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Aislamiento y selección de Saccharomyces con mayor producción
de etanol a partir de chicha de jora procedente del Mercado de
Abasto de Monsefú- Perú, 2013
TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE
BIOLÓGO - MICROBIÓLOGO
AUTORA: Br. Victoria Gabriela Esquen Cuzma
ASESOR: Dr. Heber Robles Castillo
TRUJILLO – PERÚ
2013
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II
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE
BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO
Dr. Orlando Velásquez Benites
RECTOR
Dra. Vilma Julia Mendez Gil
Vice-Rector Académico
Dr. Alberto Santiago Uceda Duclos
SECRETARIO GENERAL
Dr. Hermes Escalante Añorga
DECANO D ELA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dr. César Augusto Jara Campos
SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dra. Bertha Soriano Bernilla
DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
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MIEMBROS DEL JURADO
Ms. C. Juan Wilson Krugg
PRESIDENTE
Dr. Heber Robles Castillo
SECRETARIO
Dra. Manuela Luján Velásquez
VOCAL
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IV
APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran
que el presente informe de Tesis ha cumplido con los requisitos formales y
fundamentales, siendo aprobado por UNANIMIDAD.
Ms. C. Juan Wilson Krugg
PRESIDENTE
Dr. Heber Robles Castillo
SECRETARIO
Dra. Manuela Luján Velásquez
VOCAL
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DEDICATORIA
A DIOS, por conservarme con salud y
darme la fuerza de vencer obstáculos en el
transcurso de mi vida
A mis padres, JOSÉ Y GLADYS
Por su apoyo incondicional, su ejemplo de perseverancia,
sus consejos y valores, por la motivación constante que
me ha permitido ser una persona de bien.
A mi hermana KAREN,
Por el apoyo brindado, a pesar de
las circunstancias, para realizarme
como profesional.
A MARKO,
Por todos los gratos momentos que pasamos
y estar siempre junto a mí en las buenas y en las malas.
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AGRADECIMIENTO
Al Dr. Heber Robles Castillo, por concederme su apoyo y compartir sus
conocimientos, así como por su acertado asesoramiento en el presente trabajo de
investigación.
A la Sección Técnica del Departamento Académico de Microbiología y
Parasitología, en especial a la Ms. C. Carmen Lora Cahuas, por su apoyo y
facilidades para el uso de equipos, instrumentos y reactivos disponibles.
A los profesores de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y
Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo, por su amistad, dedicación, y
por brindarme sus conocimientos académicos durante mi formación como futura
profesional.
A mis tíos Jorge Cusma y Yola Malca, por el apoyo económico brindado y
alentarme a alcanzar mis sueños.
A mis compañeras y amigas, Sonia Grados y Claudia Bravo, por su
colaboración en el trabajo de la presente tesis.
A todas las personas que de una u otra manera estuvieron a mi lado, que
me enseñaron y me dieron ánimo. Gracias a todos.
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PRESENTACIÓN
Señores miembros del jurado.
En cumplimiento con las disposiciones vigentes del Reglamento de Grados
y Títulos de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de
Trujillo, someto a vuestra consideración y elevado criterio la presente tesis titulada:
“Aislamiento y selección de Saccharomyces con mayor producción de
etanol a partir de chicha de jora procedente del Mercado de Abasto de
Monsefú- Perú, 2013”, con el objeto de obtener el título profesional de Biólogo-
Microbiólogo.
Espero que la presente tesis sea de vuestra aprobación
.
Trujillo, Noviembre 2013.
