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AVANCES OBTENIDOS EN LOS ESTUDIOS PARA EL

ÍMANEJO DEL HUANGLONGBING DE LOS CÍTRICOS EN

CAMPECHE MÉXICOCAMPECHE MÉXICO

Alberto Uc VárguezAlberto Uc Várguez

CONACYTCONACYT

AVANCES OBTENIDOS EN LOS ESTUDIOS PARA EL MANEJO DEL HUANGLONGBING DE LOS CÍTRICOS EN

ÉCAMPECHE MÉXICOAlberto Uc Várguez1; Francisco Alberto Sánchez Rebolledo2; Oscar Alberto

Moreno Valenzuela3; Alfonso Pérez Gutiérrez4; Guadalupe López Puc1; Emiliano Loeza Ku5; Angélica Moreno Enriquez3; Yereny Minero García3;Emiliano Loeza Ku5; Angélica Moreno Enriquez3; Yereny Minero García3;

María Luisa-Pitol Cruz2. auc@ciatej.net.mx

1Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco UnidadCentro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco. UnidadSureste. Calle 30 No. 151 x 7 y 7A. Colonia García Ginerés. Mérida Yucatán. Tel y Fax: 01 (999)9202671.2Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Campeche. Calle Argentina s/n entre Tamaulipasy Veracruz, Barrio de Santa Ana. Tel: 01 (981) 8161499.3C t d I ti ió Ci tífi d Y tá C ll 43 N 130 C l i Ch b á d Hid l CP3Centro de Investigación Científica de Yucatán. Calle 43 No. 130, Colonia Chuburná de Hidalgo, CP97200, Mérida, Yucatán, México. Tel: 01 (52) 999 942 83 30-Fax: (52) 999 981 39 00.4Instituto Tecnológico de Conkal Yucatán. Km. 16.3 Antigua Carretera Mérida-Motul. C.P. 97345,Conkal, Yucatán. Tel y Fax: 01 (999) 9124130 y 9124131.5Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Estación Experimental deg , g y pMococha Yucatán. KM. 25 Carretera Mérida-Motul, Mérida C.P. 97454, Mococha Yucatán Tel: 01(991)-9162215 Y 18.

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Importancia de la citricultura en México

Rendimiento de lima persa….CONACYTCONACYT

Estado Superficie Ha Rendimiento ton/haton/ha

Veracruz 18 280 17

Tabasco 6 705 NDTabasco 6 705 NDOaxaca 3 333 NDYucatán 890 23Yucatán 890 23 Campeche* 1 069 6.91

Fuente: SIAP, 2008

*Superficie de lima persa se triplicó en los últimos dos años

*El di i t b j l ió t i*El rendimiento es muy bajo con relación a otras regiones

Principales problemas de los cítricosCONACYTCONACYT

Virus

BacteriasBacterias

Viroides

No determinadasNo determinadas

Sagarpa, 2009

HUANGLONGBING (Citrus Greening)Huanglongbing (Dragón amarillo)

CONACYTCONACYT Bacteria gram negativa

Restringida a tubos cribosos

Cl ifi ió t b t i ( lib ib t )

3 especies diferentes:Candidatus Liberibacter asiaticum (C las), (22 a 30 ºC)

Clasificación -- α proteobacterias (genero liberibacter)

( ), ( )Candidatus Liberibacter africanum (C lafr) (22 a 24 ºC)Candidatus Liberibacter americanum (C lam)

Tomado de Hall, 2010

Transmite C.l. africanum

Trioza erytreae

C.l.asiaticum y C.l. americanumDiaphorina citri

Síntomas de HLBCONACYTCONACYT

Clorosis parecida a deficiencias de zinc,muerte progresiva y floración fuera deestaciónestación.

Los cítricos más susceptibles son lasnaranjas y mandarinas. El limónj ymexicano es el más tolerante (Bové2006??)

