citología i - práctica tinción nuclear
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METODO PREPARACIÓN DEL COLORANTEHEMATOXILINA DE HARRIS
RICHARD BEDONTECNÓLOGO MÉDICOSERVICIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICAHOSPITAL “VRG” - Hz
TINCIÓN NUCLEAR
OBJETIVOS
El alumno deberá identificar los reactivos principales para lapreparación del colorante Hematoxilina de Harris.
Entender el fundamento de la coloración nuclear. Al final de la práctica el alumno deberá presentar un mapa
conceptual de lo aprendido
TINCIÓN NUCLEAR
La Hematoxilina de Harris esta compuesta por unamezcla de Hematoxilina (5 g), Alcohol 100% (50 mL),Alumbre de Potasio (100 g), Agua destilada (1000 mL)y Oxido de rojo de Mercurio (2,5 g).
TINCIÓN NUCLEAR
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES:
FUNDAMENTO – QUE ES UNA SOLUCIÓN?
Son mezclas homogéneas de dos o mas sustancias, una solución es la mezclade un soluto en un disolvente, entendiéndose por soluto la sustancia que estaen menor proporción y disolvente la sustancia que esta en mayor proporción
TIPOS DE SOLUCIONES:
Sólidas, Líquidas y gaseosas
TINCIÓN NUCLEAR Cada uno de los componentes de la Hematoxilina cumple una función.
Alcohol 96% es solvente de la hematoxilina
Agua destilada es solvente del mordiente
Alumbre de potasio es mordiente
Oxido de Mercurio que oxida la Hematoxilina a Hemateina que es su ingredienteactivo
Finalmente la Hematoxilina que es el colorante
TINCIÓN NUCLEAR
La Hematoxilina necesita de un mordiente(intermediario) entre el tejido y el colorante,formando un complejo Tejido-Mordiente-Hematoxilina, compuesto por un complejo decoordinación formado entre un ion polivalente deun metal y el colorante, que no es fácil disociarlo.
TINCIÓN NUCLEAR
La Hematoxilina colorante básico reacciona congrupos aniónicos (cargados negativamente) decomponentes de los tejidos, como grupos fosfatoionizados (PO3-) de heterocromatina, nucléolos yácidos nucleicos (ADN y RNA) del núcleo, grupossulfato ionizados (SH-) en el citoplasma y matriz delcartílago, y grupos carbonilo (COOH-) de lasproteínas, por lo que son basófilos
TINCIÓN NUCLEAR
Existen dos métodos para teñir el núcleo
Se tiñe el núcleo con la intensidad de color deseada:
METODO PROGRESIVO
Se sobre-tiñe con hematoxilina no acidificada, luego seremueve el exceso de tinción con ácido clorhídricodiluido:
METODO REGRESIVO
TINCIÓN NUCLEAR
Grupos auxocromos de las moléculas de hematoxilina
Tonalidad rojiza pH < 3:
Tonalidad azulada pH > 3:
En pH 8 el núcleo adopta un color fuertemente azulado
Reactivo Función del colorante Función en la célula
HematoxilinaComponente activo:Hemateina (carganegativa) se obtiene de lamaduración (oxidación)
Cuando madura toma uncolor rojo vinoso, tonalidadque toman los núcleos
Sulfato de Potasio yaluminio
Mordiente – le da el color ala hematoxilina
Suministra cargas positivasque actúa como puentespara unirse a las cargasnegativas de la Hemateinay del ácido fosfórico delDNA nuclear
Ácido acético glacial Diferenciador, estabiliza elcolorante, previeneoxidación
Incrementa la precisión dela tinción nuclear
Agua destilada Disuelve el sulfato depotasio y aluminio porcalentamiento
Óxido de mercurio (rojo oamarillo)
Activa la hematoxilinapara obtener poroxidación: Hemateina
La Hemateina le da latonalidad a los núcleos
PROBLEMAS CON LA TINCIÓNCOLORACIÓN NUCLEARDEMASIADO PÁLIDA
Deficiente remoción del fijador,tiempo insuficiente de coloración,hematoxilina diluida con agua,HCl muy concentrado odemasiadas inmersiones, lavadocon agua corriente con muchocloro.
