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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
LETÍCIA GONÇALVES FREITAS
CICLO MENSTRUAL: AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES
HEMATOLÓGICAS
Belo Horizonte – MG
2016
LETÍCIA GONÇALVES FREITAS
CICLO MENSTRUAL: AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS
Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profª Drª Luci Maria Sant’Ana Dusse – UFMG
Coorientadora: Drª Fernanda Freire Campos Nunes – UFMG
Belo Horizonte – MG
2016
Freitas, Letícia Gonçalves.
F866c
Ciclo menstrual: avaliação de alterações hematológicas / Letícia
Gonçalves Freitas. – 2016.
104 f. il.
Orientadora: Luci Maria Sant’Ana Dusse. Co-Orientadora: Fernanda Freire Campos Nunes.
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
1. Ciclo menstrual – Teses. 2. Sangue – Coagulação – Teses. 3. Hemostase – Teses. 4. Glicoproteínas – Teses. 5. I. Dusse, Luci Maria Sant’Ana. II. Nunes, Fernanda Freire Campos. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia. IV. Título.
CDD:616.15
Dedico este trabalho a todos que fizeram parte da minha história e que em algum
momento abdicaram de seu tempo para caminhar comigo.
AGRADECIMENTOS
À professora e orientadora Luci Maria Sant’Ana Dusse, pela oportunidade de
aprender e compartilhar conhecimentos. Pelos ensinamentos que seguirão comigo e
por me convencer de que podemos ir além do que imaginamos.
À coorientadora Fernanda Freire Campos Nunes, pelo auxílio no entendimento
da citometria de fluxo.
À professora Maria das Graças Carvalho, minha tutora no desenvolvimento das
atividades didáticas, pelo carinho, apoio e pelas portas abertas sempre que precisei.
À professora Marilene Monteiro, pelo auxílio na seleção de participantes na
Unidade Funcional, Ginecologia, Obstetrícia e Neonatologia do Hospital das Clínicas
da UFMG.
À professora Maria Auxiliadora Parreiras e ao Dr. Daniel Dias Ribeiro, pelo
auxílio na seleção das participantes no Ambulatório de Anticoagulação Oral do
Hospital das Clínicas da UFMG, na etapa inicial deste trabalho.
Às participantes que gentilmente aceitaram contribuir com o desenvolvimento
desta pesquisa, meus eternos agradecimentos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
por viabilizar minha dedicação ao desenvolvimento deste trabalho e às agências de
fomento à pesquisa FAPEMIG e CNPq, pelo suporte.
Aos responsáveis pelos Laboratórios de Biologia Molecular, de Radioisótopos,
de Toxicologia Ocupacional e de Química Farmacêutica da Faculdade de Farmácia
da UFMG, pelo apoio técnico.
Aos funcionários e amigos do Laboratório de Hematologia e da Faculdade de
Farmácia da UFMG, em especial Fátima, Márcio, Mariza, Vanderli, Beto e Batista,
pela simpatia e disponibilidade em me ajudar sempre que precisei e por fazerem parte
das minhas boas recordações da FaFar.
Aos companheiros de pesquisa Cristina Loures, Rívia Morais e Marcos Vinícius,
pela imprescindível ajuda no desenvolvimento deste trabalho. Muito obrigada por tudo!
À professora Edna Afonso Reis, pelo suporte nas análises estatísticas.
Ao meu “amigo para sempre” Leonardo Fuscaldi, por estar presente em todos
os momentos da minha vida, pelo abraço apertado e acolhedor. Esta é mais uma
etapa que vencemos juntos!
A meu pai, por abdicar de feriados, fins de semana e noites de descanso para
me acompanhar nas coletas e nos experimentos. Chegamos ao fim de mais uma
aventura e esta conquista também é do senhor! Por me ensinar que nunca é tarde
para recomeçar...
À mamãe, pela fé e confiança inabaláveis. Por aprender com o tempo e me
ensinar que na vida devemos fazer sempre “o melhor”, mesmo que isso não implique,
necessariamente, em sermos “melhores em tudo”.
A minha “empresária” e irmã Helena, por se fazer sempre presente, mesmo
estando geograficamente longe e pelo colo de mãe via telefone. Já estou organizando
tudo para que o próximo aplauso seja para você!
A Mi Amor, por su incentivo constante e por su cariño. Por los largos fines de
semana atajados a la computadora, por su paciencia, comprensión e por sus años. A
tu lado la vida es mucho más sencilla.
A vovô e vovó, pelo carinho e pelas orações para que tudo corresse bem e para
que eu fosse feliz nas minhas escolhas. À tia Nininha, pelas portas abertas, pelas
longas conversas e por eu ser a degustadora oficial de sua cozinha experimental.
À Cíntia, por me ajudar a descobrir que sempre é possível ver com um novo
olhar o “impossível”.
A toda minha família, amigos e colegas de trabalho, pelo carinho e torcida.
A Deus, que sempre guia meus passos para que as pedras sejam uma
superfície firme para que o salto seja ainda maior.
A todas as pessoas que encontrei pelo caminho e que foram, cada uma a seu
modo, de fundamental importância, meus sinceros agradecimentos.
RESUMO
O ciclo menstrual cursa com replicação e crescimento celulares sob influência de
hormônios, fatores de crescimento, neurotransmissores e moléculas reguladoras. A
menstruação é parte de um processo hemostático no qual há formação de agregado
plaquetário, coágulo de fibrina e ativação do sistema fibrinolítico para dissolução do
coágulo e remodelagem do tecido endometrial. A P-selectina (CD62P) é uma
glicoproteína da superfície plaquetária que medeia interações entre endotélio, plaquetas
e leucócitos, apresentando um papel relevante na interação inflamação/trombose. As
glicoproteínas GPIIIa (CD61), GPIIb/IIIa (CD41a) e GPIX (CD42a) atuam no processo de
adesão e agregação das plaquetas quando ocorre lesão do vaso sanguíneo. A interação
entre plaquetas e leucócitos (APL) constitui uma superfície de ancoragem para células
inflamatórias, além de secretar diferentes proteases que aumentam a adesão plaquetária.
A elevação dos níveis plasmáticos dos elementos pró-coagulantes D-Di, PAI-1 e fator VIII
está associada à hipercoagulabilidade e ao aumento do risco de trombose venosa. Nesse
contexto, o objetivo deste estudo foi investigar se o hemograma, os marcadores de
superfície plaquetária, juntamente com %APL e os níveis plasmáticos de D-Di, PAI-1 e
FVIII são capazes de esclarecer as modificações hematológicas que ocorrem durante a
menstruação e no meio do ciclo menstrual, bem como as influências do uso de
anticoncepcional oral (ACO) combinado e da idade sobre esse processo. Foram avaliadas
46 mulheres, incluindo mulheres jovens que não utilizam ACO combinado (Jovens = 16),
mulheres que utilizam ACO (Jovens-ACO = 20) e mulheres no climatério que não utilizam
ACO (Climatério = 10). O hemograma foi realizado de forma semi-automatizada, os
marcadores de superfície plaquetária e APL formam analisados por citometria de fluxo e
os marcadores de coagulação e fibrinólise, por ELISA. Os dados obtidos no presente
estudo permitem concluir que a contagem de neutrófilos, a ativação plaquetária e os níveis
plasmáticos de D-Di apresentam variação em função do ciclo menstrual. A contagem de
neutrófilos, a ativação plaquetária, a formação de APN, os níveis plasmáticos de D-Di e
de PAI-1 são influenciados pelo uso de ACO combinado. A contagem de plaquetas e os
níveis plasmáticos de PAI-1 são influenciados pela idade da mulher. Existem correlações
positivas entre contagem de plaquetas, marcadores de superfície plaquetária, APL,
cascata da coagulação e fibrinólise cuja intensidade depende da fase do ciclo menstrual,
do uso de ACO combinado e da idade da mulher.
Palavras-chave: Ciclo menstrual; Coagulação sanguínea; Hemostasia; Glicoproteínas
plaquetárias; Ativação plaquetária
ABSTRACT
Menstrual cycle progresses with cellular replication and growth under the influence of
hormones, growth factors, neurotransmitters and regulatory molecules. Menstruation
is part of a hemostatic process triggered by the formation of platelet aggregate and
fibrin clot, fibrinolytic system activation, which dissolves the clot, and remodeling of
endometrial tissue. P-selectin (CD62P) is a platelet surface glycoprotein which
mediates interactions between the endothelium, platelets and leukocytes, playing an
important role in the inflammation/thrombosis interaction. GPIIIa (CD61), GPIIb/IIIa
(CD41a) and GPIX (CD42a) glycoproteins act in the adhesion and platelet aggregation
process when blood vessel injury occurs. The interaction between platelets and
leukocytes (PLA) constitutes an anchorage surface for inflammatory cells, apart from
secreting various proteases that increase platelet adhesion. The elevated plasma
levels of D-Di, PAI-1 and factor VIII, is associated with hypercoagulability and
increased risk of venous thrombosis. In this way, the aim of this study was to
investigate whether complete blood count (CBC), surface platelet markers, %APL and
plasma levels of D-Di, PAI-1 and FVIII are able to clarify the hematological changes
during menstruation and in the middle of menstrual cycle, as well as the influences of
the use of combined oral contraceptives (OC) and age on this process. 46 women were
evaluated, including young non-combined OC users (Young = 16), combined OC-
users (Young-OC = 20) and climaterium non-combined OC users (Climaterium = 10).
CBC was carried out semi-automatically, surface platelet markers and APL were
analyzed by flow cytometry and coagulation and fibrinolysis markers by ELISA. Data
obtained in this study allow us to conclude that neutrophil count, platelet activation and
plasma levels of D-Di have variation depending on the menstrual cycle. Neutrophil
count, platelet activation, %PNA, plasma levels of D-Di, and PAI-1 are influenced by
the use of combined OC. Platelet count and PAI-1 serum levels are influenced by age
of the woman. There are positive correlations among platelet count, platelet surface
markers, PLA, coagulation cascade and fibrinolysis whose intensity depends on
menstrual cycle phase, combined OC use and woman's age.
Keywords: Menstrual cycle; Blood coagulation; Hemostasis, Platelet glycoproteins;
Platelet activation
LISTA DE FIGURAS
1 Alterações hormonais, desenvolvimento folicular e modificações endometriais de acordo com
a fase do ciclo menstrual (Adaptado de http://www.arturdzik.med.br/fator-ovulatorio/). ............23
2 Atuação das plaquetas no processo hemostático (Adaptado de http://e-
portfolioinessantoscvg.blogspot.com.br/)........................................................................................ 26
3 Etapas da Nova Teoria da Coagulação. (A) Iniciação: Ativação do FV para produzir uma
pequena quantidade de trombina. (B) Amplificação: Aumento da resposta pró-coagulante. (C)
Propagação: Síntese de trombina em grande escala (Adaptado de HOFFMAN & MONROE, 2007)
...............................................................................................................................................................29
4 Estratégias utilizadas para a determinação da intensidade média de fluorescência de
marcadores de ativação plaquetária e da percentagem de plaquetas CD62P+. Figuras obtidas
utilizando-se o software FlowJo........................................................................................................ 51
5 Estratégias utilizadas para a determinação da percentagem de agregados plaquetas-
monócitos e agregados plaquetas-neutrófilos. Figuras obtidas utilizando-se o software FlowJo
...............................................................................................................................................................54
6 Gerações dos anticoncepcionais orais combinados utilizados pelas participantes do grupo
Jovens-ACO .........................................................................................................................................57
7 Principais desconfortos durante a menstruação relatados pelas participantes do estudo. ....59
8 Contagem de neutrófilos, plaquetas, neutrófilos bastonetes e basófilos (A) na menstruação
em relação ao meio do ciclo; (B) entre os grupos (Jovens, Jovens-ACO/J-ACO e
Climatério/Climat) avaliados em uma determinada fase do ciclo menstrual.................................61
9 Intensidade média de fluorescência (IMF) de CD61 e CD41a (A) na menstruação em relação ao
meio do ciclo; (B) entre os grupos (Jovens, Jovens-ACO/J-ACO e Climatério/Climat) avaliados
em uma determinada fase do ciclo menstrual. .................................................................................62
10 Frequência de agregados plaquetas-monócitos (APM) e agregados plaquetas-neutrófilos
(APN) entre os grupos (Jovens, Jovens-ACO/J-ACO e Climatério/Climat) avaliados em uma
determinada fase do ciclo menstrual. ...............................................................................................63
11 Níveis plasmáticos de Dímero-D (D-Di) (A) na menstruação em relação ao meio do ciclo; (B)
entre os grupos (Jovens, Jovens-ACO/J-ACO e Climatério/Climat) avaliados em uma
determinada fase do ciclo menstrual. ...............................................................................................63
12 Níveis plasmáticos do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1) entre os grupos (Jovens, Jovens-
ACO/J-ACO e Climatério/Climat) avaliados em uma determinada fase do ciclo menstrual. .......64
13 Coeficientes de correlação de Spearman (ρ) para a contagem de plaquetas, parâmetros
citométricos e plasmáticos (A) na menstruação e (B) no meio do ciclo menstrual para todos os
grupos avaliados. ................................................................................................................................66
14 Gráfico comparativo dos níveis de hormônios ovarianos e análogos durante o ciclo
menstrual em mulheres que utilizam anticoncepcional oral (ACO) combinado monofásico e
naquelas que não utilizam esse medicamento (Adaptado de
http://www.ufrgs.br/espmat/disciplinas/_II/modulo_II/pilulas.htm). ...............................................68
LISTA DE TABELAS
1 Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise das
glicoproteínas plaquetárias. ...............................................................................................................49
2 Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de agregados
plaquetas-leucócitos. ..........................................................................................................................53
3 Características clínicas das participantes do estudo...................................................................58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA Ácido araquidônico (Arachidonic acid)
ADP Difosfato de adenosina (Adenosine diphosphate)
ACO Anticoncepcional oral
Ang Angiopoietina (Angiopoietin)
APL Agregado plaquetas-leucócitos
APM Agregado plaquetas-monócitos
APN Agregado plaquetas-neutrófilos
AT Antitrombina
AVC Acidente vascular cerebral
CD Grupo de diferenciação (Cluster differentiation)
COEP Comissão de ética em pesquisa
DCM Duração do ciclo menstrual
D-Di Dímero-D
DEPE Diretoria de ensino, pesquisa e extensão do Hospital das Clínicas
DS Duração do sangramento
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético (Ethylenediaminetetraacetic acid)
ELISA Ensaio imunoenzimático (Enzyme-linked immunosorbent assay)
FDP Produtos de degradação da fibrina (Fibrin degradation products)
FITC Isotiocianato de fluoresceína
FIX Fator IX
FIXa Fator IX ativado
FSC Dispersão frontal/tamanho (Forward scatter)
FSH Hormônio folículo estimulante (Follicle-stimulating hormone)
FT Fator tissular
FV Fator V
FVa Fator V ativado
FVIIa Fator VII ativado
FVIIIa Fator VIII ativado
FvW Fator de von Willebrand
FX Fator X
FXa Fator X ativado
FXI Fator XI
FXIa Fator XI ativado
FXII Fator XII
GnRH Hormônio liberador de gonadotrofina (Gonadotropin release
hormone)
GP Glicoproteína
G-CSF Fator estimulador do crescimento de colônias granulocíticas
(Granulocytic colony stimulating fator)
HESC Células do estroma endometrial humanas (Human endometrial
stromal cells)
HIV Vírus da imunodeficiência humana (Human immunodeficiency
virus)
IAM Infarto agudo do miocárdio
IL Interleucina
IMF Intensidade média de fluorescência
IMC Índice de massa corporal
LDL Lipoproteína de baixa densidade (Low density lipoprotein
cholesterol)
LH Hormônio luteinizante (Luteinizing hormone)
mAbs Anticorpos monoclonais (Monoclonal antibodies)
NO Óxido nítrico
OPD Orto-fenilenediamina
PAI Inibidor do ativador do plasminogênio (Plasminogen activator
inhibitor)
PC Proteína C
PE Ficoeritrina
PECy5 Ficoeritrina-cianina 5
PGI2 Prostaciclina
PPP Plasma pobre em plaquetas
PRP Plasma rico em plaquetas
PS Proteína S
PSGL Proteína ligante de P-selectina (P-selectin glycoprotein ligand)
SSC Dispersão lateral/granulosidade (Side scatter)
TA Temperatura ambiente
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
TFPI Inibidor da via do fator tissular (Tissue factor pathway inhibitor)
t-PA Ativador do plasminogênio do tipo tecidual (Tissue plasminogen
activator)
TXA2 Tromboxano
u-PA Ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (Urokinase
plasminogen activator)
VEGF Fator de crescimento derivado do endotélio vascular (Vascular
endothelial growth fator)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA.........................................................................19
2 REVISÃO DA LITERATURA................................................................................21
2.1 Ciclo menstrual............................................................................................... 21
2.2 Alterações do endométrio durante o ciclo menstrual................................. 23
2.3 Hemostasia e seus componentes .................................................................24
2.3.1 Fisiologia plaquetária..................................................................................25
2.3.2 Ativação dos fatores da coagulação..........................................................27
2.3.3 Marcadores plaquetários............................................................................29
2.4 Principais alterações hematológicas durante o ciclo menstrual ...............32
2.4.1 As plaquetas e o ciclo menstrual...............................................................34
2.4.2 Outros componentes hemostáticos e o ciclo menstrual.........................35
2.4.3 Principais alterações no hemograma durante o ciclo menstrual...........38
2.5 Uso dos anticoncepcionais orais combinados e a trombose ....................39
3 OBJETIVOS.........................................................................................................44
3.1 Objetivo geral ..................................................................................................44
3.2 Objetivos específicos .....................................................................................44
4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL....................................................................45
4.1 Aspectos Éticos ..............................................................................................46
4.2 Casuística ........................................................................................................46
4.3 Coleta de dados clínicos e de amostras biológicas ....................................47
4.4 Métodos............................................................................................................48
4.4.1 Protocolo do estudo da expressão de marcadores de ativação
plaquetária.................................................................................................................48
4.4.2 Protocolo do estudo dos agregados plaquetas-monócitos e plaquetas-
neutrófilos..................................................................................................................52
4.4.3 Determinação do D-Di.................................................................................54
4.4.4 Determinação do PAI-1................................................................................55
4.4.5 Determinação do FVIII.................................................................................55
4.5 Análise estatística ...........................................................................................55
5 RESULTADOS.....................................................................................................57
5.1 Características clínicas das integrantes dos três grupos avaliados .........57
5.2 Avaliação do hemograma...............................................................................59
5.3 Avaliação dos marcadores de superfície plaquetária .................................62
5.4 Avaliação dos agregados plaquetas-leucócitos ..........................................62
5.5 Avaliação de Dímero-D (D-Di), inibidor do ativador do plasminogênio-1
(PAI-1) e fator VIII (FVIII) ...........................................................................................63
5.6 Análise da correlação de Spearman para contagem de plaquetas e
biomarcadores hemostáticos ..................................................................................64
6 DISCUSSÃO........................................................................................................67
6.1 Considerações iniciais ...................................................................................67
6.2 Avaliação do hemograma...............................................................................68
6.3 Avaliação dos marcadores de superfície plaquetária .................................70
6.4 Avaliação dos agregados plaquetas-leucócitos ..........................................72
6.5 Avaliação de Dímero-D (D-Di), inibidor do ativador do plasminogênio-1
(PAI-1) e fator VIII (FVIII) ...........................................................................................73
6.6 Análise da correlação de Spearman para contagem de plaquetas e
biomarcadores hemostáticos ..................................................................................75
7 LIMITAÇÕES DO ESTUDO.................................................................................77
8 CONCLUSÕES....................................................................................................78
9 PERSPECTIVAS DE ESTUDOS.........................................................................79
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................80
ANEXO A....................................................................................................................86
ANEXO B....................................................................................................................87
ANEXO C....................................................................................................................88
ANEXO D....................................................................................................................89
ANEXO E....................................................................................................................91
ANEXO F....................................................................................................................92
ANEXO G....................................................................................................................93
ANEXO H....................................................................................................................94
ANEXO I.....................................................................................................................95
ANEXO J....................................................................................................................96
19
1 INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA
A mulher passa, ao longo da vida, por vários desafios hematológicos. O primeiro
deles é a menstruação. As mulheres que apresentam distúrbios das plaquetas ou dos
fatores da coagulação enfrentam a cada mês, desafios hemostáticos para debelar o
sangramento menstrual. Muitas vezes necessitam de intervenções que incluem o
tratamento hormonal para suspensão da menstruação e a transfusão de plaquetas ou
de fatores da coagulação.