Br. Victoria Gabriela Esquen Cuzma
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RESUMEN
El presente trabajo de investigación tuvo como objeto aislar y seleccionar
Saccharomyces sp. con mayor producción de etanol a partir de Chicha de Jora del
mercado de abasto de Monsefú (Perú). Para ello, se tomaron muestras de 800 mL
de chicha de jora de cinco puestos de venta del mercado, con botellas de plástico
limpias y desinfectadas. Las muestras se llevaron al Laboratorio de Biotecnología
donde se homogenizó y conservó para el paso posterior de obtención de las
levaduras. El aislamiento de las levaduras productoras de etanol, se hizo por la
técnica de agotamiento por estría en placas Petri conteniendo Agar Sabouraud
Sacarosado al 4% (ASS) e incubado a Temperatura ambiente (25 ± 3ºC) por 5
días. Se aislaron siete colonias típicas de levaduras, las que al analizarlos al
microscopio y de manera bioquímica mostraron ser compatibles con la morfología
típica de Saccharomyces las que se les asignó BTL13. La evaluación de la
producción de etanol se hizo a través de la determinación de la Capacidad
fermentativa (productividades) de las levaduras aisladas y se utilizó el método de
Davies-Griffith modificado. Siendo los de mayor productividad los cultivos BTL13L-
D5 y BTL13L-D2, con 0.13 y 0.11 (x 10-2 g etanol/g lev.h), respectivamente.
Palabras clave: Aislamiento, Selección, Saccharomyces, Chica de Jora, Mercado de abasto, Monsefú.
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ABSTRAT
The aim this research was intended as ethanol producing yeasts isolated from corn
steep liquor from Monsefú food market of the province of Lambayeque - Peru. For
this purpose, samples of 800 ml from four Mayorista food market stalls, plastic
bottles clean and sanitized. Samples were taken to the Biotechnology Laboratory
where homogenized and preserved for later step of obtaining yeast. Isolation of
ethanol-producing yeast was made by the technique of exhaustion streak in Petri
dishes containing Sucrose Sabouraud Agar 4% (ASS) and incubated at room
temperature (25 ± 3 ° C) for 5 days. Seven yeast typical colonies were isolated,
which when analyzed under a microscope and showed biochemical way is
compatible with the typical morphology of Saccharomyces which BTL13 assigned.
Evaluating ethanol production was through determination fermentative capacity
(productivity) of the yeasts isolated and used the method of Davies-Griffith
modified. Being more productive crops BTL13L-D5 and BTL13L-D2, with 0.13 and
0.11 (x 10-2 g etanol/g lev.h), respectively
Keywords: Isolation. Saccharomyces, corn steep liquor, Food Market. Monsefú.
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ÍNDICE
Pág. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE
OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO…….... II
MIEMBROS DEL JURADO…………………………………………………….…….… III
APROBACIÓN……………………………………………………………………………IV
DEDICATORIA……………………………………………………………………………V
AGRADECIMIENTO……………………………………………………………….…... VI
PRESENTACIÓN…………………………………………………………………….…VII
RESUMEN……………………………………………………………………….….…. VIII
ABSTRAT………………………………………………………………………………... IX
INDICE……………………………………………………………………………………. X
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………...…..1
MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………..…….7
RESULTADOS……………………………………………………………………….…..10
DISCUSIÓN…………………………………………………………………………....…14
ENUNCIADO RESUMEN…………………………………………………………….....18
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………...19
ANEXOS……………………………………………………………………………..…...24
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INTRODUCCIÓN
Las levaduras se han definido como hongos microscópicos, unicelulares, la
mayoría se multiplican por gemación y algunas por escisión. Este grupo de
microorganismos comprende alrededor de 60 géneros y unas 500 especies.(1) Los
caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su observación
microscópica. La forma de la levadura puede ser de esférica a ovoide, en forma de
limón, piriforme e incluso alargada, en cuanto a su tamaño, su diámetro oscila de
2 – 8 µ por 3 – 15 µ de longitud. (2)
Las levaduras se hallan ampliamente distribuidas en el medio ambiente, sobre la
piel de algunas frutas, en la superficie de los vegetales, en el aparato digestivo de
los animales, etc. Ya que no poseen la capacidad de desplazarse por sí mismas
dependen de vectores como el viento, insectos, animales, incluso el hombre (3). La
microflora natural de los frutos ricos en azúcares fermentables está compuesta
fundamentalmente por mohos y en menor número bacterias y levaduras. (4)
En la actualidad las levaduras más importantes empleadas en la fermentación,
desde el punto de vista biotecnológico y utilizadas en la industria agroalimentaria,
son las pertenecientes al género Saccharomyces (5), ya que estas presentan las
características de un productor de etanol ideal (6). Dentro de las especificaciones
que tendrían los organismos fermentadores se incluyen las siguientes
características: capacidad para fermentar un amplio rango de sustratos a altas
velocidades, tolerancia a etanol y la capacidad para producir altas concentraciones
de etanol, bajos niveles de formación de subproductos, tales como ácidos grasos y
glicerol y osmotolerancia. (5,7)
Las distintas especies de levaduras pueden ser muy diferentes en cuanto a su
fisiología, la mayoría necesitan más humedad para crecer y desarrollarse. El
intervalo de temperatura de crecimiento de las levaduras es en general, parecido
al de los hongos (8). Una reacción ácida del medio, próxima a un pH de 4 a 4.5,
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estimula el crecimiento de la mayoría de las levaduras, mientras que en medios
básicos, no crecen bien a no ser que se hayan adaptado a los mismos. En
general, los azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras.
