximidad y la orientación; por los donantes o los aceptadores del protón del activo-sitio; el hacer un túnel covalente de la catálisis y del quántum.[31][43]

La cinética de la enzima no puede probar qué modos de la catálisis son utilizados por una enzima. Sin embargo, un ciertos datos cinéticos pueden sugerir las posibilidades que se examinarán por otras técnicas. Por ejemplo, un mecanismo del ping-pong con cinética del pre-constante-estado de la estallar-fase sugeriría que la catálisis covalente pudiera ser importante en el mecanismo de esta enzima. Alternativomente, la observación de un efecto fuerte del pH encendido Vmáximo pero no Km pudo indicar que un residuo en el sitio activo necesita estar en un detalle ionización estado para que catálisis ocurra.

Notas al pie de la página

α. ^ Acoplamiento: Clase particular interactiva de la cinética de Michaelis-Menten (Java requerida)

β. ^ Acoplamiento: mecanismo del reductase del dihydrofolate (GIF)

γ. ^ Acoplamiento: Mecanismo de la polimerasa de la DNA (GIF)

δ. ^ Acoplamiento: Mecanismo del Chymotrypsin (flash requerido)

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Lectura adicional

Introductorio

Athel De Cornualles-Bowden, Fundamentales de la cinética de la

enzima. (3ro edición), prensa de Portland 2004, ISBN 1-85578-

158-1.

Precio de Nicholas, Lewis Stevens, Fundamentales de la

enzimología, Prensa de la universidad de Oxford, 1999. ISBN 0-

19-850229-X

Tim Bugg, Una introducción a la química de la enzima y de la

coenzima Blackwell que publica, 2004 ISBN 1-4051-1452-5

Avanzado

Irwin H. Segel, Cinética de la enzima: Comportamiento y análisis

del equilibrio rápido y de los sistemas de estado estacionario de la

enzima. Wiley-Interscience; Nueva edición 1993 del Ed, ISBN 0-

471-30309-7.

Alan Fersht, Estructura y mecanismo en ciencia de la proteína: Una

guía a la catálisis de la enzima y al plegamiento de la proteína. W.

H. Freeman, 1998. ISBN 0-7167-3268-8

Santiago Schnell, Philip K. Maini, siglo de A de la cinética de la

enzima: Confiabilidad de la KM y vmáximo estimaciones, Comentarios

sobre biología teórica 8, 169-187, 2004 DOI:

10.1080/08948550390206768

Chris Walsh, Mecanismos enzimáticos de la reacción. W. H.

Freeman y Company. 1979. ISBN 0-7167-0070-0

Paul F. Cocinero y W.W. Cleland Cinética y mecanismo de la

enzima Ciencia del Garland, 2007 ISBN 0-8153-4140-7

Acoplamientos externos

Animación de un análisis de enzima - Efectos de las demostraciones

de manipular condiciones del análisis

MACiE - Una base de datos de los mecanismos de la reacción

enzimática

ENZIMA - Base de datos de la nomenclatura de la enzima de

Expasy

ExCatDB - Una base de datos de los mecanismos catalíticos de la

enzima

BRENDA - Base de datos comprensiva de la enzima, dando los

substratos, los inhibidores y los diagramas de la reacción

SABIO-RK - Una base de datos de la cinética de la reacción

Grupo de investigación de José Kraut, universidad de California San

Diego - Animaciones de varios mecanismos de la reacción

enzimática

Simbolismo y terminología en cinética de la enzima - Una

explicación comprensiva de conceptos y de la terminología en

cinética de la enzima

Una introducción a la cinética de la enzima - Un sistema accesible

de clases particulares en línea en cinética de la enzima

Clase particular animada cinética de la enzima - Una clase

particular animada con audio