cinética de la actividad de las celulasas microbianas en el líquido de rumen

8/19/2019 Cinética de La Actividad de Las Celulasas Microbianas en El Líquido de Rumen

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Revista Cubana de Ciencia Agrícola

ISSN: 0034-7485

[email protected]

Instituto de Ciencia Animal

Cuba

Galindo, Juana; González, Niurca; Marrero, Yoandra; Aldama, Ana I.

Cinética de la actividad de las celulasas microbianas en el líquido de rumen

Revista Cubana de Ciencia Agrícola, vol. 39, núm. 4, 2005, pp. 587-592


La Habana, Cuba

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Revista Cubana de Ciencia Agrícola, Tomo 39, No. 4, 2005. 587

Cinética de la actividad de las celulasas microbianas

en el líquido de rumen

Juana Galindo, Niurca González, Yoandra Marrero y Ana I. Aldama

Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, La Habana.

Correo electrónico: [email protected]

Para determinar la cinética de las enzimas celulasas producidas por el pool de microorganismos celulolíticos

en el líquido de rumen filtrado (LRF), se efectuaron dos experimentos mediante diseño en bloques al azar,

con cinco réplicas y tres repeticiones. Los indicadores cinéticos que se estudiaron fueron: a) velocidad

inicial de la reacción enzimática (a los tiempos 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 y 2.0 h) y concentración de enzimas en

el líquido ruminal puro y diluido (1:2, 1:3, 1:4, 1:5 y 1:6). En el primer estudio, la velocidad inicial mostró

una relación polinomial entre el tiempo y el producto formado, y la ecuación que relaciona ambos factores

es y = -0.0634x2 + 0.2377x - 0.0094, R 2 = 0.99. La actividad enzimática y la enzimática específica se

redujeron a partir de las 0.75 h de incubación. En el segundo ensayo se demostró que la mayor actividad

celulolítica específica se encontró a concentraciones de proteína de 1.52, 1.99 y 2.76 mg/mL, equivalentes

a diluir el líquido de rumen, a razón de 1:4, 1:3 y 1:2, respectivamente. El valor más alto de actividad fue de

169.5 U/mg, cuando el líquido ruminal se diluyó a razón de 1:4. El menor valor de actividad específica se

encontró cuando se utilizó el líquido de rumen sin diluir (96.14 U/mg de actividad, a una concentración de

proteína de 5.194 mg/mL). La concentración de enzimas y su actividad mostraron una relación lineal y la

ecuación que la representa es: y = 42.729x + 207.27, R 2 = 0.96. Se concluye que 0.25 h de incubación y una

dilución del LRF de 1:4 son los rangos de tiempo y concentración de enzima en los que se produjo una

mayor actividad de las enzimas celulasas.

Palabras clave: rumen, bacterias celulolíticas, actividad celulolítica, celulasas.

El rumen es el sitio principal de degrada-

ción de la celulosa en los rumiantes (Dijkstra y

Tamminga 1995). La conversión de la celulosa

a glucosa requiere de la acción cooperativa

secuencial, llevada a cabo por una familia de

enzimas celulolíticas, constituida, al menos, por

tres complejos enzimáticos básicos:

endoglucanasas (CMCasa, EC 3.2.1.4),

exoglucanasas, nombradas celobiohidrolasas

(EC 3.2.1.91) y glucosidasas (EC 3.2.1.21)(Leatherwood 1965, Li y Forsberg 1987, Xue et

al. 1992, Awafo et al. 1996, Valiño 1999 y

Galindo 2001).

Este complejo de enzimas se produce por

los microorganismos que habitan en ese

reservorio (Shi- Zhan et al. 2001), entre los que

se incluyen las bacterias, protozoos y hongos

(Hoover y Strokes 1991 y White y Mackie 1993).

Las celulasas que pueden estar unidas a la

superficie celular, o que pueden degradarse en

el medio, son enzimas inducidas, cuya activi-

dad se inhibe por varios factores: el pH, la fuerza

iónica, la temperatura, la concentración del

sustrato y otros. Esto implica una disminución

en la utilización de los alimentos fibrosos por

el rumiante.