Todos los heterótrofos obtienen fundamentalmente su energía de las reacciones
de oxidación - reducción, es decir, aquellas en las que los electrones son
transferidos desde un compuesto, el dador electrónico, o agente reductor, a un
aceptor electrónico, el agente oxidante. (9) La fermentación es una de las diversas
rutas catabólicas mediante las cuales muchos organismos obtienen energía
química de varios combustibles orgánicos en ausencia de oxígeno molecular o, de
una manera más general, cualquier compuesto inorgánico oxidado. (10) Las
levaduras pueden obtener la energía que les es necesaria para vivir, siguiendo
dos vías en la transformación de los azúcares del mosto, la respiración y la
fermentación. La respiración es la vía oxidativa de los combustibles orgánicos por
el oxígeno molecular; el oxígeno actúa, por tanto, como el aceptor electrónico final
en la respiración. (11)
En la fermentación ocurre una degradación incompleta de los azúcares hasta CO2
y etanol. Los electrones pasan desde un intermediario orgánico producido en la
degradación del azúcar, el dador electrónico, hasta otro intermediario orgánico,
que actúa como aceptor electrónico. Este proceso libera muy poca energía; por
ello, las levaduras al utilizar esta vía deben transformar mucho azúcar en alcohol
para cubrir sus necesidades energéticas (11)
La fermentación alcohólica es una biorreacción que permite degradar azúcares (11),
mediante una reacción de óxido-reducción realizada por organismos que
transforman monosacáridos tales como: glucosa, fructosa y galactosa en alcohol
etílico y CO2 (12). Cualquier producto que contenga o hidratos de carbono
fácilmente transformables en azúcar fermentable, almidón o celulosa sirve para la
producción de alcohol etílico. (3) Es sin duda la fermentación la etapa clave en el
proceso de la elaboración de bebidas alcohólicas. (13)
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Los azúcares constituyen el mejor alimento energético de las levaduras. Muchas
pueden, por ejemplo, catabolizar la glucosa, ya sea en forma aerobia o anaerobia.
El proceso típico es la disimilación anaerobia, conocida como fermentación
alcohólica, el cual da como resultado etanol y dióxido de carbono. La siguiente
ecuación resume este proceso:
C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2
Bajo condiciones aerobias, las levaduras, al utilizar el oxígeno del aire, pueden
oxidar la glucosa totalmente hasta dióxido de carbono y agua, o parcialmente,
produciendo productos como ácidos orgánicos y otros productos intermediarios. (8)
La capacidad e incapacidad para fermentar carbohidratos hasta etanol y CO2 es la
característica más usada para la diferenciación de especies. Aunque esto tiene
aplicación en la definición de géneros; por ejemplo, el género Saccharomyces, es
caracterizado por la fuerte fermentación de uno o más azúcares. Estas levaduras
son los microorganismos más importantes y los de mayor uso en la industria de
producción de bebidas alcohólicas; así tenemos que, parte de los jugos de frutas
sufre una fermentación natural causada por las levaduras silvestres presentes en
las frutas y que ha permitido el aislar y seleccionar dichas levaduras para la
producción más controlada y a mayor escala. (14)
La chicha de jora es un producto oriundo del Perú con más de 3000 años de
antigüedad, que se elabora artesanalmente y se consume, además, en otros
países de América del Sur, constituyendo un producto potencialmente
industrializable. (19) (20) En su elaboración artesanal con lleva una serie de etapas
que se encuentran sistematizadas en: malteado de maíz, molienda, cocción,
filtración y fermentación. (11)(21)
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Por otro lado, Monsefú es uno de los pueblos lambayecanos con profundo y
brillante pasado histórico, se encuentra ubicado a 14 km al sur de la ciudad de
Chiclayo, ha adoptado la bebida tradicional chicha de jora, el cual se expende en
mercados y restaurantes. (15) La chicha de jora es una bebida tradicional
consumida por los sectores medios y populares en la mayoría de regiones del
Perú, es en Lambayeque donde tiene un sabor especial; en tanto que es una
bebida alcohólica obtenida de la fermentación de la materia azucarada contenida
en el mosto de la malta de maíz, con un contenido alcohólico de 9% en volumen.
