Cinetica enzimatica multisustrato

Dr. Marcelo Videa

31 de octubre de 2005

1. Analisis cinetico: reaccion bi-bi secuencial ordenada

Desarrollaremos la metodologıa para el analisis cinetico de una reaccion multisubstratotomando como modelo el esquema de una reaccion bi bi secuencial ordenada,

A + Ek1⇀↽k2

EA + Bk3⇀↽k4

EABk5⇀↽k6

P + EQk7⇀↽k8

Q + E (1)

asumiendo que las concentraciones de los substratos son mucho mayores que la concentracionde la enzima E o de cualquiera de sus especies asociadas. De esta manera podemos replantearla ecuacion 1 como un proceso cıclico que inicia y termina con la enzima E pasando por lasespecies intermediarias (en este caso EA, EAB y EQ). Las n especies enzimaticas constituyenlos vertices del ciclo, como se muestra a continuacion

E

EA

EQ

EAB

k 1[A] k3 [B]k 2 k4

k 6[P]

k 5

k8 [Q]k7

Procedimiento:

1. Se identifican numericamente los caminos prohibidos asociados con cada una de lascuatro especies enzimaticas. Estos son aquellos pasos que salen de cada vertice.

E(18); EA(23); EAB(45); EQ(67)

2. Eliminando uno de los vertices enlistar los pasos asociados con los n − 1 verticesrestantes. En este caso, eliminaremos el vertice correspondiente a EAB.

E (1,2,7,8)EA (1,2,3,4)EQ (5,6,7,8)

3. Ahora se realiza la multiplicacion algebraica de los pasos correspondientes a E, EA yEQ. Multiplicando primero E por EA obtenemos los siguientes caminos

E×EA: 11, 12, 13, 1421, 22, 23, 2471, 72, 73, 7481, 82, 83, 84

4. Antes de realizar la siguiente multiplicacion aplicaremos las siguientes reglas que nospermiten eliminar algunos caminos resultantes de la multiplicacion

i. se cancelan los caminos que contenga un mismo paso, (e.g. 11, 22)

ii. se cancelan los caminos equivalentes, (e.g. 12, 21)

iii. se cancelan los caminos que contengan caminos prohibidos, (e.g. 23, 18)

Aplicando estas tres reglas rescatamos 10 de los 16 caminos obtenidos en la primeramultiplicacion:

13, 14, 24, 71, 7273, 74, 82, 83, 84

5. Ahora multiplicamos los caminos anteriores con los pasos de EQ(5,6,7,8)

135, 136, 137, 138, 145, 146, 147, 148245, 246, 247, 248, 715, 716, 717, 718725, 726, 727, 728, 735, 736, 737, 738745, 746, 747, 748, 825, 826, 827, 828835, 836, 837, 838, 845, 846, 847, 848

Aplicando nuevamente las reglas del punto 4 depuramos la lista anterior para obtener16 caminos que son:

135, 136, 137, 146, 147246, 247, 248, 715725, 735825, 826835, 836, 846

6. Los caminos obtenidos se clasifican entre las especies enzimaticas. Un camino se asignaa una especie enzimatica si este no contiene alguno de los pasos del camino prohibidocorrespondiente a la especie enzimatica. En esta etapa los pasos de cada camino puedenescribirse en orden creciente

2

(18) E: 246, 247, 257, 357(23) EA: 146, 147, 157, 468(45) EAB: 136, 137, 268, 368(67) EQ: 135, 248, 258, 358

La informacion obtenida en este analisis nos permite escribir la concentracion relativa decada especie enzimatica

[E]

[E]0=

k2k4k6[P] + k2k4k7 + k2k5k7 + k3k5k7[B]

denominador(2)

[EA]

[E]0=

k1k4k6[A][P] + k1k4k7[A] + k1k5k7[A] + k4k6k8[P][Q]

denominador(3)

[EAB]

[E]0=

k1k3k6[A][B][P] + k1k3k7[A][B] + k2k6k8[P][Q] + k3k6k8[B][P][Q]

denominador(4)

[EQ]

[E]0=

k1k3k5[A][B] + k2k4k8[Q] + k2k5k8[Q] + k3k5k8[B][Q]

denominador(5)

donde el denominador es igual a la suma de los 16 terminos, que pueden factorizarse paradar

denominador = k2(k4 + k5)k7 + k1(k4 + k5)k7[A] + k3k5(k7 + k8[Q])[B]

+k1k3(k5 + k6[P] + k7)[A][B] + (k1[A] + k2)k4k6[P]

+k2(k4 + k5)k8[Q] + (k2 + k3[B] + k4)k6k8[P][Q] (6)

La velocidad de la reaccion puede escribirse en funcion a la ultima etapa reversible de laecuacion 1

v = k7[EQ]− k8[E][Q] (7)

e introduciendo las ecuaciones 2 y 5 llegamos finalmente a la expresion de velocidad siguiente:

v

[E]0=

k1k3k5k7[A][B]− k2k4k6k8[P][Q]

k2(k4 + k5)k7 + k1(k4 + k5)k7[A] + k3k5(k7 + k8[Q])[B] + k1k3(k5 + k6[P] + k7)[A][B]+(k1[A] + k2)k4k6[P] + k2(k4 + k5)k8[Q] + (k2 + k3[B] + k4)k6k8[P][Q]

(8)

La ecuacion 8 se simplifica considerablemente se consideran velocidades iniciales y por tantolas concentraciones de los productos son despreciables [P] = [Q] = 0

v0

[E]0=

k1k3k5k7[A][B]

k2(k4 + k5)k7 + k1(k4 + k5)k7[A] + k3k5k7[B] + k1k3(k5 + k7)[A][B](9)

3

y agrupando las constantes tenemos

v0

[E]0=

N [A][B]

C0 + CA[A] + CB[B] + CAB[A][B](10)

Si analizamos ahora esta ecuacion en condiciones tales que [B] � [A], podemos encontraruna expresion muy similar a la ecuacion de Michaleis–Menten para un solo sustrato

v0

[E]0=

N [A][B]

CB[B] + CAB[A][B](11)

v0

[E]0=

N [A]

CB + CAB[A](12)

v0 =(N [E]0/CAB)[A]

CB/CAB + [A]=

vmax[A]

KAM + [A]

(13)

De la misma manera, bajo la condicion experimental en la que [A] � [B] llegamos a laconclusion que CA/CAB = KB

M.

Utilizando estas nuevas constantes en la ecuacion 10 escribimos

v0 =vmax[A][B]

KAS KB

M + KBM[A] + KA

M[B] + [A][B](14)

donde KAS = (C0/CA)(CA)/CAB).

Finalmente, y pensando en el analisis de resultados experimentales linearizamos la ecuacion14 para obtener una ecuacion del tipo de Lineweaver-Burk con cuatro terminos

1

v0

=1

vmax

+KA

M

vmax

1

[A]+

KBM

vmax

1

[B]+

KAS KB

M

vmax

1

[A][B](15)

que se factorizan en dos terminos similares a los de una cinetica simple. El comportamientode la ecuacion 16 muestra en la Figura 1

1

v0

=1

vmax

(1 +

KAM

[A]

)+

KBM

vmax

(1 +

KAS

[A]

)1

[B](16)

4

1

2

3

4

5

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

KMB

[B]

vmax/v

[A] 8

Figura 1: Diagrama de Lineweaver–Burk para una cinetica bi bi secuencial ordenada. Ca-da lınea corresponde a experimentos en los que [A] se mantiene constante. La lınea rojacorresponde a las velocidades que se alcanzan cuando [A]→∞.

5