Uma revisão sistemática, publicada em uma revista de grande impacto na área de
Hemostasia (1) revelou diminuição dos níveis plasmáticos dos marcadores
hemostáticos durante a menstruação e no início da fase folicular, especialmente de
fator de von Willebrand (FvW), fator VIII (FVIII) e da função plaquetária. Dessa forma,
quando uma mulher for se submeter a uma cirurgia eletiva, é prudente definir a melhor
fase do ciclo menstrual, na qual ela esteja fisiologicamente menos exposta às
alterações hemostáticas, o que poderia prevenir sangramentos de maior intensidade e
contribuir para o sucesso do procedimento.
O segundo desafio hematológico enfrentado pelas mulheres é o uso de
anticoncepcional oral (ACO). Esses medicamentos estão associados ao aumento da
concentração de diversos fatores da coagulação e redução da atividade de
anticoagulantes naturais (2-4), predispondo a ocorrência de eventos trombóticos (5, 6).
Para as mulheres portadoras de alterações genéticas que favorecem a trombose, esses
medicamentos são contraindicados (6-8).
A gestação constitui o terceiro desafio. As gestantes são mais vulneráveis à
ocorrência de anemia, correspondendo a 24,8% dos casos diagnosticados,
principalmente nos países em desenvolvimento. Estima-se que cerca de 20% das
mortes maternas sejam causadas pela anemia, contribuindo para um risco adicional de
50% de ocorrência desse desfecho. Assim, durante o pré-natal recomenda-se a
suplementação de ácido fólico e ferro para essas mulheres (9). Outro aspecto
importante é a expulsão da placenta após o parto, associada ao rompimento simultâneo
de centenas de capilares e à necessidade de interromper o sangramento. O êxito desse
processo prevê a hipercoagulabilidade crescente da mulher ao longo da gestação,
sendo máxima no momento do parto, o que previne a ocorrência de uma hemorragia
excessiva (10).
20
O quarto desafio hematológico na vida da mulher é a menopausa e o uso de
terapia de reposição hormonal. Estudos sugerem a exacerbação da hemostasia em
mulheres na pós-menopausa (11-15). No entanto, são limitadas as informações
acerca das alterações hemostáticas em mulheres antes da menopausa, o que
constitui um dos objetivos do presente estudo.
Considerando os desafios hematológicos enfrentados pelas mulheres, bem
como as lacunas existentes na literatura a esse respeito, este estudo se justifica
plenamente. Espera-se gerar maior conhecimento acerca da fisiologia do ciclo
menstrual e de suas complexas interações com elementos hematológicos, bem como
o impacto das intervenções hormonais (a partir do uso de ACO combinados) e da
idade nessas variáveis. Nesse sentido, os desdobramentos deste trabalho podem
gerar futuramente potenciais alvos de intervenção laboratorial, farmacológica, clínica
e comportamental.
21
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Ciclo menstrual
O ciclo menstrual é um processo complexo envolvendo replicação e crescimento
celulares sob influência de hormônios, fatores de crescimento, neurotransmissores e
moléculas reguladoras (16). Repete-se em intervalos regulares de 21 a 36 dias, com
média de 28 dias e consiste em um fenômeno essencialmente ligado à vida
reprodutiva da mulher (17, 18).
Sabe-se que a vida reprodutiva da mulher inicia-se entre os 11 e 16 anos de idade
com a primeira menstruação (menarca) e termina entre os 45 e 52 anos com a última
menstruação (menopausa) (17, 18). A menopausa é um evento caracterizado por
falha no funcionamento dos ovários, para a qual o diagnóstico é feito
retrospectivamente após 12 meses de amenorreia consecutivos, não explicável por
causas patológicas e associado a valores séricos de hormônio folículo estimulante
(FSH) superiores a 40 UI/L (19). O climatério caracteriza-se por um período de
transição entre a fase reprodutiva e a não reprodutiva da mulher, com início médio a
partir da quarta década de vida e com duração de 2 a 8 anos em 95% dos casos. Em
60% a 80% das mulheres há alterações vasomotoras, urogenitais, comportamentais
e ganho de peso (20).
A fisiologia do ciclo menstrual depende do equilíbrio entre o eixo hipotálamo-
hipófise-ovários. Dessa forma, o ciclo menstrual requer a secreção do hormônio
liberador de gonadotrofinas (GnRH) pelo hipotálamo em uma faixa crítica de amplitude
e frequência (17).
Durante o ciclo menstrual, o estrogênio e a progesterona são responsáveis pelas
alterações que ocorrem no endométrio, na cérvice uterina e na vagina, além da
regulação por feedback da secreção de FSH e do hormônio luteinizante (LH) pela
hipófise anterior (21). A função hipofisária encontra-se na dependência da ação do
GnRH que transmite sua mensagem por meio de ondas pulsáteis (22).
O ciclo menstrual é composto de quatro fases. A fase folicular do ciclo menstrual
dura de 10 a 20 dias e termina com a ovulação; a fase lútea apresenta duração de 14
dias; e a menstrual, de quatro a sete dias (23). As fases do ciclo menstrual serão
descritas a seguir e estão representadas na Figura 1:
22
a) Fase folicular (proliferativa): Corresponde ao período compreendido
desde o primeiro dia do ciclo menstrual (primeiro dia da menstruação) até a ovulação,
com níveis crescentes de estrogênio. Durante esse período, um folículo primordial se
desenvolve no ovário enquanto os demais sofrem atresia. Os receptores para o FSH
e LH são sensibilizados nas células da teca e da granulosa, e as gonadotrofinas
estimulam a síntese do estradiol. O estrogênio atua sobre o revestimento endometrial,
preparando o útero para a possibilidade de aceitar um óvulo fertilizado, estimula o
crescimento do endométrio, das glândulas, do estroma e o alongamento das artérias
espiraladas que nutrem o endométrio. Além disso, confere maior fluidez ao muco
cervical. Os níveis aumentados de estradiol estimulam a proliferação da mucosa
uterina após a menstruação e inibem a secreção de FSH e LH por feedback negativo
(21). No início da fase folicular, as concentrações de FSH encontram-se elevadas,
mas declinam até a ovulação. A secreção de LH começa a aumentar por volta da
metade da fase folicular e é dependente da concentração de estrogênio.
Imediatamente antes da ovulação, a secreção de estrogênio pelo folículo aumenta
intensamente, estimulando positivamente o hipotálamo e há um pico de LH, por um
mecanismo de feedback positivo (18, 21, 24).
b) Ovulação: Corresponde ao meio do ciclo menstrual, coincidindo com o
pico do hormônio LH. Nessa fase observa-se uma explosão da secreção de estradiol.
Esse fenômeno é regulado por feedback positivo pelos hormônios hipofisários FSH e
LH. O pico de FSH e LH causa a liberação do ovócito maduro. O muco cervical
aumenta em quantidade e fluidez (21).
c) Fase lútea (secretora): Consiste no período de 14 dias após a ovulação,
com predomínio da progesterona, terminando com o início da menstruação. Durante
essa fase, o corpo lúteo se desenvolve e começa a sintetizar estradiol e progesterona.
Consequentemente, pelo mecanismo de feedback negativo, há uma redução gradual
das concentrações de LH e FSH. Os níveis elevados de progesterona estimulam a
atividade secretora do endométrio e aumentam a sua vascularização (21, 25). Há
secreção na luz glandular, edema do estroma e o endométrio torna-se mais espesso.
As arteríolas encontram-se proeminentes e dilatadas (18). O muco cervical torna-se
menos abundante e mais espesso. Se a fertilização não ocorrer até o final dessa fase,
o corpo lúteo regride e os níveis de estradiol e progesterona reduzem abruptamente
(21). Com a regressão do corpo lúteo, há diminuição do estroma e o endométrio
regride (18).
23
d) Menstruação (fase hemorrágica): Corresponde à regressão do corpo lúteo e à
queda abrupta das concentrações de estradiol e progesterona que causam a
eliminação do endométrio e de sangue (23).
Figura 1 - Alterações hormonais, desenvolvimento folicular e modificações endometriais de acordo com a fase do ciclo menstrual (Adaptado de http://www.arturdzik.med.br/fator-
ovulatorio/).
2.2 Alterações do endométrio durante o ciclo menstrual
O tecido endometrial humano apresenta características particulares, uma vez que
durante o ciclo menstrual está submetido a um crescimento mediado por hormônios
de forma regular, rápida e difusa, seguida de ruptura enzimática, sangramento e
posterior reparo associado à interrupção do sangramento e à remodelagem do tecido
(26).
O endométrio é composto por três camadas:
a) Basal (profunda): Essa camada é pobre em receptores hormonais e não
sofre influência dos hormônios ovarianos, não havendo alteração em sua estrutura
durante o ciclo menstrual. Responsável pela renovação endometrial a cada ciclo (23).
b) Esponjosa (média): Ocupa a maior parte da espessura do endométrio e
sofre influência dos esteroides ovarianos, por ser rica em receptores hormonais (23).
Fase lúteaFase folicular
Desenvolvimento folicular
Níveis de hormônios hipofisários e ovarianos
Ciclo endometrial
Dias do ciclo menstrual
progesterona
menstruação ovulação
FSH
estrogênio
LH
24
c) Compacta (superficial): É uma camada fina e não apresenta variações
cíclicas com a mesma intensidade que a camada esponjosa (23).
As camadas esponjosa e compacta compõem a camada funcional, que se
desintegra e é eliminada na menstruação (18, 23).
As modificações endometriais presentes no ciclo menstrual dependem dos
níveis circulantes de estrogênios e progesterona. Esses hormônios contribuem para a
proliferação e diferenciação celulares. Sob influência estrogênica e de fatores locais
de crescimento, o endométrio regenera-se após a menstruação. Os diversos
receptores de membrana dos fatores de crescimento ativam o sistema tirosinacinase,
que induz a fosforilação de proteínas intracelulares que comandarão a expressão de
genes e a divisão celular (18).
Cameron & Campbell (27) relataram que o óxido nítrico (NO) e a enzima NO-
sintase estão presentes no epitélio glandular uterino, participariam da iniciação do
fluxo menstrual e controlariam sua intensidade, além de inibir a agregação das
plaquetas no endométrio. O NO derivado do endométrio também parece contribuir
para o controle local da contratilidade do miométrio.
2.3 Hemostasia e seus componentes
A hemostasia é o processo pelo qual o organismo procura manter o sangue no
estado líquido, no interior do vaso sanguíneo, controlando a sua perda decorrente de
uma lesão vascular. Os elementos que garantem a hemostasia são: endotélio
vascular, plaquetas, fatores da coagulação, sistema fibrinolítico e anticoagulantes
naturais (28).
Didaticamente, a hemostasia é dividida em:
a) Hemostasia primária: Ocorre imediata constrição do vaso sanguíneo lesado
com o objetivo de diminuir o fluxo local e permitir maior contato entre as
plaquetas circulantes e a região lesada. Há ativação das plaquetas e a
formação do plug plaquetário (28).
b) Hemostasia secundária: Resulta na formação de um coágulo consistente,
capaz de estancar o sangramento graças à formação de uma rede de fibrina
entre as plaquetas agregadas. Nessa etapa ocorre ativação dos fatores da
coagulação (28).
25
c) Hemostasia terciária: Corresponde à fibrinólise, que regula a coagulação,
impedindo o crescimento descontrolado do coágulo no interior do vaso
sanguíneo. Isso ocorre mediante a dissolução da fibrina formada por ação da
enzima plasmina, liberada pelas células endoteliais. Nessa etapa há também a
recanalização do vaso lesado (28).
O menor fragmento resultante da degradação da fibrina pela plasmina é o dímero-
D (D-Di), um indicador sensível da formação de fibrina e de sua digestão, que tem
sido utilizado para avaliar alterações fibrinolíticas. A ação do sistema fibrinolítico, de
forma semelhante à coagulação, é controlada por inibidores específicos. Os principais
inibidores da fibrinólise são o inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1 (PAI-1), a
α2-antiplasmina, a α2-macroglobulina e a α1-antitripsina (28).
Os anticoagulantes naturais de maior importância são a antitrombina (AT), que
atua sobre a trombina formada; as proteínas C (PC) e S (PS), que atuam sobre os
fatores VIIIa e Va; e o inibidor da via do fator tissular (TFPI) que inativa o FXa e o
complexo FT/FVIIa (29).
Nas últimas três décadas, tornou-se evidente a participação ativa das células
endoteliais, que revestem internamente o vaso sanguíneo e estão em contato íntimo
com o sangue, no processo hemostático. Essas células atuam tanto na coagulação,
favorecendo a ativação plaquetária e a formação do coágulo, quando ocorre
exposição ao colágeno subendotelial, quanto na anticoagulação, favorecendo a ação
da PC, da PS e da AT (28).
2.3.1 Fisiologia plaquetária
As plaquetas são fragmentos citoplasmáticos dos megacariócitos. Esses estão
presentes na medula óssea e sua diferenciação e maturação dependem da
trombopoietina e de interleucinas (IL) IL-3, IL-6 e IL-11. A fragmentação citoplasmática
dos megacariócitos ocorre na medula óssea e as plaquetas são lançadas na
circulação isoladas ou agrupadas. Em condições normais, as plaquetas apresentam
diâmetro de 3 a 4m e cerca de 1m de espessura. Não possuem material nuclear e
apresentam vida média de oito a dez dias. O intervalo de referência da contagem de
plaquetas no sangue periférico é de 150.000 a 400.000/µL (29).
26
Atualmente, está bem estabelecida a participação das plaquetas na promoção e
modulação de diversos distúrbios, incluindo doença arterial coronariana, trombose
venosa profunda, doenças mieloproliferativas, fibrilação atrial, câncer, acidente
vascular cerebral (AVC), infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV),
doença renal, diabetes, doença intestinal inflamatória e esclerose múltipla (30-33).
A função das plaquetas no processo hemostático inclui o recrutamento das
mesmas da circulação sanguínea para a matriz subendotelial, sempre que ocorre
lesão vascular e liberação de fator tissular (FT). Quando ativadas, as plaquetas
expressam rapidamente glicoproteínas (GP) de superfície que interagem com outras
plaquetas, endotélio vascular e células inflamatórias (34).
Uma sucessão de eventos incluindo contato, adesão, ativação, secreção e
agregação culmina na formação do plug plaquetário, que impede temporariamente a
perda sanguínea (35).
As etapas que envolvem a participação das plaquetas no processo hemostático
serão descritas a seguir e estão representadas na Figura 2:
Figura 2 - Atuação das plaquetas no processo hemostático (Adaptado de http://e-
portfolioinessantoscvg.blogspot.com.br/).
plaqueta
subendotélio
endotélio
fibrina
hemácia
1 – Lesão ao endotélio vascular libera fator tissular e expõe o tecido conjuntivo subendotelial.
2 – Adesão das plaquetas à matriz subendotelial.
3 – Ativação e secreção de grânulos das plaquetas.
4 – Agregação e formação do plug plaquetário.
5 – Coágulo permanente de fibrina.
27
a) Contato com o local lesado: Quando ocorre lesão vascular, o sangue é exposto
ao FT. Há vasoconstrição reflexa e as plaquetas entram em contato com o local
lesado.
b) Adesão plaquetária: As plaquetas interagem com proteínas da matriz
extracelular do subendotélio a partir de GP específicas de adesão, expressas na
superfície das plaquetas. A proteína plasmática multimérica FvW associa-se ao
colágeno subendotelial e funciona como uma superfície de ancoragem para as
plaquetas, via interação com o complexo GPIb/IX/V.
c) Ativação plaquetária: A interação entre receptores plaquetários e seus
agonistas (especialmente a trombina) promove uma mudança conformacional das
proteínas do citoesqueleto na membrana plaquetária, da forma oval para a estelar,
com a formação de pseudópodes, os quais expõem de maneira mais efetiva as GP
de membrana.
d) Secreção plaquetária: Uma vez ativadas, as plaquetas liberam o conteúdo de
seus grânulos que estimula o recrutamento de outras plaquetas para o local da lesão.
Os grânulos densos contêm os agonistas difosfato de adenosina (ADP) e serotonina,
enquanto os grânulos α são constituídos de uma grande quantidade de proteínas de
adesão, fatores mitogênicos, fatores da coagulação e inibidores de proteases, os
quais são liberados imediatamente após a ativação plaquetária.
e) Agregação plaquetária: As plaquetas ativadas interagem entre si, via ligação
da GPIIb/IIIa ao fibrinogênio, formando um agregado. Inicialmente, a GPIIb/IIIa está
na forma inativa e somente após a exocitose dos grânulos α se torna capaz de interagir
com o fibrinogênio. Esse processo é seguido de alteração conformacional das
plaquetas que desencadeia fosforilações em cascata e sinalização intracelular.
Posteriormente, as plaquetas também contribuem para a hemostasia
secundária, ativando a cascata da coagulação, na qual ocorre a formação do coágulo
de fibrina, tamponando de forma mais eficiente o local lesado.
