cetosis y su asociacion con sanidad mamaria y fertilidad al inicio de … · como requisito parcial...
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Anexo 1
Los abajo firmantes, convocados por el Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias de la
Universidad de Caldas, hemos revisado el informe final de la tesis doctoral:
CETOSIS Y SU ASOCIACION CON SANIDAD MAMARIA Y FERTILIDAD AL
INICIO DE LA LACTANCIA EN VACAS DE ALTA PRODUCCIÓN
Presentada por: NÉSTOR ALONSO VILLA ARCILA
Como requisito parcial para obtener el título de Doctor en Ciencias Agrarias
y certificamos su aprobación
ALEJANDRO CEBALLOS MÁRQUEZ
Nombre completo 1er miembro
JUAN CARLOS RODRÍGUEZ LECOMPTE
Nombre completo 2do miembro
MARCELO RATTO
Nombre completo 3er miembro
Anexo 2
CETOSIS Y SU ASOCIACION CON SANIDAD MAMARIA Y FERTILIDAD AL
INICIO DE LA LACTANCIA EN VACAS DE ALTA PRODUCCIÓN
Tesis
Presentada a:
Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Universidad de Caldas
Como requisito parcial
para obtener el título de
Doctor en Ciencias Agrarias
Por
NÉSTOR ALONSO VILLA ARCILA
ALEJANDRO CEBALLOS MÁRQUEZ, PhD. Director de Tesis
Diciembre de 2015
Anexo 5
TABLA DE CONTENIDOS
Agradecimientos ii
Dedicatoria iii
Tabla de contenido iv
Anexo 6
Lista de figuras
Anexo 7
v
Lista de tablas vi
Lista de anexos vii
Resumen
viii
Capítulo I
1. Introducción 1
Capítulo II
2. Revisión de literatura. 4
2.1. Fisiopatología del hígado grasos y la cetosis. 5
2.2. Influencia de la cetosis en la salud de la glándula mamaria y
producción de leche 6
2.3. Cetosis y reproducción 8
2.4. Mastitis y reproducción 8
2.5. Inmunidad de la glándula mamaria 10
2.6. Justificación 13
2.7. Planteamiento del problema 13
2.8. Objetivo general 13
2.9. Objetivos específicos 14
3. Capítulo III. Primer artículo
3.1. Association between serum butyrate concentration and the odds of
intramammary infections around calving in grazing dairy cows
19
4. Capítulo IV. Segundo artículo
4.1. The association beetwenn subclinical mastitis and calving to - first
service and calving – to - conception interval in dairy cows
40
5. Capítulo V. Tercer artículo
5.1. Dinámica de las células somáticas en leche y sangre en vacas
Holstein sin y con infección intramamaria
61
6. Capítulo VI
Discusión general 89
ii
Anexo 6
LISTA DE FIGURAS
Figura Título Página
1 Concentración promedio de BHB en vacas en pastoreo productoras
de leche durante el pre y 30 días posparto (n= 208)
31
2 Logaritmo natural del recuento de células somáticas (Ln SCC
miles/mL) en vacas sin y con infección intramamaria subclínica al
secado, y promedio de las primeras cuatro semanas posparto en vacas
Holstein y Normando. Los promedios son diferentes a un valor de P
< 0.01.
48
3 Función de supervivencia de Kaplan-Meier para vacas sin (-) y con (-
-) infección intramamaria (IIM) en las primeras cuatro semanas
postparto y su efecto sobre el IPPS (a) y el IPC (b). La función de
supervivencia para el IPPS no presenta diferencias significativas
según la IIM (P > 0.05), mientras que para el IPC hay diferencias
significativas según el estado de infección de la glándula mamaria (P
< 0.05). El período de seguimiento se inició al final de la espera
voluntaria (40 días postparto).
49
4 Tiempo de supervivencia predicho para el intervalo parto concepción
(IPC) en vacas sin (-) y con (- -) infección intramamaria (IIM) en las
primeras cuatro semanas postparto. La predicción es posterior a un
modelo paramétrico con una distribución Weibull. El período de
seguimiento se inició una vez se finalizó la espera voluntaria a los 40
días postparto.
51
5 Representación del parámetro de forma (p) obtenido en el modelo
con distribución Weibull para el riesgo de concepción en vacas sin (–
–) y con (- -) infección intramamaria (IIM) en las primeras cuatro
semanas postparto. El parámetro p fue mayor a 1.0, indicando que el
riesgo no fue constante y se incrementó con el tiempo. El período de
seguimiento se inició una vez se finalizó la espera voluntaria a los 40
días postparto.
51
iii
Anexo 7
LISTA DE TABLAS
Tabla Título Página
1 Promedio ajustado, error estándar (EE), e intervalo de confianza (IC)
del recuento de células somáticas (LnRCS) de acuerdo al número de
partos de las vacas y después de controlar por el efecto hato.
28
2 Frecuencia y % de patógenos mamarios observados al secado y en las
primeras cuatro semanas posparto in vacas lecheras de cinco hatos
estudiados.
29
3 Asociación entre variables independientes y la probabilidad de tener
una infección intramamaria (IIM) en el primer mes de lactancia en
vacas de leche. Los resultados son presentados como coeficientes
(Coeff) y su intervalo de confianza (IC) después de ajustar el modelo
logístico completo.
33
4 Asociación entre variables independientes y la probabilidad de tener
una infección intramamaria (IIM) en el primer mes de lactancia en
vacas de leche. Los resultados son presentados como coeficientes
(Coeff) y su intervalo de confianza (IC) después de ajustar el modelo
logístico reducido.
34
5 Efecto de las infecciones intramamarias (IIM) alrededor del parto
sobre el intervalo parto concepción (IPC) en vacas Holstein y
Normando en pastoreo. El coeficiente representa el efecto de la IIM
en escala logarítmica y después de controlar por el efecto hato. Los
resultados corresponden a modelos de supervivencia paramétricos con
distribuciones exponencial y Weibull.
50
6 Efecto de las infecciones intramamarias (IIM) en el primer mes
postparto sobre el número de servicios por concepción (S/C) en vacas
Holstein y Normando. Se presentan los resultados de modelos de
regresión binomiales negativos, incluyendo todas las vacas del estudio
y después de la remoción de tres vacas con alta influencia en el
modelo inicial.
53
7 Promedio ajustado del LnRCS ± error estándar de acuerdo al número
de partos en vacas sin y con infección intramamaria (IIM) en vacas
Holstein en las primeras cuatro semanas posparto agrupadas según el
número de lactancias.
71
8 Promedio ajustado para el porcentaje (± error estándar) de los
neutrófilos, linfocitos y la relación neutrófilos:linfocitos en leche de
vacas Holstein sin y con infección intramamaria (IIM).
72
iv
9 Promedio de la relación neutrófilos:linfocitos en leche (± error
estándar) en vacas Holstein sin y con infección intramamaria (IIM)
según el número de lactancia.
72
10 Promedio del recuento leucocitario en sangre (± error estándar) en
vacas Holstein sin y con infección intramamaria (IIM) según el
número de lactancias.
73
11 Promedio (± error estándar) de neutrófilos, linfocitos y promedio para
la relación neutrófilos:linfocitos (N:L) en sangre de vacas Holstein sin
y con infección intramamaria.
74
12 Promedio ajustado ± error estándar de los constituyentes sanguíneos
analizados en vacas Holstein sin y con infección intramamaria.
75
v
LISTA DE ANEXOS
Anexo
1 Presentación oral Infección intramamaria al secado y el periparto en vacas
del departamento de Caldas, Colombia. 2do
Congreso
RELIM – Costa Rica 2014
97
2 Poster Association between udder health and reproductive
performance in Holstein and Normande cows, in
Caldas, Colombia. National Mastitis Council 2015.
Memphis, Tennessee
98
CETOSIS Y SU ASOCIACION CON SANIDAD MAMARIA Y FERTILIDAD AL
INICIO DE LA LACTANCIA EN VACAS DE ALTA PRODUCCIÓN
NÉSTOR ALONSO VILLA ARCILA
Universidad de Caldas
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias
Manizales, 2015
v v
Resumen
La producción de leche en los municipios de Manizales y Villamaria está basada
principalmente en ganado Holstein y Normando y se caracteriza por ser a pastoreo
intensivo más suplementación. En las 208 vacas objeto del estudio, 165 eran multíparas y
43 novillas de primer parto. En el estudio se observó una prevalencia de mastitis subclínica
al secado del 60% acompañada de un LnRCS alto 6.25 ± EE 0.1, mientras que el promedio
durante el primer mes posparto del LnRCS fue 5.12 ± 0.1 encontrándose diferencias entre
el secado y el promedio postparto (P < 0.01). El RCS al momento del secado estuvo
asociado con el RCS al inicio de la lactancia, observándose que el RCS en este período se
eleva 0.38 ± 0,13 unidades (LnRCS 1000/mL) por cada unidad de aumento del RCS al
secado (P < 0.001).
Se mantuvo un 22% con IIM crónica después del parto y el riesgo de nuevas IIM en el
inicio de la lactancia fue 26%. Se concluye que la terapia de secado en nuestro medio tuvo
un efecto de curación bajo y provocó un alto % de vacas crónicas después del parto, así
mismo, se hallo un alto % de infecciones nuevas. Lo anterior debido posiblemente a
prácticas de secado mal establecidas, manejo del preparto y la rutina y procedimientos de
ordeño principalmente. Las bacterias Staph. aureus, Staph. spp (CNS), Strep. agalactiae y
Strep. uberis fueron las más prevalentes, contrario a lo que sucede en otros países de Norte
América y Europa donde la producción de leche es con base en ganado estabulado y los
patógenos mamarios son principalmente Gram negativos.
Un total de 25 vacas presentaron valores para β-hidroxibutiratos (BHB) entre 1.2 y 2.9
mmol/L, que equivale a un riesgo de incidencia de cetosis subclínica del 12.0 % en el
primer mes postparto. Se observaron diferencias para la concentración de BHB entre el
preparto y el promedio para las cuatro primeras semanas postparto (P < 0.05). Se observó
una tendencia a una mayor probabilidad de infecciones intramamarias (IIM) en las vacas
con valores elevados de BHB una semana antes del parto (P = 0.08), mientras que la
concentración sérica promedio de BHB en las cuatro primeras semanas postparto no estuvo
asociada con la probabilidad de tener una IIM en el inicio de la lactancia. Lo que
posiblemente se debe a una falta de poder estadístico asociado con un bajo número de vacas
vi
con IIM. Se observaron diferencias para la concentración de BHB entre el preparto y el
promedio para las cuatro primeras semanas postparto (P < 0.05).
Con respecto a los índices reproductivos, las vacas tuvieron un intervalo parto primer
servicio (IPPS) y un intervalo parto concepción (IPC) de 86 ± 34 días y 128 ± 66 días
respectivamente, hallándose diferencias en ambos índices entre las vacas Holstein y
Normando (P < 0.001). Las diferencias en la proporción en el IPPS e IPC en vacas sin y
con IIM fueron analizadas mediante el análisis de sobrevivencia de Kaplan – Meir, donde
las vacas sin y con IIM tuvieron un IPPS similar (P > 0.05), mientras que en las vacas con
IIM se observó un IPC más largo en comparación con las vacas sin IIM (P = 0.009). El
número promedio de servicios por concepción (S/C) fue de 2.1 ± 1.5, donde las vacas con
IIM presentaron en promedio 2.5 ± 1.8 S/C, mientras que en las vacas sin IIM fueron 1.9 ±
1.3. Al evaluar el efecto de las IIM sobre los S/C se encontró un efecto altamente
significativo de las IIM sobre los S/C (P = 0.002).
De la influencia de las IIMs sobre los índices reproductivos, éstas tuvieron un efecto
negativo sobre el IPC y sobre los S/C, pero no en el IPPS. No obstante, en el análisis se
encontró que la variable finca tuvo un efecto significativo, lo que indica que el manejo
reproductivo y las IIMs dependen de múltiples factores relacionados con el manejo
particular de cada hato. Finalmente, y de acuerdo a los antecedentes de literatura son varios
los mecanismos fisiológico mediante los cuales las IIM pueden influenciar la reproducción
en bovinos. De lo anterior se concluye que las IIMs y los problemas reproductivos son dos
patologías íntimamente unidas y que en nuestro medio no se han cuantificado, pero siguen
siendo las dos principales causas de descarte en los hatos a nivel mundial. Así mismo,
cuando se utilizan ciertas biotécnicas reproductivas con el fin de mejorar los índices
reproductivos, programas muy generalizados en nuestro medio, los profesionales deben
colocar énfasis en la sanidad mamaria con el fin de tener mejores resultados en los
programas reproductivos.
La determinación del recuento diferencial de células somáticas (RDCS) en leche mediante
microscopía convencional es una herramienta útil para la identificación de células
vii
inflamatorias en procesos infecciosos. En este trabajo se observó que las bacterias
prevalentes fueron S. uberis, S. aureus y S. agalactiae y estos patógenos indujeron un
aumento significativo en el LnRCS en leche, si bien no se encontró una relación entre los
leucocitos sanguíneos y los hallados en leche, lo que indicaría que bajo condiciones de IIM
subclínica el transporte de leucocitos sanguíneos a la leche no es alto como en IIM agudas,
aunque se observó un aumento significativo de los neutrófilos en leche en las vacas con
IIM acompañado de una disminución de los linfocitos. En las variables del
hemoleucograma, las Ig se encontraron altas en ambos grupos y las vacas con IIM tuvieron
valores significativamente más altos que las vacas sanas.
1 1
Capitulo I
1. Introducción
La selección genética en ganado de leche se ha focalizado en aumentar la producción de
leche en los últimos años (Butler, 2013). El inicio de la lactancia es un periodo crítico para
cualquier hembra, donde la lactogénesis y la involución uterina acompañada de cambios
endocrinos y metabólicos generan una serie de cambios adaptativos que son dramaticos
para la vaca (Bradford et al., 2015). Lo anterior ha conducido a que las vacas de leche sean
consideradas “atletas metabólicos” determinando que entre un 30 y 50% de las vacas al
inicio de la lactancia padezcan algún problema infeccioso o metabólico (LeBlanc, 2010).
Durante el periparto todas las vacas de leche experimentean una disminución en la ingesta
de alimentos, un balance energético negativo, resistencia a la insulina, lipolisis y pérdida de
peso, acompañado de enfermedades metabólicas como la hipocalcemia e hipecetonemia
que inducen alteraciones en la respuesta inmune, principalmente en el útero y la glándula
mamaria (Suriyasathaporn et al., 2000; LeBlanc, 2010). Recientemente, se ha demostrado
que todas las vacas en el periparto experimentan algún grado de inflamación sistémica
caracterizada por un aumento de citoquinas proinflamatorias que inducen la síntesis de
proteínas de fase aguda por parte del hígado con el fin de restablecer la homeostasis y
favorecer la migración del leucocitos a los sitios más susceptibles de infección como son la
glándula mamaria (GM) y el útero (Bradford et al., 2015). Las enfermedeades metabólicas
o enfermedades de la producción son el eslabón entre la producción de leche y factores
inherentes al periparto en la vaca de leche, donde la nutrición juega un papel relevante en
este periodo.
La cetosis es una enfermedad metabólica que afecta a los bovinos al inicio de la lactancia y
se caracteriza por una disminución en la glucosa y un aumento de los cuerpos cetónicos,
principalmente los β-hidroxibutiratos (BHB) (Drackley et al., 2005). La cetosis subclínica
es más prevalente que la cetosis clínica y el riesgo de que una vaca desarrolle la
enfermedad depende de la finca donde se encuentre y de un aumento de la condición
2
corporal preparto (McArt et al., 2012). Su importancia radica en que la hipercetonemia
induce una disminución en la producción de leche y favorece la presentación de otras
patologías propias del periparto como metritis, mastitis y desplazamiento del abomaso entre
otras (Suriyasathaporn et al., 2000; Duffield et al., 2009).
Clásicamente la mastitis se ha definido como una “enfermedad multifactorial” porque el
riesgo de infección depende de la habilidad de la vaca para rechazarla, del tipo, número y
de la patogenicidad de las bacterias presentes en el hato y fundamentalmente, de las
condiciones del ambiente, del manejo en general y de la rutina de ordeño que se este
ejecutando en el establecimiento (Wilson et al., 1997; Ramírez et al., 2001; Sordillo, 2005).
La mastitis y las alteraciones reproductivas son patologías comunes en la lactancia
temprana y se considera que alrededor del 50% de la vacas en el periparto padecen
enfermedades como la cetosis que favorecen la retirada del hato (Bradford et al., 2015). Las
pérdidas económicas que generan las infecciones intramamarias (IIM) a nivel mundial, ya
sean clínicas o subclínicas son bastante altas, hasta el punto que se considera esta
enfermedad junto a los problemas reproductivos las que generan las mayores pérdidas en
producción bovina por disminución en la producción de leche, descarte de leche, servicios
profesionales, costo de los antibióticos, mano de obra y pérdidas del valor de las vacas
(Seegers et al., 2003; Santos et al., 2004; Nickerson and Oliver, 2014).
Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue estudiar desde el punto de vista
epidemiológico la prevalencia de cetosis subclínica y la eventual asociación con las
infecciones intramamarias. De otra parte, cuantificar el efecto de las IIM subclínicas sobre
la reproducción e igualmente, correlacionar el recuento diferencial de las células somática
en leche y sangre de vacas sin y con IIM con el fin de aunar antecedentes para futuros
estudios.