(16) (17) Por intermedio de la fermentación se activa la micro flora láctica nativa la
cuál es responsable de la fermentación láctica y/ o maloláctica. Las bacterias
lácticas son útiles como prebióticos por sus beneficios terapéuticos y nutricionales.
(18)
Al propiciar que los granos germinen y crezcan para obtener la jora, también
llamada winapu (del quechua winay que significa crecer), se desencadena el
proceso enzimático del malteado, que no solo desdobla el almidón, sino que
prepara el futuro sabor de la chicha. (21). La molienda tiene por objeto triturar la jora
para que las partículas del mismo se hidraten de modo que liberen fácilmente sus
sustratos y así producir el mosto de jora. El tamaño de la partícula deberá sopesar
entre la facilidad de liberación del extracto y la facilidad de recuperar el mosto. (22)
La cocción tiene por objeto extraer al máximo los compuestos solubles de la jora y
para ello se realiza una cocción que va de 6 a 24 horas. Se utiliza de 3 L a 10 L de
agua por cada kg de jora. La filtración separa el bagazo del mosto. Se realiza por
lo general empleando un cedazo. (11)
Para la fermentación se deja el mosto en cantaros de arcilla en donde se produce
la inoculación de microorganismos de manera natural ya que estos
microorganismos se encuentran en las porosidades de estos recipientes y son los
responsables de trasformar el mosto jora en la chicha de jora. (23)
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A lo largo de la fermentación se presenta una dinámica y sucesión de la
comunidad levaduriforme, directamente relacionada con el aumento en la
concentración de alcohol y variabilidad de compuestos orgánicos. Al inicio del
proceso es posible detectar la mayor diversidad de levaduras, y a medida que el
proceso avanza a las fases intermedia y final aparecen levaduras que se
caracterizan principalmente por su alcohol-resistencia y alto poder fermentativo
como la especie Saccharomyces cerevisiae. La intervención de las diferentes
especies de levaduras aporta propiedades organolépticas al producto final. (24)
La producción de bebidas alcohólicas utilizando levaduras, por fermentación de
azúcares es, por tanto, una de las aplicaciones de la biotecnología, más antiguas y
de gran importancia económica. (24) En el Perú, actualmente la demanda de
alcohol es superior a las posibilidades de suministro por lo que resulta de gran
interés elevar la producción de alcohol para satisfacer dicha demanda,
seleccionando levaduras capaces de experimentar mayor rendimiento alcohólico y
eficiencia fermentativa, por lo que el presente trabajo tiene como objetivo aislar y
seleccionar levaduras del género Saccharomyces con mayor producción de
etanol a partir de la chicha de jora procedente del Mercado de Abasto de Monsefú-
Perú.
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OBJETIVOS
Aislar y seleccionar Saccharomyces con capacidad fermentativa a partir de chicha
de jora del Mercado de Abasto de Monsefú- Perú.
Evaluar la productividad de los cultivos puros de levaduras del género
Saccharomyces aislados a partir de chicha de jora del Mercado de Abasto de
Monsefú- Perú.
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MATERIAL Y MÉTODOS
1. Material
1.1. Material biológico Chicha de jora de 5 puestos expendedores del Mercado de Abasto de Monsefú –
Perú.
