CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

“Proyecto final”

PATRONES ELECTROFORETICOS DE OVOCITOS DE CERDO (SUS SCROFA)

MADURADOS EN PRESENCIA DE MALATIÓN

Asesor. González Márquez Humberto

Buzoianu Mendoza Yelliane

INDICE

INTRODUCCIÓN............................................................................................................. 1

Toxicidad sobre el desarrollo ......................................................................................... 1 Mutagénesis ............................................................................................................... 1

El ovario ........................................................................................................................ 2 Plaguicidas y compuestos químicos afines.................................................................. 3

Insecticidas .................................................................................................................... 4 Epidemiología............................................................................................................ 5

Bioquímica Y Fisiopatología...................................................................................... 6 La Resistencia a insecticidas ...................................................................................... 8

Clasificación de los insecticidas ..................................................................................... 4 Modo de acción de los insecticidas................................................................................. 6

Insecticidas organofosforados .................................................................................... 8 Factores operacionales en la resistencia...................................................................... 8

Reducida sensibilidad de la acetilcolinesterasa ........................................................... 7 Glutation s-transferasa................................................................................................ 7

Carboxilesterasas ....................................................................................................... 7 Esterasas .................................................................................................................... 7

Malatión ........................................................................................................................ 8 La proteómica en el estudio de la toxicología reproductiva............................................11

JUSTIFICACION.............................................................................................................11 ANTECEDENTES ...........................................................................................................12

OBJETIVO.......................................................................................................................12 HIPÓTESIS......................................................................................................................13

DISEÑO EXPERIMENTAL.............................................................................................13 Recuperación y cultivo de Ovocitos. .............................................................................13

Maduración In Vitro .....................................................................................................13 RESULTADOS ................................................................................................................14

BIBLIOGRAFÍA..............................................................................................................17

1

INTRODUCCIÓN La infertilidad por causa tóxica en hombres y mujeres es un tema de creciente interés en el marco de los peligros profesionales y de contaminación ambiental en general. La toxicidad reproductiva ha sido definida como la aparición de efectos adversos en el sistema reproductor, secundarios a la exposición a agentes ambientales. Se expresa en forma de distintas alteraciones de los órganos reproductivos y/o del sistema endocrino relacionado. Sus manifestaciones pueden ser:

• Alteraciones del comportamiento sexual,

• Reducción de la fertilidad, • Resultados adversos del embarazo,

• Modificaciones de otras funciones que dependen de la integridad del sistema reproductor.

Toxicidad sobre el desarrollo La toxicidad para el desarrollo ha sido definida como la aparición de efectos adversos en el organismo en desarrollo, posteriores a una exposición previa a la concepción (de cualquiera de los padres) o producida durante el desarrollo prenatal o durante el período postnatal hasta el momento de la madurez sexual. Se pueden detectar efectos de este tipo en cualquier momento de la vida del organismo. Sus manifestaciones principales son:

• La muerte del organismo en desarrollo, • Anomalías estructurales,

• Alteraciones del crecimiento, • Deficiencias funcionales.

La toxicidad sobre el desarrollo se utiliza con carácter general para designar las exposiciones de la madre, del padre o del producto de la concepción que conducen a un desarrollo anormal. (Aardema and MacGregor 2002)

Mutagénesis La exposición de cualquiera de los progenitores a algún agente tóxico antes de la concepción puede producir defectos del desarrollo por mutagénesis, es decir, cambios en el material genético que pasan a la descendencia. Estos cambios pueden afectar a genes aislados o producirse a nivel cromosómico. Los primeros pueden producir la transmisión de mensajes genéticos alterados, en tanto que los segundos pueden dar lugar a la transmisión de anomalías en el número o estructura de los cromosomas.

2

El sistema reproductor femenino de mamíferos

Ovario El ovario es el responsable del control de la reproducción a través de sus productos principales, ovocitos y hormonas esteroideas y proteicas. El proceso por el que se producen los ovocitos y las hormonas se denomina folículogénesis y depende de mecanismos reguladores tanto intraováricos como extraováricos. El propio ovario tiene tres subunidades funcionales:

• El folículo,

• El ovocito, • El cuerpo lúteo.

Durante el ciclo menstrual normal, estos componentes, bajo la influencia de la hormona folículo estimulante (FSH) y la luteinizante (LH), actúan conjuntamente para producir un ovocito viable para la fertilización y un ambiente adecuado para la implantación y la gestación posterior. Durante el período preovulatorio del ciclo menstrual se produce el reclutamiento y desarrollo folicular bajo la influencia de la FSH y la LH. Esta última estimula la producción de andrógenos por las células de la teca, mientras que la FSH estimula la aromatización de los andrógenos a estrógenos por las células de la granulosa y la producción de inhibina, una hormona proteica. La inhibina actúa sobre la hipófisis anterior, disminuyendo la liberación de FSH. Así se evita una estimulación excesiva del desarrollo folicular y se permite el desarrollo interrumpido del folículo dominante, el destinado a la ovulación. La producción de estrógenos aumenta, lo que estimula tanto el pico de secreción de LH, que provoca la ovulación, como los cambios celulares y secretores de la vagina, cuello, útero y oviducto, que mejoran la viabilidad y transporte de los espermatozoides. En la fase postovulatoria, las células de la teca y la granulosa que permanecen en la cavidad folicular del ovocito ovulado forman el cuerpo lúteo y segregan progesterona. Esta hormona estimula al útero para que proporcione un ambiente apropiado para la implantación del embrión si se produce la fertilización.