Aunque la actividad celulolítica de los

microorganismos del rumen se ha estudiado

en varios trabajos, los resultados son difíciles

de comparar, debido a los diferentes sustratosy procedimientos utilizados. Sin embargo, la

verdadera actividad celulolítica extracelular en

líquido de rumen no se ha señalado. Dada la

función de estas enzimas en la digestión de los

carbohidratos estructurales, es importante su

determinación para evaluar su potencial real

de acción. El objetivo de este estudio fue de-

terminar, caracterizar y realizar un estudio

cinético de las celulasas presentes en el líqui-

do de rumen filtrado.



Revista Cubana de Ciencia Agrícola, Tomo 39, No. 4, 2005.588

Materiales y Métodos

Procedimiento experimental

Se efectuaron estudios de cinética de las

enzimas celulasas producidas por los

microorganismos del rumen, en un diseño en

bloques al azar con cinco repeticiones en el

tiempo y tres repeticiones para cada uno de

los indicadores cinéticos: velocidad inicial de

la reacción y concentración de enzimas. Los

resultados se analizaron, según el diseño ex-

perimental seleccionado, y se utilizó el sistema

SPS para Windows en la determinación de las

regresiones entre los indicadores cinéticos que

se evaluaron.

El líquido de rumen utilizado para los estu-

dios procedía de un toro Holstein, con cánula

simple en rumen. Este se consideró como ani-

mal donante y consumió forraje fresco de king

grass (Pennisetum purpureum) y 1 kg de torta

de soya. Las muestras de líquido de rumen

utilizadas en los estudios enzimáticos se ex-

trajeron a las tres horas después del consumo

de alimento. Los muestreos se efectuaron me-diante la cánula y con la ayuda de una bomba

de vacío. El líquido se filtró por muselina. A

esta fracción se le denominó líquido de rumen

filtrado (LRF).

Los experimentos realizados fueron: a) De-

terminación de la velocidad inicial a los tiem-

pos 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 y 2.0 h de incubación de

la enzima con el sustrato y b) Concentración

de enzimas en el líquido ruminal puro y diluido

(1:2, 1:3, 1:4, 1:5 y 1:6).

La actividad celulolítica se determinó por el

método referido por Galindo et al. (2001), mo-

dificado para enzimas celulolíticas, a partir del

estudio realizado por Martínez et al. (1999) y

descrito según el procedimiento que sigue:

A 1 mL de líquido de rumen filtrado, (LRF) de-

bidamente diluido, se adicionó a un tubo de

centrífuga 1 mL de carboximetilcelulosa (CMC)

10 mg mL-1 y 2 mL de buffer fosfato de sodio

0.05 mol/L, pH 5.5 previamente atemperado a

39 ºC, durante 10 min. La reacción se detuvo a

los 15 min, con 2 mL de ácido 3.5- dinitrosalicílico

(3.5 DNS), agitando rápidamente. Pasados 10 min,

se centrifugaron a 8000 r.p.m, durante 15 min. Se

tomaron 3 mL del sobrenadante y se adiciona-

ron a un tubo de ensayo, el cual se colocó en

baño de agua hirviendo, durante 5 min. Des-

pués de enfriar a temperatura ambiente, se aña-

dieron 5 mL de agua destilada y se agitó fuer-

temente. La absorbancia se leyó a 540 nm

La unidad de actividad celulolítica (U mL-1)

se definió como la cantidad de enzima presen-

te en el líquido de rumen (mL), capaz de liberar

un µg de glucosa/h (µg h,1 mL-1). La actividad

específica se expresó como U de actividad

enzimática/mg de proteína (U mg-1).

Proteína. La concentración de proteína en

el líquido de rumen se determinó por el método

de Lowry et al. (1951). Se utilizó albúmina de

suero bovino como proteína patrón.