3
Bibliografía
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Butler, S. T. 2013. Genetic control of reproduction in dairy cows. Reproduction, Fertility
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Drackley, J. K. et al. 2005. Physiological and pathological adaptations in dairy cows that
may increase susceptibility to periparturient diseases and disorders. Italian Journal
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Duffield, T. F., K. D. Lissemore, B. W. McBride, and K. E. Leslie. 2009. Impact of
hyperketonemia in early lactation dairy cows on health and production. J Dairy Sci
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LeBlanc, S. J. 2010. Monitoring metabolic health of dairy cattle in the transition period.
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McArt, J. A. A., D. V. Nydam, and G. R. Oetzel. 2012. Epidemiology of subclinical ketosis
in early lactation dairy cattle. J Dairy Sci 95: 5056-5066.
Nickerson, S. C., and S. P. Oliver. 2014. Review: How well have United States dairy
producers adopted mastitis-control technologies for reducing herd somatic cell
counts and improving milk quality? The Professional Animal Scientist 30: 115-124.
Ramírez, N., G. Gaviria, O. Arroyave, B. Blanca Sierra, and J. E. Benjumea. 2001.
Prevalencia de mastitis en vacas lecheras lactantes en el municipio de San Pedro de
los Milagros, Antioquia. Rev Colomb Cienc Pec 14: 76 - 87.
Santos, J. E. P., R. L. A. Cerri, M. A. Ballou, G. E. Higginbotham, and J. H. Kirk. 2004.
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Seegers, H., C. Fourichon, and F. Beaudeau. 2003. Production effects related to mastitis
and mastitis economics in dairy cattle herds. Vet Res 34: 475-491.
Sordillo, L. M. 2005. Factors affecting mammary gland immunity and mastitis
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Suriyasathaporn, W., C. Heuer, E. N. Noordhuizen-Stassen, and Y. H. Schukken. 2000.
Hyperketonemia and the impairment of udder defense: a review. Vet Res 31: 397 -
412.
Wilson, D. J., R. N. Gonzalez, and H. H. Das. 1997. Bovine mastitis pathogens in New
York and Pennsylvania: Prevalence and effects on somatic cell count and milk
aroduction. J Dairy Sci 80: 2592-2598.
4
CAPÍTULO II
2. Revisión de literatura
Con el mejoramiento genético alcanzado a través de los años en ganado de leche se han
multiplicado los desórdenes nutricionales que generan enfermedades metabólicas e
infecciosas (Dillon et al., 2006). Las enfermedades metabólicas o enfermedades de la
producción son provocadas por un desequilibrio entre los nutrientes que ingresan al
organismo del animal (hidratos de carbono, proteínas, minerales, agua), su metabolismo y
los egresos a través de la leche, feto, materia fecal, orina etc. (Wittwer and Contreras,
1980).
Los desequilibrios nutricionales que afectan a las vacas de alta producción se producen
porque el aporte o la utilización de los alimentos no satisfacen los requerimientos de
mantenimiento y producción (Roche et al., 2009). Cuando estos desequilibrios son de corta
duración y leves, el animal los puede compensar utilizando sus reservas corporales; sin
embargo, si en desequilibrios moderados o severos y persistentes, el animal agota sus
reservas corporales y se presenta una enfermedad producto de la movilización conocida
como cetosis (Wittwer, F. and P. Contreras. 1980).
Durante el periparto las vacas de leche experimentan una serie de adaptaciones metabólicas
principalmente relacionadas con la movilización de sus reservas corporales, producto de un
balance energético negativo (BEN); particularmente, son cambios significativos en ácidos
grasos libres y el contenido de fosfolípidos a nivel de membrana celular en el tejido adiposo
e hígado (Drackley, 1999). A nivel hepático y específicamente del hepatocito, estos
cambios pueden causar daños por la excesiva lipolisis y acumulación de triacilgliceroles
(Jorritsma et al., 2001).
Hay evidencia de los efectos que tienen estas alteraciones hepáticas producto de la cetosis
tanto clínica como subclínica sobre la salud de la glándula mamaria y la eficiencia
reproductiva de la vaca, además es una causa alta de sacrificio en vacas de alta producción
(Suriyasathaporn et al., 2000; Bobe et al., 2004).
5
La mastitis bovina, es una reacción inflamatoria de la glándula mamaria y produce
alteraciones físicas y químicas en la leche, aumento del recuento de células somáticas
(RCS) por la presencia de microorganismos patógenos y finalmente cambios en la pérdida
de la funcionalidad (Calderón and Rodríguez, 2008). La cetosis tiene un efecto negativo en
los mecanismos de defensa de la ubre, es así como (Suriyasathaporn et al., 2000)
encontraron que los leucocitos de vacas cetóticas tienen una menor capacidad de fagocitosis
a nivel de la ubre. Así mismo, estos autores indican que la capacidad de los neutrófilos es
reducida cuando estas células actúan en presencia de altas concentraciones de cuerpos
cetónicos.
Los antecedentes de literatura indican que la cetosis bovina es una enfermedad que tiene un
impacto alto sobre la salud productiva de la vaca durante el periparto (Heuer et al., 1999);
no obstante, en nuestro medio no se han realizado estudios que integren el efecto de la
cetosis y su efecto en la mastitis y la reproducción; así como tampoco el impacto
económico que de ella se deriva. Por lo anterior, este proyecto pretende conocer el impacto
de la cetosis en la calidad de la leche y su efecto en la reproducción de las vacas
productoras de leche colocando especial énfasis en los aspectos bioquímicos de esta
enfermedad y los cambios moleculares que induce y favorecen la presentación de mastitis y
disminución de la eficiencia reproductiva.
2.1. Fisiopatología del hígado grasos y la cetosis
El hígado graso o lipidosis hepática es una enfermedad metabólica que afecta más del 50%
de las vacas durante la lactación temprana (Jorritsma et al., 2001), está asociado a un
incremento en la incidencia de enfermedades metabólicas e infecciosas, como cetosis
(Smith et al., 1997), mastitis (Suriyasathaporn et al., 2000), metritis y disminución de la
fertilidad (Bobe et al., 2007). La acumulación de lípidos a nivel hepático puede alterar la
función del hígado como son la síntesis y biotransformación de metabolitos y proteínas, la
detoxificación y excreción de productos de desecho que comprometen el sistema inmune
(Jorritsma et al., 2003). La acetonemia es una alteración metabólica producida por un
balance energético negativo que se presenta en la vaca en períodos de alta demanda con
6
disminución de la glicemia, incremento de los ácidos grasos libres y acumulación de
cuerpos cetónicos en la sangre y fluidos (Drackley, 1999). Además, se produce un depósito
de grasa en el hígado que derivan en una serie de trastornos bioquímicos que en la mayoría
de los casos produce una enfermedad que no es posible detectar clínicamente (subclínica)
(Miettinen and Setälä, 1993).
Los cuerpos cetónicos, los (BHB) y el acetoacetato, son productos fisiológicos en el
metabolismo de carbohidratos y lípidos de rumiantes, sus precursores son las grasas y
ácidos grasos de la dieta, así como los depósitos de grasa del animal (Duffield et al., 2009).
El ácido butírico de la dieta es transformado en el epitelio de los preestómagos, vía
acetoacetato, a BHB por lo que este constituye el principal cuerpo cetónico de la sangre del
rumiante. Por otra parte, los ácidos grasos de cadena larga producto de la movilización de
reservas de grasa son convertidos en el hígado a acetoacetato y luego a BHB el cual puede
ser empleado como fuente de energía y en la síntesis de grasa en la ubre. De esta forma, la
cetosis se produce cuando la producción de cuerpos cetónicos es mayor que su utilización,
lo cual se presenta cuando hay un déficit de energía (oxalacetato), producto de alta
demanda de glucosa para producir lactosa (Drackley, 1999; Drackley et al., 2005).
La cetosis subclínica corresponde a los casos en que hay un incremento anormal de los
cuerpos cetónicos, si bien el animal no presenta ningún signo clínico, como anorexia,
digestivo o nervioso de la cetosis (Anderson, 1988). Su importancia radica en que está
asociada a una reducción en la producción de leche y a un deterioro en la fertilidad del
grupo de animales afectados (LeBlanc, 2010). No es claro si estos problemas son causados
primariamente por el aumento de los cuerpos cetónicos o bien, son producidos por el BEN.
Se ha descrito que la prevalencia de la cetosis subclínica en los dos primeros meses de
lactancia varía entre un 8 y un 34% (Dohoo and Martin, 1984; Duffield et al., 1997). Por lo
anterior, la cetosis subclínica es más prevalente que la cetosis clínica.
2.2. Influencia de la cetosis en la salud de la glándula mamaria y producción de leche
La cetosis subclínica y clínica tienen una asociación temporal y negativa sobre la
producción de leche. (Rajala-Schultz et al., 1999) observaron una disminución en la
7
producción de leche entre la segunda y cuarta semana de lactancia. La relación grasa –
proteína en leche también se ve afectada, el porcentaje de grasa en leche aumenta en la
cetosis subclínica producto del incremento de BHB y ácidos grasos que participan
normalmente en la síntesis de la grasa de la leche (Heuer et al., 1999). La proteína en leche
de vacas con cetosis disminuye y está asociada a un deficiente aporte de energía, ya que la
proteína en leche también depende del balance de energía (Miettinen and Setälä, 1993).
La mastitis bovina, es una reacción inflamatoria de la glándula mamaria y produce
alteraciones físicas y químicas en la leche, aumento del número de células somáticas por la
presencia de microorganismos patógenos y finalmente cambios como es la pérdida de la
funcionalidad (Calderón and Rodríguez, 2008). Sin embargo, las bacterias de los géneros
Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium y algunos gérmenes Gram negativos, son
responsables de más del 90 % de los casos clínicos y subclínicos (Wilson et al., 1997;
Barker et al., 1998). La enfermedad puede cursar como subclínica (la de mayor prevalencia
en el hato) o como clínica, con alteraciones macroscópicas de la leche y síntomas palpables
de la ubre y, a veces, de tipo sistémico en todo el animal. Clásicamente se ha definido como
una “enfermedad multifactorial” porque el riesgo de infección depende de la habilidad de la
vaca para rechazarla, del tipo, número y de la patogenicidad de las bacterias presentes en el
hato y, fundamentalmente, de las condiciones del ambiente, del manejo en general y de la
rutina de ordeño en particular que se estén desarrollando en el establecimiento (Wilson et
al., 1997; Ramírez et al., 2001; Sordillo, 2005).
El BEN tiene un efecto negativo en los mecanismos de defensa de la ubre, es así como
(Suriyasathaporn et al., 2000) encontraron que los leucocitos de vacas hipercetócicas tienen
una menor capacidad de fagocitosis a nivel de la ubre. Así mismo, estos autores indican que
la capacidad de los neutrófilos es reducida cuando estas células actúan en presencia de altas
concentraciones de cuerpos cetónicos. De otra parte, (Hoeben et al., 1997), hallaron en un
estudio in vitro que la cetosis induce una supresión de la actividad de los
polimorfonucleares por una inhibición del anión superóxido, fundamental para la
fagocitosis. Las interleuquinas o quimoquinas (IL) son proteínas que favorecen la
migración de los neutrófilos a los sitios de inflamación, en especial la IL8 parece ser uno de
8
los principales mediadores de la inflamación y migración de leucocitos a la glándula
mamaria en los procesos de mastitis (McClenahan et al., 2006).
2.3. Cetosis y reproducción
Existen una serie de publicaciones que demuestran el efecto que tiene la cetosis tanto
clínica como subclínica en la reproducción (Jorritsma et al., 2000; Berry et al., 2007; Walsh
et al., 2007). Es así como las vacas que no presentan cetosis tienen 1.6 veces más
oportunidad de quedar gestantes que las vacas que si presentan la enfermedad (Gillund et
al., 2001).
Un aumento en la incidencia de quistes ováricos encontraron (Dohoo and Martin, 1984) en
vacas con cetosis subclínica. (Miettinen and Setälä, 1993) observaron un aumento en el
lapso parto – concepción en vacas con una concentración de grasa alta en leche y en este
mismo sentido, (Walsh et al., 2007) hallaron que la rata de concepción al primer servicio
disminuyo un 50% en vacas con una concentración de ßHB superior a los 1400 umol/L en
la segunda semana posparto. Con respecto a infecciones uterinas durante el posparto, (Reist
et al., 2003) observaron un aumento en el riesgo de presentación de esta patología en vacas
que tenían acetona en leche igual o superior a 0.4 mmol/L y en suero una concentración de
ßHB superior a 2400 umol/L., en este mismo estudio observaron en estas vacas cetóticas
una disminución significativa en la producción de leche.
La concentración de AGNE por encima de 0.6 mml/L en el día 7 antes del parto fue
asociado con 1.6 veces la posibilidad de desarrollar metritis, lo anterior porque los AGNE
altos tienen un efecto negativo en la función de los neutrófilos, induciendo
inmunosupresión; además, los AGNE disminuyen la ingestión de materia seca lo que
conlleva a una mayor presentación de enfermedades metabólicas (Dubuc et al., 2010).
2.4. Mastitis y reproducción
Las pérdidas económicas asociadas con alteraciones reproductivas y que tienen un origen
en la mastitis ha ganado atención en la última década (Lavon et al., 2011). Existe una
correlación negativa entre la presencia de mastitis y el desempeño reproductivo,
9
principalmente en vacas de alta producción, estudios recientes indican este efecto (Bobe et
al., 2007). Las endotoxinas producidas por las bacterias a nivel de glándula mamaria
aumentan la temperatura corporal y la liberación de prostaglandinas y cortisol, lo que
tendría un efecto negativo sobre la calidad y desarrollo del oocito y el cuerpo lúteo,
determinando además, alteraciones del ciclo estral (Risco et al., 1999; Schurick et al.,
2001).
Mediante un meta-análisis, (Fourichon et al., 2000) evaluaron la asociación entre cetosis
clínica y el desempeño reproductivo en ganado de leche, el estudio reveló que la cetosis
clínica aumento 2.5 días el intervalo parto primera inseminación, en 6 días los días abiertos
y una disminución de la concepción al primer servicio en 3.8%. Además, la rata de
concepción entre los días 56 y 120 posparto fue 13% menos en vacas con cetosis clínica.
En el mismo estudio los autores encontraron que la cetosis no tuvo efecto significativo en
vacas Holstein de Estados Unidos y Canadá e indican que el efecto de la cetosis clínica en
la reproducción es limitado, pero muestra grandes variaciones en diferentes sistemas de
producción.
Las vacas que desarrollan infecciones uterinas posparto tienen folículos dominantes más
pequeños que si alcanzan a ovular generan un cuerpo lúteo también pequeño con una menor
concentración de progesterona circulante (Williams et al., 2007). Así mismo, (Dubuc et al.,
2012) han sugerido que la anovulación posparto está asociado con indicadores del balance
de energía y la inflamación uterina
En un estudio retrospectivo se evaluaron más de 15,000 registros provenientes de 26
explotaciones lecheras que tuvieron mastitis, descubriéndose que las vacas que sufrieron tal
afección en la lactancia temprana, presentaron un intervalo parto – primer servicio más
largo (Eicker et al., 1996). En otro estudio se valoró la fertilidad de 9000 vacas,
observándose que aquéllas que sufrieron mastitis entre los 20 y 40 días antes del servicio,
presentaron 45% de fertilidad; en los animales que registraron mastitis en los 20 días
previos al servicio tuvieron un 36% de fertilidad y un 29% de fertilidad en los animales que
padecieron la mastitis en las primeras tres semanas después del servicio (Loeffler et al.,
10
1999). En ganado Jersey se encontró que el primer servicio postparto fue de 94 días para las
vacas que presentaron mastitis antes de la primer servicio y de 71 días para las que no
presentaron mastitis; también se evidenció que los días a la concepción en las vacas que
presentaron mastitis fue de 137 días, significativamente mayor a los 92 días de las vacas
sanas o que desarrollaron mastitis clínica después de confirmada la preñez (Barker et al.,
1998).
De acuerdo a investigaciones previas, la infección e inflamación de la glándula mamaria
durante la gestación puede tener un impacto negativo en el tamaño de la reserva folicular de
las hijas en desarrollo. En otras palabras, la mastitis reduce el número de folículos con que
nacen las hijas de vacas con recuento alto de células somáticas, así como el número de
folículos que maduran y ovulan. Estas alteraciones pueden comprometer la función
reproductiva futura de esas hijas; esto se ha determinado evaluando la asociación entre las
concentraciones circulantes de hormona anti-mulleriana en las hijas y los casos de mastitis
de las madres durante la gestación (Ireland et al., 2010).
2.5. Inmunidad de la glándula mamaria
El recuento de células somáticas (RCS) en leche es un indicador del estado de infección de
la GM y es la respuesta inflamatoria de defensa natural ante la presencia de agentes
infecciosos, lo que determina un aumento en el flujo de células somáticas, principalmente
polimorfonucleares (PMN) de la sangre a la GM, que son los principales efectores de la
respuesta inmune innata rápida (Burvenich et al., 1994; Schukken et al., 2003). El RCS no
considera los cambios en la distribución de las células somáticas; fluctuaciones en el RCS
se han observado en estados donde no necesariamente la vaca tiene IIM y su población y
distribución depende del estado fisiológico de la GM (Dulin et al., 1983; Boutinaud and
Jammes, 2002). Varios estudios han determinado que el umbral para determinar la
presencia de IIM es de 200.000 células por mL (Dohoo and Leslie, 1991; Schepers et al.,
1997).