Foliculo El folículo como unidad reproductiva básica del ovario, mantiene el delicado ambiente hormonal necesario para que tenga lugar el crecimiento y la maduración del ovocito, este proceso se conoce como foliculogénesis e implica una regulación tanto intra como extraovárica. A medida que el folículo progresa desde folículo primordial a folículo preovulatorio (que contiene un ovocito en desarrollo), se producen numerosos cambios morfológicos y bioquímicos, y cada fase del crecimiento folicular presenta patrones característicos de sensibilidad a las gonadotropinas, producción de esteroides y vías de retroalimentación.

ovocito El desarrollo de los oogonios ocurre durante el periodo pre-natal por división mitótica de las células primigenias germinales. Esta rápida multiplicación continúa, lo que resulta en una numerosa cantidad de oocitos en la corteza del ovario al tiempo del nacimiento de la hembra o un poco más tarde. Cuando la hembra llega a la pubertad, la liberación de hormonas

3

gonadotrópicas estimula la división celular contínua que es completada por lo menos por un folículo en cada ciclo estral. El oocito primario se divide para producir dos células hijas desiguales. El contenido genético del oocito 1rio se retiene en cada célula hija pero la gran mayoría del citoplasma emigra hacia una sola célula llamada el oocito secundario. Es así que el oocito primario es básicamente un núcleo y se llama primer cuerpo polar, este es expulsado del óvulo al espacio perivitelino donde permanece hasta que desaparece. El oocito 2rio comienza sus etapas de desarrollo momentos antes o durante el tiempo de ovulación por activación de las hormonas gonadotrópicas y pasa de la profase I a la metafase I completando la primera división meiótica, detiene nuevamente la división al comenzar la profase II hasta el momento de la fecundación. Cuando ocurre fecundación, se activa el oocito 2rio y continúa su división meiótica para expulsar un segundo cuerpo polar y formar el óvulo maduro. Este último es de corta duración ya que se forma un cigoto relativamente rápido luego de haber completado la segunda división por meiosis. La reducción del número cromosómico ocurre del oocito primario (2N) al oocito secundario (N) y luego al óvulo maduro (N). {Betancourt, 2003. #29}

Xenobióticos, Plaguicidas e insecticidas y compuestos químicos afines

Xenobióticos La definición de xenobiótico es: “Sustancias extrañas”, es decir, agenas al organismo. Entre los xenobióticos figuran los fármacos, las sustancias químicas industriales, los venenos presentes en la naturaleza y los contaminantes del medio ambiente.

Plaguicidas Se acepta como definición universal de plaguicida a aquella sustancia química que elimina plagas. Los plaguicidas se clasifican de acuerdo a su rango de acción, es decir los organismos sobre los que actúan y/o por su composición química. Puede considerarse la segunda clasificación como más rigurosa ya que de acuerdo al contenido de los compuestos es posible conocer propiedades tales como la estabilidad, solubilidad y difusión en el medio, de tal manera que las características de un plaguicida perteneciente a un grupo determinado usualmente son parecidas a las del resto del grupo y, por lo tanto, afectan al mismo tipo de organismos. Siguiendo estos criterios los plaguicidas se clasifican en inorgánicos, naturales, fumigantes clorohidrocarbonados, organofosforados y carbamatos o uretanos.

Plaguicidas Inorgánicos son aquellos que en su composición incluyen arsénico, cobre o mercurio. Éstos son altamente tóxicos, esencialmente indestructibles por lo que permanecen en el ambiente por periodos prolongados y su manejo es muy complicado. Plaguicidas orgánicos o "botánicos" son aquéllos que, generalmente, se extraen de plantas, por ejemplo la nicotina y alcaloides nicotínicos, los cuales se extraen del tabaco. Los fumigantes son aquellos cuyas moléculas generalmente son pequeñas como el tetracloruro de carbono, el disulfuro de carbono y el dicloruro de etileno, y se utilizan para esterilizar el suelo o prevenir la proliferación de ratones e insectos en granos almacenados.

4

Los Clorohidrocarbonados u organoclorados son compuestos orgánicos que inhiben el transporte iónico en la membrana de tal manera que inhiben la transmisión de la señal nerviosa. Debido a que estos compuestos son muy tóxicos y permanecen durante mucho tiempo en el ambiente su uso esta restringido a zonas específicas, el más representativo de estos compuestos es el DDT.

Los organofosforados son compuestos que inhiben la colinesterasa, enzima esencial para remover el exceso del neurotransmisor acetil-colina en las sinapsis del sistema nervioso periférico, razón por la cual son extremadamente tóxicos para mamíferos, aves y peces aunque se degraden fácilmente en el medio.

Carbamatos o uretanos, comparten muchas propiedades con los organofosforados incluyendo el modo de acción, toxicidad, poca persistencia en el ambiente y baja bioacumulación. Aunque su empleo es contra insectos nocivos, deben ser utilizados con precaución ya que pueden afectar organismos benéficos para el hombre como las abejas.

Insecticidas Son compuestos químicos utilizados para matar insectos, (ejemplo: Hormigas), normalmente, mediante la inhibición de enzimas vitales. Tienen importancia para controlar plagas de la agricultura e insectos que afectan la salud humana y animal.

Clasificación de los insecticidas En la actualidad las principales clases de insecticidas utilizados para el control de vectores son: organoclorados (OCs), ciclodienos, organofosforados (OFs), carbamatos y piretroides, aunque comienzan a utilizarse en gran escala los insecticidas microbianos y los reguladores del crecimiento, al poder reducir sus costos de producción y mejorar sus formulaciones. Estos insecticidas pueden penetrar en el cuerpo del insecto por una de las siguientes vías: Envenenamiento por contacto: el insecticida penetra a través de la cutícula del insecto hasta alcanzar el sitio activo, ejemplo: OPs (malatión), OCs (DDT), piretroides (permetrina) o carbamatos (propoxur), o análogos de las hormonas juveniles (metropreno) e inhibidores del crecimiento de la quitina (diflubenzurón). Envenenamiento oral: el insecticida es ingerido y absorbido a través del intestino, ejemplo: insecticidas bacteriológicos, como Bacillus thuringiensis israelensis, el cual actúa liberando una endotoxina que destruye las células de la pared del intestino medio.

Fumigaciones: el insecticida penetra al cuerpo del insecto a través de los espiráculos del sistema respiratorio. Un grupo de insecticidas además de penetrar por contacto lo realizan también por esta vía, ejemplo: diclorvos.