2.3.2 Ativação dos fatores da coagulação
A teoria da coagulação, proposta na década de 1960 por Macfarlane, Davie e
Ratnoff, envolvia reações sucessivas de ativação de proteínas em uma via intrínseca,
iniciada pelo fator XII (FXII) e extrínseca, iniciada pelo complexo fator VII ativado
28
(FVIIa)-FT. As duas vias convergiam para uma via comum, a partir da qual ocorreria
a ativação do fator X (FX) e formação do complexo protrombinase (fator X ativado/fator
V ativado-FXa/FVa) capaz de clivar protrombina em trombina, que posteriormente
ativa o fibrinogênio em fibrina, resultando na coagulação do sangue (28).
A teoria da coagulação foi revista e um novo modelo proposto por Hoffman &
Monroe em 2007 (36). O modelo é composto de três etapas: iniciação, amplificação e
propagação e apresenta como grandes protagonistas o FT (expresso em células dos
tecidos, monócitos e células endoteliais ativadas) e a superfície celular. As três fases
da nova teoria da coagulação serão comentadas a seguir e estão representadas na
Figura 3:
a) Iniciação: A fase de iniciação ocorre nas células que expressam o FT. O
complexo FT-FVIIa ativa pequenas quantidades de FIX e FX. O FXa associa-se ao
FVa na superfície dessas células e está protegido da ação dos inibidores TFPI e AT,
presentes no plasma. O fator IX ativado (FIXa) pode deixar a superfície celular e
alcançar as plaquetas e outras superfícies celulares via plasma, pois não é inibido
pelo TFPI e muito lentamente pela AT. Uma pequena quantidade de trombina é
formada na superfície de células que expressam FT, suficiente para ativar plaquetas,
embora não resulte na produção de um coágulo estável de fibrina (36) (Figura 3A).
b) Amplificação: A trombina formada na fase de iniciação promove também a
ativação dos cofatores V e VIII e do fator XI (FXI) capazes de se difundirem no plasma
e ativarem outras plaquetas (36) (Figura 3B).
c) Propagação: A fase de propagação ocorre na superfície das plaquetas ativadas
onde o FIXa, proveniente da fase de iniciação, liga-se ao fator VIII ativado (FVIIIa).
Ativação adicional de FIX ocorre pela ligação de FXIa às plaquetas. Uma vez que o
FXa não pode se deslocar da superfície das células expressando FT para alcançar as
plaquetas (sob risco de ser inativado pelo TFPI e AT plasmáticos), ele deve ser
mobilizado diretamente na superfície plaquetária pelo complexo tenase (FIXa-FVIIIa).
O FXa rapidamente associa-se ao FVa na superfície plaquetária e produz uma
explosão da geração de trombina e, consequentemente, a produção de grande
quantidade de fibrina (36).
A plaqueta é provavelmente a única superfície na qual a propagação da
coagulação pode ocorrer efetivamente. Além disso, é especializada em coordenar a
ligação dos complexos tenase e protrombinase (FXa-FVa). Quando um vaso
29
sanguíneo é lesado, grande número de plaquetas é recrutado para o local a fim de
fornecer superfície suficiente para uma explosão de geração de trombina e formação
do coágulo de fibrina, efetivo no tamponamento da lesão e na garantia da hemostasia
(36) (Figura 3C).
Figura 3 - Etapas da Nova Teoria da Coagulação. (A) Iniciação: Ativação do FV para produzir
uma pequena quantidade de trombina. (B) Amplificação: Aumento da resposta pró-coagulante. (C) Propagação: Síntese de trombina em grande escala (Adaptado de HOFFMAN & MONROE,
2007).
2.3.3 Marcadores plaquetários
2.3.3.1 Marcadores de superfície plaquetária
A citometria de fluxo constitui um método amplamente utilizado para detectar
ativação celular. Os dados obtidos podem ser analisados de duas formas distintas;
pelo percentual de partículas que expressam antígenos na superfície; ou pela
intensidade média de fluorescência (IMF) da população de partículas que expressa
esse antígeno. A primeira estratégia é útil quando se sabe que o biomarcador é restrito
Fibrinogênio→ Fibrina
30
a uma subpopulação e a segunda, quando se trata de biomarcadores constitutivos. A
IMF permite a distinção de valores que estão nos extremos da faixa de linearidade
(37, 38).
P-selectina (CD62P)
A P-selectina (CD62P) é uma GP da superfície plaquetária que, quando
exposta, medeia interações entre endotélio, plaquetas e leucócitos, bem como
estabiliza inicialmente a interação GPIIb/IIIa-fibrinogênio até a formação do tampão
plaquetário (30, 39-41). Apresenta ainda um papel relevante como elemento conectivo
entre inflamação e trombose (42).
GPIIb/IIIa (CD41a)
A GPIIb/IIIa (CD41a) é ativada após um sinal interno das plaquetas iniciado
com a formação do complexo FvW-GPIb, tornando-as capazes de se ligar ao
fibrinogênio, fibronectina, FvW, vibronectina, trombospondina e, principalmente,
formar agregados plaqueta-plaqueta (30, 39, 43). Tomer (44) propôs que o aumento
dos níveis plasmáticos de GPIIb/IIIa correlaciona-se com a ativação plaquetária e que
seria útil para demonstrar a atividade pró-trombótica em várias condições clínicas.
GPIIIa (CD61)
A GPIIIa é uma glicoproteína transmembrana, integrina β3, expressa em
plaquetas, megacariócitos, osteoclastos e endotélio. Essa GP associa-se à GPIIb para
formar o complexo GPIIb/IIIa, o qual medeia a agregação entre as plaquetas ativadas,
e ao CD51 para formar o complexo CD51/CD61, um receptor de vitronectina. Além
disso, a GPIIIa liga-se ao fibrinogênio, fibronectina, FvW, e trombospondina para
mediar os processos de adesão e agregação (45).
31
GPIX (CD42a)
A GPIX (CD42a) forma o complexo GPIb/IX/V, um receptor do FvW, essencial
para o processo de adesão das plaquetas ao subendotélio vascular quando ocorre
lesão do vaso sanguíneo (39).
2.3.3.2 Agregados plaquetas-leucócitos (APL)
A interação entre plaquetas e leucócitos é observada em muitos processos
inflamatórios e trombóticos e nas doenças autoimunes. Admite-se que tal interação
visa a formação de agregados plaquetas-leucócitos que constituem uma superfície de
ancoragem para células inflamatórias, além de secretar diferentes proteases que
aumentam a adesão plaquetária dependente do FvW (46-48).
Uma vez ativadas, as plaquetas promovem a coagulação e contribuem para o
aumento do PAI-1 e, consequentemente, reduzem a fibrinólise (49). Além disso, ao
interagir com os leucócitos, podem liberar quimiocinas (CD40L, RANTES e GRO-α)
capazes de ativar os leucócitos, contribuindo para desencadear um processo
inflamatório (50).
Agregados plaquetas-monócitos (APM)
Após a ativação plaquetária, a P-selectina rapidamente se transloca para a
superfície e interage principalmente com o receptor proteína ligante de P-selectina tipo
1 (PSGL-1) dos monócitos, formando agregados, embora possa também interagir, em
menor extensão, com os neutrófilos (51). Os APM não são simplesmente um reflexo
da ativação plaquetária, mas apresentam um papel relevante na indução da ativação
de outras plaquetas e monócitos, a partir da expressão e secreção de citocinas (32).
Agregados plaquetas-neutrófilos (APN)
As plaquetas ligam-se aos neutrófilos, embora em menor extensão do que aos
monócitos, determinam a secreção de ativadores do endotélio e facilitam a
estagnação dos neutrófilos nos pequenos vasos (47). Independentemente da
formação de APN, os neutrófilos podem ligar-se diretamente ao FvW por meio do
32
PSGL-1. Assim, o FvW atua como molécula de adesão, tanto para plaquetas, quanto
para leucócitos (48).
2.4 Principais alterações hematológicas durante o ciclo menstrual
Fisiologicamente, a menstruação é um processo complexo, altamente regulado
por mecanismos hormonais, imunológicos e hemostáticos. Quando os níveis de
progesterona reduzem significativamente, ocorre a menstruação. A interrupção do
sangramento é obtida por mecanismos hemostáticos locais (52). Posteriormente,
verifica-se a ativação do sistema fibrinolítico com aumento dos níveis de plasmina
derivada do endométrio e dos ativadores do plasminogênio para remodelagem
tecidual (26, 53).
Na fase lútea, a progesterona induz um aumento da expressão de
angiotensina-1, capaz de estabilizar os novos vasos sanguíneos formados. Além
disso, estimula a síntese de FT e de outras moléculas ativadoras da coagulação,
conferindo a essa fase propriedades pró-coagulantes, importantes para reduzir a
chance de sangramento, caso ocorra a implantação do blastocisto (54, 55). Na fase
folicular, esses componentes estariam menos ativos (56, 57).
As alterações hemostáticas durante o ciclo menstrual têm sido alvo de estudos
para compreender os mecanismos que conduziriam ao desenvolvimento de trombose.
Nesse sentido, a literatura descreve que variações em parâmetros bioquímicos, pró-
coagulantes e fibrinolíticos ao longo do ciclo menstrual poderiam ser fatores de risco
para ocorrência de doença coronariana em mulheres na pré-menopausa (58). Além
disso, assim como existe uma variação nos níveis de progesterona e estradiol durante
o ciclo, existiriam diferenças intra e interindividuais nas concentrações de pró-
coagulantes e anticoagulantes naturais (14, 58, 59). No entanto, a magnitude dessas
alterações e as consequências para a saúde da mulher ainda não estão totalmente
esclarecidas.
Durante a menstruação, estima-se que cerca de 30 a 40mL de sangue sejam
eliminados ao longo de quatro a sete dias, em condições fisiológicas (17, 18). No
endométrio, estimulado e desenvolvido a partir da secreção de hormônios ovarianos,
ocorre estase sanguínea, vasodilatação e diapedese de leucócitos. A migração de
hemácias para o tecido uterino forma microtrombos no estroma e simultaneamente as
glândulas endometriais sofrem atrofia (17).
33
No meio intracelular, a redução dos níveis de progesterona desestabiliza a
membrana dos lisossomos e das células do estroma, estimulando a liberação de
prostaglandinas e enzimas fibrinolíticas. A ação enzimática rompe a malha de fibras
reticulares que sustenta as células do estroma endometrial. Com a dificuldade
circulatória crescente, ocorre anóxia, liberação de mediadores metabólicos, necrose,
ruptura, descamação e sangramento do endométrio (23, 26).
No tecido, a redução da espessura do endométrio resulta no colabamento de
arteríolas espiraladas e vênulas satélites. Esses vasos comprimidos e alongados pela
redução dos níveis de esteroides, tornam-se posteriormente mais curtos e cada vez
mais próximos da superfície endometrial (18). A contração das fibras musculares lisas
e a degeneração das arteríolas espiraladas agravam a vasoconstrição. O endométrio
desidrata-se, glândulas e arteríolas, ainda mais próximas, tornam o fluxo sanguíneo
local mais lento (23).
O sangramento menstrual não ocorre de maneira homogênea em toda a
superfície endometrial, mas de forma intermitente; predominantemente nos locais de
maior acúmulo de células do estroma e dissolução de fibras reticulares (23). A estase
sanguínea, a isquemia e a infiltração de leucócitos comprometem a circulação,
resultando em acúmulo de produtos de degradação de células endometriais. Esses
produtos seriam responsáveis por desencadear o processo menstrual, que
provavelmente não ocorreria se o sistema linfático fosse mais efetivo nessa ocasião
(23).
Existem evidências de que o endotélio dos vasos sanguíneos endometriais
produza uma variedade considerável de substâncias vasoativas com ação parácrina
e angiogênica. Essas substâncias seriam essenciais para a manutenção do equilíbrio
entre inibidores e ativadores da angiogênese, vasoconstrição e vasodilatação, além
de mecanismos antitrombóticos (26).
Os coágulos menstruais formados no interior da cavidade uterina são
dissolvidos a partir da ocorrência de fibrinólise endometrial. O material resultante
desse processo contém fibrina, PDF, α2-antiplasmina inativa, ativadores de
plasminogênio e plasmina ativa (18, 23). Contém também células do estroma lisadas,
exsudato inflamatório, células sanguíneas, fibras reticulares, glândulas e enzimas
proteolíticas (23, 26).
O êxito da interrupção do sangramento menstrual é garantido pela atuação de
mecanismos hemostáticos, incluindo agregação plaquetária, formação e deposição de
34
coágulo. O FT e a trombina apresentam papel-chave nesse processo, a partir da
ativação de moléculas pró-coagulantes como, fatores da coagulação, PAI e inibidores
de fibrinólise ativados pela trombina. Por outro lado, a coagulação é regulada pelos
ativadores de plasminogênio e pela plasmina na fibrinólise, limitando a formação do
coágulo na da cavidade uterina (52). O tecido é então regenerado, novos capilares
são formados com o objetivo de reestabelecer a circulação e a funcionalidade tecidual
(22).
2.4.1 As plaquetas e o ciclo menstrual
Fisiologicamente, a interrupção do sangramento menstrual inicia-se com a
formação do tampão plaquetário, resultante da agregação das plaquetas. Especula-
se que células do estroma endometrial sintetizem o fator de crescimento derivado de
plaquetas, que atua de forma parácrina e autócrina, complementando a ação do fator
de crescimento epidérmico (18).
Para prevenir a formação de um tampão plaquetário excessivo, que pode ocluir
parcial ou totalmente a luz do vaso, a metabolização do ácido araquidônico-AA na
superfície das plaquetas e na membrana endotelial tem um papel essencial. Na
superfície das plaquetas, o AA é metabolizado em tromboxano-TXA2 que induz a
liberação de ADP dos grânulos das plaquetas, favorecendo a agregação. No endotélio
vascular a metabolização do AA gera prostaciclina (PGI2), um vasodilatador que inibe
e reverte a agregação plaquetária (60). Simultaneamente, ocorre a ativação em
cascata dos fatores da coagulação, resultando na formação de trombina, que cliva o
fibrinogênio em monômeros de fibrina (36).
A literatura descreve flutuações na contagem de plaquetas ao longo do ciclo
menstrual com um aumento da contagem na fase ovulatória (61) e uma redução na
menstruação (62, 63) quando comparadas às fases folicular ou lútea (63).
A função plaquetária também já foi avaliada durante o ciclo menstrual por
Feuring et al (56) e Roell et al (64) que verificaram um aumento na fase lútea em
relação às demais. Estes pesquisadores observaram uma elevação dos níveis do pró-
coagulante FvW, em resposta ao aumento da concentração de progesterona, durante
essa fase (64).
Esses dados, no entanto, diferem do estudo anteriormente desenvolvido por
Yamazaki et al (65), no qual foi observada agregação plaquetária exacerbada induzida
35
por ADP e adrenalina durante a fase folicular. De forma similar, Melamed et al (66)
verificaram uma diminuição da agregação plaquetária, independente do agonista
utilizado na fase lútea. Bolis et al (67) em contrapartida, relataram que os níveis desse
biomarcador reduziriam durante o período peri-ovulatório. Contraditoriamente, Roell
et al (64), em um estudo longitudinal, não observaram variação na agregação
plaquetária durante as fases folicular e lútea.
A fim de testar a hipótese de que os APL apresentam um papel relevante nos
processos de coagulação e inflamação durante o ciclo menstrual, contribuindo para
uma maior susceptibilidade a eventos tromboembólicos e doença inflamatória em uma
dada fase do ciclo, Rosin et al (68) avaliaram a formação de APL em 20 mulheres
saudáveis. O número de plaquetas e de APL foi maior na ovulação quando comparado
às outras fases do ciclo menstrual. De maneira similar, a expressão da P-selectina
atingiu o pico máximo no 14º dia do ciclo, sugerindo efeitos fortes do estrogênio na
interação plaqueta-leucócito e uma variação na função das plaquetas durante fases
específicas do ciclo menstrual.
Robb et al (10) investigaram a influência do ciclo menstrual na ativação
plaquetária, avaliando a concentração dos marcadores P-selectina solúvel, ligante de
CD40 e a formação de APM. No entanto, não foi observada alteração desses
marcadores ao longo do ciclo menstrual ou correlação significativa entre esses
biomarcadores e a concentração de estrogênio ou progesterona.
Toth et al (55) investigaram se a ativação plaquetária é variável ao longo do
ciclo menstrual a partir da determinação do percentual de micropartículas (MP)
plaquetárias e endoteliais na circulação periférica, em mulheres saudáveis.
Observaram que durante a fase lútea, as mulheres apresentaram número elevado de
MP plaquetárias expressando anexina V, CD61 e CD63, bem como de MP endoteliais
expressando E-selectina. Concluíram que esses perâmetros podem ser fatores de
risco adicionais, contribuindo para um estado pró-coagulante, até então inexplicável
em mulheres jovens.
2.4.2 Outros componentes hemostáticos e o ciclo menstrual
A influência dos hormônios no ciclo menstrual, na coagulação e na fibrinólise é
patente. Durante a fase folicular, o estrogênio, além de induzir a proliferação
36
endometrial, estimula a angiogênese por meio da ativação de células estromais
endometriais humanas (HESC), que expressam o fator de crescimento vascular
endotelial (VEGF) e das células endoteliais do endométrio, que expressam a
angiopoietina-2 (Ang-2) (54).
Na fase lútea, a progesterona induz a decidualização em torno dos vasos
sanguíneos e aumenta a expressão de angiopoietina-1 (Ang-1) nas HESC, capaz de
estabilizar os vasos sanguíneos recém-formados. A progesterona também estimula a
síntese do FT e do PAI-1, conferindo à fase lútea, propriedades pró-coagulantes
significativas, que reduzem a chance de sangramento caso ocorra implantação do
blastocisto. Se não houver fertilização, a redução dos níveis de progesterona cria um
ambiente pró-hemorrágico em torno dos vasos sanguíneos endometriais, resultando
em sangramento menstrual (54). Em concordância, Chairet et al (69) avaliaram o
potencial de geração de trombina e outros parâmetros hemostáticos em 102 mulheres
durante as fases folicular e lútea do ciclo e verificaram que a concentração de trombina
na fase lútea é superior à observada na fase folicular.
No entanto, conclusões conflitantes têm sido obtidas na avaliação de
marcadores hemostáticos durante o ciclo menstrual. Há relatos de que as
concentrações de FVIII, de fibrinogênio e de AT se mantém inalteradas (70), reduzidas
(61) ou aumentadas durante a fase lútea (56). O mesmo ocorre com os níveis de FvW
(71-73), ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (u-PA) e PAI-1 (74). Aara et al
(63) verificaram que o tempo de protrombina varia entre as fases do ciclo menstrual,
sendo significativamente menor na menstruação quando comparada à fase folicular ou
à fase lútea.
De forma similar, a avaliação dos níveis de fibrinogênio, também é conflitante.
Alguns pesquisadores obtiveram concentração reduzida dessa proteína na fase
folicular (56, 57) e outros durante a fase lútea (75, 76) em relação às demais. Há ainda
estudos nos quais não foi verificada alteração ao longo do ciclo menstrual (64, 77, 78).