V ill l i

Síntomas de HLBCONACYTCONACYT Venas amarillas, clorosis

general Enverdecimiento

en los frutos

Fruto pequeño,amargo y nocoloreanapropiadamente

Moteados de hoja por HLB

Bové, 2006; Texeira et al., 2005; Roistacher, 2007

Distribución del HLB y VectorCONACYTCONACYT

Huanglongbing (NAPPO, 2005) Diaphorina citri (EPPO, 2006)

En Asia mató a más de 50 millones de plantasEn Asia mató a más de 50 millones de plantasEn Indonesia mató a más de 30 millonesEn África mató a más de 10 millones de plantas

Roistacher and Manjunath, 2007; Bové, 2006.

Características de transmisión de adultosCONACYTCONACYT

Periodo de adquisición 5 hr

Periodo de incubación 2- 25 días

Periodo de transmisión 15 minutos

1 hora de alimentación 100% de transmisión

Una vez adquirida la capacidad de transmisión ocurre toda la vida del insecto por

Tomado de Hall, 2010

Una vez adquirida la capacidad de transmisión ocurre toda la vida del insecto por multiplicación de la bacteria en el insecto

Hembra

Villalobos et al., 2005; Xu et al., 1998Macho

Manejo del HLB en el mundoCONACYTCONACYT

• Detección y eliminación oportuna de plantas e insectos infectados con elHLB

* Control del vector mediante aplicación de productos químicos de contacto osistémicos, uso de enemigos naturales. Lama et al., 1988; Shui-Chen-Chui et al.,sistémicos, uso de enemigos naturales. Lama et al., 1988; Shui Chen Chui et al.,1988.

* Protección cruzada (CVd III HLB CTV HLB)Protección cruzada (CVd-III-HLB, CTV-HLB)

* Plantas tolerantes o resistentes (Bové, 2006)

* El uso de activadores de la defensa sistémica pueden ser útiles. Park et al.,2007; DebRoy et al., 2004; Ton et al., 2002; Ahn et al., 2005; 2007.

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1. Detección y eliminación oportuna de plantas e insectosinfectados con el HLB útil solo cuando la incidencia esmenor al 5%. (Bové, 2006, Rocha et al., 2005)

Tomado de Juliano Ayres, 2010

Plataformas utilizadas para búsqueda de síntomas de HLBo ado de Ju a o y es, 0 0

2. Control del vectorCONACYTCONACYT

mediante aplicación de productos químicos de contacto o sistémicos, uso deenemigos naturales. Lama et al., 1988; Shui-Chen-Chui et al., 1988.

DesventajajLa baja población de insectos vectores no justifica la aplicación, además elnumero de aplicaciones necesarias para controlar la población durante todo elcultivo lo hace inviable.

Huevecillo

Ninfa

Adulto

Regmi y Lama, 1998

Inconveniente del control biológico…el hiperparatismoCONACYTCONACYT hiperparatismo

Chen-Chui et al., 1999

La busqueda de entomopatogenos puede ser una alternativa

Protección cruzada (CVd-III-HLB, CTV-HLB)

CONACYTCONACYT

CVd-IIICTV

Van Vuuren y Manicom, 2005

Plantas tolerantesCONACYTCONACYT

Hasta el momento no se tiene ninguna especie o variedad tolerante oHasta el momento no se tiene ninguna especie o variedad tolerante oresistente, sin embargo se sabe que la lima persa no presentasíntomas severos cuando esta infectada con el HLB.

Por otro lado el uso de activadores de la respuesta sistémica adquiridapueden ser una alternativa para el manejo de esta enfermedad.

Reducen 50 a 70% la infección de Erwinia amilovora y su comportamiento fue similar a las de control químico tradicional (sulfato d t t i i B i t t l 2000)de estreptomicina. Brissete et al. 2000)

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Activadores de la respuesta se han utilizado para el control de bacterias, hongos e insectos

Qiu et al., 2007 utilizaron activadores de la vía del salicílico para inducir resistencia de arroz a Xanthomonas oryzae y Magnaporte spy y g

Anand et al., 2008. demostraron que plantas de tabaco disminuyeron su susceptibilidad a Agrobacterium por aplicación exógena de Ácido salicílicosusceptibilidad a Agrobacterium por aplicación exógena de Ácido salicílico.