Insecticidas organofosforados Se denominan insecticidas organofosforados (IOP) aquellas sustancias orgánicas derivadas de la molécula del ácido fosfórico. Forman parte de los insecticidas “de contacto” al absorberse por intermedio de los lípidos del caparazón de los insectos (Maklakov et al. 2001) Los insecticidas organofosforados (IOP) se encuentran ampliamente extendidos en la actualidad ya que son utilizados tanto en el medio laboral (agrícola y no agrícola) Como en el doméstico, en diversas industrias, medicina e incluso como armamento químico.

5

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), el manejo incorrecto de los IOP es responsable de gran número de intoxicaciones agudas caracterizadas por el desarrollo de un síndrome colinérgico y de múltiples complicaciones crónicas, siendo la neuropatía retardada una de las más representativas. En la actualidad se está dando más importancia a estas últimas, cuya frecuencia va progresivamente en aumento, ya que pueden pasar desapercibidas por desconocimiento médico o del propio usuario, que no es capaz de relacionar su sintomatología con la exposición a IOP.

Las consecuencias sanitarias de la exposición a IOP constituyen en la actualidad, un problema de salud pública de primera magnitud. El rol del profesional de Atención Primaria es primordial en el adecuado manejo de estos compuestos debido a su accesibilidad y a la realización de medidas preventivas eficaces, que son las principales armas para combatir la patología derivada de los mismos. (Banos and Bosch 1992) Los IOP son ampliamente extendidos en la actualidad (Casida and Quistad 1998), su uso más relevante, aunque no exclusivo es en la agricultura como insecticidas. Los compuestos con acción anticolinesterásica se han utilizado clásicamente en medicina para el tratamiento del íleo paralítico y atonía vesical, enfermedades neuológicas degenerativas, miastenia gravis, parálisis motriz postanestésica, glaucoma, recientemente, para la retinitis por citomegalovirus y algunos tumores (Khayat et al. 1994). A pesar de estar prohibidos como armamento químico a nivel mundial (gases nerviosos: sarín, tabún) (Gunderson et al. 1992), todavía son utilizados por algunos países como armas de guerra química o terrorista; es el “armamento de los países pobres” de potencial mortífero muy elevado y bajo precio. Pueden emplearse como aditivos en diferentes industrias: petróleo, disolventes, colorantes, barnices, cuero artificial, etc. En el ámbito doméstico constituyen la formulación de insecticidas habituales. Por último, debido al manejo incorrecto por parte de determinadas empresas fumigadoras, los IOP están siendo utilizados en la desinfectación y desinsectación de áreas y edificios públicos sin realizar las medidas preventivas necesarias, hecho que conduce a numerosas bajas laborales e incluso casos de invalidez parcial y total de empleados y personal relacionado con dichos centros (hospitales, piscinas, etc.) (Benavidez et al. 1997). La mayoría de las ocasiones, los pacientes desconocen que han estado en contacto con una zona fumigada y no pueden atribuir su cuadro clínico a una posible intoxicación. Por este motivo no serán correctamente diagnosticados ni tratados. Los organofosfatos y los carbamatos son menos persistentes que los organoclorados, y son los insecticidas más utilizados en todo el mundo. Esta clase de plaguicidas se degradan relativamente aprisa en el medio y en el organismo. Algunos organofosfatos y carbamatos presentan una toxicidad aguda, y también se han observado casos de neurotoxicidad crónica. La dermatitis es otro síntoma muy documentado de exposición a plaguicidas. (Benedico 2002)

Epidemiología Las intoxicaciones agudas y complicaciones crónicas producidas por los IOP constituyen en la actualidad un importante problema de Salud Pública (Satoh and Hosokawa 2000). Según la OMS se producen anualmente más de tres millones de intoxicaciones por plaguicidas y la mayoría son causadas por IOP . Últimamente se presta mayor interés a la posibilidad de complicaciones crónicas: (Stephens et al. 1996)

• Neuromusculares: polineuropatía distal, parestesias y debilidad muscular.

6

• Cardiotoxicidad: existen evidencias experimentales de una elevada prevalencia de cambios electrocardiográficos con patrón isquémico.

• Desórdenes menstruales, aumento del riesgo de aborto y secuelas fetales en mujeres embarazadas.

• Probable afectación de la fertilidad y la libido en el hombre • Neuropsicológicas: trastornos de conducta, memoria o estado de ánimo. Alteraciones

electroencefalográficas. • Digestivas: dispepsias, gastritis, hepatitis no víricas, pancreatitis.

• Respiratorias: irritación de vía aérea superior, hiperreactividad bronquial. • Dermatitis de contacto secundaria al efecto irritativo de los IOP o como reacción

alérgica. Considerando los problemas de salud asociados al medio laboral, los IOP son agentes

causales de determinadas enfermedades centinela ocupacionales. Es decir, existe un dano (enfermedad, invalidez o muerte) cuya evolución es modificable mediante una intervención y constituye una señal de alerta que pone de relieve deficiencias del sistema preventivo o asistencial. Podemos relacionar el manejo de IOP con: neuropatía tóxica inflamatoria, asma de origen laboral, neoplasias malignas de tráquea, bronquios, pulmón y tiroides, hepatitis tóxicas no víricas y pancreatitis (Benedico 2002).

Bioquímica y Fisiopatología Clasificación habitual de bioquímica y fisiopatología para los IOP

• Toxicidad muy alta: Metamidofos (Orthomonitor y Tamarón), Paration (Folidol).

• Toxicidad moderada: Clorpirifos (Dursban ), Dimetoato (Cekutoato, Dafene), Fention (Lebaycid), Monocrotofos (Ceku y Nuvacron).

• Toxicidad baja: Malatión (Benatión y Exatión).