1.2. Medios de cultivo y soluciones Agar Sabouraud Sacarosado (ASS) (Anexo 1)
Caldo Sabouraud Sacarosado (CSS) (Anexo 2)
2. Método
2.1. Recolección y transporte de las muestras Las muestras de chicha de jora, producidas en forma artesanal, fueron
recolectadas en frascos estériles de 800 mL, rotulándoles la fecha y hora. Se tuvo
cuidado de no taparlas herméticamente para facilitar la liberación de CO2. Luego
fueron transportadas al Laboratorio de Biotecnología del Departamento de
Microbiología y Parasitología, Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad
Nacional de Trujillo para su posterior procesamiento.
2.2. Aislamiento de levaduras El aislamiento de las levaduras se realizó por la técnica de agotamiento de
muestra por estriado en placa Petri servida con Agar Sabouraud Sacarosado al
4% (ASS), se sembró las 2 últimas diluciones (10-5 y 10-6), e incubado a 25 + 3°C
por 5 días. Las colonias que se mostraron como típicos de levaduras y estuvieron
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libres de contaminantes, se seleccionaron, anotaron sus características y se les
asignó un código, (25) el cual fue BTL13 – seguida por la muestra:
B: biotecnología T: Trujillo L: levadura 13: año 2013
2.3. Identificación de Saccharomyces. Los cultivos puros fueron caracterizados fenotípicamente en base a la descripción
morfológica de las colonias, comportamiento cultural en Agar Sabouraud
Sacarosado; coloración Gram y diferenciación bioquímica, utilizando carbohidratos
como: lactosa, maltosa, manitol, sacarosa y fructosa. (26)
2.4. Obtención de cultivos puros de Saccharomyces. Cada colonia de levadura seleccionada en el paso anterior, se analizó al
microscopio a las cuales se les hizo una observación en fresco y una coloración
Gram. Aquellas colonias que se mostraron como levaduras del género
Saccharomyces y estuvieron libres de contaminantes, se trasladaron a tubos de
ensayo con ASS inclinado incubándolo a 25 + 3°C por 5 días. Luego de observar
el desarrollo microbiano, se les rotuló con su código y se conservó en refrigeración
hasta la evaluación de la capacidad fermentativa.
2.5. Obtención de biomasa de cultivos puros de levaduras. Obtenido los cultivos puros de levaduras, se procedió a realizar la obtención de
biomasa de los cultivos puros de levaduras haciendo un crecimiento en toda la
superficie del medio ASS al 4% contenido en placas petri, los que se cosecharon
con agua destilada estéril, luego se centrifugó a 2000 rpm por 15 minutos,
finalmente se obtuvo el peso de la biomasa de la levadura, la que está lista para
evaluar su capacidad fermentativa.
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2.6. Selección de la capacidad fermentativa por el método
de Davies-Griffith modificado. La biomasa de levaduras obtenido en el paso anterior se resuspendió en 20mL de
Caldo Sabouraud Sacarosado al 10 % (CSS) y se colocó en un dispositivo de
fermentación en condiciones asépticas. Luego se selló con parafina para evitar la
fuga del gas producida por las levaduras; en la parte del embone del dispositivo,
se instaló una manguera de venoclisis para recoger el gas. El otro extremo de la
manguera de venoclisis se introdujo en una jeringa hipodérmica de 20mL llena de
solución de NaCl al 23% coloreado con azul de metileno, donde se midió la
producción del gas producido por las levaduras a través del tiempo. (25)
2.7. Evaluación de la capacidad fermentativa de
Saccharomyces. La evaluación de la capacidad fermentativa de cada cultivo puro de levadura se
realizó midiendo la producción de CO2 durante diez horas continuas de
fermentación, haciéndose lectura cada 2 horas (por triplicado).
El volumen de CO2 producido cada dos horas fue convertido a gramos de
etanol/gramos de levadura por hora, luego se calculó la productividad para cada
cultivo. En este paso, se seleccionó a la levadura mejor productora de etanol.
2.8. Análisis de datos Las Capacidades fermentativas medida en productividades (g.etanol/g levadura.
hora) de cada cultivo puro de levadura aislada de Chicha de Jora del mercado de
abastos de Monsefú, se clasificaron, organizaron y presentaron en tablas y figuras.
