CFX MaestroTM

Software

El Software CFX Maestro permite controlar y programar los parámetros de análisis, así

como, la recolección y análisis avanzado de los datos de todos los termocicladores

CFX de PCR en tiempo real de Bio-Rad (CFX96 TouchTM, CFX96 Touch Deep WellTM,

CFX ConnectTM y CFX384TouchTM) y del termociclador de PCR convencional C1000

TouchTM

Actualmente, es el software de análisis de datos de Real Time PCR más potente del

mercado, y el único que incluye herramientas de análisis estadístico avanzado, y

herramientas de edición de las tablas y gráficos para su exportación con calidad de

alta resolución.

Cumple los requisitos descritos en la guía MIQE (Minimun Information for Publication

of Quantitative Real Time PCR Experiments. Bustin et all. Clinical Chemistry, 2009)

No tiene licencias de usuario, lo que permite tantos puestos de trabajo como se

deseen. Así mismo, esta licencia se instala físicamente en el ordenador del usuario, lo

que le permite trabajar donde y cuando quiera, sin necesidad de disponer conexión a

internet.

Es capaz de analizar todos los archivos de datos de otros modelos de Real Time PCR

de Bio-Rad, como el iCycler iQ, MyiQ e iQ5 Real Time PCR.

Requisitos de instalación

Los requisitos mínimos e imprescindibles que debe tener el sistema informático para poder instalar el CFX Maestro Software en sistema Microsoft Windows son los siguientes:

También es posible adquirir una licencia adicional para analizar los datos de Real Time PCR en sistemas MAC OS. En este caso los requisitos del sistema informático son los siguientes

Pantalla de inicio Permite generar distintos usuarios y asignarles una contraseña para gestionar todas las librerías de protocolos, modelos de placas y archivos de datos. Cada usuario puede configurar las opciones de funcionamiento básico del softwares, tales como fluorescencias utilizadas, protocolos más utilizados, modo de analizar los datos, dirección de e-mail para el envío automático de los resultados, etc…

Posee una herramienta llamada “Master Mix Calculator” que ayuda al usuario a calcular las concentraciones y volúmenes necesarios para cada experimento. Esta herramienta puede guardar una librería con las distintas condiciones experimentales, ya sea experimentos con SyBR Green o sondas. Introduciendo los distintos parámetros (concentración y volumen de primers/sondas, mix de reacción, etc..) calcula rápidamente los reactivos necesarios en cada experimento en función del número de muestras.

Programa y prepara diferentes ensayos mediante rutinas y ayudas específicas. El sistema de ayuda “Wizard” guía al usuario a través del software permitiéndole diseñar fácilmente experimentos, en sólo tres pasos.

El usuario puede comenzar una carrera de Real Time PCR inmediatamente sin necesidad de introducir la información del experimento. Dicha información puede introducirla durante la carrera o después de la misma.

Programación del protocolo térmico

El editor de protocolos Autowriter permite al usuario diseñar protocolos personalizados en modo estándar, rápido o ultrarrápido, así como determinar la temperatura de melting y annealing adecuada a cada experimento fácilmente.

Durante la generación de protocolos térmicos, el software permite: introducir gradientes de temperatura por filas, curvas de melting totalmente modificables en temperaturas y tiempos, varios puntos de lectura de fluorescencia durante el protocolo, modificar la rampas de temperatura, introducir incrementos o disminuciones de tiempo (rango 1-60 segundos) y/o temperatura (rango de 0,1 a 10ºC) durante los ciclos seleccionados, variar o eliminar la temperatura de la tapa calefactora, etc…

Programación de la placa de muestras. La edición de la placa de muestras se puede realizar antes, durante o después de la carrera de Real Time PCR.

En esta pantalla se puede seleccionar de modo rápido e intuitivo el tipo de muestra (standard, desconocido, positivo, negativo, NTC o NRT), los fluoróforos utilizados, generar replicas de las muestras, grupos biológicos, grupos de muestras para realizar un análisis rápido, identificadores de las muestras, lista de genes utilizados…etc…

La edición de la placa se puede realizar de modo manual, o mediante la ayuda “Wizard” que guía al usuario para realizar una programación de la placa en muy pocos pasos.

Se puede ver mediante un sistema de colores la situación de las replicas de las muestras y de los grupos biológicos generados.

Los identificadores de las muestras pueden exportarse desde una base de datos LIMS o desde una hoja Excel para mayor comodidad.

Pantalla de inicio de carrera. El software es gestionar hasta cuatro equipos de Real Time CFX al mismo tiempo, y cuatro termocicladores de PCR convencional C1000 Touch.