Modo de acción Entre los insecticidas se encuentran los organofosforados (OP) Que son muy tóxicos y aun en dosis muy bajas pueden causar intoxicaciones y producir daños en la reproducción. Los OP afectan al sistema nervioso central por la inhibición de la acción de la enzima acetilcolinesterasa (AchE) que se encuentra tanto en insectos como en mamíferos, y cuya falla provoca la acumulación de la acetilcolina, produciendo ataxia y parálisis debido a la estructura química de los compuestos. En condiciones puras, los OP tienen la estructura de los fosfotioatos (Paratión, Fenitrotión y Diazinón) o de fosforoditioatos (Malatión). Ambos son inhibidores de AchE debido a que tiene electrones débiles que atraen fácilmente a los átomos de sulfuro (P=S) ambos tóxicos para la AchE: los OP son considerados como los plaguicidas que causan más envenenamientos agudos a nivel mundial, de 1993 a 1996 se presentaron cerca de 63 000 informes de envenenamiento no intencional por exposición a estos compuestos.

7

Los organofosforados, grupo al que pertenece el Malatión, inhiben a la acetilcolinesterasa, lo que origina la acumulación de acetilcolina en los espacios sinápticos de diferentes regiones del sistema nervioso central y periférico. Sin embargo, también pueden inhibir otras enzimas, como carboxilesterasas, colinesterasa sérica, quimiotripsina, tripsina, fosfatasa ácida, que tienen en común la presencia de un residuo de serina en el sitio activo que puede ser fosforilado por los insecticidas inactivándolas, generalmente de manera irreversible. (Benedico 2002)

Reducida sensibilidad de la acetilcolinesterasa En general, una AchE modificada es menos eficiente al hidrolizar su sustrato que una enzima normal. La alteración en los sitios activos causa una disminución en la reactividad con el inhibidor. Los estudios de inhibición sugieren que el acceso a los centros catalíticos de la enzima modificada es restringido por un cambio en su conformación29, 37. Smissaert y otros plantearon que en muchos casos, el cambio de conformación se debe a la asociación de un residuo de aminoácido al centro catalítico de la enzima. El insecticida sufre dentro del organismo del insecto una serie de reacciones mediante las cuales adquiere grupos funcionales que le permiten en una segunda fase, conjugarse con sustancias endógenas y dar como resultado compuestos más polares de menor solubilidad en lípidos y como consecuencia más fácilmente excretables. No siempre es necesario que el insecticida se transforme mediante reacciones de la primera fase, porque en su estructura puede poseer grupos funcionales que le permitan experimentar directamente las reacciones de la segunda fase (Bisset 2002)

Glutation S-transferasa Estas enzimas tienen gran importancia en la detoxificación metabólica de todos los animales y son conocidas por estar involucradas en la resistencia de los insectos a los insecticidas organofosforados. Se clasifican de acuerdo con la reacción que catalizan como alquil, aril y epoxitransferasas (Bisset 2002). Las transferasas del glutation son importantes en la detoxificación de organofosforados y proveen la forma más importante de resistencia metabólica al DDT a través de la dehidroclorinación al DDE (Lalah et al. 1995) .

Carboxilesterasas Estas esterasas poseen capacidad para metabolizar los insecticidas, las cuales por su nombre podría esperarse que hidrolizaran solo los ésteres carboxílicos, así como los piretroides sintéticos y naturales. Sin embargo, el grupo requiere una clasificación más amplia porque los ésteres fosfatos y carbamatos son también atacados. (Childers et al. 2001)

Como la mayoría de los insecticidas de hoy día son ésteres, estas enzimas son extremadamente importantes como agentes defensivos. En el caso de los mosquitos (Culex quinquefasciatus) resistentes a organofosforados, la enzima en cuestión se clasifica como una carboxilesterasa. (Bisset 2002)

Esterasas Según Raymond y otros (1987), las esterasas se clasifican en dependencia de la habilidad de hidrolizar los sustratos en 2 tipos: A (hidrolizan preferentemente el 1-naftilacetato) y B (hidrolizan preferentemente el 2-naftilacetato). Ellas pueden estar presentes individualmente en los mosquitos como es el caso de Cx. quinquefasciatus de California o juntas como en Cx.

8

quinquefasciatus del este de África. Callaghan y otros (1991) mostraron la correlación existente entre la elevada actividad de esterasas A y B y la resistencia a insecticidas organofosforados. A similares conclusiones otros autores arribaron previamente. (Bisset 2002).

Mecanismo de resistencia a insecticidas Ha sido objeto de múltiples estudios, no solo por ser un ejemplo interesante de adaptabilidad de los insectos, sino porque es el principal motivo que favorece la transmisión de muchas enfermedades. En 1960 se reportaron los primeros casos de resistencia a insecticidas organofosforados y carbamatos en Aedes aegypti, Fox en 1961 reportó una cepa en Puerto Rico resistente 10x a malatión y diazinón . La capacidad de resistir a malatión se asoció a la detoxificación mediada por enzimas de actividad específica: carboxilesterasas. El incremento de los niveles de resistencia a temefos está, presuntamente, asociado con este mecanismo, solo que las enzimas detoxificadoras son fosfatasas. Estos estudios sugieren la presencia de enzimas detoxificadoras específicas, que cumplen un papel importante como mecanismo de resistencia a organofosforados. (Bisset 2002) Según Miller (1988) se clasifican en 4 categorías:

• Resistencia por comportamiento: el insecto no entra en contacto con el depósito del insecticida.

• Resistencia a la penetración: donde la composición del exoesqueleto llega a ser modificada inhibiendo la penetración del insecticida.

• Sitio insensible: el sitio químico de acción para el insecticida se modifica reduciendo la sensibilidad a la forma activa del insecticida.

• Resistencia metabólica: la vía metabólica del insecto llega a ser modificada detoxificándose el insecticida o negando el metabolismo del compuesto aplicado en su forma tóxica.

La forma más importante de resistencia metabólica incluye la multifunción oxidasa, las glutation s-transferasas y las esterasas. En los insectos los mecanismos más importantes son el sitio insensible y la resistencia metabólica. La resistencia fisiológica puede ser vista como resultado de una interacción de estos factores e incluye penetración disminuida, secuestro y excreción.

