Clasificacin de grupo ABO y D, con tcnicas en tubo y antisueros comerciales

Muestra: Sangre con citrato, EDTA o sangre sin anticoagulante.

Reactivos: Sueros clasificadores Anti A, Anti B, Anti AB, Anti DGlbulos testigos A y B

METODO:

a) Colocar en la gradilla 4 tubos para cada uno de los sueros clasificadores, un tubo para prueba autloga y 2 tubos para los glbulos A y B respectivamente.

b) Colocar en cada tubo una gota de cada uno de los sueros clasificadores, en el tubo de la prueba autloga colocar suero o plasma y glbulos rojos del paciente y en los tubos siguientes Glbulos A y glbulos B segn corresponda.

c) Agregar a cada tubo que contiene los sueros clasificadores, 1 gota de glbulos del paciente que se va a clasificar y a los tubos que tienen los glbulos A y B colocar dos gotas de suero o plasma del paciente.

d) Mezclar, centrifugar por 1 minuto a 1000 rpm y leer todos los tubos.

e) S se omite la centrifugacin, debe dejar reposar durante 1 hora a temperatura ambiente.

f) La lectura del grupo ABO debe ser la misma con los sueros clasificadores que con los glbulos testigos. Si existe alguna duda o los resultados son diferentes se debe reclasificar usando la misma muestra pero, lavada 4 veces con buffer y utilizando los sueros clasificadores.

g) Si en el tubo que contiene Suero Anti D, no se observa aglutinacin se debe realizar la Tcnica Determinacin de Du para confirmar Rh.

h) Leer y anotar los resultados en la hoja de registro de protocolo de receptores.

Clasificacin de grupo ABO. Tcnicas en tubo y suero de paciente (reversa)

a) Tomar dos tubos de Khan, rotular con GR. A, y GR. B respectivamente y el N de la muestra del paciente,

b) Agregar dos gotas de suero del paciente al tubo marcado A

c) Agregar dos gotas de suero del paciente al tubo marcado B

d) Aadir a cada tubo 1 gota de suspensin de GR. A y 1 gota de suspensin de GR. B respectivamente y mezclar

e) Incubar al menos 15 minutos o centrifugue a 1000 rpm. por un minuto en centrfuga clnica,

f) Resuspenda las clulas con agitacin suave. Los resultados de deteccin deben ser observados macroscpicamente.

g) Interpretacin del resultado: Aglutinacin es un resultado positivo del ensayo y refleja la presencia de una reaccin antgeno-anticuerpo. Si no se produce aglutinacin indica la ausencia de una reaccin antgeno-anticuerpo,

h) Leer y anotar los resultados en la hoja de registro de protocolo de receptores.

Investigacin de la variante DU

a) Colocar en un tubo una gota de suero anti D y una gota de glbulos del paciente suspendidos en su propio suero o plasma.

b) Incubar a 37C por 15 minutos.

c) Lavar 4 veces en salino o buffer. Eliminar el mximo de sobrenadante despus del ltimo lavado.

d) Agregar una gota de suero Antiglobulina humana (Coombs).

e) Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto. Observar si existe aglutinacin macroscpica.

INTERPRETACIN:

Si el resultado del test muestra ausencia de aglutinacin, se puede afirmar que corresponde a un Factor Rh NEGATIVO

Si el resultado del test muestra aglutinacin, existen dos posibles interpretaciones:El paciente tiene en sus glbulos la variante Du.Los glbulos presentan auto aglutinacin, ya sea por Anticuerpos de tipo Ig G o bien por interaccin con el medio en que estn suspendidos los anticuerpos anti Rh del antisuero usado.

Cuando el resultado de este test es POSITIVO (hay aglutinacin), se debe efectuar un test de Antiglobulina Directo (Coombs Directo) a los glbulos rojos en estudio. S el resultado de este test es NEGATIVO se puede concluir que el paciente pertenece a la variedad Du. S el resultado del test de Coombs directo es POSITIVO no se debe evacuar un informe hasta completar estudios con otros sueros.

El que se realizar en un centro de mayor complejidad.

Pruebas de coombs directa, (Tcnica en Gel)

Muestra: G.R. al 1% dispensando 1 vol.( 1 ml) de SOL. I y 10 l de sedimento de G.R.

Procedimiento:Identificar cada tarjetaAadir 50 l de G.R. al 1% en cada pocilloCentrifugar por 10 minLeer

NOTA: Terminado el tiempo de centrifugacin se debe leer inmediatamente, si no es posible retirar de la centrifuga y dejar en espera en la gradilla correspondiente. De los exmenes realizados en los turnos de noche se debe dejar la tarjeta para cotejar lectura en la entrega de turno en presencia de un profesional.

Pruebas de coombs indirecta (Tcnica en Gel)Para la deteccin de anticuerpos irregulares

a) Tomar una tarjeta de gel que contiene suero de Coombs Poliespecfico, ubicados a temperatura ambiente (no utilizar tarjetas que presenten deshidratacin o variacin en su presentacin al examen ocular),

b) Marcar cada pocillo con la identificacin del paciente. Retirar el sello que recubre el pocillo.

c) Diluir los Glbulos Rojos de los frascos de Panoscreen de la siguiente manera:Marcar un frasco I y otro II;Al primer frasco I agregar una gota (50 ul.) de Glbulos Rojos I ya agitados y agregar 200 ul. de Solucin 2Al frasco marcado II agregar una gota (50 ul.) de Glbulos Rojos II ya agitados y agregar 200 ul. de Solucin 2.d) Aadir 50 ul.(una gota) de las solucin de glbulos rojos ya preparada a cada pocillo segn corresponda (I, II).

e) Aadir 25 ul de suero o plasma del paciente a cada pocillo.

f) Incubar 15 minutos a 37 C.

g) Centrifugar por 10 minutos a la velocidad indicada por la centrfuga.

h) Interpretacin de resultados:

Hemlisis o aglutinacin es un resultado positivo del ensayo y refleja la presencia de una reaccin antgeno-anticuerpo. Si no se produce hemlisis o aglutinacin indica la ausencia de una reaccin antgeno-anticuerpo. Los ensayos negativos se deben confirmar adicionando clulas de control de Coombs.