Otros autores han demostrado que la aplicación exógena de ácido salicílico o susanálogos funcionales disparan SAR e inducen resistencia a algunos patógenosanálogos funcionales disparan SAR e inducen resistencia a algunos patógenoscomo Pseudomonas aeruginosa (Prithiviraj et al., 2005), Staphylococcus aureus(Prithiviraj et al., 2005) etc.

Jasmonato y etileno importantes en la inducción de resistencia contrarizobacterias (Ton et al., 2001)

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UFC de A. tumefasciens ,en disco de hoja de tabaco tratadas con AS

Anand et al., 2008

Los inductores de la defensa sistémica

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Considerando:

La importancia social y económica de la lima persa en Campeche

El bajo rendimiento comparado con otras regiones del país

El peligro que representa el HLB

La falta de estrategias de manejo del vector y del HLB

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“Selección de ecotipos de lima persa (Citrus latifolia Tanaka) altamente productivos y potencialmente tolerantes al daño por

el Huanglongbing en Campeche México”el Huanglongbing en Campeche México .

Ecotipo. Población local de una especie que presenta características biológicas peculiares, lasp p q p g p ,cuales surgen como respuesta del genotipo a las características ecológicas típicas del ambientelocal (Enríquez, 2002).

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OBJETIVO GENERAL

Seleccionar en el estado de Campeche, ecotipos de limalt t d ti l t lpersa altamente productivos y evaluar su respuesta a la

infección por Candidatus liberibacter spp en presencia yausencia de un inductor de la respuesta sistémica

OBJETIVO ESPECIFICOCONACYTCONACYT

OBJETIVO ESPECIFICO

1. Determinar en tres ecotipos de lima persa, la eficiencia productiva, asícomo la calidad de los frutos producidos por los árboles de cada ecotipo decomo la calidad de los frutos producidos por los árboles de cada ecotipo delima persa seleccionado.

2. Explorar el 46% de la superficie de lima persa del estado de Campeche enp p p pbusca de árboles sospechosos de estar infectados por el HLB.

3. Monitorear en los diferentes ecotipos de lima persa, los niveles deinfestación de Diaphorina citri en las cuatro estaciones del año y determinarsu relación con la temperatura y humedad relativa.

4 E l l t i t t ló i l l d l dif t4. Evaluar la respuesta sintomatológica y molecular de los diferentesecotipos de Lima persa a la infección por HLB, así como su respuesta a laaplicación de dos diferentes inductores de la respuesta sistémica.

Estrategia experimentalCONACYTCONACYT Selección de 3 ecotipos de lima persa (por su origen)

Una plantación /ecotipo de lima persa Infección de árboles de lima persaFrancisco, Alberto

Alberto1 4

Estandarización de condiciones nutricionales

Volumen de producción

Aplicación de activadores de SAR (Salicílico, Jasmonato y Biotina)

Nivel de expresión de genes marcadores de la

Jesus

Alfonso

Alberto

Volumen de copa

Calidad de la producción (4 etapas de

Nivel de expresión de genes marcadores de la RSA

Evaluación sintomatológica y molecular

Alfonso

Alfonso

Ernesto

Alberto, Ernesto

Exploración de plantaciones de lima persa

p ( pproducción)

Eficiencia productiva

Titulo de HLB en los diferentes tratamientos Lupita

Alberto

Nutan

Muestreo sistemático

Colecta de muestras de árboles sospechosos

RobertoMonitoreo de poblaciones de D. citri

Determinación del nivel de infestación /etapa

Francisco, Alberto, Ron

Francisco, Alberto, Ron

Colecta de muestras de árboles sospechosos

Diagnostico para determinación de HLB en plantas e insectos

Roberto, AlbertoDeterminación del nivel de infestación /etapa ninfal

Registros de temperatura y humedad relativa

Francisco, Alberto, Ron

Oscar, Alberto2 3

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AVANCES OBTENIDOSAVANCES OBTENIDOS