Los datos obtenidos de las productividades de las levaduras seleccionadas, fueron
evaluados por la prueba de T- Student para comparar y observar las diferencias
significativas. (26)
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RESULTADOS
Se aisló 40 y seleccionó 7 levaduras productoras de etanol a partir de muestras de
chicha de jora de 5 puestos de venta del mercado de abastos de Monsefú. De los
que presentaron características macroscópicas y microscópicas compatibles con
Saccharomyces (Figura 1)
A las levaduras seleccionadas se evaluó la productividad de etanol, utilizando el
método de Davies-Griffith modificado, durante 10 horas.
La Tabla 1, se observa la producción de etanol en gramos generados por cada
cultivo al fermentar en 10 mL de Caldo Sabouraud Sacarosado durante 10 horas
que duró la evaluación. Siendo los de mayor productividad los cultivos BT13L-D5 y
BT13L-D2, con 0.13 y 0.11 g.etanol/g levadura. h, respectivamente.
La Figura 2, muestra los perfiles de las productividades promedio de las levaduras
aisladas de la chicha de jora, obtenidas en Caldo Sabouraud Sacarosado y a
temperatura ambiente. La tendencia de la productividad es similar; sin embargo,
se observa una mayor productividad en los cultivos BT13L-D5 y BT13L-D2.
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Figura 1. Observación macroscópica, en ASS, y microscópica de levaduras
aisladas de la chicha de jora.
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Tabla 1. Capacidad fermentativa promedio (productividad) de Saccharomyces sp.
aisladas de Chicha de Jora del Mercado de Abastos de Monsefú – Perú, utilizando
el método de Davies-Griffith modificado.
Productividad (g.etanol/g levadura. h)
Saccharomyces Tiempo (horas)
2 4 6 8 10
BT13L -D1 0.015 0.033 0.048 0.066 0.078
BT13L-D2 0.023 0.041 0.067 0.091 0.110
BT13L-D3 0.016 0.034 0.052 0.075 0.100
BT13L-D5 0.028 0.055 0.096 0.110 0.130
BT13L-D6 0.014 0.027 0.042 0.060 0.074
BT13L-D8 0.013 0.026 0.041 0.055 0.071
BT13L-D9 0.015 0.025 0.038 0.053 0.070
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Figura 2. Perfiles de la productividad promedio de Saccharomyces aisladas de la
chicha de jora, en Caldo Sabouraud Sacarosado y a temperatura ambiente,
medida durante 10 horas.
0.00E+00
2.00E-02
4.00E-02
6.00E-02
8.00E-02
1.00E-01
1.20E-01
1.40E-01
0 2 4 6 8 10 12
Pro
du
ctiv
idad
pro
me
dio
(g.
eta
no
l/g
leva
du
ra. h
)
Tiempo (horas)
BT13L -D1
BT13L-D2
BT13L-D3
BT13L-D5
BT13L-D6
BT13L-D8
BT13L-D9
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DISCUSIÓN
Las levaduras son los microorganismos más utilizados para la producción
de etanol por la vía fermentativa, debido a que producen un mejor proceso de
separación después de la fermentación, además producen un contenido de
toxinas muy inferior a otros microorganismos. (27)
Para el aislamiento se usó Agar Sabouraud Sacarosado, en donde el crecimiento
de las colonias tuvo un aspecto característico al de Saccharomyces,
observándose el color, la textura y bordes de la colonia, lográndose aislar 40
levaduras de las diferentes muestras de chicha de jora. Las levaduras
fermentativas necesitan los azúcares para su catabolismo, es decir para obtener
energía necesaria para sus procesos vitales, pero además necesitan otros
substratos para su anabolismo como son nitrógeno, fósforo, carbono, azufre,
potasio, magnesio y vitaminas, especialmente de tiamina (vitamina B1). Por ello es
de vital importancia que el medio disponga de una base nutricional adecuada para
poder llevar a cabo la fermentación alcohólica. (28)Se usó ASS porque cumple con
las necesidades fisiológicas para el crecimiento y desarrollo de la levadura, siendo
materia nitrogenada, la peptona; azúcar, la sacarosa; un soporte sólido, el agar y
un pH ácido, ya que es más conveniente porque inhibe el crecimiento de las
bacterias. (29)
Saccharomyces muestra 5 fases de crecimiento bien definidas cuando es
cultivado en medios líquidos con glucosa como fuente de carbono: la fase lag, la
fase logarítmica, el cambio diáuxico, la fase postdiáuxica y la fase estacionaria. La
fase lag es un periodo de adaptación en el cual la célula se prepara para dividirse.