Si no se observa aglutinacin despus de adicionar las clulas controles de Coombs a un test negativo, significa que el reactivo antiglobulina humana estaba inactivado, neutralizado o que fue omitido, y el resultado negativo se debe considerar invlido. En este caso la deteccin del anticuerpo debe ser repetida Si se observa aglutinacin despus de adicionar las clulas controles de Coombs a un test negativo indica que la antiglobulina humana agregada fue capaz de reaccionar y que el resultado negativo es vlido.

i) Leer y anotar los resultados.

Pruebas de compatibilidad con tcnicas en tubo

a) Tomar la unidad de glbulos rojos a transfundir,

b) Tomar un tubo de Khan y un tubo plstico, ambos rotularlos con los cuatro ltimos dgitos del cdigo de barra de la unidad a transfundir,

c) Sacar tubuladura y agregar una gota de glbulos rojos al tubo de Khan, el resto de la tubuladura se inserta en el tubo plstico, que se guarda en el refrigerador (recipiente muestras diarias)

d) Se resuspende la gota del tubo Khan en solucin PBS obteniendo dilucin al 5%, centrifugar por 1 minuto a 2500 rpm,, botar sobrenadante, escurrir en papel absorbente,

e) Aadir 2 gotas de suero o plasma del receptor,

f) Agitar y aadir 2 gotas de LISS, mezclar bien,

g) Incubar al menos 15 minutos a 37 C.(se puede incubar hasta 60 minutos), centrifugar el tubo durante 1 minuto a 1000 rpm. en centrfuga clnica y examinar macroscpicamente para determinar si se produce hemlisis y/o aglutinacin,

h) Lavar 3 veces, durante 1 minuto a 4000 rpm. la mezcla clulas/suero, llenando el tubo con PBS,

i) Botar sobrenadante, escurrir en papel absorbente

j) Agregar dos gotas de antiglobulina humana a las clulas sedimentadas.

k) Mezclar bien y centrifugar a 1000 rpm. durante 1 minuto

l) Resuspenda las clulas con agitacin suave. Los resultados de deteccin deben ser observados macroscpicamente.

m) Interpretacin del resultado:Hemlisis o aglutinacin es un resultado positivo del ensayo y refleja la presencia de una reaccin antgeno-anticuerpo. Si no se produce hemlisis o aglutinacin indica la ausencia de una reaccin antgeno-anticuerpo. Los ensayos negativos se deben confirmar adicionando clulas de control de Coombs.Si no se observa aglutinacin despus de adicionar las clulas controles de Coombs a un test negativo, significa que el reactivo antiglobulina humana estaba inactivado, neutralizado o que fue omitido, y el resultado negativo se debe considerar invlido. En este caso la deteccin del anticuerpo debe ser repetida Si se observa aglutinacin despus de adicionar las clulas controles de Coombs a un test negativo indica que la antiglobulina humana agregada fue capaz de reaccionar y que el resultado negativo es vlido.

n) Leer y anotar los resultados en la unidad a transfundir y libro de PC.

Pruebas de compatibilidad con tcnicas en gela) Tomar la unidad de glbulos rojos a transfundir,

b) Tomar un tubo de Khan y un tubo plstico, ambos rotularlos con los cuatro ltimos dgitos del cdigo de barra de la unidad a transfundir,

c) Sacar tubuladura y agregar una gota de glbulos rojos al tubo de Khan, el resto de la tubuladura se inserta en el tubo plstico, que se gurda en el refrigerador (recipiente muestras diarias)

d) Se resuspende la gota del tubo Khan en solucin PBS obteniendo dilucin al 5%, centrifugar por 1 minuto a 2500 rpm, botar sobrenadante, escurrir en papel absorbente

e) Agregar solucin I (+- un puf) logrando una suspensin de glbulos rojos al 1%,

f) Tomar una tarjeta de gel que contiene suero de Coombs Poli especfico, ubicados a temperatura ambiente (no utilizar tarjetas que presenten deshidratacin o variacin en su presentacin al examen ocular),

g) Marcar cada pocillo con los cuatro ltimos dgitos del cdigo de barra de la unidad a transfundir. Retirar el sello que recubre el pocillo.

h) Aadir 50 ul. de la suspensin de Glbulos Rojos de la unidad a transfundir, al pocillo correspondiente.

i) Aadir 25 ul de suero o plasma del receptor al mismo pocillo.

j) Incubar 15 minutos a 37 C.

k) Centrifugar por 10 minutos a la velocidad indicada por la centrfuga.

l) Leer y anotar los resultados en la unidad a transfundir y libro de PCControl de Calidad Interno1.) Diariamente los reactivos debern ser observados para descartar contaminacin (cambio de color), observar si hay sedimentacin de partculas, fecha de vencimiento.

2.) El profesional encargado deber chequear todos los reactivos cada vez que se cambie de lote o marca de estos. El chequeo se debe realizar con controles positivos y controles negativos. 3.) Sueros clasificadores al cambiar de lote se debe realizar una titulacin de anticuerpos.

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