COMPARACIÓN ENTRE EL MÉTODO DE COMPATIBILIDAD, TÉCNICA ELISA Y PCR COMO BASE PARA LA

IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES DE ARMILLARIAAguín Casal, O.; Mansilla Vázquez, J.P.; Abelleira Argibay, A.

Estación Fitopatológica "Do Areeiro". Servicio Agrario. Diputación Provincial de Pontevedra. Subida a la Robleda s/n . 36153 Pontevedra. Pontevedra.

MÉTODO DE COMPATIBILIDAD DE ESPECIES o PAIRING-TEST (Korhonen, 1978): Consiste en el enfrentamiento de un fragmento de una cepa haploide (obtenida a partir de una basidiospora) de cada una de las 6 especies europeas caracterizadas por este método,con otro desconocido que puede ser de naturaleza diploide o haploide (Korhonen, 1978;Guillaumin y Berthelay,1981). En este ensayo hemos utilizado 10 muestras diploides obtenidas a partir de rizomorfos, micelio invadiendo raíces y partes del carpóforo. Las cepas test haploides utilizadas fueron proporcionadas por el Dr. Korhonen. En una placa petri, con un medio de cultivo seleccionado (agar- malta) se colocan 2 trozos de micelio con una separación entre ellos de 2-3 milímetros. Las placas se mantienen en oscuridad a una temperatura entre 23-24ºC durante 2-3 semanas; pasado este tiempo y según la morfología adquirida por el cultivo se decide si el fragmento desconocido es compatible o no con la cepa enfrentada.

TÉCNICA ELISA (Priestley et al.,1994): Se probaron 50 muestras de naturaleza variable: rizomorfos (5), micelio de madera infectada (15), micelio en cultivo (15) y diferentes controles (15). Los anticuerpos monoclonales utilizados, AM-CA12 (anticuerpo específico para Armillaria mellea), AM-FG6 (anticuerpo específico para Armillaria ostoyae), AM-JE12 (anticuerpo que reconoce Armillaria ostoyae y Armillaria gallica), fueron suministrados por la Dra. Frances Dewey.

MATERIAL

Y

MÉTODOS

INTRODUCCIÓN

La determinación de las especies de Armillaria por la simple observación de sus cuerpos fructíferos o de la morfología del micelio en cultivo presenta grandes limitaciones, y así Korhonen (1978) propone un método de compatibilidad, diferenciando en Europa 5 grupos de incompatibilidad considerados, en la actualidad, como auténticas especies. En el año 1994 Priestley et al. dan a conocer un nuevo método de identificación basado en la técnica ELISA y, más recientemente, Harrington y Wingfield (1995) describen un sistema rápido y efectivo de diferenciación de las especies europeas y americanas mediante PCR.

La alta incidencia y las graves pérdidas económicas que este hongo está provocando en la provincia de Pontevedra, más concretamente en comarcas vitivinícolas, justifica la puesta a punto de estas tres metodologías, seleccionando aquella que nos permita identificar en el menor tiempo posible y de manera eficaz y fiable, las especies existentes en nuestra zona.

TÉCNICA PCR (HARRINGTON y WINGFIELD,1995): Con una punta de micropipeta se raspa la zona más joven de crecimiento del micelio y se introduce en un microtubo estéril de 0.2-0.5 ml donde previamente se han incorporado los dNTPS, Primers (O-1 y LR12R), enzima ADN Taqpolimerasa, buffer de PCR, Cl Mg y agua hasta obtener un volumen de 100 ml. Una vez completadas las diferentes fases en el termociclador, 2

para comprobar que la amplificación ha funcionado correctamente, se hace una primera electroforesis en gel de agarosa al 2%, confirmando la presencia de una banda situada a 900 pares de bases en cada una de las muestras. Para la determinación específica de las especies se utilizan tres enzimas de restricción: Alu I, Bsm I y Nde I.

Muestras Material utilizado Especie determinada

Vñ 1* micelio en cultivo A. mellea

Vñ2* micelio en cultivo A. mellea

Vñ3* rizomorfos en cultivo A. gallica

Vñ4* micelio en cultivo A. gallica

Vñ5* micelio en cultivo A. mellea

Vñ6* micelio en cultivo A. mellea

Vñ7* micelio en cultivo A. mellea

Vñ8* aislamiento sin éxito -----

B1 (Boj) seta A. mellea

T1 (Thuja) seta A. mellea

Muestra Material utilizado Especie determinada

Vñ1* micelio en cultivo A. mellea/ A.ostoyae ?

Vñ3* rizomorfos A. mellea /A.ostoyae ?

Vñ5* micelio en cultivo A. mellea/ A.ostoyae ?

Vñ11* micelio en planta A. mellea/ A.gallica ?