Exploración de plantacionesCONACYTCONACYTMuestreo sistemático en cinco de oro, recomendado para enfermedades con

distribución en agregados y aleatoria

Gottwalt, 1995

Colecta de muestras de árboles sospechosos, 10 insectos por árbol sospechoso

E t ió d ADN ét d d CTAB difi d (R d Ak i 2006)Extracción de ADN método de CTAB modificado (Ruangwong and Akarapisan, 2006)

PCR (Meyer et al., 2007) con Cebadores específicos (Li et al., 2007)

Exploración de plantacionesCONACYTCONACYT

1 2 3

Resumen de los resultados obtenidos en la exploración de plantaciones de lima persa en el Edo. de Campeche

Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 TotalSuperficie explorada Ha 290 144 143 577Municipios 7 +1 +2 10Localidades 27 34 25Productores 97 68 48 213Muestras vegetales colectadas y 48 12 15 75Muestras vegetales colectadas y Diagnosticadas por PCR Tiempo real y punto final

48 12 15 75

Muestras de insectos colectados y 7 33 80 120yDiagnosticados por PCR punto final

Numero de positivos 8 * 8 12 20•No confirmado

Municipios explorados para la detección de insectos y árboles infectados con HLB

CONACYTCONACYTy

*Positivos detectados en las localidades de Pioneros del Río y dos Laguna sur ubicados en el municipio de Calakmul

Diagnóstico de HLB por PCR punto finalCONACYTCONACYT

T 1 2 3 4 M

1166 pb

Electroforesis en gel de agarosa al 1% mostrando productos de PCRlifi d ti t iti (T t l ti 1 2 3 4 itiamplificados a partir muestras positivas: (T control negativo, 1. 2, 3 y 4 positivo

a HLB, M marcador de peso molecular).

H004C

C. Las Campeche

CONACYTCONACYTH003C

H005C

H006C

H007CH008C

agua

Neg planta

Grafica de la amplificación por PCR tiempo real de 8 muestras positivas a HLB, mediante la sonda Taqman con oligos específicos para Ca Liberibacter asiaticusmediante la sonda Taqman con oligos específicos para Ca. Liberibacter asiaticus

Monitoreo de D. Citri

CONACYTCONACYT

Hall, 2010

Monitoreo de la población del vectorCONACYTCONACYT

9 trampas amarrillas por plantación, (3 por lote) (Hall, 2007)

Semanalmente se erifica el n mero de insectos por trampaSemanalmente se verifica el numero de insectos por trampa

Se registra la temperatura y humedad relativa con un datalogger

**Diciembre del 2009**

Se inició el monitoreo de las poblaciones del vector Diaphorina citri Baja población en árboles (0.5 insectos/brote/árbol)

Fluctuación poblacional de D. citri, en tresplantaciones de lima de persa del estado de

CONACYTCONACYTplantaciones de lima de persa del estado deCampeche, muestreados semanalmente mediantetrampas amarillas Agosto-2010-Junio 2011

140

160

rampas 

Xcoloche

Oxa

40

60

80

100

120

e Adu

ltos de D. citri en t

Bacabchen0

20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No. de

Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero Febrero Marzo Abril Mayo

*Cada punto, representa la media del número de insectos capturados en 9 trampas amarillas/ por plantación

Fluctuación poblacional de D. citri, en tres plantaciones de lima de persa del estado de Campeche, muestreados

CONACYTCONACYT semanalmente mediante inspección de brotes vegetales

70

80

90

va

30

40

50

60

mpe

ratura y H

umed

ad re

lativ

a

Temperatura °CHumedad relativa %

0

10

20

30

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55

Temp

Bacabchen, 259200

300

e D. c

itri en 

s 

Semanas de Agosto 2010-Julio 2011

Xcoloche, 0Oxa, 230

100

200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42. de ad

ulto

s de

brot

es

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

No

Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero Febrero Marzo Abril Mayo

*Cada punto, representa la media del número de insectos contabilizados en 36 brotes vegetativos por plantación, distribuidos en 9 árboles por plantación.