Factores operacionales en la resistencia La dosis del plaguicida es un factor determinante importante de la dominancia. En relación con esto existe la formulación y la tasa de disipación del plaguicida en el medio ambiente. Después de la aplicación inicial, la concentración del plaguicida efectivamente decae, por causa de la degradación, dilución, y demás. Si esto ocurre rápido, entonces se puede pensar que la población recibe una dosis muy alta, Dl, o no recibe nada. La disipación de un plaguicida persistente ocurre de manera lenta, sin embargo, y por algún tiempo existe una dosis efectiva pequeña, Ds, que puede ser muy favorable para el desarrollo de la resistencia. Un plaguicida persistente también puede matar a inmigrantes susceptibles y de esta manera evitar una inmigración efectiva. (Aluigi et al. 2005)

9

Agentes xenobióticos en el ovocito y Folículo Anualmente se producen en todo el mundo varios centenares de millones de toneladas de plaguicidas. Herbicidas, fungicidas e insecticidas se emplean sobre todo en los países desarrollados para mejorar el rendimiento y la calidad de los cultivos. Los conservantes de la madera constituyen una parte mucho menor, pero también importante, del mercado. Las aplicaciones domésticas y de jardinería representan una proporción relativamente menor del consumo total, pero, desde el punto de vista de la toxicidad neonatal, las intoxicaciones domésticas son probablemente las más numerosas. También la exposición profesional es fuente potencial de exposición indirecta para el lactante si el trabajo de los padres supone el manejo de plaguicidas. La exposición a los plaguicidas se produce por absorción dérmica, inhalación e ingestión. Más de 50 plaguicidas se han declarado cancerígenos para los animales.

Cada uno de ellos tiene características que lo hacen específicamente sensible a la lesión química. Varios investigadores han estudiado la metodología de la detección selectiva de sustancias xenobióticas responsables de la toxicidad en las células de la granulosa midiendo los efectos sobre la producción de progesterona por parte de células de la granulosa en cultivo. La supresión con estradiol de la producción de progesterona por parte de las células de la granulosa se ha utilizado para verificar la sensibilidad de estas. El plaguicida p,p′-DDT y su isómero ο,p′-DDT dan lugar a una supresión de la producción de progesterona con una potencia aparentemente igual a la del estradiol. Por el contrario, plaguicidas como el malatión, el paratión y el dieldrín y el fungicida hexaclorobenceno no ejercen efecto alguno. Las células de la teca proporcionan los precursores de los esteroides que sintetizan las células de la granulosa. Se cree que son reclutadas a partir de las células del estroma ovárico durante la formación y crecimiento del folículo. El reclutamiento puede implicar la proliferación de las células del estroma, así como la migración a las regiones que rodean al folículo. Las sustancias xenobióticas que alteren la proliferación, migración y comunicación celular afectará a la función de las células de la teca. Las sustancias xenobióticas que alteran la producción tecal de andrógenos también pueden alterar la función folicular. Por ejemplo, las células de la teca producen los andrógenos que se metabolizan a estrógenos en las células de la granulosa. Se supone que las alteraciones de la producción de andrógenos por las células de la teca, tanto en el sentido de aumentos como de disminuciones, tienen un efecto importante sobre la función folicular. (Bonilla et al. 2001) Existen datos que demuestran claramente que los ovocitos pueden resultar lesionados o destruidos por este tipo de agentes. Los agentes alquilantes destruyen los ovocitos en los seres humanos y en los animales de experimentación. El plomo produce toxicidad ovárica. El mercurio y el cadmio también producen lesión ovárica que puede estar mediada por toxicidad sobre el ovocito.

Los ovocitos inmaduros, encerrados dentro del folículo ovárico, se encuentran detenidos en la profase de la primera división meiótica y para completar su maduración y liberación del folículo, es indispensable la participación de señales hormonales adecuadas (Eppig, 1993). Es por esto que la maduración es un evento crítico para la fertilización y el desarrollo embrionario que ocurren a continuación y es un evento (quitar) dentro del fenómeno reproductivo muy sensible a las agresiones de parte de distintos xenobióticos.

Ya que el folículo progresa desde el foliculo primordial, a preovulatoria y se presentan cambios morfologicos y bioquimicos (anteriormente mencionado). Estas características sugieren que existe una serie de puntos en los que es posible la interacción con sustancias xenobióticas. Además, hay distintas poblaciones foliculares dentro del ovario, lo que complica la situación,

10

posibilitando el desarrollo de una toxicidad diferencial. Los patrones de infertilidad inducidos por una sustancia química dependerían, pues, del tipo folicular afectado. Por ejemplo, un episodio de toxicidad sobre los folículos primordiales no produciría signos inmediatos de infertilidad, sino que acortaría el período de vida reproductiva. Por otro lado, un episodio de toxicidad sobre los folículos antrales o preovulatorios traería como consecuencia una pérdida inmediata de la función reproductiva. (Abeydeera et al. 1998)

