“Como a Bioquímica auxilia na descoberta de novas terapias”

Palestrantes:

• Gabrielle do Amaral e Silva Muller: “Como a proteômica pode auxiliar a identificar novos alvos terapêuticos”

• Priscila Graziela Alves Martins: “Inibição enzimática como novo alvo para o tratamento de doenças como tuberculose, diabetes e peste”

• Tiago Bortolotto: “Como os ácidos nucléicos (DNA e RNA) podem ser usados em terapias?”

Universidade Federal de Santa CatarinaDepartamento em Bioquímica

Programa de Pós-Graduação em BioquímicaProjeto REUNI: Integração de alunos de Graduação – Pós-graduaçãoCentro de Biologia

Molecular Estrutural

Como a proteômica pode auxiliar a identificar novos alvos

terapêuticos

Universidade Federal de Santa CatarinaDepartamento em Bioquímica

Programa de Pós-Graduação em BioquímicaProjeto REUNI: Integração de alunos de Graduação – Pós-graduação

Gabrielle do Amaral e Silva Muller201007739

Florianópolis, 02 de junho de 2011

Centro de Biologia Molecular Estrutural

• A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um genOMA.

• Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo.

• Técnica que visa caracterizar processos biológicos e permitem a descrição de mecanismos celulares.

DNA

Pré- RNAm

RNAm

Proteoma

Proteoma

Por que utilizar a proteômica

Na busca de novos alvos terapêuticos vem sido utilizada a proteômica, pois ela revela proteínas biomarcadoras permitindo a identificação de indivíduos doentes X indivíduos

saudáveis.

Genes alvos: presente em células sadias e patogênicas.

Alterações na transcrição: RNA muitas vezes é expresso,

porém não é traduzido.

Proteínas: refletem diretamente se o individuo está com determinada doença por meio da interação ptn-anticorpo –ELISA.

Moléculas biomarcadoras são utilizadas como uma importante ferramenta para detecção e monitoramento e tratamento de doenças.

O status patológico de um indivíduo pode ser verificado por :

• Em 2004, haviam 1619 artigos somente com pesquisas na área da proteômica (hoje - 29564);

• Destes 192 artigos eram referente a proteômica clínica (hoje - 3702);

• E, 71 eram referentes a procura de moléculas biomarcadoras utilizando-se a proteômica como ferramenta (hoje - 5247);

Proteômica

• Diagnóstico: Próstata, mama, pâncreas, fígado, câncer de cabeça e nuca;

• Proteínas sinalizadoras são pouco abundantes em estágios iniciais;

• Falso negativo: indivíduos com câncer o exame negativo;• Falso positivo: indivíduos sem câncer e exame positivo;

Câncer

Proteína CA – 125 (Câncer ovariano): são positivos 50 % a 60%. É elevado endometriose e gravidez;

• 2006: Clinical Proteomic Technologies for Cancer (CPTC) foi fundada para acelerar o desenvolvimento de tecnologias mais sofisticadas na busca de biomarcadores.

National Cancer Institute

Proteômica

• Técnica relativamente barata;

• Rápida;

• Poderosa ferramenta na busca por biomarcadores em fuidos e tecidos humanos;

• Géis 2DE com espectrometria de massa e a utilização de sofisticadas ferramentas de bioinfomática são capazes de discriminar estados iniciais da doenças, de tumores belignos e malignos.

Vantagens proteômica

• Grande quantidade de proteína;

• Não detecta proteínas pouco abundantes;

• Durante a detecção pode ir outros tecidos e isso pode resultar na diminuição da precisão do método;

• Antes de iniciar a busca por biomarcadores é necessário a padronização e reprodutibilidade dos géis;

• Comprovação em diversos laboratórios;

Desvantagens proteômica

Proteômica

Proteômica sistemática: mapa protéico de:

Tecidos

Células

Compartimentos celulares

Proteômica diferencial: faz análise das modificações a nível protéico comparativamente com proteínas de referência:

Desenvolvimento

Interações entre microorganismos e hospedeiros

Tratamentos

Fluxograma das etapas experimentais

Tampão de lise Lise mecânica da célula

30´ a 1200 x gGelo por 20 min

Diversas macromoléculas

Proteínas

Extração da amostra

1. Não existe um método Universal;

2. Objetivo a serem visualizados no gel 2DE: Maior quantidade de proteína possível ou

somente um subgrupo de proteínas;

Solubilização das ptns

Métodos de ruptura celular

Proteínas oriundas da extração

Bradford

545 nm

Métodos de quantificações de proteínas

Com base na concentração da curva padrão da BSA.

2D Quant Kit

480 nm

Com base na concentração da curva padrão da BSA.

• Fosfolipídios e ácido nucléicos: listras horizontais;

• Sal provoca alta condutividade na fita de pH: pode provocar desidratação em algumas porções do gel e hidratação em outras.

• Ácidos nucléicos: causam aumento da viscosidade da amostra, aparecimento de bandas adicionais, obstrui poros e liga-se a proteínas.

• Polissacarídeos: bloqueiam poros do gel, aumenta o tempo de focalização;

• Lipídeos: ligam-se a proteínas e diminuem a mobilização das mesmas no gel.

Limpeza das amostras

Agentes redutores: DTT

Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia

Agentes Surfactantes: CHAPS

Solubilização das proteínas

Tiras de strip com pH imobilizado

Re-Hidratação da amostra em gradiente de pH

Tampões-acrilamida

• Temperatura ambiente 25oC; • Over night;

Gradiente Faixa de pH

Linear 4,0-7,0

6,0- 11,0

3,0- 10,0

Não linear 3,0-10,0

Separação das proteínas em 1ª Dimensão

• É um método eletroforético que separa as proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos;

• Primeiro passo: escolha a faixa de pH ideal para a sua amostra;• Temperatura;• 3500V a qual é mantida por até mils volts/hora;

Corrente elétrica

Strips foram removidos

Cerâmica IEF Strips foram posicionados

Paper Pads umedecidos

Total: 15500 V/h e 25 uA/strip

Ettan IPGphor 3 Ajuste dos eletrodos

Separação das proteínas em 1ª Dimensão

Após coloração com Coomassie Blue G-250

por 24h

Separação 1ª dimensão Separação 2º dimensão

Preparação do gel em placas:

1. Homogêneo;

2. Concentração da acrilamida é graduada.

Eletroforese em 2º Dimensão

É um método eletroforético que separa componentes de uma amostra de acordo com o peso molecular. Esta técnica é realizada em gel de poliacrilamida contendo SDS.

12,5%

Análise simultânea de diversas proteínas

Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes.

Análise das imagens dos géis

Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais)

Volume dos spots: permitindo uma quantificação relativa

Presença ou Ausência de spots

Análise das imagens no gel

Descoloração Desidratação tripsinização Extração dos peptídeos

Digestão in-gel

Excisão dos spots

Série de passos

Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos.

Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas.

Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações pós-traducionais das proteínas.

Amostras 2-DE

Fonte de ionização

Analisador de massa

Detector

Sistema à vácuo

Identificação das proteínas por espectrometria de massa

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Identificação das proteínas por espectrometria de massa

Obrigada!!