Durante la duración de la carrera la pantalla muestra el tiempo restante para que finalice, y diversas opciones de edición, como por ejemplo, añadir más ciclos de amplificación durante el experimento, para el protocolo, eliminar algún paso, editar la placa de muestras..etc…

Módulos de análisis de datos

Calcula la línea base óptima de cada una de las muestras independientemente, de forma automática, aunque es posible que el usuario lo haga también manualmente, si lo desea.

Determina de forma automática el valor de ciclo umbral (Therhold) para cada una de las muestras, y cada uno de los targets analizados de modo independiente.

Es capaz de realizar los siguientes análisis de Real Time PCR.

1. Cuantificación absoluta: cuantificación automática de las muestras problema tomando como referencia una recta patrón estándar. Los datos se muestran en una única pantalla en donde se puede ver la colocación e información de las muestras, los valores Cq y desviaciones calculadas, la recta estándar con los valores de eficiencia y r2, y las curvas de amplificación.

2. Presencia/Ausencia - el software determina automáticamente la presencia/ausencia de un target de ADN en una muestras de dos modos distintos: mediante curvas de melting o disociación y mediante análisis de

punto final, tomando como referencia los valores de fluorescencia de los controles negativos.

3. Método de discriminación alélica. El software realiza análisis de discriminación

alélica (SNPs) y clasifica automáticamente las muestras de acuerdo con su genotipo

4. Expresión génica (Cuantificación relativa): el software permite cuantificaciones relativas de las muestras o entre distintos grupos biológicos, mostrando los resultados con varios tipos de gráficas.

a. Barras de desviación estándar y tablas de datos.

b. Clustergram: los datos se organizan en una jerarquía basada en el grado de similitud de expresión para diferentes genes objetivo y muestras.

c. Scatter Plot: diagrama de dispersión de la expresión normalizada de un control frente a una muestra experimental

d. Volcano Plot: muestra el cambio en la expresión de una muestra experimental en comparación con un control e indica el grado de significación basado en el valor-p

e. Heat Map: Mapa de la placa que muestra la regulación experimental en comparación con una muestra de control basado en la expresión relativa normalizada

Dichas cuantificaciones relativas pueden ser normalizadas frente a uno o varios

genes de referencia teniendo en cuenta la eficiencia particular de cada uno de

los genes comparados.

Así mismo, realiza estudios de expresión génica de más de 5000 genes al

mismo tiempo, agrupando en un único archivo distintos experimentos

realizados en distintas placas.

En el módulo de expresión génica del CFX Maestro, es capaz de realizar los

siguientes análisis estadísticos avanzados:

- Distribución T de Student (T-Test): se utiliza para determinar si las medidas de dos poblaciones diferentes son significativamente diferentes la una de la otra, estableciendo un valor de confianza (valor p) que determinara la probabilidad de que dicha diferencia este causada por el azar.

- Análisis de la Varianza (ANOVA) de los datos, permitiendo determinar si los diferentes tratamientos entre tres o más grupos muestran diferencias significativas o por el contrario pueden suponerse que sus medias poblacionales no difieren. Se puede realizar dos tipos de análisis ANOVA: unidireccional, para analizar grupos en donde sólo varia una variable, o bidireccional, para analizar grupos que tienen dos variables independientes

El software también permite encontrar el mejor candidato a gen de referencia con al

herramienta “Reference Gene Selection”, según el método GeNorm. (Accurate

normalization or real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple

internal control genes. Jo Vandesompele, et al.)

En el caso de utilizar los paneles para Real Time PCR “Prime PCR” de Bio-Rad

(http://www.bio-rad.com/es-es/product/pcr-primers-probes-panels) el software

incorpora diversas herramientas para una rápido análisis de los mismos, analizando

automáticamente los controles de retrotranscripción, contaminación por DNA

genómico, etc…

Con la herramienta “Custom Data View” es posible personalizar la pantalla para ver

varios resultados al mismo tiempo y poder analizarlos, por ejemplo las curvas de

amplificación, gráficos de genotipado, y las tablas de resultados.

Dispone de una herramienta de control de calidad de los datos de qPCR, para ver y

eliminar rápidamente aquellas muestras que no cumplan los requisitos mínimos de

calidad exigidos.

Exportación y edición de tablas y datos personalizable

Dispone de varias herramientas de edición y anotación para exportar tablas y gráficas con la máxima resolución gráfica, de manera que, los datos sean enviados a su publicación rápidamente sin necesidad de retoques.

Los tablas de datos pueden exportase de modo personalizado con la herramienta “Custom Export”, el usuario podrá elegir el formato en el que desea exportar los datos, así como los que considera más importantes, y el orden de los mismos,

Permite la exportación de datos procesados, informes y gráficos a otros programas a través del portapapeles de Windows. Formatos: Texto (*.txt), CSV (*.csv), Excel (*.xlsx), XML (*xml), HTML (*. Html), RDML y pdf, siendo posible elegir los parámetros del informe por el usuario.

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