La carboximetilcelulosa (CMC) se prepa-

ró según describe Halliwell (1962) y el ácido

3.5 dinitrosalicílico (3.5 DNS), según Gascoigne

y Gascoigne (1960).

Determinación de la velocidad inicial. Para

verificar el intervalo de tiempo en el que se

trabajó con velocidades iniciales, la actividad celulolítica se determinó deteniendo la reac-

ción, por la adición de ácido tricloroacético

(TCA) al 10 %, a las 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5 y 2 h.

El líquido de rumen se utilizó puro; la CMC, a

razón de 10 mg mL-1 en buffer fosfato de sodio

0.05 mol L-1, pH de 5.5 y temperatura de 39 ºC.

Para cada tiempo, se colocaron dos tubos en

baño de incubación, los que contenían el

sustrato y el extracto crudo enzimático.

Concentración de enzima. El líquido de

rumen filtrado (LRF) se utilizó puro, a las di-

luciones 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 y 1:6, para obtener dife-

rentes concentraciones de enzimas (concentra-

ciones de proteína). La reacción se detuvo a unavelocidad inicial de 0.75 h, según se comprobó

en el ensayo anterior. El resto de los indicadores

se señalaron previamente. Para cada concentra-

ción de enzima se colocaron en el baño de

incubación dos tubos.

Resultados y Discusión

En los ensayos enzimáticos es importante

demostrar que la velocidad de la reacción que

se cataliza por una enzima es directamente pro-




porcional a la concentración de la misma, a una

determinada concentración de sustrato (Chávez

et al. 1990). En el presente trabajo se corrobo-

ró la necesidad de determinar el rango de tiem-

po en que se trabaja, con velocidades iniciales

de reacción (V0), fundamentalmente en los ex-

tractos crudos enzimáticos, en los que pueden

ocurrir reacciones colaterales.

El comportamiento de la curva que presenta

la figura 1 es el típico para los ensayosenzimáticos (Kochetov 1980, Kopecny y Wallace

1982 y Chávez et al. 1990). En la misma se repre-

senta la densidad óptica (DO), determinada a

540 nm, lo que constituye la unidad arbitraria de

la actividad enzimática a diferentes tiempos de

reacción.

Se observa que la velocidad inicial mostró

una relación polinomial entre el tiempo y el pro-

ducto formado. La ecuación que relaciona am-

bos factores es y = -0.0634x2 + 0.2377x - 0.0094;

R 2 = 0.99. Esto significa que la velocidad de la

reacción catalizada por la enzima es práctica-

mente lineal hasta las 1.5 h de incubación de

esta con el sustrato, para mantener posterior-

mente una velocidad de reacción constante.

En la tabla 1 se muestran los valores de

actividad enzimática, obtenidos a diferentes

tiempos de incubación. La relación entre el

tiempo de reacción y el producto formado se

mantuvo hasta 0.5 h y se señala en el rango en

que se pueda trabajar con velocidades inicia-

les. Es importante que el tiempo de reacción de

0.25 h es lo suficientemente corto para garanti-

zar que una pequeña fracción de sustrato se

utilice cuando aumente la concentración de en-

zima en el líquido de rumen. Esto puede indicar

que detener la reacción enzimática a ese período

significa un considerable ahorro de tiempo.

La actividad enzimática y la enzimática es-

pecífica se redujo a partir de las 0.75 h de

incubación (P < 0.001) y no se encontraron

diferencias entre las 0.25 y 0.5 h. Sin embargo,

a tiempos superiores a los señalados disminu-yó (P < 0.001). Estos resultados corroboran el

comportamiento que se observó en los estu-

dios acerca de la velocidad inicial de la reac-

ción enzimática (figura 1).

Los resultados no coinciden con los tiem-

pos de reacción a los que se determinó la acti-

vidad celulolítica, correspondiente a 1 y 2 h y

encontrada por Krisnamurt y Kitts (1969). No

obstante, confirman lo informado por Galindo

et al. (2004), lo que se verifica por los estudios

cinéticos realizados.