Malatión El malatión es un insecticida organofosforado (figura 1) que no ocurre naturalmente. El malatión puro es un líquido incoloro, y el malatión de calidad técnica, que contiene >90% de malatión e impurezas en un solvente, es un líquido pardo-amarillento que huele a ajo. El malatión se usa para matar insectos en cosechas agrícolas y en jardines, para tratar piojos en la cabeza de seres humanos y para pulgas en animales domésticos. El malatión se usa también para eliminar mosquitos y la mosca de la fruta en extensas áreas al aire libre. La población general probablemente no está regularmente expuesta al malatión. Aunque la población en general no está expuesta al malatión , la exposición en altas cantidades de malatión puede causar dificultad para respirar, opresión del pecho, vómitos, calambres, diarrea, visión borrosa, dolores de cabeza, mareo, pérdida del conocimiento y posiblemente la muerte. Esta sustancia química se ha encontrado en por lo menos 21 de los 1,636 sitios de la Lista de Prioridades Nacionales identificados por la Agencia de Protección Ambiental (EPA). No hay prueba definitiva de que el malatión cause cáncer en seres humanos, aunque en algunos estudios se ha observado un aumento de la tasa de ciertos cánceres en gente que está expuesta frecuentemente a pesticidas, como por ejemplo agricultores y aplicadores profesionales. Los estudios en animales no han suministrado evidencia conclusiva de carcinogenicidad. La Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) ha determinado que el malatión no puede clasificarse en cuanto a carcinogenicidad en seres humanos. Es probable que los efectos del malatión sobre la salud de niños sean similares a los observados en adultos. No se sabe si los niños son más sensibles a los efectos del malatión que los adultos. Hay ciertos datos que sugieren que las ratas jóvenes pueden ser más sensibles que las adultas a los efectos sobre el sistema nervioso. No se han observado defectos de nacimiento en seres humanos expuestos a malatión. No obstante, se han observado efectos sobre el desarrollo en crías de animales que ingirieron suficiente malatión durante la preñez como para afectar la salud de la madre. Los estudios en animales han demostrado que el malatión puede ser transferido de una madre preñada al feto y de una madre que lacta al recién nacido a través de la leche materna. (Espinoza-Navarro and Bustos-Obregon 2005) El malatión puede ser detectado en su sangre y sus productos de degradación pueden detectarse en la orina, aunque solamente por unos pocos días luego de su última exposición. Si se sabe o se sospecha que estuvo expuesto, se puede llevar a cabo un examen que mide los niveles de la colinesterasa en su sangre. Niveles bajos de colinesterasa pueden deberse a exposición a malatión o pueden ser causados por otros factores sin relación a malatión. Estos exámenes generalmente no están disponibles en el consultorio, pero el médico puede mandar las muestras a un laboratorio que puede realizar estos exámenes. Sin embargo, ninguno de estos exámenes puede predecir si se presentará algún efecto nocivo. Con respecto a el efecto de los insecticidas en células sexuales masculinas, con el malatión se observó un ligero incremento de la capacitación y un incremento notable en los valores de la

11

reacción acrosomal. Con el diazinón se encontró una ligera disminución de la capacitación y de la viabilidad, pero la reacción acrosomal aumentó al mismo tiempo que disminuyó la viabilidad. (Espinoza-Navarro and Bustos-Obregon 2005)

.

Figura 1. Fórmula química del malatión.

La proteómica en el estudio de la toxicología reproductiva. Los grandes avances en biología molecular en los últimos años han dado como resultado un cúmulo de conocimientos sobre la estructura y función de los genes, una base de datos inmensa de secuencias genéticas y un grupo de nuevas tecnologías muy eficientes para monitorear las secuencias, la variación y la expresión global de los genes, a lo que se le ha dado el nombre de genómica (Aardema and MacGregor 2002). Esta es una definición muy amplia y engloba el estudio de los productos celulares controlados por el genoma (RNA mensajeros, proteínas, metabolitos, etc.). A estos nuevos métodos globales para identificar y cuantificar a estas familias de moléculas se les ha dado el nombre de tecnologías “-omicas” (proteómica, transcriptómica, metabolómica). El éxito de estas técnicas es que intentan, y muchas veces logran, caracterizar todos o casi todos los miembros de una familia de moléculas en un solo análisis. Con estas herramientas ahora se puede obtener una visión global de las actividades funcionales de una ruta bioquímica y de genética estructural (secuencias), diferente entre individuos o especies, lo que era impensable hasta hace poco. En particular, la proteómica se dedica al estudio del proteoma, es decir a caracterizar a la colección de proteínas expresadas por el genoma de un organismo en todas sus isoformas, polimorfismos y modificaciones postraduccionales en un momento fisiológico particular (IDIM, et al. 2005). Este momento fisiológico puede ser normal o patológico y en este último se encuentran los efectos biológicos adversos producidos por agentes exógenos en el desarrollo de la reproducción. A esta rama de la Toxicología podríamos llamarla Toxicoproteómica, o quizá Proteómica Toxicológica (Graham et al. 2005)

JUSTIFICACION Existen pocos los estudios acerca del daño producido en el sistema reproductivo de los humanos y otros animales expuestos a plaguicidas. Además, la importancia de los estudios de toxicología reproductiva a nivel básico radica en la necesidad de conocer los mecanismos por los cuales los plaguicidas afectan a los gametos durante su génesis y función, y las repercusiones que puedan

12

tener en la concepción y desarrollo de nuevos individuos, así como también los efectos producidos en su descendencia. En los últimos años se ha suscitado una gran preocupación sobre la salud reproductiva humana debido al incremento de tumores gonadales, especialmente en países desarrollados, una de cada cinco parejas es involuntariamente estéril (Carlsen et al. 1992) Entre 32 y 34% de los óvulos fertilizados e implantados no llegan a término y que aproximadamente 3% de los niños recién nacidos presentan malformaciones o alguna variación morfológica o bioquímica.

El hecho de que estos cambios en la salud reproductiva humana hayan ocurrido en un periodo corto, sugiere que pudieran ser causados por la exposición a agentes potencialmente tóxicos (APTs) que se encuentran en el ambiente. Actualmente estamos expuestos a casi 100,000 productos químicos de uso comercial y se estima que se generan entre 700 y 1000 nuevos compuestos cada año. La reproducción en las hembras de mamíferos es un proceso muy complejo que incluye distintas fases: ovogénesis, fertilización y embriogénesis entre otras, que se encuentran bajo un estricto control hormonal {Betancourt, 2003. #29}. Por esto, para conocer los mecanismos por los que un xenobiótico ejerce algún daño reproductivo, es necesario estudiar cada una de sus fases por separado, ya que cada agente químico puede tener distintos blancos y producir distintos efectos dependiendo del órgano o tipo celular involucrado.

ANTECEDENTES En el Laboratorio de Biología Celular se están llevando a cabo estudios en ovocitos porcinos sobre el efecto de dos OP: el malatión y el diazinón y de dos herbicidas: la atrazina y el fenoxapropetil sobre la fertilización, la viabilidad y el desarrollo embrionario hasta mórula . La razón para elegir el cerdo como modelo de investigación radica en que la fisiología del sistema reproductor y endocrino es similar al del ser humano. Se ha encontrado que el diazinón en diferentes concentraciones no afecta la fertilización, desarrollo embrionario temprano ni la viabilidad de los cigotos, ni embriones hasta el estado de mórula.