Presencia de agentes de control biológicoCONACYTCONACYT biológico

Colecta de muestras de insectos momificados (20 muestras de insectos)

Identificación*

Metharhizium anisopliae

Bauveria bassiana

Tomado de Arredondo, 2010)

*Dr. Jairo Cristobal Alejo. Instituto Tecnologico de Conkal

Selección de ecotipos (California, Cuba y España)

CONACYTCONACYTy p )

Una plantación/ Ecotipo

Análisis de macro ymicronutrientes en suelo yfollaje. Estandariza manejo de

Altura de la planta, diámetro de di ió N S O P

p p

Tres lotes/ Plantación

riego y practicas culturas deacuerdo a Curtí et al 2000.

copa en dirección N-S y O-P Nueve árboles/ lote

Formula de Turrel. V= 0. 5236 H. D2) (Quijada et al., 2002).Volumen de copa ) ( j , )Volumen de copa

Cuantificación de la producciónNumero y peso de frutos por planta en mayo-septiembre y abril-octubre

Eficiencia es la relación del volumen de producción/ volumen de copa

Selección de ecotiposCONACYTCONACYT

Colecta en cada ecotipo de lima persa, muestras de suelo y follaje.

3 muestras compuestas (5 submuestras/muestra) de suelo por plantación

3 muestras compuestas (5 submuestras/muestra) de follaje por plantación

Selección de ecotiposCONACYTCONACYT

Se realizaron las correcciones adecuadas para estandarizar el nivel nutricional de los árboles en 3 plantaciones

Se determinó la altura y cobertura de los árboles de cada lote en 3 plantaciones (MC. Alfonso Pérez Gutiérrez)

Características de la producción de tres plantaciones de lima persa del estado de

CONACYTCONACYT Campeche

90

100

60

70

80

30

40

50No. frutosPeso kgD. ecuatorial mmD. polar mm

10

20

30

6.3 ton/ha (Sagarpa 2008) 9 ton/ha en plantaciones

0Bacabchen Xcoloche Oxa Testigo

Diámetro mínimo de limón: 42-49mm (Codex stan 213-2005)

Diámetro mínimo de 47-57 mm en muestras

Características físico-químicas de frutos de lima persa en tres plantaciones del estado

de CampecheCONACYTCONACYT de Campeche

45

50

30

35

40

Rendimiento jugo mL

Acidez titulable

Grosor de cascara mm

15

20

25Grosor de cascara mm

Grados Brix

0

5

10

Contenido mínimo de jugo 42% (Codex stant 213-2005)

Bacabchen Xcoloche Oxa Testigo

Contenido de jugo: 45% en muestras

Contenido de Vitamina C en frutos de lima persa de tres plantaciones del estado de

C hCONACYTCONACYT

0 4

0.45

Campeche

0.3

0.35

0.4gramo

0.2

0.25

os / 1

C2 (vitamina C)

0.05

0.1

0.1500

ml

0 Bacabchen Xcoloche Oxa Testigo

Plantación

45 mg/100 gramos** (Curti et al., 2000)

Respuesta de ecotipos a la infección con HLB y asperjados con activadores de SAR

CONACYTCONACYT

1. Plantas asperjadas antes de la inoculación con Candidatus liberibacter asiaticus (no se realizó)3 Pl t j d d é d l i l ió HLB

Tratamientos

3. Plantas asperjadas después de la inoculación con HLB 4. Plantas asperjadas después de la inoculación con el activador a una dosis mayor. 5. Controles. Plantas sin inocular, inoculadas y sin activador, inoculadas y asperjadas

únicamente con la solución sin activador.

Genes marcadores NPR1

Se determina el nivel de expresión de Genes PR (PR1, PR 2 y PR 10)

Monitoreo de síntomas y Titulo de HLB después de la evaluación RT-PCR tiempo real (Meyer, 2007)p ( y )

En proceso

CONACYTCONACYT Efecto del AS asperjado sobre plantas de lima persa infectados experimentalmente con HLB

100 plantas de lima persa –inoculados mediante injerto de yemas de plantas infectadas (6 Febrero 2011)

Mantenimiento de plantas bajo condiciones de invernadero

Colecta de muestras para confirmar la infección (se realizó la extracción de ADN y diagnóstico mediante PCR Punto final Aun no se detecta a lade ADN y diagnóstico mediante PCR Punto final. Aun no se detecta a la bacteria).