El comportamiento de la actividad

enzimática específica y la concentración de

proteína en el LRF se muestra en la tabla 2.

Como se observa, los mayores valores de ac-

tividad específica de las enzimas celulasas se

encontró a concentraciones de enzima (deter-

minada como proteína) de 1.52, 1.99 y 2.76, lo

que es equivalente a diluir el líquido ruminal

(LRF), a razón de 1:4, 1:3 y 1:2, respectivamen-

te. Quedó demostrado en el trabajo que el lí-

quido ruminal sin diluir presentó la más baja

actividad celulolítica específica (96.14 U/mg

Tabla 1. Influencia del tiempo de incubación en la actividad celulolítica

abcd Medias con letras no comunes en la misma columnas difieren

significativamente a P < 0.05 ( Duncan 1955)

*** P < 0.001

h,o pmeiT Lm/U,acitámizned ad ivitcA gm/U,acif íce psed ad ivitcA

52.0 49.717 a 90.751 a

5.0 6.656 a 6.341 a

57.0 88.694 b 07.801 b

0.1 84.924 c 59.39 c

5.1 30.563 c 78.97 c

0.2 92.282 d 67.16 d

±EE ***89.02 ***95.4




de proteína, a una concentración de proteína

de 5.194 mg/mL). Esta observación demuestra

que no toda la proteína soluble determinada

en el LRF tiene actividad celulolítica. Martínezet al. (1999) encontraron similar comportamien-

to cuando estudiaron la actividad proteolítica

en LRF.

No resulta recomendable diluir el líquido

ruminal, a razón de 1:6, para efectuar estudios

de cinética enzimática (valores de actividad

enzimática de 131.34 U/mg de proteína), debido

a que la concentración de enzima es insuficiente

para obtener una adecuada actividad celulolítica.

La determinación de la actividad celulolítica

a diferentes diluciones del LRF permitió estimar

la relación que existe entre dicha actividad y la

concentración de proteína en el líquido ruminal

(figura 2). La relación entre la concentración de

enzima y su actividad fue lineal y se representaen la siguiente ecuación: y = 42.729x + 207.27;

R 2 = 0.96.

En la gráfica se muestra que la velocidad

aumentó proporcionalmente hasta una concen-

tración de proteína en LRF, igual a 2.76 mg/mL,

equivalente a 4.4 x 102 U/mL. Esto implicó que

el líquido de rumen puede utilizarse a una con-

centración de proteína 2.76 mg/mL, lo que hace

posible cuantificar la concentración de enzimas

celulolíticas activas, independientemente de su

pureza (Chávezet al. 1990).

y = 42.729x + 207.27; R 2 = 0.96

Figura 2. Efecto de la concentración de proteína en

LRF en la actividad celulolítica (mg glu-

cosa h-1.mL-1 10 -2)

0

100

200

300

400

500

0 2 4 6 8Proteína, mg/mL

Actividad celulolítica

Figura 1. Determinación de la velocidad inicial de la

reacción de las enzimas celulasas

y = -0.0634x2 + 0.2377x - 0.0094

R 2 = 0.99

DO, 540 nm

Tiempo, h

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,5 1 1,5 2 2,5

abcMedias con letras no comunes en la misma columna difiere

significativamente P < 0.05 (Duncan 1955)

*** P < 0.001

Tabla 2. Comportamiento de la actividad enzimática a diferentes

concentraciones de enzimas (proteína) en LRF

FR Lled nóiculiD Lm/gm,aníetor P gm/U,acif íce psed ad ivitcA

6:1 01.1 43.131 b

5:1 62.1 9.341 a b

4:1 25.1 5.961 a

3:1 99.1 26.161 a

2:1 67.2 36.951 a

r iulid niS 491.5 41.69 c

±EE - ***03.8




Se concluye que 0.25 h de incubación y una

dilución del LRF de 1:4 son los rangos del tiempo y

concentración de enzimas, en los cuales se produjo

una mayor actividad de las enzimas celulasas.

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Recibido: 21 de noviembre de 2003.





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