En la GM, el número y distribución de los leucocitos son fundamentales para la defensa
contra los patógenos, donde los leucocitos difieren en su distribución y juegan el papel más
11
importante en la inmunidad de la ubre (Leitner et al., 2003). En la GM sana, el tipo de
células somáticas predominantes son 35 – 79% de macrófagos, seguido por linfocitos, 16 –
28%, neutrófilos 3 – 26% y células epiteliales entre un 2 y 15%; sin embargo, bajo
condiciones de IIM el número y tipo de células somáticas experimentan un rápido cambio
en el número y el tipo de células predominantes, alcanzando los neutrófilos valores
superiores al 95% (Kehrli and Shuster, 1994). En este mismo sentido, parece que la
proporción de los tipos de células, o subtipos, más que el número total, es el factor que
determina el resultado de la infección, que puede ser su curación, una infección crónica o la
muerte del animal (Fitzpatrick, 2001; Sordillo, 2005).
Durante la IIM los PMN, en particular los neutrófilos, migran desde el torrente sanguíneo a
la GM constituyéndose en la primera línea de defensa; son llevados al sitio de infección por
agentes quimio tácticos como son las interleuquinas (IL), factor de necrosis tumoral (TNF)-
α y leucotrinos B4 liberados por el endotelio y los macrófagos (Paape et al., 2003; Sohn et
al., 2007). Una vez los PMN se unen a las bacterias éstos producen sustancias oxidantes
como el peróxido de hidrogeno, superóxido de hidrogeno y el radical hidroxilo que matan
la bacteria (Paape et al., 2002).
Los animales que tienen una mejor respuesta inmune a nuevas IIM no solo reclutan
rápidamente y masivamente un número alto de PMN, sino que además, tienen altos niveles
sanguíneos de IgG2, además de una efectiva respuesta inflamatoria temprana (Burton and
Erskine, 2003).
Los macrófagos actúan como centinelas contra bacterias invasoras y en caso de infección
liberan quimioatrayentes que causan una rápida migración de los PMN al sitio de infección
(Burvenich et al., 2007). Los aspectos inmunológicos y la dinámica de los PMN en la
patogénesis de la mastitis ha sido descrita, existiendo una marcada supresión de los PMN
de la sangre alrededor del parto y durante la lactancia temprana tanto en vacas primíparas
como multíparas y en leche los PMN en son menores que los PMN en sangre (Mehrzad et
al., 2002; Schukken et al., 2011).
12
Varios son los métodos que se han desarrollado para determinar el recuento diferencial de
las células somáticas (RDCS) en leche. Métodos simples, donde previa fijación de las
células, el recuento diferencial se realiza mediante un microscopio, hasta métodos
computarizados como la citometría de flujo, método éste exacto pero costoso (Pilla et al.,
2012; Pilla et al., 2013). Se ha descrito que existe una alta correlación entre la citometría y
la microscopía para los PMN y linfocitos, pero una menor correlación para macrófagos y
células epiteliales (Leitner et al., 2000).
13
2.6. Justificación
Con base en los antecedentes de literatura, y conociendo la alta prevalencia de la cetosis
sublcínica y su efecto sobre otras enfermedades de alto impacto económico como las
infeciones intramamarias, este proyecto pretende determinar si dos enfermedades en
producción de leche como es la cetosis y las infecciones intramamarias están relacionadas y
si las infecciones infecciones intramamarias afectan los índices reproductivos. También
cuantificar la dinámica del recuento diferencial de células somáticas en leche y sangre de
vacas con infección intramamaria subclínica.
2.7 Planteamiento del problema
En la actualidad la producción de ganado de leche se ve afectada por desequilibrios
nutricionales que determinan la presencia de enfermedades metabólicas que se manifiestan
de forma clínica o subclínica. La cetosis subclínica es una enfermedad metabólica que
favorece la presentación de otras patologías durante el puerperio e induce, además,
alteraciones en la respuesta inmune en la vaca, lo que determina en muchos casos la
aparición de infecciones a nivel de la glándula mamaria y el útero en las vacas de leche. Por
lo anterior, es necesario aunar antecedentes en nuestro medio sobre estas patologías con el
fin de diseñar estrategias que permitan disminuir la incidencia de esta enfermedades y de
esta manera mejorar la calidad de leche para consumo humano y aumentar los índices
reproductivos en las explotaciones dedicadas a la producción de leche; contribuyendo al
aumento de los ingresos del productor.
2.8. Objetivo general
Establecer la eventual asociación entre la concentración sérica de BHB, como indicador de
cetosis subclínica, y la probabilidad de tener una IIM en los primeros 30 días de lactancia,
así como la asociación entre las IIM en el periparto y la fertilidad. Igualmente, establecer la
respuesta sistémica y local a las IIM que ocurren alrededor del parto.
14
2.9. Objetivos específicos
1. Evaluar la asociación entre la concentración sérica de -hidroxibutiratos en el
perioparto y las infecciones intramamarias subclínicas en el primer mes de lactancia
en vacas Holstein y Normando.
2. Conocer el efecto de las infecciones intramamarias subclínicas en el primer mes de
lactancias sobre los índices reproductivos intervalo parto primer servicio, intervalo
parto concepción y el número de servicios por concepción en vacas Holstein y
Normando.
3. Conocer los cambios citológicos en leche y sangre en vacas Holstein con y sin
infección intramamaria (IIM) en el primer mes posparto y asociarlos con los
cambios en el leucograma.
15
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19
CAPÍTULO III
Association between serum butyrate concentration and the odds of intramammary
infections around calving in grazing dairy cows1
N. A. Villa-ArcilaA, P. C. Duque-Madrid
A, S. Sánchez
A, J. C. Rodríquez-Lecompte
B M.
RattoC and A. Ceballos-Márquez
A
ABiology of Livestock Industry Research Group, Universidad de Caldas. Manizales,
Colombia. E.mail: [email protected]
BDepartment of Pathology and Microbiology, Atlantic Veterinary College, University of
Prince Edward Island. Charlottetown, PEI, Canada.
CSchool of Veterinary Medicine, Ross University. Saint Kitts, West Indies.
Animal Production Science
________________
20
1 Project 0182912 funded by Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados of Universidad
de Caldas.
Abstract
The aim of this study was to evaluate the association between serum -hydroxybutyrate
(BHB) concentration around calving and the probability of having an intramammary
infection (IMI) in the first month of lactation in Holstein and Normande grazing dairy
cows. In total, 208 cows were selected in five Colombian dairy herds. Two composite milk
samples were collected from each cow at drying-off, and every week during the first month
in milk. One sample was used for the analysis of somatic cell count (SCC), and the other
one for milk culture. An IMI was declared when a mastitis-causing pathogen was isolated
from a high SCC milk sample. Blood serum samples from each cow were also collected at
drying-off, a week before calving, and then weekly for one month after calving. Serum
samples were analyzed for concentrations. Multivariate logistic regression models were
used to establish the association of the prevalence of IMI around calving on the
concentration. On average, SCC at drying-off was higher than the average in the first month
of lactation. The most frequent bacteria isolated were Staphylococcus aureus,
Staphylococcus spp. (CNS), and Streptococcus uberis. The incidence risk of subclinical
ketosis was 12% around calving. There was no association between serum concentration
and the probability of having an IMI after calving. Our results suggested that subclinical
mastitis around calving is not associated with the energy balance of the cow, being the
result of multiple herd- and cow-level factors that were beyond the scope of this study.
21
Keywords: subclinical mastitis, somatic cell count, intramammary infection, beta-
hydroxybutyrate
Introduction
The period from three wk before to three wk after calving, known as the transition period,
is critically important to health, production, and profitability of dairy cows. A number of
health disorders may occur around this time of the lactation cycle. The dairy cow is
constantly facing metabolic adaptations during the peripartum period, such as lipid
mobilization, that contribute to a negative energy balance (NEB) (Jorritsma et al. 2001). An
excessive mobilization of lipids from adipose tissue causes an increase of free fatty acids
(FFA), which can start before calving and lead to an increased accumulation of lipids in the
hepatic tissue and a high concentration of ketone bodies (Drackley 1999; Jorritsma et al.
2001).
Ketosis, either subclinical or clinical, is a metabolic disorder of the cow that results
as a consequence of the NEB in the transition period (Drackley 1999). The NEB leads to
hypoglycemia, increased serum concentrations of FFA and hyperketonemia (i.e. high levels
of blood β-hydroxybutyrate --, and other ketone bodies), which is produced mainly in the
liver cells in response to an unavailability of blood glucose (Duffield et al. 2009; McArt et
al. 2012). Subclinical ketosis may affect up to 43% of the cows in the transition period
(McArt et al. 2012). Consequently, several disorders in the periparturient cow, such as milk
fever, retained placenta, immunosuppression, and metritis, have been associated with high
levels of FFA and ketone bodies (Drackley, 1999). Cows in NEB during the periparturient
22
period experience some degree of immunosuppression due to an impairment of neutrophil
trafficking, phagocytosis, and killing capacity leading to diseases, such as mastitis
Mastitis is an inflammation of the mammary gland, which can have an infectious or
non-infectious etiology, and it is still the most costly disease of dairy cattle. Although
clinical mastitis cause a substantial impact to the profitability of the dairy business, it is
even more significant the losses associated with subclinical mastitis, as this type of mastitis
is the dominant form in most of the herds (Bradley 2002) Both quantity and quality of
polymorphonuclear leukocytes (PMN) are important as components of the udder defense in
order to protect the cow from clinical and subclinical mastitis, regardless of bacterial
species (Kehrli M.E. et al. 1989; Schukken et al. 1999). When cows are experiencing some
degree of ketosis around calving, referred as subclinical or clinical, the PMN function in the
mammary gland may be impaired increasing the risk of mastitis (Schukken et al. 1999;
Suriyasathaporn et al. 2000; Berge and Vertenten 2014).
A recent European study found that subclinical ketosis might affect approximately
39% of the cows between 7 and 21 d after calving (Berge and Vertenten 2014). These
authors also indicated that the risk of having mastitis was almost twice as likely to have a
mastitis event in the first 35 d of lactation. However, a former study also conducted in
Europe showed that there was no association between high blood concentration and the
odds of having mastitis within 30 d after calving (Suthar et al. 2013). Although studies
have not found an association between hyperketonemia and the odds of having clinical
mastitis within two wk in milk, it increased the severity and duration of clinical cases of
mastitis (Suriyasathaporn et al. 2000; LeBlanc 2010). Regardless of growing evidence
showing that hyperketonemia increases the odds of having clinical mastitis within 30 DIM,
there is a lack of studies on the association between hyperketonemia and subclinical
23
mastitis around calving. Therefore we hypothesized that hyperketonemia is associated with
a higher odds of having subclinical mastitis within the first month of lactation. Our
objective was to determine the association between serum concentrations and the odds of
having subclinical mastitis, evaluated by means of SCC and milk culture, within the first
month of lactation in grazing dairy cows.
Material and Methods
Cows enrolment and herd management
A prospective longitudinal study was designed in five dairy herds in Manizales and
Villamaria, Colombia between October 2013 and May 2014. Dairy herds were purposively
selected based on the following criteria: to have a permanent veterinary service, to record
productive and reproductive events of the cows, to have a health management plan in place,
and willing of the owner to participate in the study. Cows (n = 208) were selected based on
the approximate date of drying-off. Cows within one wk before drying-off, with no clinical
mastitis or blind quarters were selected. The selected cows (n = 208) were Holstein (n =
151) and Normande (n = 57). Regarding parity of cows, 43 were primiparous and 165 were
multiparous cows.
Herds were managed under a rotational grazing systems plus supplementation with
concentrates according to milk yield. The predominant pasture was a mixed of Kikuyu
grass (Pennisetum clandestinum), Orchardgrass (Dactylis glomerata L.), and Yorkshire fog
grass (Holcus lanatus). Concentrates used were commercial mixes of cereals, containing
14% to 16% of crude protein, and approximately 2.9 Mcal of metabolizable energy/kg of
24
dry matter. Concentrates were fed at a rate of 1 kg per 4 kg of milk yield. Mineral
supplements and water available ad-libitum.
Milk samples
Two samples of milk from all quarters in each cow were aseptically collected one
wk before drying-off. One sample was used to analyze somatic cell count (SCC), and the
other one for bacteriological analysis. Subsequently, every cow enrolled in the study
received an intramammary dry cow therapy. After calving, two milk samples were
collected from all quarters of all cows on a weekly basis up to four wk in milk. One sample
was used for SCC. According to the SCC results, the other sample was used for used for
bacteriological analysis whenever SCC was ≥ 200,000 cells/mL (Laevens et al. 1997;
Schepers et al. 1997).
Somatic cell count and microbiological analysis of milk samples
The SCC was determined using an electronic counter (Fossomatic®, Foss Electric Hillerød,
Denmark), results were expressed as the natural log (Ln SCC, thousands / mL) to normalize
the data distribution (Ali and Shook 1980).
Microbiological analyses were performed according to protocols established by the
National Mastitis Council (Hogan et al. 1999). Milk samples were cultured using sterile
cotton swabs on sheep blood agar at 5% and enriched with 0.1% esculin. Morphology and
Gram staining were used for initial identification. Catalase test was used to differentiate
staphylococci from streptococci. Coagulase test was performed on catalase positive cocci to
confirm Staphylococcus aureus. Gram-positive and catalase negative cocci were
differentiated by their reaction to the hydrolysis of esculin under ultraviolet light. Christie,
25
Atkins, Munch-Petersen test and esculin reaction were used to differentiate Streptococcus
agalactiae and Strep. dysgalactiae, and esculin reaction and culture in enterococcosel agar
were used for the identification Strep. uberis. Their morphology and Gram staining were
used to identify Corynebacterium spp. species. The growth in McConckey agar and
biochemical tests, such as citrate, indole, oxidase and motility, were used to identify
coliforms.
Definition of intramammary infection
An IMI was declared in an individual cow when SCC was higher than 200,000 cells/mL
and at least one colony of a mastitis-causing pathogen was isolated at drying-off period.
These criteria were not applied to primiparous cows. An IMI in the four-wk period after
calving was established when the mean SCC of the four wk in milk was > 100,000 cells/mL
or > 200,000 cells/mL in primiparous and multiparous cows, respectively, and at least one
colony of a mastitis-causing pathogen was identified in two out of three consecutive
samples (i.e. between weeks 1 and 3 or between weeks 2 and 4) (Ceballos-Marquez et al.
2010). Milk containing more than two bacterial species was considered contaminated and
not informative of IMI (Ceballos-Marquez et al. 2010).
Analysis of -hydroxybutyrate concentration
Blood samples were collected from each cow by coccygeal venipuncture with vacuum
tubes without anticoagulant (Vacutainer®, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) at
drying-off, one week before calving, and then once a week from calving up to four wk in
milk. Samples were cooled and transported within the following six hours to the Institute of
26
Biotechnology at Universidad de Caldas. Blood samples were centrifuged at 1000 x g for
15 minutes. Serum was separated and stored at -20 °C for subsequent analysis. Serum
concentration was analyzed using an NAD-dependent UV (Ranbut®, Randox Lab. Ltd.,
Crumlin, Ireland). Subclinical ketosis was considered when serum concentration ≥ 1.2
mmol /L (McArt et al. 2012; Suthar et al. 2013).
In addition, body condition score (BCS) was evaluated using a numeric scale from 1
to 5 (Schröder and Staufenbiel 2006).
Statistical analysis
All data were loaded into an Excel (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA) database, and
subsequently exported to the statistical software Stata 14.0 (StataCorp, College Station, TX,
USA).
Logistic regression analysis was used to evaluate the association of independent
variables on the probability to have an IMI in the first month of lactation. The effect of the
independent variables: herd (categorized 1 to 5), IMI at drying-off (negative, positive),
breed (Holstein, Normande), parity (categorized into 1, 2 and 3 or more), mean serum
concentration prior to calving and after calving (arithmetic mean of the serum
concentration in the first month of lactation), and average milk yield in the first month of
lactation were included in the model. All variables were included in a full model that was
manually reduced using the backward selection method (Dohoo et al. 2009). The P-value
was set at ≤ 0.10 in order to select the variables to be included in the final model. Although
was not considered as a direct cause of IMIs in the first month of lactation, the aim was to
establish the association between those variables and the magnitude of that association. The
logistic model was adjusted according to the following equation:
27
logit pij = 0 + 1x1 + … + nxn
where p is the probability of having IMI during the first four lactation weeks in the i cow at
the j time, 0 is the constant and 1 to n is the regression coefficient of the effect of the
independent variables from 1 to n.
The model was evaluated by calculating the standardized residuals and their
covariate patterns, which were useful for detecting influential points in the model. The
Pearson 2 statistic and the Hosmer-Lemeshow test were used to assess the goodness-of-fit
of the model. Associations were presented by coefficients of the logistic model. The
coefficients represent the log odds of disease (i.e. IMI in the first month of lactation)
increase or decrease when the factor is present (e.g. dichotomous predictors), or the change
in the log odds of disease for one-unit change in the predictor (Dohoo et al. 2009).
Results and Discussion
The study included 208 dairy cows in five herds, where the average herd size was 41.6
cows. The number of primiparous cows was 43 that did have no information about the
infection status of the mammary gland before calving. The study cows were mainly
Holstein in four out of five herds. The average dry period of multiparous cows was 70 ± 17
d. After calving, all cows were tested between 2 and 35 d after calving and the average time
for testing was 27 ± 3 DIM. The average milk yield for Holstein cows was 28.7 ± 1.4 L/d,
while the milk yield difference showed that Normande cows produced less milk (-5.9 ± 2.7
L/d; P = 0.03) after controlling for the effect of herd.