Diagnóstico por PCR Tiempo realDiagnóstico por PCR Tiempo real

En proceso (18-04-2011)

CONACYTCONACYT

Efecto del AS, JA y Gentamicina asperjados en plantas de lima persa infectados con HLB

Tratamiento* Nivel 1 Nivel 2 controlAcido salicilico (200 3 3 3µM)Metil Jasmonato 100 µM 3 3 3Metil Jasmonato 200 µM 3 3 3µGentamicina 4g/Lt 3 3 3Agua 3 3 3

*Tres replicas de cada tratamientoTres replicas de cada tratamientoColecta de muestras antes de la aplicación y cada 8 días aproximadamente.Segunda aplicación 31-05-2010)

En proceso (18-04-2011)

CONACYTCONACYT

Variabilidad de aislados bacterianos en muestras de Hlb colectados en diferentes regiones del pais.

130 muestras de Yucatan, 35 de Campeche, 49 de Quintana Roo y 4 de Nayarit

1166pb de la 16s Porcentaje de identidad del 99%1166pb de la 16s -Porcentaje de identidad del 99%Cambios polimorficos en su mayoría fueron transcisiones: Purina:Purina (C:T), Pirimidina: Pirimidina (A:G) 5 Inserciones y 4 deleciones (Angelica Moreno Enriquez en5 Inserciones y 4 deleciones (Angelica Moreno Enriquez en preparación).

CONACYTCONACYT

Titulo bacteriano y distribución de HLBTitulo bacteriano y distribución de HLB

Variabilidad intraespecie

AGRADECIMIENTOSCONACYTCONACYT AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue realizado con recursos del Proyecto “Selección deecotipos de lima persa (Citrus latifolia Tanaka) altamente productivos ypotencialmente tolerantes al daño por el Huanglongbing en CampecheMéxico”. Fomix Campeche. Clave 46801.

Los autores agradecen la colaboración del Comité Estatal de SanidadLos autores agradecen la colaboración del Comité Estatal de SanidadVegetal del Estado de Campeche (CESAVECAMP) por el apoyo en elmonitoreo y exploración de plantaciones de lima persa en busca deárboles e insectos con HLB. También se agradece al Dr. Ron Brlanskyd l U i id d d Fl id l d ió d l i íde la Universidad de Florida, por la donación de los primers y asesoríapara detección por PCR Tiempo real de la bacteria causal del HLB en losinicios de este trabajo. Al MC. Roberto Canales del INIFAP CampusEdzna en Campeche por su apoyo en el monitoreo de la poblaciones delp p p y pvector en la primera etapa del proyecto. Al Dr. Jesús Arreola Enríquezdel Colegio de Postgraduados Campus Campeche, por sucolaboración en la determinación de las condiciones nutricionales de losárboles en tres plantaciones de lima persaárboles en tres plantaciones de lima persa.

CONACYTCONACYT

GraciasGraciasG ac asG ac as

GraciasGracias

250

Precipitación media mensual registrada en el estado de Campeche en el periodo de Agosto 2010 a Mayo del 2011

CONACYTCONACYT

100

150

200

reci

pita

cion

en

mm

Precipitacion mm

0

50

Agosto

Septie

mbre

Octub

re

Noviem

bre

Diciem

bre

Enero

Febr

ero

Marzo

Abril

Mayo

Pre

S N D

Temperatura media, maxima y minima mensual registrada en el estado de Campeche en el periodo de Agosto 2010 a

30

35

40Mayo del 2011

10

15

20

25Temp media °CTemp Max °CTem min °C

0

5

Agosto

Septie

mbre

Octub

re

Noviem

bre

Diciem

bre

Enero

Febr

ero

Marzo

Abril

Mayo