Um estudo longitudinal realizado com 39 mulheres revelou diminuição na
concentração de fibrinogênio e do FvW durante os três primeiros dias da menstruação,
com um pico na fase lútea (71). Em contrapartida, Onundarson et al (72) em um estudo
transversal não observaram diferenças nesses parâmetros. Nesse estudo também não
foi verificada associação entre os níveis de estradiol, progesterona ou testosterona e
FvW ou FVIII. Contudo, os resultados obtidos por Miller et al (73), revelaram uma
37
concentração reduzida de FvW durante os primeiros quatro dias do ciclo menstrual e
elevação nos dias 9 e 10 do ciclo (72).
Cederblad et al (61) investigaram a variação do número e da agregação das
plaquetas, fatores da coagulação e fibrinólise durante o ciclo menstrual em 30 mulheres
saudáveis. Os resultados obtidos indicaram que a concentração de fibrinogênio foi
menor durante a menstruação do que na fase lútea. O potencial fibrinolítico foi
considerado maior na fase lútea e na menstruação quando comparado à folicular.
Resultados semelhantes foram obtidos por Larsen et al (79), no entanto, não foi
observada alteração nos parâmetros fibrinolíticos.
Diferentemente de Cederblad et al (61), Dapper & Didia (80) obtiveram
concentração de fibrinogênio elevada durante a menstruação, seguida das fases
ovulatória e lútea, e reduzida na folicular. Em contrapartida, Siegbahn et al (70) não
observaram variação nos níveis de fibrinogênio e de AT, no número de plaquetas e na
ativação plaquetária nesse período. Para os parâmetros fibrinolíticos, foi verificada uma
menor concentração na fase lútea quando comparada às demais (70).
Fernandez-Shaw et al (81) demonstraram que durante a ovulação e a fase peri-
ovulatória, há ativação do sistema plasminogênio-plasmina. Na menstruação, esse
sistema parece auxiliar a desintegração do endométrio, conferindo fluidez ao sangue
menstrual. Sugeriram que na fase ovulatória, o mesmo sistema provavelmente
favoreceria a remoção de fragmentos celulares e de fibrina das paredes da cavidade
uterina, facilitando a migração dos espermatozoides. Esse processo seria coordenado
pelos esteroides sexuais e inibidores locais antiplasmínicos.
Tem sido admitido que a ação dos ativadores do plasminogênio no fluido
luminal uterino e no endométrio é intensificada na fase proliferativa, alcançando o
ápice no meio do ciclo e diminui na fase lútea, aumentando novamente no início da
menstruação (23). Os ativadores do plasminogênio, que ativam essa proteína em
plasmina, são encontrados também na fase lútea tardia e na menstruação, sendo
liberados pelo endotélio vascular do endométrio degenerado (26). Os inibidores PAI-
1 e 2 também estão presentes no endométrio e podem atuar no remodelamento
tecidual durante a fase folicular e na menstruação (23).
Sabe-se que, de uma maneira geral, macrófagos e leucócitos são capazes de
sintetizar ativadores de plasminogênio e que durante o período pré-menstrual há uma
leucocitose fisiológica (82). Bulmer et al (83) relataram que os linfócitos endometriais
38
encontram-se numericamente aumentados na fase lútea tardia e que, em consequência
disso, os níveis de t-PA e PAI-1 também estariam elevados nesse período.
Casslen & Astedt (84) revelaram que o estrogênio é capaz de aumentar a
concentração de t-PA no endométrio e no fluido luminal. Schatz et al (85) obtiveram
resultados semelhantes quando avaliaram o endométrio durante a menstruação. No
entanto, foi demonstrado que a progesterona estimula a síntese de PAI-1 e 2 em
experimentos in vitro (85-87).
Koh et al (57) investigaram marcadores da coagulação, da fibrinólise e da função
plaquetária em 30 mulheres ao longo do ciclo menstrual e não foi verificada diferença
nos mesmos. No entanto, observaram uma associação entre um estado fibrinolítico
reduzido e o meio do ciclo.
Maki et al (88) e Basu (89) relataram que o período menstrual é acompanhado de
aumento da concentração sérica dos PDF, sendo uma manifestação sistêmica de
estímulo à fibrinólise. Contrariamente, Cole & Clarkson (90) avaliaram os níveis séricos
de PDF em 331 mulheres após a menstruação e não observaram correlação
significativa entre esse parâmetro e a quantidade de sangue perdida.
Em relação aos níveis plasmáticos de D-Di, também foi descrita uma variação
durante o ciclo menstrual, apresentando valores reduzidos nas fases folicular (57), lútea
(14), ou na metade do ciclo (57). Para a α2-antiplasmina, também foi relatada a
diminuição dos níveis plasmáticos durante a fase folicular (91).
2.4.3 Principais alterações no hemograma durante o ciclo menstrual
Sabendo que o ciclo menstrual induz várias modificações na fisiologia da mulher,
tanto nos órgãos reprodutivos quanto sistêmicas, é esperado que também ocorram
alterações no hemograma, considerando a variação dinâmica das células sanguíneas,
especialmente dos leucócitos (61, 71, 92). Nesse contexto, Makinoda et al (92)
avaliaram o hemograma e as concentrações séricas de eritropoietina, fator estimulador
de colônias granulocíticas (G-CSF), citocinas e hormônios sexuais durante o ciclo
menstrual de mulheres saudáveis. Não foram observadas alterações na contagem de
hemácias, global de leucócitos, granulócitos, plaquetas, nos níveis de eritropoietina e
de interleucinas. No entanto, a concentração sérica de G-CSF aumentou durante a
ovulação, quando comparada às demais fases do ciclo. Concluíram que a perda de
39
sangue durante a menstruação não altera o hemograma e que o G-CSF pode
apresentar um papel importante no mecanismo da ovulação.
Admite-se que a mulher apresente maior contagem de neutrófilos do que os
homens devido à ação do estrogênio e da progesterona sobre os leucócitos (93).
Nesse sentido, há estudos na literatura que sugerem que a ovulação guarda
semelhanças com processos inflamatórios, uma vez que a contagem global de
leucócitos pode se modificar durante esse período (93, 94).
Bain & England (95) investigaram a variação da contagem de leucócitos
durante o ciclo menstrual e a correlação com as alterações hormonais. Observaram
um pico na contagem de neutrófilos no período pré-menstrual, seguido de neutropenia
durante a menstruação e outro pico após essa fase. Não obtiveram variações na
contagem de linfócitos, e a contagem de eosinófilos mostrou uma variação cíclica,
inversamente proporcional ao número de neutrófilos e monócitos. A contagem de
plaquetas apresentou variações discretas, sendo observado um maior número
durante e após a menstruação.
Em suma, conclusões definitivas acerca do impacto do ciclo menstrual em
parâmetros hematológicos e os prováveis desdobramentos na saúde da mulher
requerem maior investigação.
2.5 Uso dos anticoncepcionais orais combinados e a trombose
Os anticoncepcionais orais (ACO) estão entre os medicamentos mais amplamente
vendidos no mundo e constituem um método de contracepção seguro e de baixo custo
(6). Nos ACO, o estrogênio (etinilestradiol) e os análogos de progesterona estão
normalmente combinados porém, existem apresentações de progestina isolada (96).
Os estrogênios e progestogênios são também utilizados para a reposição hormonal na
menopausa (96, 97). Os ACO foram introduzidos na década de 1950 e, embora haja
evidências de aumento do risco de doenças cardiovasculares, tromboembólicas e
câncer associado ao seu uso desde a década de 1960, esses medicamentos são
utilizados por mais de 100 milhões de mulheres no mundo (6, 98).
Os ACO combinados são classificados em gerações, de acordo com o tipo de
progestogênio utilizado na formulação. A primeira geração de ACO contém acetato de
noretisterona, linestrenol, acetato de etinodiol ou noretinodrel e está em desuso (99).
Os ACO de segunda geração, ainda utilizados na atualidade, contêm majoritariamente
40
levonorgestrel ou norgestrel. Os de terceira geração, contendo desogestrel ou
gestodeno, tornaram-se disponíveis na década de 1980 e também são frequentemente
utilizados. Dois outros tipos de ACO, considerados de quarta geração e disponíveis no
mercado desde 2001, correspondem às preparações contendo acetato de ciproterona
(indicadas também para o tratamento de acne vulgar, seborreia e hirsutismo leve) e
drospirenona, um antimineralocorticóide indicado no combate à retenção hídrica (5).
Os ACO combinados tradicionais (monofásicos) são compostos de 21
comprimidos com a mesma dosagem de estrogênio e progestogênio em todas as
pílulas, e requerem sete dias de pausa (21/7) durante a qual ocorre o sangramento
semelhante ao menstrual. As composições di e trifásicas apresentam um aumento
gradual da dose do progestogênio, com o objetivo de mimetizar o ciclo natural e
minimizar os efeitos androgênicos. No entanto, na prática, esses efeitos são de
importância clínica questionável (6).
Os primeiros casos de tromboembolismo associados ao uso de ACO foram
relatados em 1961 e um aumento de duas a seis vezes no risco de ocorrência de
trombose venosa profunda associada ao uso desses medicamentos foi observado.
Assim, com a evolução da indústria farmacêutica, novas formulações de ACO
combinados surgiram para diminuir esse risco, nas quais as altas doses de estrogênio
foram reduzidas gradativamente para concentrações entre 30 e 15µg (5).
De acordo com dados da Agência Europeia de Medicamentos, o risco de
desenvolvimento de tromboembolismo venoso no período de um ano para mulheres
não gestantes e que não utilizam qualquer combinação hormonal seria de 2:10.000;
variando de 5 a 12:10.000, dependendo da combinação de ACO utilizada (6). As
formulações de maior risco seriam as de terceira geração que utilizam desogestrel ou
gestodene como progestogênio (6, 99). Além disso, o período de maior risco seria
durante os três primeiros meses de uso, podendo ser rapidamente revertido após três
meses da interrupção do tratamento (4). Nesse sentido, a Agência Francesa
Reguladora de Medicamentos, desde 2012, aconselha que os ACO de terceira geração
não sejam prescritos como primeira escolha, mas apenas nos casos de existência de
efeitos adversos importantes com o uso das formulações de segunda geração (99).
Uma explicação biologicamente plausível para o maior risco tromboembólico
envolvendo os ACO de terceira geração, em relação aos de segunda, refere-se ao fato
de que essas progestinas, combinadas com etinilestradiol, parecem conferir resistência
à PC ativada de maneira mais efetiva (99).
41
Nesse sentido, Helmerhorst et al (5) no MEGA Study caso-controle, avaliaram o
risco de trombose associado ao uso dos atuais ACO combinados (de acordo com a
dose de estrogênio e o tipo de progestogênio presentes na formulação). Verificaram
que esses medicamentos estão associados a um risco cinco vezes maior de trombose
venosa e que o mesmo difere claramente dependendo do tipo de progestogênio e da
dose de estrogênio. Assim, o uso de ACO contendo desogestrel estaria associado a
um risco duas vezes maior de trombose venosa em comparação com aqueles contendo
levonorgestrel. Para as mulheres que utilizam ACO contendo acetato de ciproterona ou
drospirenona, o risco encontrado foi similar às formulações contendo desogestrel,
correspondendo a um aumento de seis a sete vezes em relação às não usuárias de
ACO. Concluíram que a opção mais segura no que se refere ao risco de trombose
venosa seria a combinação de levonorgestrel com uma dose baixa de estrogênio.
Embora para as formulações contendo drospirenona o risco trombogênico seja
teoricamente similar ao dos ACO de terceira geração, o órgão norte-americano Food
and Drug Administration (FDA), fundamentado em revisões e estudos epidemiológicos
recentes, concluiu que os ACO contendo drospirenona poderiam ser associados a um
risco superior às demais pílulas, resultando na obrigatoriedade de um alerta a esse
respeito na bula desses medicamentos (3).
Em concordância com esse posicionamento, Tchaikovski et al (3) demonstraram
que durante o uso de ACO combinados contendo drospirenona, existem alterações
envolvendo aumento de vários fatores da coagulação (protrombina, FV, FX, FVIII), além
da redução de anticoagulantes naturais (antitrombina, PC, PS e TFPI). As modificações
associadas à PC e ao TFPI são as mais relevantes, aumentando o risco de trombose
nessas mulheres.
Tem sido admitido que a alteração no equilíbrio entre coagulação e fibrinólise,
induzida pelos ACO, favorece a formação de fibrina e que tais modificações são
atribuídas aos efeitos do componente estrogênico das pílulas sobre o fibrinogênio, fator
VII, plasminogênio, t-PA, AT e PS. O aumento do turnover da fibrina levaria a maior
formação dos fragmentos 1+2 da protrombina e D-Di, bem como dos complexos
trombina-antitrombina/TAT e plasmina-antiplasmina/PAP (4).
Além da determinação laboratorial de marcadores hemostáticos, métodos como a
tromboelastografia (que verifica a viscosidade e a elasticidade do sangue durante a
coagulação e a fibrinólise) foram utilizados para avaliar a hemostasia em usuárias de
ACO e resultaram em conclusões semelhantes, no que tange à indução do estado de
42
hipercoagulabilidade. Murray et al (100) demonstraram que usuárias de ACO
combinados monofásicos apresentaram redução no tempo de formação e maior taxa
de formação do coágulo, além de maior coagulabilidade sanguínea entre os dias 20 e
24 do ciclo menstrual, em comparação com os dias 10 a 14 e com mulheres que não
utilizam esse medicamento. Postularam que isso resultou de um efeito hormonal
cumulativo, aumentando a coagulabilidade sanguínea, em consequência à maior
atividade pró-coagulante e menor ação anticoagulante. Além disso, as mulheres que
utilizaram ACO, apresentaram menor tempo de protrombina-TP (que avalia a via
extrínseca da coagulação) e tempo de tromboplastina parcial ativado-TTPa (que avalia
a via intrínseca), indicando maior potencial de coagulação em relação ao grupo de
mulheres que não utilizam esse medicamento (100).
Os ACO combinados estão também associados ao risco aumentado de trombose
arterial, tanto infarto agudo do miocárdio (IAM), quanto acidente vascular cerebral
(AVC) isquêmico. Uma revisão sistemática recente visando estimar o risco desses
eventos em usuárias de ACO (considerando-se os diferentes tipos, doses e gerações)
em relação às mulheres que não os utilizam, concluiu que há um risco relativo de 1,6
de ocorrência de IAM ou AVC isquêmico. No entanto, o risco não varia claramente de
acordo com a geração ou com o tipo de progestogênio. Ao fazer a estratificação, por
dose de estrogênio, o risco desses eventos cresceu à medida que aumentou a
concentração desse componente e as formulações contendo levonorgestrel e 30 µg de
estrogênio mostraram-se mais seguras (101).
A meta-análise realizada por Xu et al (102) apresentou resultados semelhantes no
que se refere à associação entre a dose do estrogênio contida nas formulações dos
ACO e o risco de ocorrência do primeiro AVC isquêmico Esses pesquisadores
concluíram que em todas as gerações de ACO existe um risco, no entanto, esse é
consideravelmente menor para os ACO de quarta geração.
Em suma, embora o tromboembolismo seja de natureza multifatorial, Tchaikovski
& Rosing (2) definiram os principais mecanismos a partir dos quais o estradiol
contribuiria para a ocorrência dos eventos trombóticos: aumento dos níveis de pró-
coagulantes (fatores da coagulação II, VII, VIII IX e XI e fibrinogênio); aumento na
atividade de PAI-1 e PAI-2; e redução da atividade dos anticoagulantes naturais (AT,
TFPI, PC e PS). No entanto, as alterações referentes ao sistema fibrinolítico
permanecem inconclusivas.
43
É relevante ressaltar que variações individuais na farmacocinética e
farmacodinâmica dos ACO, bem como a predisposição genética a eventos
tromboembólicos (deficiência de AT, PC e PS; presença de fator V Leiden e mutação
no gene G20210A da protrombina) podem explicar o fato de que para algumas
mulheres o uso desses medicamentos configure um risco adicional (6-8). Assim, o uso
de ACO combinados são contraindicados para mulheres com trombofilia grave. No
entanto, para aquelas com trombofilia leve, o risco de desenvolver trombose é
moderado. Na ausência de outros fatores de risco, esses medicamentos podem ser
prescritos quando contraceptivos alternativos confiáveis não são bem tolerados (8).
44
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar as alterações hematológicas que ocorrem fisiologicamente, em dois
momentos do ciclo menstrual e durante o uso de ACO combinado, em mulheres
saudáveis, jovens e mulheres no climatério.
3.2 Objetivos específicos
Avaliar em mulheres jovens (em uso ou não de ACO combinado) e em mulheres
no climatério, no 2º dia da menstruação e no meio do mesmo ciclo menstrual:
Hemograma;
Expressão de glicoproteínas da membrana plaquetária (P-selectina, GPIIb/IIIa,
GPIIIa e GPIX) por citometria de fluxo;
Percentagem de agregados plaquetas-monócitos (APM) e agregados
plaquetas-neutrófilos (APN) por citometria de fluxo;
Níveis plasmáticos de D-Di, PAI-1 e FVIII.
A partir do estudo desses parâmetros espera-se gerar maiores conhecimentos
acerca da fisiologia do ciclo menstrual e de suas complexas interações com elementos
hematológicos, bem como do impacto das intervenções hormonais (ACO combinado)
e da idade nessas variáveis.
45
4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Os experimentos foram delineados da seguinte maneira:
Aprovação do projeto de pesquisaComitê de Ética em Pesquisa da UFMG (CAAE 03770212.3.0000.5149) e pela Diretoria de Ensino,Pesquisa e Extensão/DEPE do Hospital das Clínicas da UFMG
Seleção das participantes
Critérios de exclusão- Obesidade (IMC >30Kg/m2)- Distúrbios plaquetários ou da coagulação, doenças ginecológicas, cardiovasculares, autoimunes, hepáticas, renais e infectocontagiosas, síndrome dos ovários policísticos, diabetes, câncer e inflamação/infecção em um período inferior a 3 semanas.
Critério de inclusão18 a 30 anos
Critérios de inclusão- Acima de 42 anos
- Não usar ACO
Critério de inclusão- Usar ACO
Critério de inclusão- Não usar ACO
Jovens=16 Jovens-ACO=20 Climatério=10
AMOSTRAS BIOLÓGICAS- 2º dia da menstruação
- Meio do ciclo
Sangue em EDTA 2 mL
Sangue em citrato de
sódio 3,5 mL
HemogramaCoulter T890® e filme sanguíneo
APM e APNCitômetro de fluxo BD
LSRFortessa®
PRP
centrifugação
centrifugação
Glicoproteínas plaquetáriasCitômetro de fluxo BD
LSRFortessa®
PPP
Dímero-D (Kit Imuclone® D-Dimer); PAI-1 (Kit IMUBIND®
Plasma PAI-1 ); FVIII (Kit IMUBIND® Factor FVIII)
Sekisui Diagnostics (Germany)
*
*
**
Análise estatística- Programa Minitab (versão 17.0)- Normalidade dos dados: método Shapiro-Wilk - Comparação entre as duas coletas: teste t pareado ou teste de Wilcoxon- Comparação entre grupos: teste t de Student ou teste de Mann Whitney- Correlação de Spearman P <0,05: estatisticamente significativo
*
46
4.1 Aspectos Éticos
Este projeto foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa/COEP da Universidade Federal de Minas Gerais (ANEXO A), sob o número
CAAE 03770212.3.0000.5149, e pela Diretoria de Ensino, Pesquisa e Extensão/DEPE
do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais (ANEXO B).