COLORACIÓN NUCLEAR MUYOSCURO
Frotis con áreas gruesas y finas,frotis hemorrágicos cambia el pH yhay mayor afinidad porhematoxilina, mal enjuague,pocas inmersiones en HCl o suconcentración es muy baja.
Definition of cytopathology
Cytopathology is the study of normal and abnormal exfoliated cells in
tissue fluid.
The individual cells reflect the normal and abnormal morphology of the
tissue from which they are derived.
Types of exfoliated cyto-pathology
Natural spontaneous exfoliation
Natural covering epithelium: skin, urinary tract, vagina, and cervix.
Glandular epithelial secretion: Breast (Nipple secretion).
Sputum
Urine
Exudates and transudate:
Pleural fluid Peritoneal fluid
Pericardial fluid
Artificial enhanced exfoliation:
Scrapings from cervix, vagina, oral cavity, and skin
Brushing and lavage: bronchi, GIT, and urinary tract
Fine needle aspiration (FNA) for:
Body cavity fluid: pleural, pericardial & peritoneal fluids
Cysts: neck, breast & ovary
Solid tissue: body organs, tumors
Role of cytopathology
Early detection of unsuspected diseases (malignant
or pre-malignant lesions).
Confirmation of suspected diseases without surgical
trauma.
Diagnosis of hormonal imbalance.
Useful in flow up the course of disease or
monitoring therapy.
Advantage of Cytopathology
Rapid diagnosis - Inexpensive - Simple
It is better in evaluating the infectious diseases.
Supplement or replace frozen section or biopsy
No injury to tissue allowing repeated sampling
It is better for hormonal assay
Cytopathological smear cover a wider surface than that
involved in surgical biopsy.
Disadvantage of Cytopathology
Interpretation of the morphological cellular changes is based only on
individual cell observation.
Not always finally diagnosis, so it is confirmed by histopathology in some
cases.
Not determine the size and type of lesion of some cases.
Factors that determine the appearance of cells
Type of the technique used.
Level of cell maturation at the time of cell collection.
Nature of the parents tissue: soft tissue, cyst, or solid organ.
Medium of the exfoliated cells.
Interval between the stain of the exfoliated cells and collection of samples.
Type of fixative, stain, and processing of the technique used.
PAP smear: named afterDr. George Papanicolaou (1883-1962)
Vaginal smears from guinea pigs (1917)
Women (1920)Hormonal cycles
Pathological conditions (1928)
Normal Cervix
Taking the Sample
Liquid Based Cytology – lab processing
The Pap Smear
Pap smears are not perfect
For a high grade lesion, the sensitivity of a single pap smear is only
60-80%
Estimated false negative rate is 30-50%
Requires adequate specimen collection
Requires adequate cytological review
Requires adequate patient and physician follow-up
10% of women with cervical cancer had inappropriate follow-up.
Requires access to care
50% of women with cervical cancer were never screened and 10% had
not been screened within 5 years of diagnosis.
Who to screen
Any woman with a cervix who has ever had sexual activity.
Screening frequency
Yearly until three consecutive normal pap smears, then may decrease
frequency to every three years
Annual screening for high-risk women is highly recommend.
When to stop routine screening
Age 65 and “adequate recent screening”
Three consecutive normal pap smears
No abnormal pap smears in last 10 years
No history of cervical or uterine cancer
Hysterectomy for benign disease
Hysterectomy for invasive cervical cancer
Cervical histology
Original Squamous Epithelium
Vagina and outer ectocervix
4 cell layers
Well-glycogenated (pink) unless atrophic
Columnar Epithelium
Upper and middle endo-cervical canal
Single layer of columnar cells arranged in folds
Mucin producing (not true glands)
Squamous Metaplasia
Central ectocervix and proximal endocervical canal
Replacement of columnar cells by squamous epithelium
Progressive and stimulated by
Acidic environment with onset of puberty
Estrogen causing eversion of endocervix
Transformation Zone
Zone between original squamo-columnar junction and the “new” squamo-columnar junction
Nabothian cysts visually identify the transformation zone if present
SquamousEpithelium
Parabasal Cells
Intermediate Cells
Superficial Cells
Endocervix
Endocervical Cells
Endometrial Cells
Non-Epithelial Cells
sperms
Lymphocytes Polymorphs
Normal smear
Metaplastic Cells