Vñ12* micelio en planta A. mellea ?

P1 (Pino) micelio en planta A. mellea ?

P2 (Pino) micelio en planta A. ostoyae/ A.gallica ?

Muestras Material utilizado Especie determinada

Vñ 1* micelio en cultivo A. mellea

Vñ2* micelio en cultivo A. mellea

Vñ3* rizomorfos en cultivo A. gallica

Vñ4* micelio en cultivo A. gallica

B1 (Boj) seta A. mellea

T1 (Thuja) seta A. mellea

MÉTODO DE COMPATIBILIDAD: Aunque en algunas muestras la determinación fue complicada, los resultados fueron confirmados por el Dr. Kari Korhonen

TÉCNICA ELISA: Todas las pruebas dieron resultados muy ambiguos, lo cual aportaba muy poca fiabilidad. Se hizo un ensayo conjunto (representado en la tabla) entre nuestro laboratorio y los autores del protocolo que corroboró nuestras primeras observaciones.

TÉCNICA PCR: Hasta el momento no hemos conseguido adaptar la técnica para nuestras muestras. Sin embargo, sabemos que este método está dando resultado en otros laboratorios (Ver comunicación presentada en este Congreso titulada "Identificación de las diferentes especies de Armillaria en el Reino Unido; la Dr. Ana Pérez et al. siguiendo su protocolo nos ha determinado varias muestras que previamente habían sido confrontadas por el test de compatibilidad, obteniendo la misma relación de especies).

RESULTADOS

CONCLUSIONES*En las muestras estudiadas se ha detectado la presencia de dos especies: Armillaria

mellea y Armillaria gallica.*El método de compatibilidad de especies exige el aislamiento en cultivo puro del hongo y

el mantenimiento de las cepas test en óptimas condiciones. Los resultados pueden ser confusos y bastante subjetivos siendo el tiempo aproximado de duración del proceso (entre 5-6 semanas) muy amplio para un laboratorio de diagnóstico.

*La técnica Elisa no necesita el aislamiento del hongo y posibilita la determinación de la existencia de Armillaria en muestras asintomáticas pero, a tenor de los resultados obtenidos, se descarta como método de identificación hasta que no se obtenga una caracterización más específica de los anticuerpos.

*La valoración del tercer método utilizado (PCR) no puede ser definitiva ya que, por ahora, no hemos completado el proceso y, en colaboración con la Dra. Ana Pérez, pretendemos llevar a cabo las variaciones necesarias para lograr el funcionamiento correcto de la citada técnica.

*Como conclusión a nuestro trabajo, podemos decir que el método de compatibilidad, que ha sido el más usado hasta ahora para la determinación de Armillaria, presenta una serie de inconvenientes que pueden ser subsanados por técnicas más actuales (como PCR y Elisa) una vez que se pongan a punto.

- Guillaumin, J.J. and Berthelay, S. 1981. Determination spécifique des armillaries par la méthode des groupes de compatibillité sexualle. Specialisation écologique des espéciesfrancaises. Agronomie, 1: pp. 897-908.- Korhonen, K. 1978. Interfertility and clonal size in the Armillariella mellea complex. Karstenia 18:31-42.- Harrington, T.C. and Wingfield, B.1995. A PCR-based identification method for species of Armillaria. Mycologia, 87 (2), pp. 280-288.- Priestley, R.; Mohammed, C.; Dewey, F.M. 1994. The development of Monoclonal Antibody- based ELISA and Dipstick Assays for the detection and identification of Armillaria species ininfected wood, pp.149-156. In: Modern Assays for Plant Pathogenic Fungi: Identification, Detection and Quantification. CAB-International. Oxford 0X10 8DE. UK.

BIBLIOGRAFIA

Los autores queremos expresar nuestro agradecimiento a los Dr. Kari Korhonen (Finnish Forest Research Institute, Helsinki), Dra. Frances Dewey (University of Oxford, UK), Dra. Ana Pérez (The Royal Horticultural Society, UK) y Dra. Carmen Salinero (Estación Fitopatológica "Do Areeiro") por la colaboración y ayuda prestada para la realización de este trabajo.

AGRADECIMIENTOS

IX CONGRESO DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE FITOPATOLOGÍA. SALAMANCA, 19 al 23 Octubre 1998 EE FFAA

Carpóforos, basidio y basidiosporas de A. mellea

Armillaria borealis Armillaria cepistipes Armillaria ostoyae

Armillaria tabescensArmillaria gallica Armillaria mellea

Confrontación incompatible (línea negra)

Confrontación compatible(ausencia de línea negra)

Armillaria spp. sobre planta

Micelio de Armillaria spp. en cultivo

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* Plantas de vid de la denominación de origen Albariño “Rias Baixas”