O esclarecimento dos objetivos da pesquisa, utilizando-se linguagem clara, foi
feito pelos pesquisadores, a todas as mulheres que participaram do estudo, e o Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) foi obtido em todos os casos (ANEXO
C). Uma ficha clínica contendo dados importantes para análise dos resultados foi
preenchida em todos os casos (ANEXO D).
4.2 Casuística
Participaram deste estudo 46 mulheres em idade reprodutiva, com ciclos
menstruais regulares, distribuídas em três grupos:
Grupo Jovens (n=16)
Os critérios de inclusão utilizados foram: Idade entre 18 e 30 anos, não utilizar
ACO ou qualquer outra apresentação há pelo menos 5 meses.
Grupo Jovens-ACO (n=20)
Os critérios de inclusão utilizados foram: Idade entre 18 e 30 anos, utilizar ACO
combinado monofásico há pelo menos 5 meses.
Grupo Climatério (n=10)
Os critérios de inclusão utilizados foram: Idade superior a 42 anos, não utilizar ACO
ou qualquer outra apresentação há pelo menos 5 meses.
Os critérios de exclusão comuns a todos os grupos foram: Presença de doenças
como, distúrbios plaquetários ou da coagulação, doenças ginecológicas,
cardiovasculares, autoimunes, hepáticas, renais e infectocontagiosas, síndrome dos
47
ovários policísticos, obesidade (IMC >30Kg/m2), diabetes, câncer e
inflamação/infecção em um período inferior a 3 semanas.
As integrantes dos grupos foram selecionadas nas unidades da Universidade
Federal de Minas Gerais (Campi Pampulha e Saúde), na Unidade Funcional,
Ginecologia, Obstetrícia e Neonatologia do Hospital das Clínicas da UFMG e na
comunidade em geral.
4.3 Coleta de dados clínicos e de amostras biológicas
Os dados utilizados para preenchimento da ficha clínica foram colhidos a
partir de uma entrevista com a participante por telefone ou pessoalmente. Mediante
essa avaliação prévia, foram programadas duas coletas de sangue periférico: a
primeira no segundo dia da menstruação e a segunda no meio do mesmo ciclo
menstrual.
Para a definição da data da segunda coleta, foi feita uma análise retrospectiva
dos ciclos menstruais, de pelo menos dois meses, para a definição do dia
correspondente à metade do ciclo. Para os grupos Jovens e Climatério, esse
momento corresponderia à ovulação, cujas concentrações de estrogênio e LH seriam
máximas.
Para o grupo Jovens-ACO, o segundo momento da coleta apresenta
interpretação distinta. Os ACO combinados monofásicos, utilizados por todas as
participantes desse grupo, caracterizam-se por apresentar em cada uma das 21
pílulas as mesmas concentrações de estrogênio e progestogênio. Assim, não há
variações de dose nem variações fisiológicas, mas um efeito cumulativo, graças aos
níveis hormonais elevados e constantes durante o uso desses medicamentos.
Em cada coleta, foram obtidos 2mL de sangue periférico em ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) 1,8 mg/mL (Vacuette® - Greiner Bio-One,
Áustria/Alemanha), para realização do hemograma e 3,5mL em citrato de sódio 0,129
mmol/L (Vacuette®), para o estudo da expressão de marcadores de ativação
plaquetária e análise de APL (APM e APN) por citometria de fluxo. Alíquotas de
plasma pobre em plaquetas (PPP), obtidas do tubo contendo citrato de sódio, foram
congeladas a -70ºC para posterior dosagem de D-Di, PAI-1 e FVIII.
48
As coletas foram realizadas utilizando-se sistema a vácuo e material
descartável. As amostras de sangue foram processadas em até duas horas após a
punção venosa e a leitura dos testes por citometria de fluxo foi feita em até 24 horas.
4.4 Métodos
O hemograma foi realizado, utilizando o contador eletrônico de células
(Coulter T-890® - Beckman Coulter, Estados Unidos), no Laboratório de Hematologia
Clínica da Faculdade de Farmácia da UFMG. A avaliação do filme sanguíneo para
contagem diferencial de leucócitos foi feita em triplicata ao microscópio óptico
(Olympus Cx21® - Olympus, Japão).
A expressão de marcadores de ativação plaquetária e formação de APM e
APN foram avaliadas utilizando o citômetro de fluxo BD LSRFortessa® (Becton
Dickinson, Estados Unidos) e os dados obtidos avaliados no software FlowJo®
(FlowJo Inc, Estados Unidos).
A determinação dos níveis plasmáticos de D-Di, PAI-1 e FVIII foi realizada
utilizando-se ensaio imunoenzimático (ELISA) de captura a partir de kits específicos
comercialmente disponíveis. A leitura da absorvância das placas foi feita no leitor
VersaMax ELISA® (Molecular Devices, Estados Unidos) e os dados obtidos avaliados
no software SoftMax Pro 5,2® (Molecular Devices, Estados Unidos).
4.4.1 Protocolo do estudo da expressão de marcadores de ativação
plaquetária
O estudo da expressão de marcadores de ativação plaquetária foi realizado
conforme protocolo original padronizado por Freitas et al (103). Os anticorpos
utilizados foram previamente titulados a fim de se obter a concentração ideal para os
mesmos.
O protocolo utilizado nos experimentos é descrito a seguir. A amostra de
sangue total citratado foi previamente centrifugada a 800rpm durante 10 minutos para
obtenção do plasma rico em plaquetas (PRP). Para fixação das plaquetas, alíquotas
de 200µL de PRP foram gotejadas em um tubo de poliestireno 12x75mm contendo
800µL de solução fixadora (paraformaldeído a 10g/L em cacodilato de sódio a 10,2g/L
49
e cloreto de sódio a 6,63g/L; pH ajustado para 7,2-7,4) sob agitação em vórtex e
acondicionadas em geladeira (4ºC a 8ºC) overnight.
A suspensão de plaquetas foi lavada com 1mL de solução fosfato tamponada
(PBS 0,015M, pH=7,2) filtrada a 0,45µm e centrifugada a 2.200rpm durante 10
minutos. O sobrenadante foi desprezado por inversão e o excesso foi retirado
vertendo-se o tudo sobre papel absorvente. O pellet foi ressuspendido suavemente
com 1mL de PBS e a contagem de plaquetas foi feita utilizando o contador
hematológico Coulter T-890®.
A suspensão de plaquetas fixadas foi ajustada para 5x106 plaquetas/mL.
Alíquotas de 100µL dessa suspensão (500.000 plaquetas) foram adicionadas a tubos
de poliestireno 12x75mm e incubadas com anticorpos monoclonais (Becton Dickinson
Pharmingen®, Estados Unidos) dirigidos contra GP plaquetárias, conforme descrito na
Tabela 1. Os tubos continham um controle interno de auto-fluorescência (branco) no
qual a suspensão de plaquetas foi incubada na ausência de anticorpos monoclonais.
Os tubos foram homogeneizados em vórtex e, posteriormente, incubados à
temperatura ambiente (TA) e ao abrigo de luz, durante 30 minutos. Após o período de
incubação, as amostras foram lavadas com 1mL de PBS, homogeneizadas em vórtex
e centrifugadas a 2.200rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi desprezado por
inversão e o excesso retirado vertendo-se o tubo sobre papel absorvente. O pellet foi
ressuspendido em 200µL de PBS.
Tabela 1 – Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise das
glicoproteínas plaquetárias.
Tubo Reagente/anticorpo Fluorocromo Volume/
Concentração Clone
Fenótipo alvo
1 PBS - 20µL - -
2 Anti-CD41a PE 1:40 HIP8 GPIIb/IIIa
3 Anti-CD61 PE 1:80 VI-PL2 GPIIIa
4 Anti-CD42a
Anti-CD62P
FITC
PE
1:640
1:10
ALMA.16
AK-4
GPIX
P-selectina
_________________________
FITC: isotiocianato de fluoresceína; PE: ficoeritrina.
50
4.4.1.1 Aquisição e análise dos dados da ativação plaquetária por citometria de
fluxo
Um total de 50.000 eventos foram adquiridos por tubo, usando o citômetro de
fluxo BD LSRFortessa®. O software FlowJo® foi utilizado para a análise dos dados.
As diferentes estratégias utilizadas para análise do perfil de marcadores
plaquetários estão representadas na Figura 4. A população de plaquetas foi
inicialmente selecionada pela combinação tamanho (forward scatter - FSC) versus
granulosidade (side scatter - SSC) e feito um gate. Posteriormente, foram utilizados
histogramas unidimensionais de fluorescência para estabelecer a intensidade média
de fluorescência (IMF) para as GP plaquetárias CD41a, CD61, CD42a e CD62P.
A percentagem da população de plaquetas CD62P+ foi definida a partir da
combinação anti-CD42a FITC versus anti-CD62P PE. Os resultados foram expressos
como percentual de plaquetas CD42a+/CD62P+, correspondente ao quadrante
superior direito duplo positivo.
51
Figura 4 – Estratégias utilizadas para a determinação da intensidade média de fluorescência
de marcadores de ativação plaquetária e da percentagem de plaquetas CD62P+. Figuras
obtidas utilizando-se o software FlowJo.
Anti-CD41a PE
Anti-CD61 PE
Anti-CD42a FITC
Anti-CD42a FITC
An
ti-C
D6
2P
PE
IMF=4.100
IMF=2.300
IMF=12.000
2,2%
97,8%
Plaquetas
FSC/Tamanho
SSC
/ G
ran
ulo
sid
ade
Análise plaquetária
Nú
mer
od
e p
laq
uet
as Ativação plaquetária
Marcadores de superfície
Anti-CD62P PE
IMF=250
52
4.4.2 Protocolo do estudo dos agregados plaquetas-monócitos e plaquetas-
neutrófilos
O estudo da percentagem de agregados plaquetas-monócitos e plaquetas-
neutrófilos foi realizado conforme protocolo original padronizado por Freitas et al (103).
Os anticorpos utilizados foram previamente titulados, a fim de se obter a concentração
ideal para os mesmos.
O protocolo utilizado nos experimentos é descrito a seguir. Alíquotas de 100µL
de sangue total foram adicionadas a tubos de poliestireno 12x75mm contendo
anticorpos monoclonais (Becton Dickinson Pharmingen®) dirigidos contra GP
plaquetárias (anti-CD51/CD61), monócitos (anti-CD14) e neutrófilos (anti-CD16),
conforme descrito na Tabela 2. Os tubos continham um controle interno de auto-
fluorescência (branco) no qual o sangue foi incubado na ausência de anticorpos
monoclonais. Os tubos foram homogeneizados em vórtex e, posteriormente,
incubados à TA e ao abrigo de luz, durante 30 minutos.
Após o período de incubação, as amostras foram submetidas à lise das
hemácias, utilizando 2mL de solução de lise (citrato trissódico dihidratado a 25g/L;
heparina comercial a 5.000UI/mL; formaldeído a 54v/v; dietileno glicol a 30v/v; pH
ajustado para 7,85) diluída 10 vezes em água destilada. Após nova homogeneização
em vórtex, as preparações foram incubadas durante 10 minutos, à TA e ao abrigo de
luz. Depois foram centrifugadas a 1.300rpm durante 7 minutos. O sobrenadante foi
desprezado por inversão e o excesso foi retirado vertendo-se o tudo sobre papel
absorvente. O pellet foi ressuspendido em vórtex e os leucócitos foram lavados com
2mL de PBS. As etapas de centrifugação e descarte do sobrenadante foram repetidas.
O pellet foi então ressuspendido em 200µL de solução fixadora.
53
Tabela 2 – Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de
agregados plaquetas-leucócitos.
Tubos Reagente/anticorpo Fluorocromo Volume/
Concentração Clone Fenótipo alvo
1 PBS - 20µL - -
2 e 3 Anti-CD51/CD61 FITC 1:1.300 23C6 Integrina
heterodimérica αVβ3
2 Anti-CD14 PE 1:320 MϕP9 Monócitos
3 Anti-CD16 PECy5 1:1.500 3G8 Neutrófilos
_________________________
FITC: isotiocianato de fluoresceína; PE: ficoeritrina; PECy5: ficoeritrina-cianina 5
4.4.2.1 Aquisição e análise dos dados para determinação da percentagem de
agregados plaquetas-monócitos e plaquetas-neutrófilos
Um total de 50.000 eventos por tubo foi obtido usando o citômetro de fluxo BD
LSRFortessa®. O software FlowJo® foi utilizado para a análise dos dados.
As diferentes estratégias utilizadas para análise do perfil de APM e APN estão
representadas na Figura 5. A população dos monócitos foi selecionada a partir da
combinação de anti-CD14 PE versus SSC. Foi realizado um gate, selecionando a
população de interesse e posteriormente a combinação anti-CD14 PE versus anti-
CD51/CD61 FITC para definir a percentagem de APM.
A análise seletiva dos neutrófilos foi estabelecida pela combinação de anti-
CD16 PECy5 versus SSC. Foi realizado um gate, selecionando a população de
interesse e posteriormente a combinação anti-CD16 PECy5 versus anti-CD51/CD61
FITC para definir a percentagem de APN.
Os resultados foram expressos como percentual da população
CD51/CD61+/CD14+ (APM) e CD51/CD61+/CD16+ (APN), correspondente ao
quadrante superior direito duplamente marcado.
54
Figura 5 – Estratégias utilizadas para a determinação da percentagem de agregados
plaquetas-monócitos e agregados plaquetas-neutrófilos. Figuras obtidas utilizando-se o
software FlowJo.
4.4.3 Determinação do D-Di
A determinação dos níveis plasmáticos de D-Di foi realizada por ELISA de
captura, utilizando-se o Kit IMUCLONE® D-Dimer (Sekisui Diagnostics®, Alemanha),
seguindo rigorosamente as instruções do fabricante.
O princípio do teste consiste na captura dos antígenos D-Di presentes nos
plasmas testados, por anticorpos monoclonais de rato (anti-D-Di humano), fixados na
superfície de uma placa. Os antígenos não capturados são retirados por lavagens
sucessivas. Em seguida, adicionam-se os segundos anticorpos monoclonais de rato
(conjugados com peroxidase), que vão se ligar a determinantes antigênicos do D-Di
Anti-CD16 PECy5
An
ti-C
D5
1/C
D6
1 F
ITC
Anti-CD14 PE
Anti-CD16 PECy5Anti-CD14 PE
MonócitosNeutrófilos
SSC
/Gra
nu
losi
dad
e
SSC
/Gra
nu
losi
dad
e
1,1%98,9%
0,2%
An
ti-C
D5
1/C
D6
1 F
ITC
Análise dos monócitos Análise dos neutrófilos
Agregados plaquetas-monócitos Agregados plaquetas-neutrófilos
99,8%
55
(capturados na etapa anterior), distintos daqueles ligados aos primeiros anticorpos.
Os anticorpos conjugados com peroxidase que não se ligaram ao D-Di são,
posteriormente, retirados por lavagens sucessivas. A revelação dos antígenos
capturados na primeira etapa é feita por meio da determinação da reação da enzima
peroxidase (ligada ao segundo anticorpo) com o substrato orto-fenilenediamina
(OPD), na presença de peróxido de hidrogênio. Essa reação resulta na formação de
um produto corado e é interrompida pela adição de um ácido forte. A intensidade da
cor produzida (determinada espectrofotometricamente) é diretamente proporcional à
concentração do D-Di na amostra plasmática.
4.4.4 Determinação do PAI-1
A determinação dos níveis plasmáticos de PAI-1 foi realizada por ELISA de
captura, cujo princípio é o mesmo descrito para o D-Di, utilizando-se o Kit IMUBIND®
PLASMA PAI-1 (Sekisui Diagnostics®, Alemanha), seguindo rigorosamente as
instruções do fabricante.
4.4.5 Determinação do FVIII
A determinação dos níveis plasmáticos de FVIII foi realizada por ELISA de
captura, cujo princípio é o mesmo descrito para o D-Di, utilizando-se o Kit IMUBIND®
FACTOR VIII (Sekisui Diagnostics®, Alemanha), seguindo rigorosamente as
instruções do fabricante.
4.5 Análise estatística
A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o programa Minitab® 17,0
(Minitab®, Estados Unidos). A normalidade dos dados foi testada pelo método
Shapiro-Wilk.
A comparação das médias entre os dois momentos da coleta em um mesmo
grupo foi feita pelo teste T-pareado, para as varáveis com distribuição normal. Para
os dados que não seguiam a normalidade, utilizou-se o teste de Wilcoxon para a
comparação das medianas.
56
A comparação das médias entre os difere ntes grupos em um mesmo momento
do ciclo menstrual (Jovens versus Jovens-ACO e Climatério) foi feita pelo teste T de
Student, para as variáveis com distribuição normal. Para aquelas que não seguiam a
normalidade, utilizou-se o teste de Mann Whitney para a comparação das medianas.
O valor de p≤0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Para avaliar a associação entre contagem de plaquetas, biomarcadores de
ativação plaquetária e marcadores hemostáticos, utilizou-se o coeficiente de
correlação de Spearman. O índice de correção (ρ) foi utilizado para caracterizar a
força da correlação, como fraca (ρ<0,36), moderada (0,36<ρ<0,67) ou forte (ρ>0,68).
As correlações foram classificadas como negativas, com associação inversamente
proporcional, se ρ<0,0 e positivas, com associação diretamente proporcional, se
ρ>0,0. O valor de p≤0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
57
5 RESULTADOS
5.1 Características clínicas das integrantes dos três grupos avaliados
As características clínicas das participantes dos grupos estudados foram obtidas
durante a entrevista para agendamento das coletas.
Das 46 participantes do estudo, uma (2,2%) apresentava ensino médio
completo, 16 (34,8%) superior incompleto, 14 (30,4%) superior completo e 15 (32,6%)
pós-graduação. Vinte e oito (60,9%) mulheres declararam consumir álcool e 26
(56,5%) realizar atividade física regular. Apenas uma (2,2%) declarou ser fumante
eventual.