Intramammary infections
28
The mean LnSCC was higher in older cows compared to primiparous cows (Table 1).
There were also differences in the mean LnSCC at drying-off and the mean after calving.
On average, the mean LnSCC dropped -0.93 ± 0.12 (thousands/mL) units during the first
month of lactation compared to the mean at drying-off (LnSCC 5.46 ± 0.24 in
thousands/mL) (P < 0.01). Although the mean LnSCC after calving was, on average, lower
than before calving, cows with high LnSCC at drying-off had a higher mean LnSCC after
calving. For each unit of LnSCC at drying-off, the mean LnSCC increased 0.40 ± 0.08 units
(thousands/mL). The breed had no effect on LnSCC (P = 0.91).
Table 1. Adjusted mean, standard error (SE), and confidence interval (CI) of the somatic
cell count (LnSCC) according to the parity of the cows and after controlling for the effect
of herd.
Parity LnSCC (thousands/mL)
Mean ± SE CI (95%)
Primiparous: 4.88 ± 0.19a 4.51; 5.26
Multiparous:
2 4.95 ± 0.16a 4.63; 5.27
3 5.32 ± 0.17a 4.97; 5.66
3+ 6.10 ± 0.10b 5.91; 6.29
a,bDifferent letters mean P < 0.01.
Our results were in concordance with other studies showing that high SCC at
drying-off increases the likelihood of having a high SCC during the first four months of
next lactation (Halasa et al. 2009; Pantoja et al. 2009; Pinedo et al. 2012). An increase of
SCC in cows with parity was observed. Older cows may have certain degree of
immunosuppression compared to younger cows that may affect the response of the
mammary gland to mastitis pathogens (Pantoja et al. 2009; Pinedo et al. 2012).
29
The most frequently isolated pathogens were Staph. aureus, followed by CNS and
Strep. uberis (Table 2). In primiparous cows, there were 11 animals (25.6%) with an IMI in
the first wk after calving. At drying-off, there were 74 cows (46.0%) out of 161 with an
IMI, and 36 (48.6%) of them remained with an IMI after calving. The number of cows with
a new IMI at calving was 22, which corresponded to an incidence risk of 25.3%. Regarding
to clinical mastitis, 12 cows (5.8%) presented clinical cases in the first month of lactation.
Clinical cases were caused by Staph. aureus (4/12), CNS (2/12), Strep. uberis (2/12), Strep.
agalactiae (1/12), Cor. bovis (1/12), and Strep. uberis (1/12).
Table 2. Frequency and % of mammal pathogens observed at drying off and during the first
four weeks postpartum in dairy cows in the five farms in which the study was carried out.
Pathogen
Drying-
off
n= 88
%
Wk
1
n=
64
%
Wk
2
n=
57
%
Wk
3
n=
55
%
Wk
4
n=
49
%
Strep. agalactiae 5 5.7 3 4.7 2 3.5 4 7.3 7 14.3
Strep. spp. 9 10.2 5 7.8 2 3.5 4 7.3 1 2.0
Staph. aureus 15 17.0 18 28.1 18 31.6 15 27.3 15 30.6
CNS 34 38.2 16 25.0 14 24.6 10 18.2 11 22.4
Cor. bovis 8 9.1 2 3.1 5 8.8 3 5.5 1 2.0
Strep.
dysgalactiae 2 2.3 5 7.8 4 7.0 5 9.1 4 8.2
Strep. uberis 10 11.4 7 10.9 6 10.5 5 9.1 3 6.1
E. coli 1 1.1 2 3.1 0 0 0 0 0 0
Mixed infections 4 4.5 6 9.4 6 10.5 9 16.4 7 14.3
TOTAL 88 100 64 100 57 100 55 100 49 100
This incidence risk was higher than that observed in other studies with dairy cows
maintained housed and grazing systems (Compton et al. 2007; Pinedo et al. 2012).
Although the aim of our study was not to evaluate the first case of clinical mastitis after
calving, a former study showed that cow factors as increased parity and at least one SCC ≥
30
200,000 cells/mL in the 90 d before drying-off were significant factors associated with
mastitis in the first month of lactation (Green et al. 2007; Madouasse et al. 2012). These
authors also found a number of management factors associated with an increased rate of
clinical mastitis around calving, such as the administration of treatments at drying-off and
overall management of the early and late dry-period accommodation. In our study any
additional information than breed, parity, milk yield, and body condition of the cows was
not recorded and beyond the scope of our study.
The dry period is an important part of the lactation cycle for the cure of existing IMI
and the acquisition of new IMIs (Dingwell et al. 2004; Madouasse et al. 2012). The high
incidence of IMIs in the first month of lactation and the high prevalence of chronic IMIs
found in our study may be the result of herd- and cow-level risk factors for infections
acquired during the dry period, although not all of them were analyzed in this study. The
overall management of the environment is important to maintain a good udder health over
the course of the dry period and in the subsequent lactation; however, a former study did
not show differences in the incidence rate of clinical mastitis around calving in cows that
were housed or at pasture for their dry period (Green et al. 2007). Herds having dry cows
and pregnant heifers (Barkema et al. 1999) and transition cows with the milking cows
(Green et al. 2007) altogether in the same area or space had a higher incidence rate of
clinical mastitis in the first 30 DIM. Other herd factors associated with an increased rate of
clinical mastitis during the onset of lactation were a pasture rotation policy that allows the
dry cows area to remain nongrazed for less than four wk, and poor overall hygiene
conditions of cows environment (Green et al. 2007). Even though these risk factors were
not evaluated in our study, all of those are conditions that remain as part of the overall
management in Colombian dairy herds.
31
Concentration of -hydroxybutyrate and its association with intramammary infections
The serum serum concentration increased approximately 30% after calving
compared to the concentration one wk before calving (Fig. 1). Only three cows (1.6%) had
a serum concentration ≥ 1.2 mmol/L before calving. The frequency of postpartum cows
with serum concentrations above the cut-off point was variable across the four wk period.
The highest frequency of high values occurred two wk after calving (16/193; 8.3%).
Primiparous cows had a lower serum concentration compared to other parity groups (P =
0.06). There were no differences according to breed (P = 0.90).
Figure 1. Average serum -hydroxybutyrate concentration in grazing dairy cows before
and after calving (30 DIM).
*Different letters indicate significant differences P = 0,05.
The prevalence of subclinical ketosis (serum concentration ≥ 1.2 mmol/L) in our
study was lower than observed in United States and Europe (McArt et al. 2012; Suthar et
al. 2013). However, those authors found also a higher frequency of high concentrations
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Before calving After calving
β-h
yd
roxy
bu
tyra
te (
mm
ol/
L)
a*
b
32
two wk after calving. Studies conducted in herds from western Colombia showed that cows
in those herds had higher serum concentrations compared to the concentrations found in
our study (Ceballos et al. 2002). No differences were found between prepartum and
postpartum but a higher frequency of increased was observed at the peak of milk yield,
which occurred six wk after calving (Ceballos et al. 2002).
Results might be affected also by the definition of the cut-off points to declare
subclinical ketosis, which is variable across studies (Suthar et al. 2013; Berge and
Vertenten 2014). Different cut-offs have been used to define serum concentrations
suggesting the subclinical condition (Duffield et al. 2009; McArt et al. 2012; Berge and
Vertenten 2014), which may be not appropriate to set a cut-off to evaluate the dynamic
metabolic state of the transition cow. Therefore, we decided to evaluate the association of
the serum concentration on a continuous scale instead of grouping the cows as healthy or
having subclinical ketosis based on their results of concentrations.
The initial multivariate regression model did not include the effect of having an IMI
at drying-off, as primiparous cows had no information on their IMI status prior to calving.
However, the effect of subclinical mastitis was previously discussed. The full model
showed that breed and the change in body condition score during the follow-up period after
calving were not associated with having an IMI postpartum (Table 3).
Therefore, not significant variables were removed from the model but the effect of
concentration was kept, as this was the variable of interest. Both concentrations before and
after calving were evaluated. Mean serum concentration after calving showed a high P-
value in both models (P = 0.86 for the reduced model), and then concentration after
calving was removed from the model (Table 4).
33
Table 3. Association between independent variables and the probability of having an
intramammary infection (IMI) in the first month of lactation in dairy cows. Results are
presented as coefficients (Coeff.) and its confidence interval (CI) after fitting a full logistic
model.
Variable Coeff. CI 95% P-value
Herd: < 0.01
1 Reference
2 -2.30 -4.67; 0.07
3 2.69 0.73; 4.64
4 0.56 -1.15; 2.27
5 1.30 -0.53; 3.13
Breed: 0.43
Holstein Reference
Normande 1.06 -1.589; 3.70
Parity: < 0.01
Primiparous Reference
2 1.41 -0.05; 2.86
3 1.42 -0.26; 3.11
3+ 2.25 0.98; 3.52
-hydroxybutyrate:
Prepartum 1.16 -0.75; 3.06 0.24
Postpartum 0.30 -1.65; 2.24 0.77
Milk yield -0.14 -0.23; -0.04 < 0.01
Change in body condition score -0.38 -1.35; 0.59 0.44
Constant 1.23 -2.98; 5.44 0.57
There was no evidence against the goodness-of-fit as the P-values observed for the
Pearson 2 statistic (P = 0.56) and the Hosmer-Lemeshow test (P = 0.83) were not
significant. Three covariate patterns had showed high standardized residuals but the overall
conclusion did not change after removing these observations in a further model.
The serum concentration showed no effect on the odds of having an IMI in the first
month of lactation. However, the odds of having an IMI shortly after calving was
numerically higher in cows with high serum concentration one wk before calving
compared to cows with lower levels (P = 0.20; Table 4). For example, for a change from
34
0.5 mmol/L to 1.2 mmol/L in the serum concentration before calving, the log odds of
having an IMI in the first month of lactation changes by: (1.2-0.5)*1.26=0.88 units.
Alternatively, a change of 0.7 mmol/L in the concentration before calving increases the
odds of IMI by: (3.53)(1.2-0.5)
=2.41. Cows with a change of such magnitude in their
concentration before calving are 2.41 times likely to have an IMI in the first 30 DIM.
Table 4. Association between independent variables and the probability of having an
intramammary infection (IMI) in the first month of lactation in dairy cows. Results are
presented as coefficients (Coeff.) and its confidence interval (CI) after fitting a logistic
reduced model.
Variable Coeff. CI 95% P-value
Herd: < 0.01
1 Reference
2 -1.37 -3.17; 0.42
3 2.77 1.04; 4.50
4 0.45 -0.93; 1.83
5 1.21 -0.28; 2.70
Parity: < 0.01
Primiparous Reference
2 1.50 0.06; 2.93
3 1.44 -0.19; 3.07
3+ 2.29 1.03; 3.54
-hydroxybutyrate:
Prepartum 1.26 -0.66; 3.19 0.20
Milk yield -0.14 -0.23; -0.05 < 0.01
Constant .2687655 -2.09; 2.63 0.82
Nevertheless, the odds of having subclinical ketosis in cows of our study was lower
compared to the results reported in European studies (Suthar et al. 2013; Berge and
Vertenten 2014). The analysis of clinical mastitis records in 10 different European
countries did not find any evidence to support the association of subclinical ketosis with
clinical mastitis cases occurred within 30 DIM (Suthar et al. 2013). North American studies
35
also failed to demonstrate the association between these variables (Duffield et al. 2009).
Although cows experience an immunosuppression during the transition period increasing
the susceptibility to mastitis (Drackley 1999; Suriyasathaporn et al. 2000), the lack of
association between subclinical ketosis and the odds of having an IMI after calving in our
study is indicating that mastitis is a disease highly influenced by the effect of environmental
and sanitary conditions (Barkema et al. 1999; Barnouin et al. 2005; Green et al. 2007).
Herd-specific information on management and hygiene was not collected, and it was
beyond of the scope of our study.
On the other hand, the lack of the association can be partially explained by the
power of the study. Although the expected incidence risk of subclinical ketosis around
calving was set at 30% to calculate the sample size, our data did not reflect such incidence
risk. Consequently, the frequency of exposure (i.e. cows with serum concentrations ≥ 1.2
mmol/L) was not sufficient to detect a significant association with the outcome of interest,
having an IMI within 28 DIM.
The average milk yield within 28 DIM was significantly associated with the odds of
having an IMI in early lactation (P < 0.01, Table 4). Cow-level predictors are important to
explain individual cow performance, thus the effect of milk yield was considered as a
potential factor to increase the susceptibility to mastitis within the first month of lactation.
Nevertheless, a lower odds of having an IMI in cows producing more milk was not
expected (Table 4). By contrast, high-producing cows are more likely to develop IMIs, and
milk losses are associated with the type of pathogen causing the infection (Schukken et al.
2011). A former study indicated that cows were able to cope with high levels of milk
production, without consequences for host resistance as measured by the severity of
experimental E. coli mastitis (Kornalijnslijper et al. 2003). Regarding to risk factors
36
associated to IMIs around calving, increasing evidence indicates that lowering milk yield
before drying-off resulted in reduced risk of clinical mastitis in the first 30 DIM (Dingwell
et al. 2004; Madouasse et al. 2012). However, contradictory results have been reported
(Green et al. 2007). In our study, milk yield was not evaluated after 30 DIM but it would be
of interest to conduct studies in multiple herds to assess the effect of milk yield on the risk
of having IMIs shortly after calving.
Conclusions
A high prevalence of subclinical mastitis at drying-off and a high odds of having an IMI in
the first four wk postpartum was found, where Staph. aureus, Staph. spp (CNS) and Strep.
uberis were highly prevalent species. Although a significant association with serum
concentration before calving was not found, cows with high serum concentrations had a
high odds of developing an IMI in the first month of lactation. Herd- and cow-level factors
not analyzed in this study might be related to the susceptibility to mastitis shortly after
calving. The effect of overall management of the herd and hygiene might have a higher
effect on the odds of having an IMI; therefore, more studies are necessary to assess the
effect of subclinical ketosis on mastitis after controlling for the effect of those herd-level
variables.
Acknowledgements
The authors would like to thank to the Office of the Vice-president of Research and
Postgraduate Studies of Universidad de Caldas for funding this project, to all herd owners
and employees for their willingness to collaborate with our study. Finally but not least, we
thank to the members of the research group on milk quality of Universidad de Caldas.
37
References
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40
CAPÍTULO IV
THE ASSOCIATION BEETWEEN SUBCLINICAL MASTITIS AND CALVING-
TO-FIRST-SERVICE AND CALVING-TO-CONCEPTION INTERVALS IN DAIRY
COWS1
N.A. Villa-Arcilaa,*
, J. Sánchezb, M.H. Ratto
c, J.C. Rodriguez-Lecompte
d, P.C. Duque-
Madrida, S. Sánchez-Arias
a,A. Ceballos-Marquez
a
aDept. of Agric. Sciences, Univ. de Caldas. Manizales, Colombia;
b,dDept. of Health Mgmt.
and Dept. of Path. Microbiol, Univ. of Prince Edward Island, Charlottetown, PEI, Canada;
cSchool of Vet. Med., Ross Univ., Saint Kitts, West Indies.
* Corresponding author: P. +57 (6) 8781500 ext 15661; F. +57 (6) 8781500 ext 15661
E-mail address: [email protected] (N. A. Villa-Arcila)
Preventive Veterinary Medicine
1 Project 0182912 funded by Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados of Universidad de Caldas.
41
Abstract
The objective of this study was to evaluate the effect of subclinical intramammary
infections (IMI) on calving-to-first-service interval (CFS), calving-to-conception interval
(CC), and the number of services per conception (S/C) in grazing Holstein and Normande
cows. Primiparous (n = 43) and multiparous (n = 165) cows were selected from five dairy
herds. Two composite milk samples were aseptically collected from each cow at drying-off,
and then every week during the first postpartum month. One sample was used for somatic
cell count (SCC), and the other one for bacteriological analysis. Cows were followed up to
300 d after calving. Non-parametric and parametric survival models, and negative binomial
regression were used to assess the association between IMIs and reproductive indices.
Staphylococcus spp. (CNS), Staph. aureus and Streptococcus uberis were the most frequent
isolated pathogens. The SCC was higher at drying-off compared to the average in the first
month postpartum. Subclinical mastitis in the first month of lactation was associated with a
longer CC interval than that in healthy cows, and a higher number of S/C.
Keywords: Intramammary infection, reproductive index, calving-to-conception interval,
survival analysis
42
1. Introduction
Bovine mastitis is a costly disease that affects the profitability of the milk industry
due to high discarded milk, early culling of cows, and treatments. The cost of the udder
health program has been estimated in one third of the total money invested for preventing
diseases in dairy herds (Fourichon et al., 2001; Bar et al., 2008). The reproductive
performance of the herd has also an impact on the economic results of the dairy business, as
low reproductive efficiency may cause a decrease in milk production, and in the number of
calves born per year (Maizon et al., 2004).
Fertility in dairy herds has declined in the past five decades while milk yield has
increased (Walsh et al., 2011). Nevertheless, how much variation in cow fertility is
explained by high milk yield remains unclear, as fertility is affected by many other factors
not only milk yield (e.g. heat detection, nutrition, environment, stress, and cow’s genetics
and health status (Dohoo et al., 2001; LeBlanc, 2010). In recent years, studies on the
physiology of reproduction have looked for different explanations on how physiological,
immunological and pathological processes have an impact on fertility in different species
(Pate et al., 2010; Bromfield and Sheldon, 2011). For example, in cows with intramammary
infections (IMI) there is an activation of inflammatory and immune responses out to the
reproductive organs that can lead to embryonic death. This occurs by means of activating
several pathways that disrupt the hypothalamic-pituitary-gonadal axis at several sites
(Hansen et al., 2004).