Durante la fase logarítmica las células alcanzan su máxima velocidad de
duplicación y llevan a cabo un metabolismo fermentativo del que se produce
etanol. Al disminuir la concentración de glucosa, las células atraviesan por el
cambio diáuxico, un periodo breve de tiempo en el cual no hay división, y la célula
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cambia de un metabolismo fermentativo a uno respiratorio. En la fase postdiáuxica
las células usan como fuente de carbono el etanol producido durante la fase
logarítmica e incrementan su resistencia al estrés gradualmente; en tanto que la
fase estacionaria se presenta cuando los nutrientes del medio se han agotado y no
hay división celular. (30)
El crecimiento en masa de las levaduras no resulta apropiado para su
identificación; en los cultivos de agar, como se presenta en la Figura 1, es difícil
diferenciar las colonias de levaduras de las de bacterias por lo que la observación
microscópica es una de las formas para su diferenciación, pero además se realizó
identificación bioquímica de las levaduras utilizándose carbohidratos como:
lactosa, manitol, maltosa, sacarosa y fructosa, se incubó durante 48h y a
temperatura ambiente, luego de este tiempo se observó crecimiento con grumos y
turbidez en las 3 últimas, tomándose estas como positivas y el resto negativas, en
el cual se comprobó que las levaduras aisladas y seleccionadas pertenecen al
género Saccharomyces. (31)
(Anexo 7)
En el presente trabajo se evaluó la productividad de las diferentes levaduras
aisladas de chicha de jora utilizando el método de Davies-Griffith modificado (32).
(Anexo 6) Este método permite calcular en forma indirecta la producción de etanol
midiendo el volumen de CO2 producido, esta equivalencia es factible debido a que
a partir, de un mol de glucosa se producen 2 moles de etanol y 2 moles de CO2;
por lo tanto, el número de moles de CO2 es equivalente al número de moles de
etanol producido. (27)Aunque no refleja verdaderamente la realidad, puesto que la
glucosa no toda se transforma en etanol y CO2 exclusivamente, es suficiente para
revelar el metabolismo característico de una levadura productora de alcohol, en
contraste con una levadura de panificación. (33)
Los resultados obtenidos de las levaduras, luego de ser identificadas con los
diferentes tipos de carbohidratos, demuestran que los cultivos aislados tienen
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diferentes capacidades fermentativas, siendo algunas mejores fermentadoras que
otras, como es el caso de la levadura BT13L-D5 que tuvo una productividad de
0.13 g.etanol/g levadura. h., este resultado fue obtenido utilizando el método de
Davies-Griffith modificado, resuspendido en Caldo Sabouraud Sacarosado al 10%
(CSS) y a temperatura ambiente, midiendo la productividad durante 10 horas
continuas.
La productividad obtenida no supera a otras levaduras antes aisladas, a pesar de
haberse trabajado con el mismo método, por ejemplo, Centurión (2008) aisló
levaduras productoras de etanol de fresa, ciruela y uva, siendo las mayores
productividades 2.86 x 10-2, 4.58 x 10-2 y 3.75 x 10-2 g etanol/g de lev.h.,
respectivamente. También se da en el caso de Robles (2012), quien aisló
levaduras productoras de etanol a partir de chicha de jora del mercado Mayorista
de Trujillo, en el cual las levaduras aisladas se les dio el código de BT-R1 Y BT-
R2, y mostraron productividades en promedio de 0.57 x 10-2 y 0.56 x 10-2 g
etanol/g de lev. h, respectivamente.