Todas as participantes do grupo Jovens-ACO utilizavam ACO combinado
monofásico de segunda, terceira ou quarta gerações, conforme representado na
Figura 6. Dessas, 02 (10%) participantes utilizavam ACO de segunda geração
(0,10mg de levonorgestrel + 20µg de etinilestradiol); 10 (50%) de terceira (0,15mg de
desogestrel + 20 ou 30µg de etinilestradiol; 0,06 ou 0,075mg de gestodeno + 15 ou
20µg de etinilestradiol); e oito (40%) de quarta geração (3mg de drospirenona + 20 ou
30µg de etinilestradiol; 2mg de acetato de clormadinona + 30µg de etinilestradiol).
Figura 6 - Gerações dos anticoncepcionais orais combinados utilizados pelas participantes do grupo Jovens-ACO
2ª geração10%
3ª geração50%
4ª geração40%
58
Em relação aos dados acerca do ciclo menstrual, foram avaliados os seguintes
parâmetros: duração do ciclo menstrual, duração do sangramento e intercorrências
durante a menstruação.
Algumas características clínicas das participantes dos três grupos avaliados
neste estudo estão apresentadas na Tabela 3, bem como a comparação estatística
entre as mesmas.
Tabela 3 – Características clínicas das participantes do estudo.
Jovens
(n=16)
Jovens-ACO
(n=20)
Climatério
(n=10)
p1 p2 p3 p4
Idade (anos)
IMC (Kg/m2)
25 ± 3
21 ± 4
25 ± 3
22 ± 3
44 ± 2
24 ± 2
0,00*
0,06
0,57
-
0,00*
-
0,00*
-
DCM (dias) 30 ± 34 28 ± 1 29 ± 4 0,37 - - -
DS(dias) 5 ± 1 5 ± 1 5 ± 1 0,15 - - -
IMC: índice de massa corporal; DCM: duração do ciclo menstrual; DS: duração do sangramento; Jovens: grupo de jovens que não usam ACO; Jovens-ACO: grupo de jovens que usam ACO combinado; Climatério: grupo de mulheres no climatério que não utilizam ACO. *p≤0,05. Dados representados como média±desvio padrão (ANOVA/Teste t-Student). p1: Jovens x Jovens-ACO x Climatério; p2: Jovens x Jovens-ACO; p3: Jovens x Climatério; p4: Jovens-ACO x Climatério.
A média da idade das integrantes do grupo Climatério foi superior à dos grupos
Jovens e Jovens-ACO (p=0,00 para ambos). Não houve diferença entre as médias do
IMC (p=0,06), duração do ciclo menstrual (p=0,37) e duração do sangramento
(p=0,15).
As participantes também foram questionadas quanto à presença de
intercorrências durante a menstruação. Trinta e cinco (76%) relataram sentir algum
desconforto. Na Figura 7 estão representadas as queixas mais frequentes.
59
Figura 7 - Principais desconfortos durante a menstruação relatados pelas participantes do
estudo.
Devido ao número elevado de dados avaliados, bem como à complexidade das
comparações realizadas dentro de um mesmo grupo (nos dois momentos do ciclo
menstrual) e entre os grupos (para cada um dos momentos do ciclo) optou-se por
apresentar e discutir os resultados que foram estatisticamente significativos. Os
demais foram considerados dentro dos intervalos de referência estabelecidos na
literatura e sem diferença estatística para todas as comparações avaliadas (ANEXOS
E e F).
5.2 Avaliação do hemograma
Os resultados obtidos mostraram um aumento da contagem relativa de neutrófilos,
durante a menstruação nos grupos Jovens e Jovens-ACO em relação ao meio do
ciclo. No grupo Climatério, uma menor contagem relativa e neutrófilos foi verificada
comparando-se os dois períodos, conforme apresentado na Figura 8A.
Considerando a influência do uso de ACO combinados e da idade, foi observada
maior contagem de plaquetas no grupo Jovens, no meio do ciclo menstrual, em
relação aos grupos Jovens-ACO e Climatério (p=0,005 e p=0,015, respectivamente),
como representado na Figura 8B. A contagem absoluta de neutrófilos foi maior,
durante a menstruação, no grupo Jovens em relação ao grupo Jovens-ACO (p<0,001)
(Figura 8B). A contagem relativa de neutrófilos bastonetes foi maior no grupo de
Jovens-ACO, no meio do ciclo, em relação ao grupo Jovens (p=0,037) (Figura 8B).
0
5
10
15
20
25
30
Cólica Cefaleia Dor na lombar Dor naspernas
Inchaço Outros
60
Finalmente, verificou-se que a contagem relativa de basófilos, no meio do ciclo, foi
maior no grupo Jovens, em relação ao grupo Jovens-ACO (p=0,003) (Figura 8B). Não
foram verificadas diferenças estatisticamente significativas para os demais
parâmetros do hemograma entre os grupos avaliados.
61
Figura 8 - Contagem de neutrófilos, plaquetas, neutrófilos bastonetes e basófilos (A) na
menstruação em relação ao meio do ciclo; (B) entre os grupos (Jovens, Jovens-ACO/J-ACO e Climatério/Climat) avaliados em uma determinada fase do ciclo menstrual.
50
55
60
65
Neu
tró
filo
s (
%)
3000
3500
4000
4500
Menstruação Meio do ciclo
Neu
tró
filo
s/m
m3
Jovens Jovens-ACO Climatério
Jovens J-ACO Climat Jovens J-ACO Climat
2º dia da menstruaçãoMeio do ciclo
200000
220000
240000
260000
280000
300000
Menstruação Meio do ciclo
Pla
qu
eta
s/m
m3
Jovens J-ACO Climat Jovens J-ACO Climat
1
2
3
4
Menstruação Meio do ciclo
Neu
tró
filo
s b
asto
nete
(%
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Meio do cicloMenstruação
Basó
filo
s (
%)
Jovens J-ACO Climat Jovens J-ACO ClimatJovens J-ACO Climat Jovens J-ACO Climat
A
B
s
62
5.3 Avaliação dos marcadores de superfície plaquetária
Um aumento da expressão de GPIIIa (CD61) no grupo Jovens-ACO, no meio do
ciclo foi obtido, comparando-se com a fase menstrual (p=0,040) (Figura 9A). A
expressão de GPIIb/IIIa (CD41a) foi também maior, no meio do ciclo, no grupo Jovens-
ACO em relação ao grupo Jovens (p=0,005), conforme mostrado na Figura 9B. Não
foram verificadas diferenças estatisticamente significativas na expressão de CD42a
(GPIX) ou CD62P (P-selectina) entre os grupos avaliados.
Figura 9 - Intensidade média de fluorescência (IMF) de CD61 e CD41a (A) na menstruação em relação ao meio do ciclo; (B) entre os grupos (Jovens, Jovens-ACO/J-ACO e Climatério/Climat)
avaliados em uma determinada fase do ciclo menstrual.
5.4 Avaliação dos agregados plaquetas-leucócitos
Uma frequência elevada de APM e APN, no meio do ciclo, no grupo Jovens-ACO
foi obtida em relação ao grupo Jovens (p=0,001 e p=0,015, respectivamente). A
frequência de APN, durante a menstruação, no grupo Jovens-ACO foi maior quando
comparado ao grupo Jovens, conforme representado na Figura 10.
2500
3000
3500
4000
4500
Inte
nsid
ad
e m
éd
ia d
e f
luo
rescên
cia
(IM
F) CD61
Jovens Jovens-ACO Climatério
2º dia da menstruaçãoMeio do ciclo
A
3000
4000
5000
Inte
nsid
ad
e m
éd
ia d
e f
luo
rescên
cia
(IM
F)
CD41a
Menstruação Meio do ciclo
Jovens J-ACO Climat Jovens J-ACO Climat
B
63
Figura 10 - Frequência de agregados plaquetas-monócitos (APM) e agregados plaquetas-neutrófilos (APN) entre os grupos (Jovens, Jovens-ACO/J-ACO e Climatério/Climat) avaliados
em uma determinada fase do ciclo menstrual.
5.5 Avaliação de Dímero-D (D-Di), inibidor do ativador do plasminogênio-1
(PAI-1) e fator VIII (FVIII)
Os níveis plasmáticos de D-Di, durante a menstruação, nos grupos Jovens e
Climatério foram mais elevados, em relação ao meio do ciclo (p<0,001 e p=0,022,
respectivamente) (Figura 11A). No grupo Jovens-ACO os níveis também foram mais
elevados, no meio do ciclo, quando comparado ao grupo Jovens (p=0,040), conforme
representado na Figura 11B.
Figura 11 - Níveis plasmáticos de Dímero-D (D-Di) (A) na menstruação em relação ao meio do ciclo; (B) entre os grupos (Jovens, Jovens-ACO/J-ACO e Climatério/Climat) avaliados em uma
determinada fase do ciclo menstrual.
0.5
1.0
1.5
Menstruação Meio do ciclo
% A
PM
Jovens J-ACO Climat Jovens J-ACO Climat0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Menstruação Meio do ciclo
% A
PN
Jovens J-ACO Climat Jovens J-ACO Climat
100
200
300
400
D-D
i (n
g/m
L)
Jovens Jovens-ACO Climatério
2º dia da menstruaçãoMeio do ciclo
A
100
150
200
250
300
350
Menstruação Meio do ciclo
D-D
i (n
g/m
L)
Jovens J-ACO Climat Jovens J-ACO Climat
B
64
Os níveis plasmáticos de PAI-1, foram reduzidos, na menstruação, nos grupos
Jovens-ACO (p=0,023) e Climatério (p=0,040), em relação ao grupo Jovens, conforme
representado na Figura 12. Comportamento semelhante foi observado, no meio do
ciclo, para os mesmos grupos (p=0,001 e p=0,040, respectivamente) (Figura 12). Não
foram observadas variações cíclicas em relação aos níveis plasmáticos de PAI-1, bem
como diferenças estatisticamente significativas nas concentrações de FVIII entre os
grupos avaliados.
Figura 12 - Níveis plasmáticos do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1) entre os grupos
(Jovens, Jovens-ACO/J-ACO e Climatério/Climat) avaliados em uma determinada fase do ciclo menstrual.
5.6 Análise da correlação de Spearman para contagem de plaquetas e
biomarcadores hemostáticos
Um modelo de correlação foi proposto para os parâmetros contagem de
plaquetas, biomarcadores plaquetários e componentes da coagulação e fibrinólise,
como uma ferramenta potencial no esclarecimento das alterações hematológicas que
ocorrem em mulheres em diferentes faixas etárias e submetidas a diferentes
condições hormonais.
Primeiramente, foram analisados os biomarcadores durante a menstruação para
todos os grupos. Verificou-se que o grupo Jovens apresentou cinco associações de
natureza moderada, envolvendo a contagem de plaquetas e diferentes biomarcadores
citométricos de ativação plaquetária. Para o grupo Jovens-ACO, o mesmo número de
associações significativas foi encontrado, mas agora envolvendo uma associação com
0
10
20
30
40
50
PA
I-1 (
ng
/mL
)
Menstruação Meio do ciclo
Jovens J-ACO Climat Jovens J-ACO Climat
65
o D-Di. Observou-se também o aparecimento de uma associação forte entre IMF de
CD62P e %CD62P. Finalmente, verificaram-se três associações fortes no grupo
Climatério, envolvendo biomarcadores de ativação plaquetária, contagem de
plaquetas e D-Di (Figura 13A). Todas as correlações encontradas foram positivas, ou
seja, os parâmetros estão relacionados de forma diretamente proporcional.
Posteriormente, os mesmos biomarcadores foram avaliados no meio do ciclo
menstrual para todos os grupos de mulheres. Para o grupo Jovens, observou-se a
existência de quatro associações moderadas entre contagem de plaquetas,
biomarcadores citométricos, D-Di e PAI-1. Além disso, houve o aparecimento de duas
associações fortes entre IMF de CD62P-%CD62P e PAI-1-%CD62P. Para o grupo
Jovens-ACO, foi verificado o mesmo número de correlações moderadas, mas agora
envolvendo, além de biomarcadores plaquetários, os níveis de FVIII. Finalmente,
houve um aumento do número de associações no grupo Climatério, correspondendo
a cinco de natureza forte, envolvendo biomarcadores plaquetários e níveis de PAI-1.
Todas as correlações encontradas foram positivas (Figura 13B).
66
Figura 13 - Coeficientes de correlação de Spearman (ρ) para a contagem de plaquetas, parâmetros citométricos e plasmáticos (A) na menstruação e (B) no meio do ciclo menstrual para todos os grupos avaliados.
A 2º dia da menstruação
0.53
0.07 0.15
-0.14 0.24 0.44
0.17 0.29 0.09 0.41
0.26 0.54 -0.05 0.21 0.61
-0.03 -0.57 -0.30 -0.43 0.06 -0.02
0.38 0.62 0.36 0.29 0.30 0.36 -0.09
0.47 0.00 0.15 0.13 0.05 0.03 0.01 -0.03
0.09 -0.23 0.12 -0.09 -0.24 -0.41 0.28 -0.07 0.34
0.14 -0.13 0.23 0.22 0.26 0.22 0.19 0.08 0.15 0.26
JovensCD41
CD42a
CD61
CD62P
%CD62P
APM
APN
D-Di
Pla
qu
etas
CD
41
CD
61
CD
62
P
%C
D6
2P
AP
N
AP
M
FVII
I
FVIII
PAI-1
CD
42
D-D
i
0.22
0.00 0.27
0.08 0.30 0.13
0.19 0.39 0.12 0.24
0.29 0.41 0.14 0.10 0.71
0.35 -0.04 0.19 0.10 -0.41 -0.31
0.46 -0.04 0.19 0.03 0.04 -0.16 0.41
0.58 0.35 0.07 -0.04 0.49 0.51 -0.02 0.37
-0.11 -0.37 0.16 -0.22 -0.13 -0.12 -0.18 0.29 0.09
-0.11 -0.10 -0.05 -0.28 -0.01 0.15 -0.16 -0.17 0.03 0.21
Jovens-ACOCD41
CD42a
CD61
CD62P
%CD62P
APM
APN
D-Di
Pla
qu
etas
CD
41
CD
61
CD
62
P
%C
D6
2P
AP
N
AP
M
FVII
I
FVIII
PAI-1
CD
42
D-D
i
-0.01
-0.32 0.37
0.10 0.18 0.20
-0.11 0.58 0.13 -0.24
0.33 0.78 0.23 0.03 0.73
-0.11 0.03 -0.06 -0.21 -0.46 -0.39
0.04 0.46 0.16 -0.08 0.49 0.46 -0.29
0.72 -0.39 -0.67 0.07 -0.21 -0.08 -0.18 0.16
-0.05 0.02 0.27 -0.39 -0.20 0.06 0.49 -0.46 -0.42
0.60 0.25 -0.29 -0.43 0.53 0.58 -0.24 0.48 0.38 -0.10
ClimatérioCD41
CD42a
CD61
CD62P
%CD62P
APM
APN
D-Di
Pla
qu
etas
CD
41
CD
61
CD
62
P
%C
D6
2P
AP
N
AP
M
FVII
I
FVIII
PAI-1
CD
42
D-D
i
0.53
0.07 0.15
-0.14 0.24 0.44
0.17 0.29 0.09 0.41
0.26 0.54 -0.05 0.21 0.61
-0.03 -0.57 -0.30 -0.43 0.06 -0.02
0.38 0.62 0.36 0.29 0.30 0.36 -0.09
0.47 0.00 0.15 0.13 0.05 0.03 0.01 -0.03
0.09 -0.23 0.12 -0.09 -0.24 -0.41 0.28 -0.07 0.34
0.14 -0.13 0.23 0.22 0.26 0.22 0.19 0.08 0.15 0.26
JovensCD41
CD42a
CD61
CD62P
%CD62P
APM
APN
D-Di
Pla
qu
etas
CD
41
CD
61
CD
62
P
%C
D6
2P
AP
N
AP
M
FVII
I
FVIII
PAI-1
CD
42
D-D
i
0.22
0.00 0.27
0.08 0.30 0.13
0.19 0.39 0.12 0.24
0.29 0.41 0.14 0.10 0.71
0.35 -0.04 0.19 0.10 -0.41 -0.31
0.46 -0.04 0.19 0.03 0.04 -0.16 0.41
0.58 0.35 0.07 -0.04 0.49 0.51 -0.02 0.37
-0.11 -0.37 0.16 -0.22 -0.13 -0.12 -0.18 0.29 0.09
-0.11 -0.10 -0.05 -0.28 -0.01 0.15 -0.16 -0.17 0.03 0.21
Jovens-ACOCD41
CD42a
CD61
CD62P
%CD62P
APM
APN
D-Di
Pla
qu
etas
CD
41
CD
61
CD
62
P
%C
D6
2P
AP
N
AP
M
FVII
I
FVIII
PAI-1
CD
42
D-D
i
B Meio do ciclo
0.15
0.02 0.27
0.06 0.17 -0.01
0.40 0.30 0.12 0.45
0.47 0.41 -0.17 0.21 0.85
-0.16 0.34 0.36 -0.05 0.33 0.13
0.37 0.68 0.53 0.01 0.06 0.09 0.17
0.54 -0.01 0.05 -0.48 0.14 0.04 -0.04 0.30
-0.16 -0.23 0.47 -0.01 -0.28 -0.51 0.16 0.35 0.09
0.43 0.37 -0.18 0.24 0.65 0.73 0.13 0.33 0.33 -0.07
JovensCD41
CD42a
CD61
CD62P
%CD62P
APM
APN
D-Di
Pla
qu
etas
CD
41
CD
61
CD
62
P
%C
D6
2P
AP
N
AP
M
FVII
I
FVIII
PAI-1
CD
42
D-D
i
0.34
0.02 0.02
-0.07 0.10 0.39
-0.13 0.03 -0.21 0.51
-0.24 -0.24 -0.42 0.16 0.63
0.05 0.14 -0.07 -0.10 -0.20 -0.04
-0.19 -0.30 -0.04 0.26 0.32 0.45 -0.46
0.33 0.29 -0.01 -0.03 0.12 -0.11 -0.34 0.20
-0.06 0.54 -0.14 -0.11 -0.14 0.04 -0.09 -0.17 0.27
-0.27 -0.12 -0.23 0.06 0.17 0.41 -0.35 0.22 -0.08 0.12
Jovens-ACOCD41
CD42a
CD61
CD62P
%CD62P
APM
APN
D-Di
Pla
qu
etas
CD
41
CD
61
CD
62
P
%C
D6
2P
AP
N
AP
M
FVII
I
FVIII
PAI-1
CD
42
D-D
i
-0.15
0.08 0.22
0.78 -0.15 0.14
-0.44 0.75 -0.15 -0.48
-0.10 0.60 0.15 -0.08 0.41
-0.44 -0.20 0.26 -0.52 0.21 0.44
0.16 0.27 0.59 -0.04 -0.16 0.54 0.66
0.04 0.42 -0.26 0.27 -0.02 0.09 -0.47 -0.19
0.25 0.18 -0.01 0.18 0.15 0.48 -0.12 0.22 0.32
-0.24 0.30 0.60 -0.12 0.14 0.72 0.77 0.77 -0.27 0.09
ClimatérioCD41
CD42a
CD61
CD62P
%CD62P
APM
APN
D-Di
Pla
qu
etas
CD
41
CD
61
CD
62
P
%C
D6
2P
AP
N
AP
M
FVII
I
FVIII
PAI-1
CD
42
D-D
i
Em preto estão os valores de ρ que foram estatisticamente significativos (p≤0,05)
67
6 DISCUSSÃO
6.1 Considerações iniciais
Sabe-se que o ciclo menstrual está associado à síntese e flutuação dos níveis de
hormônios que têm ação fisiológica na hemostasia. No entanto, são raros os estudos
que visam esclarecer o impacto das alterações hormonais, ao longo do ciclo e,
especialmente na menstruação, quando é necessária a ativação da coagulação para
garantir a suspensão do sangramento, após a descamação da camada endometrial.