El malatión afecta la penetración de los ovocitos evaluada por la formación del pronúcleo masculino, disminuye el desarrollo embrionario y la producción de mórulas, y tiene un efecto tóxico reduciendo la viabilidad de los cigotos y los embriones en estado temprano de desarrollo.

OBJETIVO.

Determinar el efecto del Malatión sobre el patrón de expresión proteica de ovocitos de cerda madurados in vitro.

13

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ¿Cuáles son los cambios en la expresión genética en la maduración de ovocitos de Sus scrofa a nivel de proteína ?

HIPÓTESIS Si las células responden al estrés modificando la expresión genética, entonces se esperan modificaciones a nivel proteico que serán reflejados en los patrones electroforéticos.

DISEÑO EXPERIMENTAL

Recuperación y cultivo de Ovocitos. El siguiente método es una modificación al método de Abeydeera y colaboradores (1998). Se colectarán ovarios de hembras prepúberes y serán transportados al laboratorio en una solución salina (NaCl al 0.9%, Penicilina-G Potásica 75mg/ml, y sulfato de estreptomicina 50 µg/ml) a temperatura ambiente. (Abeydeera et al. 1998)Los ovocitos se recuperarán a partir de folículos de 3 a 6 mm de diámetro a través de aspiraciones sucesivas con jeringa de 10 ml y aguja 18G X38 mm. Se seleccionarán aquéllos ovocitos que estén rodeados por una masa folicular compacta y presenten citoplasma granular regular. Estos ovocitos serán lavados 3 veces en medio de maduración para posteriormente colocar de 30 a 35 ovocitos por caja en una gota de 500µl con el mismo medio pero suplementado con las hormonas folículo estimulante y luteinizante (FSH y LH), este medio habrá sido previamente cubierto con aceite mineral y equilibrado con CO2 al 5% en una incubadora a 39oC. La maduración se realizará de 44 a 48 horas en incubación bajo las mismas condiciones.

Maduración In Vitro Bajo el microscopio estereoscópico con una pipeta Pasteur alargada por calor se seleccionarán los complejos ovocito células del cúmulo (COC), eligiéndose aquellos que presenten ovocitos con el citoplasma uniforme y rodeado por una masa completa de células del cúmulo.

Los COC seleccionados, se lavarán tres veces en cajas de Petri con gotas de 500 µl de medio de cultivo TCM 199 con sales de Earle y bicarbonato de sodio, suplementado con PVA al 0.1%, D-glucosa 3.05 mM, piruvato de sodio 0.91 mM, estreptomicina, penicilina y Factor de crecimiento Epidérmico (EGF) 10 ng/ml, cubiertas con aceite mineral.

En una caja de cuatro pozos se depositarán de 20 a 40 ovocitos en gotas de 500µl de medio de maduración cubiertas con aceite mineral. Antes de la incubación se le agregarán 0.5 µg de LH 0.5 µg/ml de FSH. Las cajas se incubaran a 39°C en una atmósfera de CO2 al 5% y humedad a saturación, durante un periodo de 44 hrs. Transcurrido el tiempo de maduración, a cada pozo se

14

le agregarán 300 µl de hialuronidasa al 0.1% y utilizando la pipeta Pasteur alargada por calor para que pasen por ella los ovocitos sin dañarse; posteriormente, para quitar el exceso de la enzima se lavarán en dos gotas de 500 µl de medio de maduración TCM 199 suplementado y posteriormente en tres gotas de 500 µl de medio de fertilización TrisBuffered-Medium (TBM), compuesto por NaCl 113.1 mM. KCl 3.0mM, CaCl2.2H2O 7.5 mM, Tris 20.0, Glucosa 11.0 mM, piruvato de sodio 5.0 mM, suplementado con cafeína 2.5 mM y BSA al 4% (Abeydeera et al. 1998). En cajas de cuatro pozos, se depositarán de 20 a 30 ovocitos en gotas de 50 µl de TBM suplementado, cubiertas con aceite mineral.

Electroforesis La electrofores se realizo en el fastsystem, se coloca unas gotas en forma vertical en el MIQ al centro se coloca el gel evitando que se hagan burbujas, se coloca el marcador de peso molecular y la muestra y se corre el programa, cuando llega a 5oovts se colocan los buffers estrips SDS cuando llegue a 70vh se para.

Después los geles son fijados en metanol, ácido acetico y se tiñen con plata de la siguente manera: 20min con etanol, 1 min con Na2S203. 5H20 se lava con agua y se deja 20 minutos en plata después se lava con agua y se coloca el revelado. Después se analizó con el densitometro.

15

RESULTADOS

Figura 1electroforesis de peso molecular Tabla 1 resultados de peso molecular

Marcador Control Malatión

216.8 208.15 ----------

97.4 100.61 103.69

-------- 76.92

70.69 66.25

66.2 69.89 64.75

------ 47.77

45.0 42.48 42,57

40.00 40.25

39.49 37.86

31.00 37.23 35.56

34.80 33.95

33.02 31.99

21.5 29.88 ------

27.52 28.42

14.4 24.41 25.32

33.00

76.92

33.95 37.86

64.75 42.57

31.99 30.99

35.56

216.85

97.40

66.20 45.00

31.00

21.50

14.40

208.15

100.61

70.69 69.89 42.48

39.49 34.80 31.02

24.41

103.69 66.25

47.77

28.42 25.32

MARCADOR

CONTROL MALATIón

KDKD KDKD KDKD

40.00

37.23 29.88

27.2

40.25

16

Tabla 2 resultados del isoelectroenfoque

isoelectroenfoque

figura 2 isoelectroenfoque

Se obtuvo 80% de maduración de los ovocitos cultivados in vitro. Después de la adición de malatión, la maduración llegó al 50%. La recuperación promedio de proteína fue de 50 µg por cada 200 ovocitos. En la SDS-PAGE, se observan un aumento en la expresión de proteínas de 47 y 76 Kd (figura 1), de masa molecular relativa en los ovocitos expuestos a malatión. En el enfoque isoeléctrico puede observarse una disminución en la expresión de proteínas con punto isoeléctrico neutro y un aumento en la expresión de proteínas ácidas (figura 2).