Estos resultados, probablemente fueron debidos, en el primer caso, a que no se
utilizó la Solución Azucarada Bufferada sino el Caldo Sabouraud Sacarosado, que
incluye otros componentes como el K2HPO4 y el NaH2PO4, en el cual su aporte
será esencial para el crecimiento, regular la síntesis de los lípidos y los
carbohidratos y mantiene la integridad de la pared celular, además a pH ácido
estimula la fermentación y la respiración, actúa como efector de numerosas
enzimas; piruvato quinasas, aldolasas, aldehídos deshidrogenosas, y permeasas e
interviene en la estructura de los ARN. (34)
En el segundo caso, que se trabajó con el mismo método y se utilizó el mismo
medio de fermentación, probablemente al momento de purificar los cultivos
provenientes de chicha de jora, se haya repicado células “agotadas” y produzca
poca actividad en la producción de etanol. Así mismo, cabe la posibilidad de haber
ocurrido un proceso degenerativo o deterioro gradual del rendimiento de las
levaduras como consecuencia de alguna mutación durante la manipulación. (35)
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Al considerar todos estos compuestos necesarios para un buen proceso en la
asimilación, no todas las levaduras aisladas tuvieron la capacidad de ser buenos
productores de etanol, debido a que varía con las diferentes clases, aún dentro de
un mismo género y de una misma especie.
También la influencia de la temperatura es muy importante sobre el desarrollo de
la fermentación alcohólica. La disminución o el aumento de la temperatura en un
intervalo entre 4 y 40°C afecta el funcionamiento de numerosas actividades
enzimáticas. En este intervalo, una variación de temperatura afecta negativamente
la tasa de crecimiento alrededor de un óptimo situado entorno a 30°C (36), es por
eso que este trabajo fue realizado a temperatura ambiente.
El pH tiene un marcado efecto en la velocidad de crecimiento y en el rendimiento.
El pH óptimo para algunos organismos en especial para las levaduras se
encuentra en un rango de 4.0 a 6.0. Un cambio en el valor de pH puede afectar su
composición o su naturaleza de la superficie microbiana al disociarse ácidos y
bases. Este último puede afectar la floculación de la biomasa o la adhesión a las
paredes. El pH tiene una gran influencia en los productos finales del metabolismo
anaerobio. (34)
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ENUNCIADO RESUMEN
Se aislaron 40 cultivos de levaduras con capacidad fermentativa a partir de chicha
de jora del Mercado de Abasto de Monsefú- Perú.
Se seleccionaron 7 cultivos puros de levaduras del género Saccharomyces con
capacidad fermentativa a partir de chicha de jora del Mercado de Abasto de
Monsefú- Perú.
Se evaluó la productividad de los cultivos puros de levaduras del género
Saccharomyces aislados a partir de chicha de jora del Mercado de Abasto de
Monsefú- Perú, siendo los de mayor productividad los cultivos BT13L-D5 y BT13L-
D2, con 0.13 y 0.11 g.etanol/g levadura. h, respectivamente.
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ANEXOS
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Anexo 1. Composición de Agar Sabouraud Sacarosado (ASS) al 4 %
Componentes Cantidad
Peptona 1.0 g
Sacarosa 4.0 g
Agar 2.0 g
Agua destilada 100.0 mL
pH 6.0 + 0.2
Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos y a 15 lb de presión, enfriar a
45 °C y servir en placas de Petri y tubos estériles.
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Anexo 2. Composición del Caldo Sabouraud Sacarosado (CSS) al 10%
Componentes Cantidad
Peptona 1.0 g
Sacarosa 10.0 g
Agua destilada 100.0 mL
pH 6.0 + 0.2
Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos y a 15 lb de presión.
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Anexo 3. Frascos conteniendo ASS con cultivos de levaduras aisladas a partir de
chicha de jora.
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Anexo 4. Crecimiento de Saccharomyces en ASS, incubado a temperatura
ambiental.
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Anexo 5. Carbohidratos usados en la identificación bioquímica.
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Anexo 6. Sistemas para medir la productividad de etanol de Saccharomyces,
incubado a temperatura ambiente (25 + 3), durante 10 horas.
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Anexo 7. Tabla utilizada para la identificación bioquímica para Saccharomyces.
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