O presente estudo envolveu dois grupos de mulheres que apresentam flutuações
fisiológicas nos níveis hormonais (Jovens e Climatério) e o grupo Jovens-ACO, no
qual os níveis hormonais são constantes.
No grupo Jovens-ACO, os progestogênios e estrogênios sintéticos presentes nos
ACO combinados inibem por feedback negativo os hormônios (LH e FSH) que
desencadeiam a ovulação. As concentrações dos esteroides são mantidas superiores
às fisiológicas durante todo o período de uso, exceto durante sete dias, nos quais a
mulher interrompe seu uso e ocorre o sangramento por privação hormonal (100). Além
disso, os ACO monofásicos combinados caracterizam-se por apresentar em cada uma
das 21 pílulas as mesmas concentrações de estrogênio e progestogênio. Assim, as
alterações verificadas nos dois momentos da coleta nesse grupo de mulheres também
não poderiam ser explicadas por variações de dose, mas por um efeito cumulativo
desse medicamento. A Figura 14 ilustra essas diferenças em relação aos níveis
hormonais ao longo do ciclo menstrual natural e com o uso de ACO combinados
monofásicos.
68
Figura 14 - Gráfico comparativo dos níveis de hormônios ovarianos e análogos durante o
ciclo menstrual em mulheres que utilizam anticoncepcional oral (ACO) combinado monofásico e naquelas que não utilizam esse medicamento (Adaptado de
http://www.ufrgs.br/espmat/disciplinas/_II/modulo_II/pilulas.htm).
6.2 Avaliação do hemograma
Dados da literatura revelam que as mulheres apresentam maior contagem de
neutrófilos do que os homens, sugerindo que os níveis fisiológicos de estrogênio e/ou
progesterona influenciam o número de leucócitos (95). Comprovando a hipótese de
que a contagem de leucócitos pode ser alterada quando ocorre uma mudança nas
concentrações hormonais durante o ciclo menstrual, no presente estudo verificou-se
que a contagem relativa de neutrófilos aumentou durante a menstruação nos grupos
Jovens e Jovens-ACO.
Maybin & Critchley (104) propuseram que a menstruação (devido ao declínio
abrupto das concentrações circulantes de progesterona) está associada a um
momento inflamatório clássico, no qual o endométrio liberaria grande quantidade de
marcadores inflamatórios, além da presença de edema tecidual e influxo de células
imunes, justificando o aumento de neutrófilos circulantes verificados neste estudo.
Paradoxalmente, Bain & England (95), verificaram que, em mulheres entre 20-
35 anos, ocorre uma redução na contagem de neutrófilos durante a menstruação.
Esses pesquisadores sugeriram que as alterações na contagem neutrofílica
decorreriam de oscilações nos níveis de estrogênio, que provavelmente atuam na
liberação dessas células da medula óssea.
Para a contagem absoluta de neutrófilos, verificou-se um aumento, durante a
menstruação, no grupo Jovens em relação ao grupo Jovens-ACO, sugerindo que no
69
primeiro grupo as oscilações fisiológicas das concentrações de estrogênio
apresentam papel relevante. Contraditoriamente, no meio do ciclo, foi observado um
aumento da contagem relativa de neutrófilos bastonetes no grupo Jovens-ACO
quando comparado ao grupo Jovens. Uma provável explicação seria o efeito
cumulativo dos hormônios presentes nos ACO combinados, os quais são mantidos
em concentrações constantes e superiores às fisiológicas. O aumento verificado na
contagem absoluta de basófilos, no meio do ciclo, no grupo Jovens em relação ao
grupo Jovens-ACO tem relevância limitada, uma vez que essas células apresentam
frequência rara no sangue periférico, podendo ser um fator de confusão.
Não foram observadas alterações, em um mesmo grupo, durante a menstruação
ou no meio do ciclo para as contagens de basófilos, eosinófilos e monócitos. No
entanto, Bain & England (95) verificaram uma menor contagem dessas células no
início da menstruação, chegando ao ápice no 10º dia do ciclo menstrual e
posteriormente retornando a um valor mínimo próximo ao 15º dia. Também não foram
descritas alterações significativas na contagem de linfócitos, como verificado no
presente estudo.
No grupo Climatério, houve uma diminuição da contagem relativa de neutrófilos
durante a menstruação. Não foram encontrados na literatura relatos que justifiquem
essa observação, podendo ser decorrente do pequeno número amostral desse grupo.
Em relação às plaquetas, os resultados apresentados revelaram uma menor
contagem, no meio do ciclo, no grupo Jovens-ACO e Climatério em relação ao grupo
Jovens. No entanto, estudos prévios relataram um aumento significativo do número
de plaquetas circulantes, entre os dias 1-7 e 26-28 do ciclo menstrual, em mulheres
que utilizavam ACO de primeira e segunda gerações em relação àquelas que não
utilizavam esse medicamento (105, 106). Não foi observada diferença estatística na
contagem de plaquetas entre a fase menstrual e o meio do ciclo para nenhum dos
grupos avaliados, embora dados da literatura revelem um aumento desse parâmetro
na fase ovulatória (61, 68) e uma redução na menstruação (62, 63), comparadas às
fases folicular e lútea (63). Além disso, Buchan & Macdonald (105) verificaram um pico
de contagem de plaquetas durante a ovulação, reduzindo durante e após a
menstruação em mulheres não usuárias de ACO.
Bain & England (95) observaram apenas discreto aumento do número de
plaquetas, durante e após a menstruação, e redução, entre a segunda e terceira
semana do ciclo menstrual. Em usuárias de ACO de segunda geração, Buchan &
70
Macdonald (105) relataram que a contagem de plaquetas permaneceu constante
durante todo o ciclo menstrual, como verificado no presente estudo.
Uma hipótese para a menor contagem plaquetária verificada nos grupos Jovens-
ACO e Climatério seria que, no primeiro caso, o uso desses medicamentos poderia
ativar plaquetas que seriam consumidas em processos hemostáticos (12, 107). O
mesmo ocorreria naturalmente ao longo de vida da mulher (104, 108).
Segal & Moliterno (109) verificaram uma variabilidade na contagem de plaquetas
de acordo com a idade e a etnia das mulheres, sendo maior na faixa dos 40-49 anos
em relação aos 20-29 anos. É relevante destacar que esse estudo avaliou apenas a
população norte-americana e não considerou a fase do ciclo menstrual, podendo ser
essa a causa da divergência entre os resultados. Além disso, a população brasileira,
devido à grande miscigenação torna-se difícil compará-la com uma etnia definida.
6.3 Avaliação dos marcadores de superfície plaquetária
Sabe-se que a ativação plaquetária está associada a mudanças conformacionais
da glicoproteína de superfície GPIIb/IIIa (reconhecida pelos anticorpos anti-CD61 e
anti-CD41a), seguida da liberação de grânulos que induzem a agregação das
plaquetas. No presente estudo foi verificado um aumento da expressão de CD61 no
grupo Jovens-ACO no meio do ciclo em relação à fase menstrual. Para o CD41a, foi
observado também um aumento da expressão no grupo Jovens-ACO, no meio do
ciclo menstrual, quando comparado ao grupo Jovens. Esses achados reforçam o
efeito cumulativo das concentrações de estrogênio e progestogênio sintéticos nos
ACO combinados no estímulo à ativação plaquetária. Os ACO combinados atuariam
favorecendo a agregação plaquetária a partir do aumento dos níveis de homocisteína
(um marcador de hipercoagulablidade) e redução dos níveis do NO (importante
inibidor da agregação plaquetária) (110). Além disso, sabe-se que as plaquetas
expressam o receptor de estrogênio β, confirmando que essas partículas são alvos
potenciais para os efeitos diretos desse hormônio (68).
Os dados relativos à ativação plaquetária ao longo do ciclo menstrual
encontrados na literatura são contraditórios. Há relatos tanto de um aumento do
número de micropartículas plaquetárias e endoteliais expressando anexina V
(marcador de apoptose), CD61 e CD63 (marcadores de ativação plaquetária), bem
como micropartículas endoteliais expressando E-selectina (marcador inflamatório)
71
durante a fase lútea (55), quanto uma redução da agregação plaquetária (66) nessa
fase do ciclo menstrual. Além disso, Yamazaki et al (65), em estudo pioneiro,
verificaram exacerbação da agregação plaquetária induzida por ADP e adrenalina
durante a fase folicular. Em contrapartida, Bolis et al (67) reportaram uma redução da
ativação das plaquetas no período peri-ovulatório. Em concordância com os dados
obtidos no presente estudo, Repina et al (78) não verificaram variação na atividade
plaquetária ao longo do ciclo menstrual de mulheres não usuárias de ACO combinado.
No entanto, a interpretação da ativação plaquetária in vitro requer cautela.
Infelizmente, para a maioria dos marcadores de exocitose, as reações são reversíveis
e sofrem interferência do manuseio da amostra, uso de fixadores (utilizados nos
experimentos) e inibidores, os quais podem mascarar a ativação das plaquetas (111).
Assim, a fixação é uma variável que necessita ser controlada porque a afinidade da
ligação ao anticorpo dependente de ativação pode ser reduzida, quando comparada
às plaquetas não fixadas. Possivelmente, esse pode ser um dos motivos da ausência
de alteração na expressão de alguns marcadores no presente estudo. Um argumento
a favor da fixação imediata é que a ativação das plaquetas é também dependente do
tempo in vitro para diversos antígenos de superfície, como GPIX, GPIIb/IIIa e P-
selectina, e que evitaria uma ativação indesejável na fase pré-analítica (39). No
entanto, não se pode descartar que, no presente estudo, a expressão de alguns
marcadores plaquetários possa ter sofrido interferências in vitro.
Por outro lado, experimentos in vitro demonstraram que a expressão máxima de
P-selectina requer um estímulo extra com agonistas como a trombina (111). Nesse
sentido, supõe-se que esse estímulo poderia ter sido importante para a identificação
de diferenças entre os grupos e momentos do ciclo menstrual avaliados.
Além disso, uma análise crítica de estudos encontrados na literatura revelou que
não existe uma distribuição homogênea dos resultados, gerando dificuldades em se
estabelecer um cut-off para os marcadores de superfície e ativação plaquetária.
Konijnenberg et al (38) admitiram que em geral somente uma subpopulação de
plaquetas estaria ativa, mesmo em situações patológicas, mas seria rapidamente
depurada da circulação sanguínea. Torna-se necessário enfatizar ainda que a P-
selectina é instável e se desprende rapidamente da superfície plaquetária, embora
ainda permaneça funcionante, solúvel no plasma, mas indetectável por citometria de
fluxo. Sabe-se também que as plaquetas que perderam a P-selectina podem
72
permanecer ainda ativas na circulação, embora não expressem mais essa GP (37-
40).
6.4 Avaliação dos agregados plaquetas-leucócitos
Acerca das frequências de APM e APN, os resultados do presente estudo
demonstraram um aumento da formação desses agregados, no meio do ciclo, no
grupo Jovens-ACO em relação ao grupo Jovens. Bem como de APN, durante a
menstruação, no grupo Jovens-ACO em relação ao grupo Jovens. Esses dados
suportam a existência de interação entre coagulação e processo inflamatório, mais
evidente nas mulheres que utilizam ACO combinados. De fato, Larsen et al (112)
verificaram um aumento das concentrações séricas de proteína C reativa (um
marcador clássico de reação de fase aguda) em mulheres que utilizavam ACO
combinados em relação àquelas que não utilizavam esse medicamento. Dessa forma,
pode-se inferir que o uso desses medicamentos induz um processo inflamatório, que
contribui para o aumento do risco de evento tromboembólico, a partir da ativação do
sistema hemostático.
Contrariamente, Rosin et al (68) verificaram um aumento da formação de APL
durante a ovulação em relação às demais fases do ciclo menstrual, em mulheres que
não faziam uso de ACO, sugerindo que o estrogênio contribui fortemente nas
interações entre plaquetas e leucócitos, resultando em uma variação na função
plaquetária durante uma determinada fase do ciclo.
Vale ressaltar que esses pesquisadores realizaram uma ativação prévia das
plaquetas com peptídeo ativador do receptor de trombina (TRAP-6), podendo
superestimar os resultados obtidos. Outra hipótese para justificar a discordância de
resultados é que a formação de APL é dependente de Ca2+ e pode ser inibida por
anticoagulantes sequestradores desse cátion, como o citrato de sódio, utilizado no
presente estudo (10).
Cumpre ressaltar ainda que a técnica para a determinação da percentagem de
APL é bastante variável (113). A literatura relata uma diversidade de protocolos de
marcação, evidenciando que ainda não há um consenso. Nesse sentido, é possível
utilizar como anticoagulante uma mistura de citrato de sódio e paraformaldeído (114);
apenas citrato de sódio (68) ou EDTA (10). Os marcadores para a identificação dos
APL ou leucócitos ativados também variam; anti-CD61/anti-CD45, anti-CD41/anti-
73
CD45 (114), anti-CD42a/anti-CD45 (115), anti-CD42a/anti-CD14 (10) e anti-
CD11/anti-CD19 (116). Essas variáveis inviabilizam a comparação segura dos
resultados obtidos nos diferentes estudos realizados com protocolos distintos para
marcação de APL.
Em conformidade com os achados do presente estudo, Robb et al (10) não
verificaram qualquer alteração na formação desses agregados ou correlação com os
níveis séricos de estrogênio ou progesterona ao longo do ciclo menstrual de mulheres
que não utilizam ACO.
6.5 Avaliação de Dímero-D (D-Di), inibidor do ativador do plasminogênio-1
(PAI-1) e fator VIII (FVIII)
Os resultados obtidos no presente estudo indicaram um aumento dos níveis
plasmáticos de D-Di, durante o período menstrual, nos grupos Jovens e Climatério,
em relação ao meio do ciclo. Essa observação pode ser justificada pela própria
fisiologia da menstruação, ou seja, a ocorrência de lesão da microvasculatura do
endométrio, seguida de ativação plaquetária e dos fatores da coagulação, com
posterior formação e dissolução do coágulo. Em concordância, Maki et al (88) e Basu
(89), reportaram que a menstruação é acompanhada por um aumento da formação
dos PDF e Koh et al (57) relataram uma redução dos níveis de D-Di no meio do ciclo.
Por outro lado, Giardina et al (14) verificaram um aumento na concentração de D-Di
na fase folicular em relação à lútea, não avaliadas no presente estudo.
O aumento dos níveis plasmáticos desse marcador, no meio do ciclo, no grupo
Jovens-ACO em relação ao grupo Jovens, verificado no presente estudo também
sugere uma contribuição cumulativa importante dos ACO no equilíbrio hemostático,
favorecendo um estado hipercoagulável, corroborando com os dados da literatura (4,
107, 117). Além disso, o uso contínuo desses medicamentos, principalmente em
decorrência do etinilestradiol, presente nas formulações, poderia contribuir para
modificar a estrutura da fibrina, tornando-a mais resistente à fibrinólise, predispondo
a mulher a eventos tromboembólicos (98).
Seguindo esse raciocínio, a redução dos níveis plasmáticos de PAI-1 (um
inibidor do sistema fibrinolítico), durante a menstruação e no meio do ciclo, nos grupos
Jovens-ACO e Climatério em relação ao grupo Jovens poderia ser justificada pelo
aumento do potencial fibrinolítico nessas mulheres sob duas perspectivas. Em relação
74
às mulheres que utilizam ACO combinado, o uso desses medicamentos, ao ativar
mecanismos pró-coagulantes induziria, simultaneamente e como mecanismo de
equilíbrio, o sistema fibrinolítico na tentativa de dissolver os coágulos formados (4,
117). Para as mulheres no climatério, a justificativa seria que, ao longo dos anos,
existe uma tendência natural de aumento de fatores pró-coagulantes em relação aos
anticoagulantes naturais, resultando também em uma maior susceptibilidade a um
estado hipercoagulável (104, 108, 118). Para as mulheres no climatério avaliadas, a
hemostasia ainda estaria preservada graças ao aumento do potencial fibrinolítico.
Não foram verificadas no presente estudo variações cíclicas nas concentrações
de PAI-1 durante o ciclo menstrual. Em concordância, Onundarson et al (72), Dorr et
al (74) e Knol et al (1) não detectaram alterações nos níveis de PAI-1 durante o ciclo
menstrual. No entanto, há relatos de redução da fibrinólise nas fases folicular (83) e
lútea (57); e ativação desse processo durante o período peri-ovulatório e a ovulação
(81). Vale ressaltar que esses pesquisadores utilizaram amostras de fluido
endometrial para avaliação desse marcador. Admitindo que exista uma variação
cíclica no potencial fibrinolítico, pode-se inferir que a determinação do PAI-1 no
sangue periférico não apresentaria sensibilidade suficiente para detectar alterações,
dentro da faixa de normalidade, o que justificaria os resultados obtidos no presente
estudo.
Não foram observadas também diferenças cíclicas nos níveis plasmáticos de
FVIII, em concordância com Tchaikovski et al (3). No entanto, são limitados e
conflitantes os estudos que investigaram esse parâmetro durante a menstruação e o
meio do ciclo. Nesse sentido, há relatos de manutenção dos níveis de FVIII (70),
redução (61) e aumento (56) durante essa fase.
Contraditoriamente, Onundarson et al (72) não verificaram associação entre os
níveis de estradiol ou progesterona e os de FVIII. Provavelmente, os níveis
plasmáticos desse fator da coagulação seriam mais altos se a avaliação fosse
realizada no fim do período menstrual, admitindo-se que a cascata da coagulação
estaria ativada em intensidade máxima para debelar o sangramento (52).
Uma limitação importante a se considerar em relação à literatura é a variedade
dos momentos de coleta das amostras (duas a 16 vezes) durante o ciclo menstrual,
dificultando a possibilidade de comparações. A maioria dos estudos avalia os
parâmetros hemostáticos durante as fases folicular e lútea, e poucos em outros
75
momentos. Grande parcela também não verificou variações cíclicas ou, quando
presentes, foram consideradas discretas e restritas a essas fases (1).