Recent studies found that cows with subclinical or clinical IMI had a significant
decrease in their first service conception rate (Fuenzalida et al., 2015). Likewise, cows with
clinical IMI have a higher number of services per conception (S/C), and longer interval
from calving-to-first-service (CFS) or calving-to-conception (CC) than that of healthy
cows. It has been reported that the number of S/C was higher in cows with clinical cases
after their first service than in cows with clinical mastitis before the first service (Gunay
and Gunay, 2008).
43
Dairy cows under grazing conditions suffering a subclinical IMI needed more
services than their healthy counterparts cows without IMI (Gómez-Cifuentes et al., 2014).
Meta-analytic studies suggested that reproductive pathologies occurring around calving,
such as retained placenta and ovarian cysts, might negatively affect the reproductive
performance (i.e. increasing of intervals from calving-to-first-service; CFS, and CC);
however, mastitis did not show a significant effect on the reproductive performance
(Fourichon et al., 2000). The effect of mastitis, subclinical and clinical on reproductive
performance is due to an increased production of interleukins and inflammatory mediators,
consequently there is a higher production of prostaglandins and cortisol. These compounds
might have a negative effect on the development and quality of oocytes and corpus luteum,
affecting the length of the estrous cycle in cows (Risco et al., 1999; Schurick et al., 2001).
In Colombia, results from several studies suggested that mastitis-causing pathogens
belong to Gram positives (Ramírez et al., 2014; Reyes et al., 2015), while in other countries
where dairy cows are confined, Gram negative microorganisms are more prevalent (Zadoks
et al., 2011). Although the most prevalent type of mastitis-causing pathogens in Colombian
dairy herds has been described, there are no studies conducted to evaluate what is the effect
of these infections on the reproductive performance of the cows. Therefore, the main
objective of this study was to test the hypothesis that subclinical IMIs occurring in the first
postpartum month, affect negatively the intervals from CFS and CC, and the number of
services per conception in dairy cows maintained on grazing conditions. Therefore, the
effect of IMIs defined according to somatic cell count (SCC) and milk culture on CFS and
CC intervals, and on the number of S/C in Holstein and Normande cows under grazing
conditions were investigated.
2. Materials and Methods
A prospective longitudinal study was designed, and conducted between August
2013 and September 2014. Five dairy herds located in Manizales and Villamaria, Colombia
were enrolled. Herds were selected due to the willingness of the owner to participate in the
study, and according to the following criteria: to have permanent veterinary advisory
service, records from each cow of the herd, and a health management plan.
44
Cows (n = 208) were selected by convenience according to their probably calving
date, without clinical cases of mastitis at drying-off, and having no blind quarters. Cows
were assigned to one of two groups according to their breed: Holstein, n = 151 or
Normande, n = 57. A total of 165 cows were multiparous and 43 were primiparous. The
general characteristics of the herds were described elsewhere (Villa et al., 2016).
Sampling
Two samples of composite milk from the four quarters were aseptically collected
one week prior to drying-off, for SCC and microbiological analysis, respectively. Then
every cow received an intramammary antibiotic dry cow therapy. Once again, two samples
of milk were collected from each cow approximately three d after calving, and then once a
week until the first postpartum month. Samples were cooled, and submitted for SCC and,
depending on the SCC result, the second sample was used for microbiological analysis. The
SCC cut-off point for deciding the need of bacteriological diagnose was established at
100,000 and 200,000 cells/mL for primiparous and multiparous cows, respectively
(Ceballos et al., 2011). SCC was performed using a Fossomatic electronic somatic cell
counter (Foss Electric Hillerød, Denmark). The SCC was transformed to its natural log
(LnSCC, in thousands/mL) to normalize the distribution (Ali and Shook, 1980).
Bacteriological analysis were performed according to protocols established by the
National Mastitis Council (Hogan et al., 1999). Milk samples were cultured with a sterile
cotton swab on blood agar enriched with esculin at 0.1%. Morphology and Gram staining
were used for initial identification. The catalase test was used to differentiate staphylococci
from streptococci. Coagulase test was performed on catalase positive cocci to confirm
Staphylococcus aureus. Gram positive and catalase negative cocci were differentiated by
their reaction to the hydrolysis of esculin under ultraviolet light. Christie, Atkins, Munch-
Petersen test and esculin reaction were used to differentiate Streptococcus agalactiae and
Strep. dysgalactiae, and esculin reaction and culture in enterococcosel agar were used for
the identification Strep. uberis. Corynebacterium spp. was identified by their morphology
and Gram stain. Gram negative bacteria were identified by their morphology and growth in
45
MacConkey agar. Biochemical tests, such as citrate, indole, motility and oxidase, were used
to differentiate Gram negative bacteria.
Definition of intramammary infection
A cow was considered having a subclinical IMI at drying-off when SCC was greater
than 200,000 cells/mL, and at least one colony of a mastitis-causing pathogen was isolated.
This criterion was not applied to the primiparous cows, as milk samples in this group of
cows were only collected after calving. An IMI was declared at the beginning of lactation
when the mean SCC for the four weeks after calving was greater than 100,000 or 200,000
cells/mL in primiparous and multiparous cows, respectively, and at least one colony of any
mammary pathogen was isolated in two out of three consecutive samples (between weeks 1
and 3 or between weeks 2 and 4). Milk samples containing more than two bacterial species
were considered contaminated and not informative of IMI.
Reproductive parameters
Cows were followed up for 300 d after calving to record their reproductive
performances. The interval from CFS was defined as the number of days between calving
and the first insemination date. The first service in each herd did occur after the voluntary
waiting period, which was 40 d after calving. The interval from CC was defined as the
number of days between calving and the conception date. The number of S/C was defined
as the number of services required to effect a pregnancy.
Artificial insemination was used in all herds. Experienced veterinarians made the
diagnosis of gestation approximately 45 d after the last service. In one of the dairies (n = 80
cows), the diagnosis was made by transrectal ultrasound (Tringa Linear, Vet Pie Medical,
Maastricht, The Netherlands). Once the cows were confirmed as pregnant, they were not
reconfirmed later. Additionally, body condition was evaluated from 1 to 5 (Schröder and
Staufenbiel, 2006).
Statistical analysis
46
All data were initially introduced in an Excel spreadsheet (Microsoft Corp.,
Redmond, WA), and then exported to Stata version 14.0 (StataCorp, College Station, TX,
USA). Stata commands ‘stset’, ‘stsplit’ and ‘streg’ were used for the analysis.
Interval from calving-to-first-service and calving-to-conception
As mentioned above, cows were followed up for 300 d, cows that failed after this
period were considered censored. Given the type of variables and events recorded in this
study, the associations between IMI and the intervals from CFS and CC were analyzed by
survival analysis. Non-parametric and parametric survival models were explored (Dohoo et
al., 2009). Briefly, preliminary evaluations were made using Kaplan-Meier survival graphs
according to the absence or presence of IMI. Any eventual differences between the survival
functions in cows with no IMIs and those having an IMI were analyzed by the Log-rank,
Wilcoxon, and Tarone-Ware tests (Dohoo et al., 2009). Significance level was set at P
<0.05.
The effect of IMIs at the beginning of lactation on the intervals to CFS and to CC
was analyzed using parametric survival models. These models assume a specific form of
hazard across time. For example, the exponential model assumes a constant hazard, while
in the Weibull model hazard is monotonic (i.e. may increase or decrease over time) (Dohoo
et al., 2009). The data obtained in this study were assessed using both survival parametric
models. The model that fitted better the data was selected by its lowest Akaike’s
information criterion. The coefficients of the model were presented in the metric form of
hazard. This means that each unit change in the predictor represents a unit of change on the
frequency of the outcome, which in this case was measured as a hazard, assuming a linear
relationship between the regressors and the hazard (Dohoo et al., 2009). In general the
model can be described as a semi-parametric model following the equation:
h(t) = h0(t)*e’X
[1]
where h0(t) corresponds to the baseline hazard, dependent on time and is assumed to have a
specific functional form. e’X
corresponds to a non-negative specific function of the subject
47
of the X covariate, not time t dependent and scales the baseline hazard, which is common to
all individuals enrolled in the study (Dohoo et al., 2009).
An evaluation of the effect of the independent variables: IMI at drying-off and IMI
around calving (negative, positive), herd (categorized 1 to 5), breed (Holstein, Normande),
number of lactations (categorized into 1, 2 and 3 or more lactations), average milk
production in the first month of lactation, and days (time; d) to the occurrence of the event
on a continuous scale were included in the model. An evaluation of the interaction between
IMI and time was also carried out. The model fit was assessed by calculating the Cox-Snell
residuals and deviance, where the latter are also useful for the identification of unusual
values (outliers) having a high influence on the model. Once the influential points were
identified, they were removed and sensitivity analyzes were made to evaluate their effect on
the final estimates (Dohoo et al., 2009). The estimates of the final model were presented.
Services per conception (S/C)
To fit a model of the effect of IMIs around calving on the S/C, only the information
of pregnant cows was included. The dependent variable S/C was analyzed using a negative
binomial model, being necessary to subtract one from each value of S/C for fitting the
model. The effect of the independent variables described above was also included in the
model. The general model was as follows:
Log(S/C) = 0 + 1x1 + 2x2 + . . . + nxn [2]
Where the number of S/C is expressed on log scale; 0 corresponds to the intercept,
and n corresponds to the coefficient of the effect when the independent variable xn was
present. Obtaining Anscombe residuals and Cook’s distance was used to assess the fit of
the model and detect influential points. Analyzes were Performed in Stata version 14.0
(StataCorp, College Station, TX, USA) using the 'nbreg' command. The significance level
was set at P <0.05.
3. Results
48
The average number of cows per herd was 41.6 with an average milk yield of 27.8 ±
0.8 L/d in Holsteins and 21.9 ± 2.0 L/d in Normande cows (P = 0.03), after controlling for
the effect of herd. The average time between drying-off and calving was 71 ± 18 d.
Intramammary infections
Eighty-eight cows out of 165 were classified as IMI positive at drying-off.
However, 12 cows had a low SCC, and their milk culture was positive, while 42 cows
showed a high SCC with negative culture results. The most frequent mammary pathogens
isolated were Staph. spp. (CNS), Staph. aureus, and Strep. uberis. Twenty-two percent of
the cows remained chronically infected after calving.
There was a higher SCC mean at drying-off in all herds of the study than that of the
the mean observed in the first month of lactation (Fig. 2; P <0.01). On average, cows at
drying-off had 0.43 ± 0.09 (LnSCC, thousands/mL) more SCC compared to the average
around calving (P <0.01). No differences were found in the average SCC according to
breed (P = 0.20).
Figure 2. Average natural log of somatic cell count (SCC Ln miles/mL) in cows without
and with subclinical intramammary infections (IMI) at drying-off, and the average during
the first four weeks after calving in Holstein and Normande cows. Averages are at P < 0.01.
Intervals from calving-to-first-service and calving-to-conception
0
1
2
3
4
5
6
7
SCC dry off SCC 1st month
LnS
CC
(th
ousn
ads/
mL
)
a
b
a
49
The Kaplan-Meier survival function for cows without IMI and IMI positive is
showed in Fig. 3. These functions were compared using different tests that did not yield
significant differences for the interval from CFS (Fig. 3a; P > 0.05), while for the interval
from CC the three tests (i.e. Log-rank, Wilcoxon, and Tarone-Ware) indicated that cows
with IMI appeared to have a lower risk of conception during the follow-up period (Fig. 3b;
P < 0.05).
a b
Figure 3. Kaplan-Meier survival function curves for cows without (-) and with (- -)
intramammary infection (IMI) in the first four weeks postpartum and their effect on FSCI
(a) and CCI (b). The survival function for FSCI does not present significant differences
according to the IMI (P> 0.05), while for CCI there are significant differences depending
on the infection status of the mammary gland (P <0.05). The follow-up period began at the
end of the voluntary waiting period (40 days postpartum).
In both parametric models, exponential and Weibull, the effect of some of the
independent variables, such as breed, parity, average milk yield, and the interaction
between IMI around calving and time, did not significantly affect the interval from CC (P >
0.10). Subsequently, the simple effect of IMIs and time was evaluated (Table 5). While
both models showed a significant effect of IMI in the first month after calving on the risk of
conception in the follow-up, the Weibull model had a lower AIC compared to the
exponential model (Table 5). At any time after calving, cows with IMI had 0.67 [=exp(-
0403)] times lower risk of conception compared with negative cows.
50
The predicted median for failure time was approximately 71 d for cows with no
IMI, while for positive IMI cows was 95 d (Fig. 4). The shape parameter (p) in the Weibull
model was greater than 1.0 (Table 5), indicating that the risk of conception in both groups
of cows was not constant and increased with time after calving (Fig. 5).
Table 5. Effect of intramammary infections (IMI) in the first month of lactation on the
interval from calving-to-conception (CC) in grazing Holstein and Normande cows. The
coefficient represents the effect of IMI on the interval (log scale) after controlling for herd
effects. The results correspond to parametric survival models with exponential and Weibull
distributions.
Days after calving Coefficient IC (95%) Value of P AIC
Exponential distribution: 514.39
Cows with IMI -0.411 -0.751; -0.071 0.02
Time 0.005 0.002; 0.007 < 0.01
Herd: < 0.01
1 0
2 -1.213 -1.755; -0.670 < 0.01
3 -0.746 -1.400; -0.091 0.03
4 -0.366 -0.855; 0.123 0.14
5 0.134 -0.453; 0.721 0.66
Constant -4.166 -4.610; -3.721 < 0.01
Weibulla distribution: 501.33
Cows with IMI -0.403 -0.741; -0.065 0.02
Herd: < 0.01
1 0
2 -1.248 -1.784; -0.712 < 0.01
3 -0.772 -1.426; -0.118 0.02
4 -0.356 -0.844; 0.132 0.15
5 0.162 -0.424; 0.749 0.57
Constant -6.645 -6.469; -4.821 < 0.01
Shape parameter 1.387 1.236; 1.556 aIn this Weibull distribution time effect was not significant (P = 0.20).
51
Figure 4. Predicted survival time for the interval from calving-to-conception (CC) in cows
without (-) and with (- -) intramammary infection (IMI) in the first four weeks after calving.
The prediction is subsequent to a parametric model with Weibull distribution. The follow-
up period started once the voluntary waiting period was over (i.e. 40 d after calving).
Figure 5. Representation of the shape parameter (p) obtained in Weibull distribution model
for the risk of conception in cows without (-) and with (- -) intramammary infection (IMI)
in the first four weeks after calving. The p parameter was greater than 1.0, indicating that
52
the risk was not constant and was increased with time. The follow-up period started once
the voluntary waiting period was over (i.e. 40 d after calving).
Two cows were identified with deviance residuals greater than 3.0. These cows did
not show an IMI around calving and were pregnant during the first week of the follow-up
period. On the other hand, there was a cow with a deviance residual less than 3, this cow
did not show an IMI around calving and was not pregnant after 300 d. The latter cow was
considered censored. The Weibull model was fitted again after removing the influential
cows, there were no substantial changes either in the magnitude or direction of the
coefficients.
Services per conception (S/C)
The overall mean for the number of S/C in pregnant cows was 2.1 ± 1.5. Cows with
no IMI had, on average, 1.9 ± 1.3 S/C, while positive cows had 2.5 ± 1.8 S/C. The negative
binomial model showed a tendency for higher S/C in cows positive to IMI around calving
after controlling for the effect of herd (Table 5; P = 0.11). Other independent variables such
as breed, parity, and average milk yield in the first month of lactation were not significant.
These variables were further removed from the final model. Three cows were highly
influential on the model. Those cows were not having an IMI and had, on average, five S/C.
The subsequent sensitivity analysis showed a significant effect of IMIs around calving on
the number of S/C, as infected cows required more services per conception compared to
negative cows (Table 5). The number of S/C increased by 1.83 [=exp(0.605)] in cows with
an IMI in the first month of lactation.
53
Table 5. Effect of intramammary infections (IMI) in the first month after calving on the
number of services per conception (S/C) in Holstein and Normande cows. The results of
negative binomial regression models are presented, including all pregnant cows in the study
(Initial model), and after removing three cows highly influential in the model (Final
model).
Number of S/C Coefficient IC (95%) Value of P
Initial model:
Cows with IMI 0.364 -0.084; 0.811 0.11
Herd: < 0.01
1 0
2 0.329 -0.480; 1.138 0.43
3 0.859 0.014; 1.704 0.05
4 0.621 -0.100; 1.340 0.09
5 -0.329 -1.285; 0.627 0.50
Constant -0.721 -1.389; -0.053 0.03
Final model:
Cows with IMI 0.605 0.172; 1.037 < 0.01
Herd: < 0.01
1 0
2 0.705 -0.183; 1.593 0.12
3 0.989 0.058; 1.920 0.04
4 1.051 0.232; 1.870 0.01
5 -0.332 -1.434; 0.770 0.55
Constant -1.202 -1.990; -0.417 < 0.01
54
4. Discussion
The most frequent isolated bacteria in this study were Staph. aureus, Staph. spp.
(CNS) and Strep. agalactiae, These results coincide with other studies conducted in grazing
dairy systems (Compton et al., 2007; Pinedo et al., 2012). The frequency of Staph. aureus
isolations was higher than that observed by Dufour et al. (2012), who found a quarter-level
prevalence up to 18.3%, and an increase in the likelihood of being Staph. aureus positive
when the cow was infected with CNS.