CONCLUSIÓN Y DISCUSIÓN La respuesta celular a las diferentes clases de estrés involucra la expresión de varias proteínas. Un grupo de respuesta general que incluye a las proteínas de choque térmico y otros grupos

Marcador Control Malatión

9.30 8.52 8.71

8.65 ------- 8.27

8.15 7.73 ------

8.05 7.32 ------

7.35 6.78 6.86

6.95 6.47 6.54

6.55 5.89 5.98

5.85 ------ 5.01

5.20 4.70 4.58

4.55 4.47 4.48

3.75 3.86 3.65

3.50 3.64 ------

2.99 3.42 3.47

------ 3.40

2.30 ------ 3.15

3.08 2.92

-------- 2.87

2.81 2.84

2.40 --------

MarcadorMarcador ControlControl MalatiMalati óónn

9.30 8.65 8.15 8.05

7.35

6.85 6.55

5.85 5.20

4.55

3.75

3.50 2.99

2.30

7.32

6.78 6.47

5.89

4.70 4.47

2.40

2.81

3.08

3.42

3.86

8.71 8.27

6.54

5.98

2.84

2.97

3.40

3.65

4.58

6.86

bbáásicosico

áácidocido

7.73

3.64

8.52

5.01

4.48

3.47

3.15

2.87

17

particulares de cada estrés. La presencia de malatión durante la maduración de ovocitos de cerdo provocó cambios en tanto en el patrón de isoelectroenfoque como en el de masa molecular con respecto a las proteínas obtenidas de ovocitos control. Lo anterior significa que hay una respuesta de las células a la presencia del malatión durante su maduración que involucra la disminución de la síntesis de algunas proteínas y la activación de la síntesis de otro grupo. La identificación de las proteínas involucradas en estos cambios se plantea mediante la utilización de cromatografía multidimensional y espectrometría de masas.

BIBLIOGRAFÍA

Aardema, M. J., and MacGregor, J. T. (2002). Toxicology and genetic toxicology in the new era of "toxicogenomics": impact of "-omics" technologies. Mutat Res 499, 13-25.

Abeydeera, L. R., Wang, W. H., Prather, R. S., and Day, B. N. (1998). Maturation in vitro of pig oocytes in protein-free culture media: fertilization and subsequent embryo development in vitro. Biol Reprod 58, 1316-20. Aluigi, M. G., Angelini, C., Falugi, C., Fossa, R., Genever, P., Gallus, L., Layer, P. G., Prestipino, G., Rakonczay, Z., Sgro, M., Thielecke, H., and Trombino, S. (2005). Interaction between organophosphate compounds and cholinergic functions during development. Chem Biol Interact 157-158, 305-16. Banos, J. E., and Bosch, F. (1992). [Historic aspects of organophosphorous compounds]. Med Clin (Barc) 99, 718-9. Benavidez, G., Ruiz, C., and García, A. (1997). Salud Laboral. Conceptos y técnicas para la prevención de riesgos laborales. Masson, Barcelona. Benedico, E. C. (2002). Insecticidas organofosforados. “De la guerra química al riesgo

laboral y doméstico”. Especialista en Medicina Familiar y Comunitaria. Centro de Salud de Biescas. Huesca 12, 333-340.

Bisset, J. A. (2002). Uso correcto de insecticidas: control de la resistencia. Cubana Med Trop 54.

Bonilla, E., Altamirano, M., Casas, E., Fierro, R., Ducolomb, Y., and Betancourt, M. (2001). Identificación de Reprotóxicos en el laboratorio. In Biología de la Reproducción II (J. Velazquez Moctezuma, ed., pp. 55-73. Universidad Autónoma Metropolitana, México. Carlsen, E., Giwercman, A., Keiding, N., and Skakkebaek, N. E. (1992). Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. Bmj 305, 609-13. Casida, J. E., and Quistad, G. B. (1998). Golden age of insecticide research: past, present, or future? Annu Rev Entomol 43, 1-16. Childers, C. C., Villanueva, R., Aguilar, H., Chewning, R., and Michaud, J. P. (2001). Comparative residual toxicities of pesticides to the predator Agistemus industani (Acari: Stigmaeidae) on citrus in Florida. Exp Appl Acarol 25, 461-74.

18

Espinoza-Navarro, O., and Bustos-Obregon, E. (2005). Effect of malathion on the male reproductive organs of earthworms, Eisenia foetida. Asian J Androl 7, 97-101. Graham, D. R., Elliott, S. T., and Van Eyk, J. E. (2005). Broad-based proteomic strategies: a practical guide to proteomics and functional screening. J Physiol 563, 1-9. Gunderson, C. H., Lehmann, C. R., Sidell, F. R., and Jabbari, B. (1992). Nerve agents: a review. Neurology 42, 946-50. Khayat, D., Giroux, B., Berille, J., Cour, V., Gerard, B., Sarkany, M., Bertrand, P., and Bizzari, J. P. (1994). Fotemustine in the treatment of brain primary tumors and metastases. Cancer Invest 12, 414-20.

Lalah, J. O., Chien, C. I., Motoyama, N., and Dauterman, W. C. (1995). Glutathione S-transferases: alpha-naphthyl acetate activity and possible role in insecticide resistance. J Econ Entomol 88, 768-70. Maklakov, A., Ishaaya, I., Freidberg, A., Yawetz, A., Horowitz, A. R., and Yarom, I. (2001). Toxicological studies of organophosphate and pyrethroid insecticides for controlling the fruit fly Dacus ciliatus (Diptera: Tephritidae). J Econ Entomol 94, 1059-66.

Satoh, T., and Hosokawa, M. (2000). Organophosphates and their impact on the global environment. Neurotoxicology 21, 223-7.

Stephens, R., Spurgeon, A., and Berry, H. (1996). Organophosphates: the relationship between chronic and acute exposure effects. Neurotoxicol Teratol 18, 449-53.