Embora Tchaikovski et al (3) e Tchaikovski & Rosing (2) verificassem a existência
de alterações pró-coagulantes em vários parâmetros hemostáticos, incluindo o FVIII
durante o uso de ACO combinados, não foram observadas essas modificações no
presente estudo. Não houve alterações também em relação ao grupo Climatério,
embora se saiba que ao longo dos anos exista uma elevação dos fatores da coagulação
(104, 108, 118). Provavelmente, o pequeno número amostral da população estudada
subestimou possíveis modificações nos níveis plasmáticos do FVIII.
6.6 Análise da correlação de Spearman para contagem de plaquetas e
biomarcadores hemostáticos
A análise de correlação entre os parâmetros hematológicos investigados foi feita
visando elucidar a relação desses com as fases do ciclo menstrual avaliadas. Diversas
correlações diretamente proporcionais entre contagem de plaquetas, biomarcadores
da ativação plaquetária, da coagulação e da fibrinólise foram obtidas e a intensidade
dessas variou com a fase do ciclo menstrual e com o grupo de mulheres avaliado.
Durante a menstruação, as correlações apresentaram natureza moderada,
envolvendo elementos plaquetários (CD41, CD62 e contagem de plaquetas) e APL no
grupo Jovens, sugerindo que nessa fase do ciclo menstrual essas mulheres estariam
fisiologicamente menos expostas a eventos tromboembólicos em relação aos demais
grupos avaliados. Para os grupos Jovens-ACO e Climatério, foi verificada a
participação do D-Di (correlacionando-se com contagem de plaquetas e CD62 no
primeiro caso; e com contagem de plaquetas e CD42 no segundo caso), elemento
simultaneamente envolvido na cascata da coagulação e na fibrinólise. Foi observado
também o surgimento de correlações fortes (uma para o grupo Jovens-ACO e três
para o grupo Climatério), fornecendo a esses grupos status hipercoagulável mais
pronunciado em decorrência do uso de ACO combinados e da idade,
respectivamente.
Considerando o meio do ciclo, as associações foram tornando-se
progressivamente mais fortes ao envolver também o PAI-1, o D-Di e o FVIII,
resultando em um estímulo à hipercoagulabilidade provavelmente em decorrência dos
níveis de estrogênio (fisiologicamente aumentados ou por efeito cumulativo dos ACO
76
combinados). As modificações mais significativas ocorreram no grupo Climatério, no
qual foi verificada a existência de cinco correlações fortes, envolvendo contagem e
plaquetas, marcadores de ativação plaquetária (CD41, CD61 e CD62), APL e PAI-1.
Esses dados permitem inferir que as mulheres no Climatério estariam mais
hipercoaguláveis e seriam mais propensas a eventos tromboembólicos durante essa
fase do ciclo menstrual, em relação às mulheres Jovens, em uso ou não de ACO.
Dessa forma, é sempre recomendável a adoção de mudanças de estilo de vida que
visem minimizar a possibilidade de ocorrência de eventos tromboembólicos nessas
mulheres.
77
7 LIMITAÇÕES DO ESTUDO
Constituem limitações deste estudo:
1. O pequeno número de participantes, decorrente da dificuldade de seleção e da
obtenção de amostras múltiplas. Isso poderia subestimar diferenças entre
parâmetros devido à grande variabilidade intra e interindividual;
2. A existência de divergências metodológicas quanto à expressão de marcadores
de ativação plaquetária avaliados por citometria de fluxo. Ainda não há
consenso quanto ao método ideal para avaliar esses parâmetros, incluindo a
definição do anticoagulante a ser utilizado na coleta da amostra sanguínea, o
tipo de amostra (sangue total ou PRP), a especificação dos anticorpos, o uso
ou não de fixador no processamento da amostra e a necessidade de ativação
plaquetária prévia;
3. Existência de grande variabilidade, na população em geral, da expressão de
marcadores de ativação plaquetária, dificultando o estabelecimento do cut-off;
4. A não determinação dos níveis hormonais, capaz de identificar com maior
segurança a fase do ciclo menstrual na qual a participante se encontrava (para
os grupos Jovens e Climatério).
78
8 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste estudo permitem concluir que:
1 A contagem de neutrófilos, a ativação plaquetária e os níveis
plasmáticos de D-Di apresentam variação em função do ciclo menstrual;
2 A contagem de neutrófilos, a ativação plaquetária, a formação de APL,
os níveis plasmáticos de D-Di e de PAI-1 são influenciados pelo uso de
ACO combinados;
3 A contagem de plaquetas e os níveis plasmáticos de PAI-1 são
influenciados pela idade da mulher;
4 Existem correlações positivas entre contagem de plaquetas, marcadores
de superfície plaquetária, APL, cascata da coagulação e fibrinólise cuja
intensidade depende da fase do ciclo menstrual, do uso de ACO
combinados e da idade da mulher.
79
9 PERSPECTIVAS DE ESTUDOS
1. Avaliar, em um número maior de participantes, marcadores de ativação
plaquetária em todas as fases do ciclo menstrual: menstruação, fase folicular,
ovulação (definida a partir de dosagem de LH) e fase lútea;
2. Avaliar, em um número maior de participantes, a geração de trombina em todas
as fases do ciclo menstrual: menstruação, fase folicular, ovulação (definida a
partir de dosagem de LH) e fase lútea;
3. Avaliar as participantes deste estudo após cinco e dez anos para verificar a
ocorrência de eventos tromboembólicos e/ou outros desfechos;
4. Avaliar marcadores de ativação plaquetária e geração de trombina em
mulheres sob uso de ACO combinados de segunda, terceira e quarta gerações.
80
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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86
ANEXO A
87
ANEXO B
88
ANEXO C
Universidade Federal de Minas Gerais
Faculdade de Farmácia
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
(Para o grupo de mulheres jovens e no climatério)
PROJETO DE PESQUISA: “Ciclo menstrual: avaliação de alterações hematológicas”
Prezada Sra,
Você está sendo convidada para participar de uma pesquisa que tem por objetivo investigar as
alterações do hemograma e da coagulação que ocorrem durante o ciclo menstrual e, dessa forma,
contribuir para o entendimento das implicações clínicas da menstruação. Serão feitos o hemograma e
exames que avaliam as plaquetas no 2º dia da menstruação e no meio do mesmo ciclo menstrual.
Se você estiver de acordo, iremos colher 11 mL do seu sangue nesses dois momentos para
realização dos exames. Na coleta de sangue pode ocorrer uma leve dor localizada e formação de um
pequeno hematoma. Para minimizar o risco de formação de hematomas, a coleta de sangue será
realizada por um profissional experiente. Serão utilizados agulhas e tubos descartáveis.
Seu nome e os resultados dos exames serão mantidos em segredo. Os resultados dos seus
exames laboratoriais serão encaminhados para você com os devidos esclarecimentos. Caso alguma
alteração importante seja encontrada nos exames, você deverá procurar um serviço médico para
orientação clínica.
Esclarecemos que você tem total liberdade de participar ou não desta pesquisa, sem nenhum
prejuízo.
Para qualquer dúvida sobre esta pesquisa você deverá entrar em contato com as pessoas
responsáveis pela mesma, cujos nomes estão abaixo relacionados.
Se você estiver de acordo, por favor, assine esta folha.
Responsáveis:
Luci Maria Sant’Ana Dusse – telefone: 3409-6880
Letícia Gonçalves Freitas – telefone: 3409-6900
Comitê de Ética em Pesquisa – COEP: Av. Antônio Carlos, nº. 6627 – Pampulha – Campus UFMG,
Unidade Administrativa II. CEP: 31270-901. Telefone: 3409-4592.
NOME: _____________________________________________________________________
Carteira de identidade:__________________________________
Assinatura: _______________________________________ DATA: ____/____/____
Agradecemos sua valiosa participação!
89
ANEXO D
FICHA CLÍNICA DO GRUPO DE MULHERES JOVENS E NO CLIMATÉRIO
Projeto: “Ciclo menstrual: avaliação de alterações hematológicas”
Data da entrevista: Data da 1ª coleta: Data da 2ª coleta:
Grupo: Participante nº:
1. Identificação
Nome:
Naturalidade:
Data de nascimento: Idade:
Estado civil: Escolaridade:
Endereço:
Rua/Avenida:
Número: Complemento:
Bairro: Cidade:
CEP: Estado:
Telefone: ( ) E-mail:
2. Anamnese
Presença de doenças intercorrentes? (distúrbios plaquetários e da coagulação, doenças cardiovasculares,
obesidade (IMC >30Kg/m2), doenças renais, doenças autoimunes, doenças hepáticas, diabetes, câncer, sangramento, infecção/inflamação ≤ 3 semanas, doença ginecológica, síndrome dos ovários policísticos)
Fumante? ☐ SIM ☐ NÃO Quantidade:
Consumo de álcool? ☐ SIM ☐ NÃO Quantidade:
Pratica exercício físico? ☐ SIM ☐ NÃO
Freqüência: Modalidade:
3. Informações sobre o ciclo menstrual
Data da última menstruação:
Regularidade do ciclo menstrual:
Duração do ciclo menstrual:
Duração da menstruação:
Intensidade do fluxo menstrual:
☐ Fraco ☐ Moderado ☐ Intenso
90
Intercorrências durante a menstruação (cólicas, sangramento intenso):
4. Uso de medicamentos:
Uso de anticoncepcional oral: ☐ SIM ☐ NÃO Se sim, qual?
5. Informações clínicas
Altura: ______ cm
Peso: ______ Kg
IMC: ______ kg/cm2
91
ANEXO E
Média/Mediana e Desvio padrão/Intervalo interquartil dos parâmetros avaliados no
segundo dia da menstruação para todos os grupos
Parâmetros
Jovens Jovens-ACO Climatério
Média/Mediana DP/IQ Média/Mediana DP/IQ Média/Mediana DP/IQ
Nº de hemácias x 106/µL 4,3 0,3 4,3 0,5 4,3 0,4
Hemoglobina (g/dL) # 12,5 1,7 12,8 2,1 12,7 1,4
Hematócrito (%) 37,7 3,6 37,9 3,8 37,2 3,8
VCM (fL) 87,0 4,3 88,6 4,4 87,4 4,5
HCM (pg) 29,3 1,9 32,1 4,4 29,2 2,5
CHCM (g/dL) 33,1 1,5 36,2 4,3 33,1 1,5
Nº plaquetas x 103/µL 252,6 49,1 228,1 35,0 224,1 39,0
Global de leucócitos x 103/µL 6,4 1,5 6,1 2,1 6,0 2,2
Neutrófilos bastonetes/µL# 111,0 256,5 87,5 154,8 108,0 155,3
Neutrófilos bastonetes (%)# 2,0 4,0 1,5 2,8 2,0 1,5
Neutrófilos segmentados x 103/µL 3,8 1,3 3,5 1,7 3,6 1,8
Neutrófilos segmentados (%) 58,6 10,4 55,4 11,4 57,3 11,0
Eosinófilos/µL# 75,5 178,3 108,0 75,8 94,0 125,0
Eosinófilos (%)# 1,0 2,8 2,0 1,8 2,0 1,8
Basófilos/µL# 0,0 50,8 0,0 63,5 0,0 41,8
Basófilos (%)# 0,0 1,0 0,0 1,0 0,0 1,0
Linfócitos x 103/µL# 1,8 0,7 1,9 0,8 1,8 0,7
Linfócitos (%) 32,9 10,8 36,1 10,9 34,7 12,3
Monócitos/µL 262,0 146,8 234,4 121,9 184,7 106,1
Monócitos (%) 4,0 2,0 4,2 2,1 3,3 2,2
CD41a x 103 (IMF) 3,7 1,4 4,2 1,6 3,0 1,0
CD42a x 103 (IMF) 13,4 5,0 13,9 3,6 13,1 6,3
CD61 x 103 (IMF) 3,3 1,3 2,6 0,6 3,9 1,2
CD62P (IMF) # 389,5 159,5 269,5 138,5 315,0 198,5
CD62P (%) 2,0 1,3 2,1 0,9 1,7 0,9
APM (%) 1,2 0,5 1,2 0,8 1,1 0,5
APN (%)# 0,1 0,2 0,2 0,3 0,1 0,2
Dímero-D (ng/mL) 256,8 130,7 275,9 428,4 229,2 73,7
PAI-1 (ng/mL) # 33,8 26,9 19,6 14,3 22,7 18,2
Fator VIII x 103 (ng/mL) 9,8 1,8 10,2 3,1 10,7 4,0
VCM: volume corpuscular médio; HCM: hemoglobina corpuscular média; CHCM: concentração de hemoglobina corpuscular média; IMF: intensidade média de fluorescência; APM: agregados plaquetas-monócitos; APN: agregados plaquetas-neutrófilos; PAI-1: inibidor do ativador do plasminogênio-1
#Dados apresentados como mediana±intervalo interquartil (IQ). Para as variáveis que seguem a normalidade, os dados são apresentados como média±desvio padrão (DP).
92
ANEXO F
Média/Mediana e Desvio padrão/Intervalo interquartil dos parâmetros avaliados no
meio do ciclo menstrual para todos os grupos
Parâmetros
Jovens Jovens-ACO Climatério
Média/Mediana DP/IQ Média/Mediana DP/IQ Média/Mediana DP/IQ
Nº de hemácias x 106/µL 4,3 0,3 4,2 0,4 4,3 0,3
Hemoglobina (g/dL) 12,7 1,0 12,9 1,5 12,9 1,6
Hematócrito (%) 37,3 3,1 37,3 3,3 37,6 4,1
VCM (fL) 85,9 4,3 88,5 4,5 86,9 4,7
HCM (pg) 29,2 2,0 30,8 3,5 29,9 2,3
CHCM (g/dL) 33,4 3,5 34,8 3,3 34,4 1,2
Nº plaquetas x 103/µL 267,3 38,3 228,6 37,1 220,4 45,5
Global de leucócitos x 103/µL 6,5 1,4 5,8 1,3 6,3 2,1
Neutrófilos bastonetes/µL# 61,5 128,0 110,0 177,3 96,0 135,0
Neutrófilos bastonetes (%)# 1,0 2,0 2,0 4,0 2,0 1,5
Neutrófilos segmentados x 103/µL 3,8 1,2 3,2 1,1 3,8 1,5
Neutrófilos segmentados (%) 57,8 7,7 50,8 14,0 59,3 7,0
Eosinófilos/µL# 95,0 167,0 90,0 75,3 103,0 155,6
Eosinófilos (%)# 2,0 2,0 2,0 1,0 2,0 1,5
Basófilos/µL# 24,5 61,3 0,0 66,5 0,0 8,0
Basófilos (%)# 0,5 1,0 0,0 1,0 0,0 0,3
Linfócitos x 103/µL 2,2 0,6 2,1 0,5 2,0 0,7
Linfócitos (%) 34,3 8,3 36,6 8,0 32,0 6,5
Monócitos/µL# 197,0 408,5 252,0 144,0 237,0 245,3
Monócitos (%) 3,9 2,5 4,7 2,4 4,2 1,9
CD41a x 103 (IMF) 3,0 1,8 4,7 1,2 2,9 1,2
CD42a x 103 (IMF) 12,9 4,9 13,8 4,8 13,3 5,0
CD61 x 103 (IMF)# 3,2 1,3 2,9 1,2 3,8 2,9
CD62P (IMF) # 293,5 253,7 338,0 138,0 408,0 225,5
CD62P (%) 2,0 1,4 2,4 1,1 1,6 0,9
APM (%) 1,1 0,6 1,4 1,0 1,1 0,6
APN (%)# 0,1 0,2 0,2 0,3 0,1 0,3
Dímero-D (ng/mL)# 88,5 171,4 172,7 170,0 132,1 86,0
PAI-1 (ng/mL) # 37,9 16,1 20,3 12,1 23,9 16,2
Fator VIII x 103 (ng/mL) 9,0 2,0 10,1 2,9 10,0 2,6
VCM: volume corpuscular médio; HCM: hemoglobina corpuscular média; CHCM: concentração de hemoglobina corpuscular média; IMF: intensidade média de fluorescência; APM: agregados plaquetas-monócitos; APN: agregados plaquetas-neutrófilos; PAI-1: inibidor do ativador do plasminogênio-1
#Dados apresentados como mediana±intervalo interquartil (IQ). Para as variáveis que seguem a normalidade, os dados são apresentados como média±desvio padrão (DP).
93
ANEXO G
Resultados parciais apresentados no Congresso Hemo 2013 - Brasília
94
ANEXO H
Resultados parciais apresentados no Congresso Hemo 2014 - Florianópolis
95
ANEXO I
Resultados parciais apresentados no Congresso ISTH 2015 - Toronto
EVALUATION OF PLATELETS COUNT AND ACTIVATION DURING MENSTRUAL CYCLE
IN YOUNG WOMEN IN ORAL CONTRACEPTIVE USE
Letícia Gonçalves Freitas, Cristina de Mello Gomide Loures, Marcos Vinícius Ferreira Silva,
Fernanda Freire Campos Nunes, Maria das Graças Carvalho, Luci Maria SantAnaDusse
Menstruation is a hemostatic process triggered by platelet activation, fibrin clot formation and
dissolution and endometrial tissue remodeling. P-selectin is a surface glycoprotein that mediates platelet
interactions among the endothelium, platelets and leukocytes, stabilizing GPIIb/IIIa-fibrinogen
interaction until the formation of the platelet plug. GPIX and GPIIb/IIIa act in the adhesion and platelets
aggregation processes when the blood vessel injury occurs. The interaction between platelets and
leukocytes is observed in inflammatory and thrombotic processes. To evaluate the platelet count and
activation in women using oral contraceptives during menstruation cycle. This study was approved by
local Ethical Committee and consent was obtained in all cases. It included 20 healthy women (18-30
years old). The platelets evaluation was done on the 2nd day of menstruation and on the average day of
the cycle. Mean fluorescence intensities of platelet glycoproteins CD41a/GPIIb/IIIa, CD61/GPIIIa,
CD42a/GPIX, CD62P/P-selectin, %CD62P+ platelets, platelet-monocyte aggregates (PMA) and
platelet-neutrophil-aggregates (PNA) were evaluated by flow cytometry. Platelets count was done by
automatic method. To compare the means/medians, paired t-test and Wilcoxon test were used,
respectively. P≤0.05 was considered significant. There were no differences in platelets count or platelets
expression of CD41a, CD42a, %CD62P+ and PMA or PNA, comparing the two phases of the menstrual
cycle. The average menstrual cycle day was accompanied by increased platelet expression of CD62P
and CD61 (P=0.05) vs 2nd day of menstruation. The platelet activation is more intense in average cycle
day vs the 2nd day of menstruation, probably by the higher levels of estrogen at that time. We speculated
that the MFI of CD61 and CD62P are more sensitive markers to the hormone effects and less subject to
pre-analytical interferences. Support: CNPq and FAPEMIG/Brazil
96
ANEXO J
Artigo publicado – Menstrual cycle and hemostatic modifications: a review –
International Journal of Health Sciences and Research
97
98
99
100
101
102
103
104