Somatic cell count at drying-off was high, which may be due to an effect of dilution
at the end of lactation (Green et al., 2006). Similarly, an increase in SCC in the first week
after calving might be related to a dilution effect, once milk yield increases the SCC
decreases in cows with no IMIs (Dohoo, 1993; Barkema et al., 1999). Regarding to the
association between low SCC (i.e. <200,000 cells/mL) after calving and reproductive
performance, cows having low SCC around calving are 2.5 times more likely to become
pregnant (Gómez-Cifuentes et al., 2014). Our results were consistent with some other
studies. Thus, IMIs around calving are associated with longer intervals from CFS and from
CC, and also with a higher number of S/C (Maizon et al., 2004). Studies conducted in dual
purpose cows in Venezuela and Argentina, have indicated that clinical or subclinical IMIs
were associated with an increase interval from CFS and CC, and higher S/C (Nava et al.,
2010; Gómez-Cifuentes et al., 2014).
Indices of reproductive performance can be related among them; however, under the
conditions of this study, subclinical IMIs did not appear to affect the resumption of ovarian
function after calving but did affect the hazard of conception. Non-detected embryonic
deaths or factors related to the blood progesterone concentration at the time of first service
or due to the presence of chemical mediators that would affect the viability of the embryo
might explain the effect of IMIs on the reproductive performance of the cow, in particular
on the interval from CC.
Proinflammatory cytokines might trigger febrile reactions that which induce
changes in the pattern of hormone secretion, characterized by inhibiting the gonadotropin
55
release necessary for steroidogenesis (Huszenicza et al., 2004; Pate et al., 2010). As a
consequence, inflammatory states around calving, not necessarily caused by infections,
would have a negative effect on reproduction (Bertoni et al., 2008). Although the immune
response to an infection will not trigger necessarily a severe response that affects
substantially the reproductive performance, an IMI around calving might affect the
reproductive performance of the cow. Moreover, the severity of the effect on reproduction
will depend on the response degree to inflammation (Fuenzalida et al., 2015).
The herd effect cannot be ignored; we found a significant effect of this variable on
the reproductive indices (Tables 1 and 2). Herd-level factors that were not evaluated in our
study, such as nutrition and methods used for heat detection can affect the intervals from
CFS and from CC. However, cow-level factors, such as time of calving, milk yield,
metabolic diseases occurring around calving, and the interval between calving regarding to
the previous lactation might also have an impact on the intervals from CFS and from CC
(Dohoo et al., 2001). Among the cow-level factors, breed and potential milk yield were the
most important factors that may affect the interval from CFS, which is an indication that
genetics influences the reproductive performance (Dohoo et al., 2001). Same authors
concluded that the reproductive performance of individual cows affect the overall
performance of the herd. Nevertheless, we did not find evidence to support that cow-level
variables, such as breed, average milk yield around calving or parity, affected the overall
reproductive indices of the herds in this study.
Mastitis is associated with anovulatory estrus, failures in fertilization and embryonic
death, which causes an increase in the interval from CC and in the number of S/C
(Huszenicza et al., 2005; Hansen et al., 2004). A study about the effect of IMIs caused by
Strep. uberis on the expression of estrous after synchronization, indicated that 33% of the
cows showed estrous, while a high percent of the cows did not. Those cows not showing
estrous had lower levels of estrogens, and less frequency of LH pulses (Hockett et al.,
2005). Other studies have also indicated that cows with IMI showed lower estrogen levels
when they are in estrous, which would favor a delay in ovulation (Lavon et al., 2010). This
might affect the intervals we studied, since delayed estrous detection increases the time that
56
cow needs to get a new conception after calving.
The effect of mastitis-causing pathogens on reproductive performance may be
explained by the effect of mediators of inflammation released during the infections, such as
lipopolysaccharides (LPS) and lipoteichoic acid (LTA), and their effects on the pituitary
and gonadal hormones (Hertl et al., 2010). Gram negative bacteria would have a greater
impact on reproductive performance than Gram positive bacteria. This effect will be more
significant when IMIs occur close to the time of artificial insemination (Hertl et al., 2010;
Lavon et al., 2011). The net effect of Gram negative IMIs was a larger number of S/C in
positive cows, and their probability of conception was lower compared to negative cows
(Hertl et al., 2014). In Colombia the most frequent isolations are for Gram positives,
probably due to differences in dairy production systems. No matter the isolated pathogen,
proinflammatory cytokines such as TNFα, proinflammatory interleukins such as IL6, and
chemokines such as IL8 have receptors at the granulosa cells level that interfere with the
synthesis of estrogens in the dominant follicle and on recruited follicles (Sakumoto et al.,
2003; Herath et al., 2007; Bromfield and Sheldon, 2011). Since granulosa and theca cells
have TNFα receptors that modulate steroidogenesis and protein production from
gonadotropins, changes in ovarian physiology might be explaining the delays in the interval
from CC associated with IMIs (Sakumoto et al., 2003).
The LTA produced by Staph. aureus had a higher impact on reproductive
physiology compared to the LTA produced by streptococci. This effect was found in a
study where labor in mice was prematurely induced by LTA-producing bacteria, such as
Staph. aureus (Kajikawa et al., 1998). Although the objective of our study was not to
evaluate the specific effect of LTA on calving, it might be a cause of low reproductive
performance in cows infected with Staph. aureus, as this bacteria was highly prevalent in
our study. Also, endotoxins produced by other bacteria increase body temperature and
induce the release of prostaglandins and cortisol, which would have a negative effect on the
development and quality of the oocyte and the corpus luteum, besides causing a disruption
of the estrous cycle (Risco et al., 1999; Schurick et al., 2001; Hockett et al., 2005). This
would confirm the effect of IMIs on reproduction and would indicate that this effect is
57
mediated by multiple mechanisms, not only at the pituitary level but also at the gonadal
level.
Under the conditions of our study, the effect of clinical mastitis on reproduction was
not evaluated, as there were only 12 cases of clinical mastitis. A negative effect of clinical
mastitis on conception rates and pregnancy has been reported (Santos et al., 2004). This
effect has been observed when mastitis, no matter the causing pathogen, occurred between
the first service date and pregnancy confirmation. In addition, IMIs affect embryo
development (Hansen et al., 2004). Clinical IMIs induce embryonic death before the
gestation was confirmed, where this embryonic loss occurred due to the action of
proinflammatory cytokines (Chebel et al., 2004; Hansen et al., 2004). Therefore, cows with
IMI would need a larger number of S/C, which in turns increases the interval from CC.
5. Conclusion
Under the conditions of this study, the survival models used were suitable for
evaluating the effect of IMIs on the interval from CFS and from CC. The IMI occurred at
drying-off were highly prevalent in our study, keeping chronic at calving in one fourth of
the cows. Nevertheless, the number of chronic infections was not enough to stratify the
analysis by the duration of IMIs. However, the presence of IMIs in the first month after
calving was associated with longer intervals from CC; therefore, a cow will need a higher
number of S/C to become pregnant. Although cow-level factors did not affect the indices
studied, there was an effect of the overall herd management that should not be dismissed as
a potential explanation for the results. The reproductive performance is the result of the
impact of multiple factors, not explained only by mammary health.
Acknowledgements
Authors want to express their gratitude to the Office of the Vice-president of
Research and Postgraduate Studies for funding the study, to the owners and employees of
dairy herds enrolled in the study for their willingness to participate, and to all members of
the research group on milk quality and veterinary epidemiology of Universidad de Caldas
for their collaboration.
58
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61
CAPÍTULO V
Dinámica de las células somáticas en leche y sangre en vacas Holstein sin y con
infección intramamaria
N A Villa-Aa, J C Rodríquez-L
b, P C Duque-M
a, Aura M Valencia
a, J Valencia
a, D
Velásqueza, C Cobo
a, M H Ratto
c y A Ceballos-M
a
aGrupo de Investigación Biología de la Producción Pecuaria, Universidad de Caldas.
Manizales, Colombia. bDepartment of Pathology and Microbiology, Atlantic Veterinary College, University of
Prince Edward Island. Charlottetown, PEI, Canada. cSchool of Veterinary Medicine, Ross University. Saint Kitts, West Indies.
Archivos de Medicina Veterinaria
62
SUMMARY
Resumen
El objetivo de este estudio fue evaluar los cambios citológicos en leche mediante
microscopía en vacas Holstein con y sin infección intramamaria (IIM) en el primer mes
posparto y asociarlos con los cambios en el leucograma. Se seleccionaron 25 vacas
Holstein, dividas en dos grupos. El grupo 1 constaba de 13 vacas sin IIM y el grupo 2
conformado por 12 vacas con IIM subclínica que al parto estaban infectadas con patógenos
mamarios mayores. A partir del cuarto día posparto y semanalmente por cuatro semanas; a
cada vaca se le tomaran dos muestras compuestas de leche, para cultivo bacteriológico y
determinar el recuento de células somáticas (RCS) y el recuento diferencial de células
somáticas (RDCS). Así mismo, se tomo una muestra cada semana de sangre para realizar
hemoleucogramas completos para evaluar los posibles cambios hematológicos, haciendo
especial énfasis en el recuento absoluto y relativo de leucocitos (%). El análisis estadístico
se baso en estadística descriptiva y modelos mixtos. Las bacterias encontradas fueron Strep.
uberis, la más prevalente, seguida del Stap. aureus y S. agalactiae. En leche, el LnRCS
miles/mL en las vacas sin y con IIM fue de 3,6 ± 0,3 y 6,2 ± 0,3 respectivamente,
observándose diferencias significativas (P < 0,01). Al comparar las citologías en leche, los
PMN de las vacas con IIM fue la fracción celular predominante (P < 0,01) y los linfocitos
tuvieron una disminución significativa (P < 0,01). Al relacionar los leucocitos sanguíneos
con el LnRCS no se encontró asociación (P = 0,67). En los leucocitos sanguíneos en los dos
grupos de vacas la diferencia fue (P = 0,05). Los linfocitos sanguíneos no se asociaron con
los hallados en leche (P > 0,05). Las proteínas totales fueron más altas en las vaca con IIM
(P = 0,04), la albumina y el fibrinógeno no tuvieron cambios significativos entre los dos
63
grupos, mientras que las globulinas tuvieron una tendencia a estar aumentadas en las vacas
con IIM.
INTRODUCCIÓN
La producción de leche, la composición y la calidad de la misma son los factores
que afectan la rentabilidad de las explotaciones bovinas. Las infecciones intramamarias
(IIM) son a nivel mundial una enfermedad que genera un alto impacto económico y las
pérdidas económicas se originan en el control de la enfermedad y las pérdidas que de ella se
derivan (Seegers et al., 2003).
Cuando las bacterias superan las barreras anatómicas de la glándula mamaria (GM)
puede establecerse la IIM y es allí donde los leucocitos juegan un papel determinante en la
severidad y duración de la IIM (Kehrli and Shuster, 1994).
El recuento de células somáticas (RCS) en leche es un indicador del estado de
infección de la GM y es la respuesta inflamatoria de defensa natural ante la presencia de
agentes infecciosos, lo que determina un aumento en el flujo de células somáticas,
principalmente polimorfonucleares (PMN) de la sangre a la GM, que son los principales
efectores de la respuesta inmune innata rápida (Burvenich et al., 1994; Schukken et al.,
2003). El RCS no considera los cambios en la distribución de las células somáticas;
fluctuaciones en el RCS se han observado en estados donde no necesariamente la vaca tiene
IIM y su población y distribución depende del estado fisiológico de la GM (Dulin et al.,
1983; Boutinaud and Jammes, 2002). Varios estudios han determinado que el umbral para
64
determinar la presencia de IIM es de 200.000 células por mL (Dohoo and Leslie, 1991;
Schepers et al., 1997).
En la GM, el número y distribución de los leucocitos son fundamentales para la
defensa contra los patógenos, donde los leucocitos difieren en su distribución y juegan el
papel más importante en la inmunidad de la ubre (Leitner et al., 2003). En la GM sana, el
tipo de células somáticas predominantes son 35 – 79% de macrófagos, seguido por
linfocitos, 16 – 28%, neutrófilos 3 – 26% y células epiteliales entre un 2 y 15%; sin
embargo, bajo condiciones de IIM el número y tipo de células somáticas experimentan un
rápido cambio en el número y el tipo de células predominantes, alcanzando los neutrófilos
valores superiores al 80% (Burvenich et al., 1994; Kehrli and Shuster, 1994). En este
mismo sentido, parece que la proporción de los tipos de células, o subtipos, más que el
número total, es el factor que determina el resultado de la infección, que puede ser su
curación, una infección crónica o la muerte del animal (Fitzpatrick, 2001; Sordillo, 2005).
Durante la IIM los PMN, en particular los neutrófilos, migran desde el torrente
sanguíneo a la GM constituyéndose en la primera línea de defensa; son llevados al sitio de
infección por agentes quimio tácticos como son las interleuquinas (IL), factor de necrosis
tumoral (TNF)-α y leucotrinos B4 liberados por el endotelio y los macrófagos (Paape et al.,
2003; Sohn et al., 2007). Una vez los PMN se unen a las bacterias éstos producen
sustancias oxidantes como el peróxido de hidrogeno, superóxido de hidrogeno y el radical
hidroxilo que matan la bacteria (Paape et al., 2002; Blagitz et al., 2013).
65
Los animales que tienen una mejor respuesta inmune a nuevas IIM no solo reclutan
rápidamente y masivamente un número alto de PMN, sino que además, tienen altos niveles
sanguíneos de IgG2, además de una efectiva respuesta inflamatoria temprana (Burton and
Erskine, 2003).
Los macrófagos actúan como centinelas contra bacterias invasoras y en caso de
infección liberan quimioatrayentes que causan una rápida migración de los PMN al sitio de
infección (Burvenich et al., 2007). Los aspectos inmunológicos y la dinámica de los PMN
en la patogénesis de la mastitis ha sido descrita, existiendo una marcada supresión de los
PMN de la sangre alrededor del parto y durante la lactancia temprana tanto en vacas
primíparas como multíparas y en leche los PMN en son menores que los PMN en sangre
(Mehrzad et al., 2002; Schukken et al., 2011).
Varios son los métodos que se han desarrollado para determinar el recuento
diferencial de las células somáticas (RDCS) en leche. Métodos simples, donde previa
fijación de las células, el recuento diferencial se realiza mediante un microscopio, hasta
métodos computarizados como la citometría de flujo, método éste exacto pero costoso
(Pilla et al., 2012; Pilla et al., 2013). Se ha descrito que existe una alta correlación entre la
citometría y la microscopía para los PMN y linfocitos, pero una menor correlación para
macrófagos y células epiteliales (Leitner et al., 2000). No obstante, el recuento diferencial
de las células somáticas tanto en sangre y en leche de vacas libres de IIM y con IIM son
escasos.
66
La reacción inflamatoria en la GM de vacas con IIM subclínica determina cambios
locales en los componentes celulares, sin embargo, los cambios sistémicos en este tipo de
infecciones pocas manifestaciones clínicas tienen; por lo anterior, el objetivo de este
estudio fue describir las variaciones citológicos en leche y sangre de vacas Holstein sin y
con IIM durante el primer mes posparto.
MATERIAL Y MÉTODOS
Para el desarrollo de este estudio se seleccionaron 25 vacas Holstein entre el
segundo y el quinto parto, dividas en dos grupos. El Grupo 1 constaba de 13 vacas sin IIM
y el grupo 2 conformado por 12 vacas con IIM subclínica que al parto estaban infectadas
con patógenos mamarios mayores.
RECUENTO DIFERENCIAL DE CÉLULAS SOMÁTICA EN LECHE (RDCS)
Para conocer el estado de salud de la GM, a partir del cuarto día posparto y
semanalmente por cuatro semanas; a cada vaca y en el ordeño de la tarde se le tomaron dos
muestras compuestas de leche, una para cultivo bacteriológico y la otra para determinar el
RCS (Fossomatic®, Foss Electric, Hillerod, Dinamarca), y el recuento diferencial de
células somáticas (RDCS) que se realizó manualmente mediante tinción y observación
directa por microscopía óptica. Para el RDCS se realizó mediante la metodología descrita
por (Lindmark-Månsson et al., 2006; Pilla et al., 2012), donde 20 mL de leche fueron
mezclados con 20 mL de fosfato buffer salino (PBS) a un pH de 7,4. La mezcla fue
centrifugada a 3.500 g por 10 minutos a 4 ºC usando una centrifuga refrigerada (Compact
67
High Speed Refrigerated Centrifuge, modelo 6500, Kubota Corporation, Tokio, Japón).
Después de la centrifugación, el sobrenadante fue desechado y el pellet fue resuspendido en
1.6 mL de PBS y nuevamente centrifugado a 3.500 g por 10 minutos a 4 ºC. Nuevamente,
el sobrenadante fue desechado y el pellet fue resuspendido en 0.6 mL de caldo de soya
tripticasa (KeboLab AB, Spanga, Sweden). Posteriormente, para la diferenciación celular,
10 µL de la suspensión celular fueron colocados en un portaobjetos para microscopio y
coloreados con la solución de Wright, la coloración se dejó secar al aire y fue fijada con
metanol por 5 a 7 minutos y posteriormente las células fueron contadas mediante
microscopía óptica con objetivo 100x. De cada placa se contaron entre 100 y 200 células,
diferenciando linfocitos, macrófagos y PMN (Sarikaya et al. (2004). Las células epiteliales
no siempre se pueden distinguir de los macrófagos y por lo anterior se contaron como
macrófagos (Pilla et al., 2012). Los datos del RCS fueron expresados como logaritmo
natural del RCS (Ln RCS, miles/mL) (Ali and Shook, 1980), y los resultados del RDCS se
expresaron en porcentaje.
ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO
Los análisis bacteriológicos se realizaron de acuerdo a los protocolos establecidos
por el National Mastitis Council (Hogan et al., 1999). Las muestras de leche fueron
sembradas con un hisopo de algodón estéril y para el aislamiento primario se utilizo agar
sangre de cordero al 5% con esculina al 0,1%. La morfología y coloración de Gram fueron
usadas para una primera identificación. La prueba de catalaza se uso para diferenciar los
Staphylococcus de los Streptococcus. La prueba de coagulasa se realizo en los cocos
catalaza positivos para confirmar los Staphylococcus aureus. Los cocos Gram positivos y
68
catalasa negativos fueron diferenciados por su reacción a la hidrólisis de esculina bajo luz
ultravioleta. Se realizó prueba de CAMP y siembra en agar enteroccocel para diferenciar
Streptococcus agalactiae y Streptococcus uberis, respectivamente. Las bacterias del genero
Corynebacterium se identificaron por su morfología y coloración de Gram. Las bacterias
Gram negativas fueron identificadas por su morfología y crecimiento en agar McConckey y
su diferenciación se realizó usando pruebas bioquímicas como citrato, indol, motilidad y
oxidasa.
La IIM se estableció cuando, en al menos una de las cuatro muestras postparto, se
aisló un patógeno mayor causante de mastitis, independientemente del RCS (Compton et
al., 2007b). Las muestras donde se aislaron dos patógenos mamarios, se contaron como una
sola infección y la vaca se declaró positiva. Las muestras donde crecieron más de dos
bacterias, se consideraron contaminadas y no informativas de IIM.
HEMOLEUCOGRAMAS
Además, a cada vaca se le realizaron cuatro hemoleucogramas completos con
intervalo de una semana, para evaluar los posibles cambios hematológicos, haciendo
especial énfasis en el recuento absoluto y relativo de leucocitos (%). Los leucocitos
sanguíneos fueron expresados en logaritmo natural para favorecer la distribución normal de
los datos. Se hizo el recuento diferencial para linfocitos, neutrófilos y monocitos. Las
muestras de sangre se tomaron mediante venopunción coccígea utilizando tubos al vacío
con y sin anticoagulante (Vacutainer®, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, Estados
Unidos de América). Los hemoleucogramas se realizaron en un contador electrónico de
69
impedancia volumétrica (Celltac-α MEK 6450, Nihon Kodhen, Japón). Así mismo, se
determinó la concentración de proteínas totales, albúmina, globulinas y fibrinógeno.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El estudio fue de tipo observacional prospectivo, donde las vacas fueron agrupadas
según el estado de infección de la glándula mamaria (i.e. vacas sin IIM y vacas con IIM).
Todos los datos se introdujeron en una base de datos en Excel (Microsoft Corp., Redmond,
WA) y posteriormente fueron exportados al programa Stata 14.0 (StataCorp, College
Station, TX, USA) para su posterior análisis. Inicialmente, las variables fueron analizadas
mediante estadística descriptiva donde además se hizo una evaluación del tipo de
distribución de los datos, con el objeto de detectar eventuales distribuciones no normales.
Se evaluó el efecto de las variables independientes: IIM (negativa o positiva),
tiempo (semana después del parto), número de lactancias (dos, tres y más de tres) y
producción de leche en el inicio de la lactancia sobre las variables respuesta: recuento de
leucocitos, recuento de neutrófilos y linfocitos, relación neutrófilos:linfocitos (N:L),
relación albúmina:globulinas (A:G), relación fibrinógeno:proteínas totales (F:PT), RCS,
recuento relativo de neutrófilos y linfocitos en leche y su relación. Las variables
independientes fueron incluidas en un modelo multivariado que fue reducido mediante la
selección de variables paso atrás (backward selection) siempre que la significancia fuera P
≤ 0,10 (Dohoo et al., 2009). Posteriormente, las variables asociadas se incluyeron en un
modelo final de regresión lineal mixta multivariado para evaluar el efecto de ellas sobre la
70
respuesta. Se consideró la vaca como variable aleatoria para ajustar el modelo por las
medidas repetidas dentro de cada individuo. El modelo estadístico fue el siguiente:
yijk = 0 + 1infección(i) + 2semana(j) + (12)(i),j) + 3partos(k) + (13)(i)k) + ijk
Donde yijk = variable respuesta medida en escala continua, 0 = intercepto, 1=
efecto de la IIM en la iésima vaca, 2 = efecto de jésima semana de toma de la muestra,
(12)(i),j) = interacción la infeccción y la semana, 3 = efecto del késimo número de
parto en la iésima vaca, (13) (i),j) = interacción entre la infección y el número de partos,
ijk = error. Los análisis se realizaron en Stata 14.0 usando el comando ‘mixed’ y los
comandos para las estimaciones posteriores al ajuste del modelo.
RESULTADOS
En total se aislaron patógenos mamarios en 12 vacas, mientras que las 13 restantes
se consideraron no infectadas por patógenos causantes de mastitis. No se observaron
muestras contaminadas. Los patógenos aislados con mayor frecuencia fueron Strep. uberis
en ocho vacas, Staph. aureus en tres vacas y Strep. agalactiae se aisló en una vaca. En las
vacas consideradas positivas para IIM, solamente una vaca tenía dos partos, las vacas
restantes tenían más de dos partos.
CÉLULAS SOMÁTICAS EN LECHE
71
Las vacas sin IIM tuvieron un promedio ± EE para el LnRCS de 3,6 ± 0,3 (en
miles/mL), mientras que las vacas con IIM presentaron un promedio 6,2 ± 0,3 (P < 0,01).
Se observó una interacción significativa del LnRCS con el número de lactancias (P < 0,01;
Tabla 7).
Tabla 7. Promedio ajustado del LnRCS ± error estándar de acuerdo al número de partos en
vacas sin y con infección intramamaria (IIM) en vacas Holstein en las primeras cuatro
semanas posparto agrupadas según el número de lactancias.
Estado de infección
No
lactancias Sin IIM Con IIM
2 3,55 ± 0,76a,b
4,40 ± 1,08a,b
3 3,98 ± 0,54a,b
5,14 ± 0,54b
>3 3,41 ± 0,41a 7,24 ± 0,41
c
Letras diferentes indican P < 0,01
De otra parte, el LnRCS disminuyó durante el primer mes postparto (P < 0,01), no
observándose diferencias en la interacción entre el tiempo y la IIM (P = 0,38).
El recuento relativo (%) de PMN en la leche de las vacas con IIM fue 63,0 ± 3,5 y
en las vacas sin IIM 48,0 ± 3,4 (P < 0,01). Los neutrófilos en leche fueron la fracción
celular que tuvo el mayor aumento en las vacas con IIM (P < 0,01; Tabla 8), mientras que
los linfocitos disminuyeron significativamente en las vacas con IIM (P < 0,01; Tabla 8). No
hubo efecto de las interacciones del tiempo, número de lactancias y la producción de leche
con los neutrófilos y los linfocitos.
72
Tabla 8. Promedio ajustado para el porcentaje (± error estándar) de los neutrófilos,
linfocitos y la relación neutrófilos:linfocitos en leche de vacas Holstein sin y con infección
intramamaria (IIM).
Estado de infección
Sin IIM Con IIM
Neutrófilos 35,7 ± 3,9 a 50,2 ± 4,1
b
Linfocitos 49,6 ± 3,5a 36,0 ± 3,7
b
Relación N:L 1,2 ± 0,3 a 2,8 ± 0,3
b
Letras diferentes indican P < 0,01
Para la relación N:L se observó un aumento en las vacas con IIM en un efecto dependiente
del número de lactancias (P < 0,01; Tabla 9).
Al evaluar la interacción de la relación con N:L con el tiempo no se encontraron diferencias
(P = 0,59), así como tampoco hubo una asociación con la producción de leche (P = 0,26).
Tabla 9. Promedio de la relación neutrófilos:linfocitos en leche (± error estándar) en vacas
Holstein sin y con infección intramamaria (IIM) según el número de lactancias.
Estado de infección
No
lactancias Sin IIM Con IIM
2 0.67 ± 0,8a 12,3 ± 1,5
b
3 1,66 ± 0,5a 1,32 ± 0,6
a
>3 0,98 ± 0,4a 2,04 ± 0,4
a
Letras diferentes indican P < 0,01
73
Una vaca con dos partos e IIM causada por S. aureus, tuvo una alta influencia en el modelo
al evaluar la relación N:L, por lo tanto se realizó un análisis de sensibilidad en un modelo
sin incluir esta vaca. La interacción tiempo por IIM en este modelo no fue significativa (P =
0,76). Posteriormente, se analizó el mismo modelo eliminando la interacción con el número
de lactancias, dado que solamente una vaca con dos lactancias tenía una IIM,
encontrándose que el número de lactancias no tuvo un efecto significativo en la relación
N:L (P = 0,71). Si bien, hubo un aumento numérico en la relación N:L en las vacas con
IIM, la asociación no fue significativa (P = 0,15).
RECUENTO LEUCOCITARIO EN SANGRE
Las diferencias en el recuento de leucocitos entre los dos grupos de vacas fue de (P
= 0,05). Se observó una tendencia hacia el aumento del recuento dependiendo del tiempo (P
= 0,07), encontrándose un aumento de los leucocitos en las vacas con IIM en la primera
semana postparto (P < 0,01; Tabla 10).
Tabla 10. Promedio del recuento leucocitario en sangre (± error estándar) en vacas Holstein
sin y con infección intramamaria (IIM) según el número de lactancias.
Estado de infección
No
lactancias Sin IIM Con IIM
2 9,6 ± 0,1a 9,1 ±0,2
b,c
3 8,8 ± 0,08b 9,1 ± 0,08
c
>3 8,9 ± 0,04b 9,0 ± 0,05
b,c
Letras diferentes indican P < 0,01
74
Igualmente, se observó una interacción entre el recuento leucocitario con el número
de lactancias No se encontró asociación entre el recuento leucocitario en sangre y el LnRCS
(P = 0,67).
Los PMN (%) en las vacas sin IIM fueron 48,6 ± 10,8 y en las vacas con IIM 50,6 ±
14,7 (P = 0,60). El número de lactancias, la producción de leche y las interacciones entre el
recuento y el tiempo y el número de lactancias no tuvieron efecto significativo sobre los
PMN y los neutrófilos (Tabla 11). En el recuento diferencial, se observó una interacción
entre linfocitos e IIM (P = 0,05), no observándose relación con las demás variables
independientes. La relación sanguínea N:L fue 0,9 ± 0,1 y 1,2 ± 0,1 para las vacas sin y con
IIM, respectivamente (P = 0,35).
Tabla 11. Promedio (± error estándar) de neutrófilos, linfocitos y promedio para la relación
neutrófilos:linfocitos (N:L) en sangre de vacas Holstein sin y con infección intramamaria.
Variable Estado de infección
Sin IIM Con IIM
Neutrófilos (%) 42,4 ± 3,4a 44,7 ± 3,5
b
Linfocitos (%) 49,7 ± 3,6a 35,6 ± 3,7
b
Relación N:L 0,9 ± 0,1a 1,2 ± 0,1
a
Letras diferentes indican P < 0,01
Así mismo, no se encontró efecto de las variables tiempo, número de lactancias,
producción de leche y las interacciones entre estas variables y el estado de infección de la
glándula mamaria. Otra fracción celular analizada fueron los monocitos sanguíneos (%),
que en las vacas sin IIM fueron 0,5 ± 0,3 y en las vacas con IIM 0,3 ± 0,3 (P = 0,17).
75
Las proteínas totales (PT) en las vacas con IIM presentaron los valores más altos (P
= 0,04), no encontrándose asociación con las demás variables independientes, excepto con
el tiempo observándose un aumento durante el mes postparto (P < 0,01). Para la albúmina,
no hubo asociación con las IIM (P = 0,83), pero igualmente se encontró una asociación con
el tiempo (P < 0,01), la que presentó los mayores valores en la primera semana. Las
variables tiempo y producción de leche tuvieron efecto sobre las globulinas (P < 0,05) y
solamente se observó una tendencia a aumentar en las vacas con IIM (P = 0,06). El
fibrinógeno fue similar en las vacas sin y con IIM (P = 0,12; Tabla 12).
Tabla 12. Promedio ajustado ± error estándar de los constituyentes sanguíneos analizados
en vacas Holstein sin y con infección intramamaria.
Variable Estado de infección
Sin IIM Con IIM
Prot. Total g/L 74,7 ± 1,5a 79,1 ± 1,5
b
Albúmina g/L 26,2 ± 0,7a 27,9 ± 0,7
a
Globulinas g/L 47,8 ± 1,5a 51,9 ± 1,6
a
Fibrinógeno g/L 2,5 ± 0,3a 3,1 ± 0,3
a
Relación A:G 0,61 ± 0,03a 0,54 ± 0,03
a
Relación
PT:Fibrinógeno
26,7 ± 1,7a 27,1 ± 1,7
a
La relación albúmina:globulina en las vacas sanas fue 0,61 ± 0,03 y en las vacas con
IIM fue 0,54 ± 0,03 (P > 0,05) y el tiempo fue la única variable que tuvo efecto (P < 0,01).
Es de anotar que ambos valores son normales ya que este cociente debe fluctuar entre 0,5 y
1,0. También, se determinó la relación proteínas totales:fibrinógeno, donde valores menores
76
a 10 son indicadores de procesos inflamatorios y para este estudio fue de 26,7 ± 1,7 y 27,1
± 1,7 para las vacas sin y con IIM respectivamente (P > 0,05).
DISCUSIÓN
Se ha indicado que el S. uberis es la mayor causa de IIM subclínica posparto en los
hatos de leche en pastoreo (Compton et al., 2007b); lo que concuerda con lo registrado en
este estudio; mientras que los casos clínicos por esta bacteria constituyen una menor
proporción, son numerosas las cepas de esta bacteria que intervienen en los procesos
infecciosos y donde se han aislado en un mismo hato hasta 12 cepas de esta bacteria que
tienen diferentes características en la duración de los síntomas de la enfermedad y la gran
mayoría se establecen en el periodo seco (Zadoks et al., 2003).
Los mecanismos mediante los cuales esta bacteria se establece en la GM en el
periodo seco o durante la lactancia son desconocidos, pero se ha advertido que el Strep.
uberis aumenta en la época de invierno y en la superficie del suelo dos semanas después
que las vacas se alimentaban en potreros (Lopez-Benavides et al., 2007). Es de resaltar que
el S. uberis fue la bacteria más prevalente en este estudio desde la primera semana
posparto, y en las explotaciones donde se realizo este trabajo tienen practicas de secado con
antibiótico; lo que genera incógnitas acerca de que está sucediendo con esta bacteria o con
la terapia de secado, conociendo que las vacas permanecen en pastoreo todo el año.
Además se ha establecido que muchas IIM se establecen al inicio de la lactancia, lo que
está directamente relacionado con el estado de inmunosupresión que se observa en este
período (Suriyasathaporn et al., 2000).
77
En las IIM crónicas por S. aureus se ha señalado que tienen un efecto inmunosupresor por
su efecto citotóxico a nivel de linfocitos sanguíneos, reduciendo la proliferación de
linfocitos a nivel de leche (Nonnecke and Harp, 1988). Lo anterior concuerda con lo
observado en este estudio, donde una vaca con cultivo positivo a esta bacteria en las
diferentes semanas mantuvo un RCS bajo. El S. aureus puede invadir y sobrevivir
intracelularmente, lo que favorecería el desarrollo de una respuesta humoral que no sería
suficiente para eliminar las bacterias, lo que explicaría la persistencia de la infección
(Grönlund et al., 2006). Además, las infecciones crónicas están asociadas con variaciones
en la respuesta inmune debido a factores relacionados con la bacteria y con el huésped
(Grönlund et al., 2006).
El Strep agalactiae, patógeno obligado de la GM, tiene la habilidad de ser muy
contagioso a través de los procedimientos de ordeño y es la principal causa de mastitis
subclínica. En nuestro medio, se han encontrado prevalencias que fluctúan alrededor del
6,4% y el 6,8% (Calderón and Rodríguez, 2008; Trujillo et al., 2011). No obstante, en la
sabana de Bogotá se encontró una prevalencia del 44,9% en infecciones de corta duración y
estuvo asociada a fincas donde el ordeño era manual y en tanques de enfriamiento en varias
zonas del país, se han observado prevalencias que superan el 40% (Rodríguez, 2006; Keefe
et al., 2011). Es de resaltar que existen países como Nueva Zelanda donde han erradicado
este patógeno (Compton et al., 2007a).
CÉLULAS SOMÁTICAS EN LECHE
78
El número y actividad de los leucocitos en la GM desempeñan un papel
fundamental en la severidad y duración de las IIM subclínicas y el RCS es comúnmente
usado como un indicador de la salud de la GM. Sin embargo el RCS no considera los
cambio en la población de las células somáticas. Como se observó en este estudio, los
patógenos mayores indujeron un incremento superior a 2 unidades en el LnRCS comparado
con los patógenos menores que inducen aumentos menores a una unidad (Schepers et al.,
1997). Así mismo, un RCS superior a 200,000 células/mL es un indicador específico de
IIM, pero el no aislamiento de la bacteria de una vaca con alto RCS no indica que la GM
este sana (Dohoo and Leslie, 1991; Pantoja et al., 2009). Por lo tanto, las pruebas
microbiológicas y el RCS en leche son los métodos más sensibles para la medición de la
infección de la GM en bovinos (Sarikaya et al., 2006).
La respuesta inflamatoria de defensa natural ante la presencia de agentes infecciosos
a nivel de la GM determina un aumento en el flujo de células somáticas, principalmente
PMN, que son los principales efectores de la respuesta inmune innata rápida (Burvenich et
al., 1994; Schukken et al., 2003). Similar a lo registrado en este estudio, las vacas con IIM
tienen un incremento de los neutrófilos en leche como parte de la primera línea de defensa
y una disminución de los linfocitos (Rivas et al., 2001; Sarikaya et al., 2004).
La explicación del aumento de los neutrófilos en las vacas con IIM que no superó el
50,2 ± 4,1%, puede ser la cronicidad de la enfermedad, aunque no se tienen antecedentes de
la sanidad mamaria al secado en las vacas objeto de este estudio, se ha evidenciado una
disminución de los neutrófilos en vacas con IIM crónica comparado con vacas con IIM
aguda (Leitner et al., 2000; Paape et al., 2002).
79
Al correlacionar los leucocitos sanguíneos con el RCS en leche no se encontró
asociación. Lo anterior indicaría que a pesar de la IIM subclínica, caracterizada
generalmente por un aumento en el RCS en leche; los bovinos bajo condiciones de
infección, movilizan del compartimento marginal de los neutrófilos o linfocitos estas
células a la circulación general sin alterar el eritograma (Wittwer, 2012). Además, durante
el periparto hay una liberación de corticoides endógenos que inducen una leucocitosis
neutrofílica acompañada de linfopenia y eosinopenia (Wittwer, 2012). Lo anterior estaría
compensando la migración de las células somáticas que migran a la GM bajo condiciones
de IIM subclínica.
Existe una alta correlación del RDCS entre los métodos de citometría y microscopia
convencional para linfocitos y PMN y una menor correlación para monocitos y células
epiteliales (Leitner et al., 2000; Rivas et al., 2001). En este sentido, se ha establecido que
las células epiteliales no afectan los resultados por errores de clasificación cuando se utiliza
la microscopía, debido a que se encuentran en un porcentaje que no supera el 5%
(Boutinaud and Jammes, 2002; Pilla et al., 2012). Los monocitos en leche en este estudio
no superaron el 0,5 ± 0,3%, sin embargo, se ha encontrado que los macrófagos
determinados mediante citología en vacas sanas son significativamente más altos que los
determinados por citometría (Rivas et al., 2001).
En este estudio se encontró que los linfocitos a nivel de GM son las células
preponderantes en vacas sin IIM y los PMN son las células dominantes en vacas con IIM,
lo que estaría de acuerdo con varios autores (Rivas et al., 2001; Dosogne et al., 2003). Se ha
80
señalado que los PMN en leche de vacas con IIM superan el 80% (Burvenich et al., 1994),
sin embargo, existen antecedentes donde se ha encontrado que este aumento es poco
dramático como se observó en este estudio (Rivas et al., 2001). Además, se describe que los
PMN disminuyen concomitante con un aumento de los linfocitos dos semanas post
infección, disminuyendo la relación N:L (Rivas et al., 2001). La dinámica de los PMN en
leche de vacas infectadas con S. aureus en algunos casos no aumentan drásticamente y se
mantienen en valores inferiores al 47% (Leitner et al., 2003), lo anterior explicaría la alta
influencia que tuvo una vaca con IIM por S. aureus en la relación N:L.
La proporción de células mononucleares en muestras de leche varían entre vacas
infectadas con S. aureus. Sin embargo, el número absoluto es mayor por el aumento
absoluto en el RCS (Leitner et al., 2003). La ausencia o poco número de monocitos,
basófilos y eosinófilos en leche indicarían que estas células no tienen ninguna significancia
en los procesos inflamatorios de la GM. Además, los monocitos en la lactancia temprana
son cerca de la mitad de los observados en la lactancia intermedia o tardía (Dosogne et al.,
2003).
RECUENTO LEUCOCITARIO EN SANGRE
Los neutrófilos y linfocitos fueron las fracciones celulares más abundantes en
sangre, tanto en vacas sin y con IIM, además, su relación debe ser menor a uno en esta
especie como se observó en las vacas sin IIM (Mehrzad et al., 2002; Wittwer, 2012),
aunque se halló un aumento no significativo de la relación en las vacas con IIM. La
composición y la capacidad funcional de los leucocitos sanguíneos en vacas de leche se
81
modifican sustancialmente durante el periparto y estos cambios están asociados a una
mayor susceptibilidad de la GM a las infecciones, donde hay una menor respuesta de las
células mononucleares, principalmente linfocitos a los agentes patógenos y esta alteración
estaría asociada a cambios hormonales y metabólicos que se suceden durante el periparto
(Nonnecke et al., 2003). Los linfocitos inducen la respuesta inmune de la GM y en su
mayoría mediada por linfocitos T, encargados de eliminar células dañadas o viejas y
disminuyen la susceptibilidad de la GM a las infecciones (Sordillo et al., 1997).
Durante el periparto, la función y el número de neutrófilos está alterada o afectada
por los glucocorticoides, estos tienen un efecto inhibidor en la migración de los PMN por
una disminución en la expresión del receptor de adhesión de los neutrófilos llamado
CD62L (selectina L) que es necesaria para la penetración dentro del endotelio en los sitios
de infección (Weber et al., 2004). Sin embargo, una mayor cantidad de neutrófilos se han
encontrado en vacas primíparas inmediatamente después del parto, lo que podría estar
relacionado con una mejor respuesta inmune cuando se compara con vacas multíparas
(Mehrzad et al., 2002).
Aunque no se observo una reducción en el número de leucocitos sanguíneos, se ha
observado que esto sucede en el periparto, debido posiblemente a una pérdida de la
funcionalidad de estas células por la alta demanda metabólica asociada a la producción de
leche (Nonnecke et al., 2003; Hammon et al., 2006). Se debe resaltar que en el modelo final
los leucocitos en las vacas con IIM presentaron una interacción con el número de
lactancias.
82
Así mismo, se ha demostrado que el 17β estradiol también tiene efecto sobre los
PMN durante el periparto, inhibiendo la diapédesis de estas células al sitio de infección, lo
que explicaría porque la mayoría de infecciones se establecen al inicio de la lactancia, por
el efecto inmunosupresor de esta hormona y que se encuentra en altas concentraciones
alrededor del parto (Lamote et al., 2004). Con respecto a la progesterona, altos niveles de
ésta tienen un efecto negativo sobre los PMN generando una desviación a la izquierda y
favoreciendo la aparición de PMN inmaduros (Moreira da Silva et al., 1998).
Las PT y las albuminas estuvieron dentro de los valores normales, aunque se ha
descrito que durante el periparto puede haber un aumento en la producción de PT, como
sucedió en este estudio en las vacas con IIM, debido a que las infecciones inducen un
aumento de proteínas de fase aguda y de globulinas (Wittwer, 2012). Aunque no se
encontró en este trabajo, lo contrario sucede con la albumina, donde la síntesis se puede
comprometer como consecuencia del estrés hepático asociado a la movilización grasa que
se sucede en este periodo principalmente en vacas sobreacondicionadas (Bertoni et al.,
2008; Wittwer, 2012).
Al determinar la concentración de globulinas, evaluadas en procesos de
inmunodeficiencia o como respuesta a procesos infecciosos, se encontró que ambos grupos
presentaron valores por encima de los valores de referencia (Wittwer, 2012). Lo anterior
estaría de acuerdo con lo observado por Nonnecke et al. (2003) quienes indican que durante
el preparto y al parto las IgG sanguíneas disminuyen por una distribución mayor a la GM,
pero en el posparto las vacas aumentan la concentración de IgG séricas. También se ha
señalado que durante el periparto las IgG séricas disminuyen y esta reducción es debida a la
83
alta demanda de IgG por parte de la GM y esta disminución de IgG está correlacionado con
una disminución de los linfocitos (Herr et al., 2011). De otra parte, se ha encontrado una
alta correlación entre la concentración de IgG2 sérica e IIM clínicas en vacas, pero dicha
correlación no se observó para IgG1, IgM e IgA (Mallard et al., 1983).
El fibrinógeno, proteína sintetizada en el hígado, estuvo dentro de los rangos de
referencia en ambos grupos (Wittwer, 2012); aunque hubo una tendencia a estar aumentada
en las vacas con IIM, es importante resaltar que esta proteína de la inflamación es poco
específica y una activación del sistema inmune en el periodo de transición de la vaca es
normal debido a que está expuesta a varias condiciones que la estimulan, como son, el
aumento de los corticoides, el edema de la ubre, los traumas propios del parto y la
involución uterina.
CONCLUSIÓN
La determinación del RDCS en leche mediante microscopía convencional es una
herramienta útil para la identificación de células inflamatorias en procesos infecciosos.
Bajo las condiciones de este trabajo se observó que las bacterias prevalentes fueron S.
uberis, S. aureus y S. agalactiae y estos patógenos indujeron un aumento significativo en el
LnRCS en leche, si bien no se encontró una relación entre los leucocitos sanguíneos y los
hallados en leche, lo que indicaría que bajo condiciones de IIM subclínica la respuesta
sistémica es independiente de la respuesta local a nivel de la GM. Se observó un aumento
significativo de los neutrófilos en leche en las vacas con IIM acompañado de una
disminución de los linfocitos. En las variables del hemoleucograma, las PT, la albúmina y
el fibrinógeno estuvieron dentro de valores normales para la especie y las Ig se encontraron
84
altas en las vacas sin y con IIM. Lo que confirmaría la falta de respuesta sistémica en las
vacas durante el puerperio y con IIM subclínica. De acuerdo a lo observado en este trabajo,
es necesario realizar estudios que permitan evaluar la dinámica de las células somáticas
tanto en leche y sangre con variables independientes como el tiempo, número de lactancias,
producción de leche y sus interacciones.
AGRADECIMIENTOS
A la Vicerrectoría de Investigaciones y Posgrados de la Universidad de Caldas por
el apoyo económico para desarrollar este estudio. Como también a las empresas ganaderas
que facilitaron los animales y al grupo de calidad de leche y epidemiología veterinaria de la
Universidad de Caldas.
85
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89
CAPÍTULO VI
DISCUSIÓN GENERAL
Cetosis
En este estudio se presentó una prevalencia de cetosis subclínica del 12%, basados en el
umbral de 1,2 mmol/L, que correspondió a 25 vacas de las 208 objeto del estudio. Esta
prevalencia es baja si se compara con lo observado en vacas bajo condiciones subtropicales
donde se reportan prevalencias superiores tanto en Norteamérica como Europa (McArt et
al., 2012; Berge and Vertenten, 2014). Sin embargo, prevalencias similares a las de este
estudio también se han observado en países europeos como Alemania y Turquía (Suthar et
al., 2013; Mahrt et al., 2015).
Una razón para esta baja prevalencia de cetosis puede tener un origen en la menor
producción de leche bajo las condiciones nuestras, en comparación a las registrada en hatos
de otras latitudes, lo que determina unos menores requerimientos para producción, a pesar
de que la producción promedio de leche ha aumentado en los últimos veinte años y estaría
favoreciendo una mayor prevalencia de la cetosis (Berge and Vertenten, 2014). En este
mismo sentido, se ha observado que el tipo de alimentación o los suplementos
suministrados en el periparto tiene efecto en la presentación de la enfermedad, donde vacas
alimentadas con ración total mezclada tienen menos probabilidad de desarrollar la
enfermedad en comparación a las alimentadas con ración parcialmente mezclada (Berge
and Vertenten, 2014). En este mismo sentido, un factor que favorecería la baja prevalencia
de la enfermedad es la suplementación con concentrados en el preparto y el pastoreo en
praderas fertilizadas más la suplementación ajustada a la producción de leche que se
realizaba en las cinco fincas objeto del trabajo.
La baja prevalencia de cetosis en nuestro medio, con respecto a otros países y el hecho de la
presentación subclínica de la cetosis, ha determinado que los profesionales y ganaderos le
resten importancia a la enfermedad. Pero, por los antecedentes de literatura, Berge and
Vertenten (2014) indican la asociación entre cetosis y otras enfermedades como
desplazamiento de abomaso, problemas gastrointestinales, cojeras, metritis y mastitis. Lo
90
anterior motivaría en futuros estudios cuantificar el impacto económico de la cetosis y
medir el grado de asociación con otras patologías propias del periparto en nuestro medio.
Infección intramamaria
Se observó una alta prevalencia de mastitis subclínica al secado y un alto riesgo de
incidencia en las primeras cuatro semanas postparto y un 5,8% de IIM clínicas. Las
bacterias Staph. aureus, Staph. spp (CNS) y Strep. uberis fueron las más prevalentes. El
valor promedio más alto para el RCS se observó al momento del secado (6,26 ± 1,37 en Ln,
miles/mL) con una diferencia con el promedio del RCS en las cuatro primeras semanas
postparto de 0,49 ± 0,13.
El número de animales que se curaron durante el secado fueron 77, con un riesgo de
curación con la terapia de secado del 61%, un 26% de infecciones nuevas y una prevalencia
del 22% de vacas crónicas que permanecieron con IIM entre el secado y la primera muestra
posparto. El ideal de vacas que deben curarse con la terapia de secado es del 80% y el
número de infecciones nuevas no debe superar el 10% (Schukken et al., 2003). Lo anterior
indica que bajo las condiciones nuestras se debe colocar especial énfasis en la terapia de
secado y determinar los factores que pudiesen estar determinando esta alta prevalencia. Se
ha señalado como causas que pudiesen afectar la terapia de secado, factores inherentes al
hato y a la vaca como son: la duración de periodo seco, la nutrición, la edad de la vaca, la
producción de leche, el tipo de bacterias al secado entre otros (Dingwell et al., 2003).
La alta prevalencia de infecciones nuevas son compatibles con problemas en los
procedimientos y rutina de ordeño, higiene de la ubre y problemas ambientales
principalmente (Schukken et al., 2003). Por lo anterior, en nuestra zona de influencia es
fundamental establecer programas de educación a los ganaderos y operarios con el fin de
disminuir estas prevalencias y afectar positivamente los costos de producción de la leche.
Cetosis y su relación con IIM
No se encontró una asociación entre cetosis subclínica y las IIM. Sin embargo, hubo una
tendencia a una mayor probabilidad de IIM en las vacas con cetosis subclínica una semana
91
antes del parto. Lo que indica posiblemente una falta de poder estadístico asociado a un
bajo número de vacas con cetosis subclínica e IIM y se demuestra que la mastitis subclínica
es un problema multifactorial relacionado a las condiciones propias de cada finca.
Varios estudios sostienen que la cetosis no está asociada a las IIM, a pesar de la
inmunosupresión en el periparto que favorecería la presentación de mastitis (Duffield et al.,
2009; Suthar et al., 2013). Mientras que otros indican que la cetosis tiene un efecto sobre
las IIM. En un meta-análisis reciente se hallo un OR de 1,64 ± 0,2 para IIM clínica en vacas
con cetosis subclínica (Raboisson et al., 2014). Y desde el punto de vista inmunológico,
vacas con altas concentraciones de BHB y sometidas a infusiones de lipopolisacaridos en la
GM, disminuyeron la migración de leucocitos del torrente sanguíneo a la GM y se
explicaría por alteración en la síntesis de citoquinas, las cuales son fundamentales para la
migración de los polimorfonucleares (Zarrin et al., 2014).
Las condiciones de manejo sanitario y nutricional propias de cada finca estarían
influenciando los resultados más que la variable en estudio. Nuestros resultados permiten
concluir que se requieren más estudios que involucren un mayor número de vacas para
establecer la significancia de esta asociación. Igualmente, la asociación entre la producción
de leche y una menor probabilidad de IIM en el inicio de la lactancia requiere más estudios
para confirmar este resultado.
IIM y reproducción
La presencia de IIM en el primer mes postparto estuvo asociado con un IPC más largo y las
vacas infectadas requirieron también un mayor número de S/C. Los modelos de
supervivencia utilizados fueron adecuados para evaluar el efecto de las IIMs sobre el
tiempo a la ocurrencia del evento y el riesgo de ocurrencia del mismo. Aunque las variables
raza, número de lactancias y la producción de leche no afectaron los índices estudiados,
hubo un efecto de la finca, lo que indica que el manejo general de los hatos es una
explicación a los resultados obtenidos, lo que también indica que la reproducción es la
consecuencia del efecto de múltiples factores y no explicada solamente por la sanidad
mamaria.
92
Varios son los estudios donde se ha señalado el efecto que tienen las enfermedades del
periparto entre ellas las IIM sobre los índices reproductivos (Maizon et al., 2004) En la
fisiopatología para explicar la asociación IIM y reproducción, se ha encontrado que las
vacas con IIM tienen cambios hormonales caracterizados principalmente por un aumento
de corticoides, disminución de hormonas hipofisiarias y alteración de hormonas ováricas
que inducen alteraciones reproductiva (Hockett et al., 2000; Lavon et al., 2010).
En Colombia, la producción de leche se basa en pastoreo lo que favorece una baja
prevalencia de patógenos Gram negativos y una mayor prevalencia de Gram positivos. Se
ha señalado que independiente del tipo de patógeno causante de IIM, las mastitis clínicas o
subclínicas afectan lo indicies reproductivos, donde los lipopolisacaridos y el ácido
lipoteicoico inducen la producción de citoquinas proinflamatorias que favorecen la
migración de leucocitos a la GM (Santos et al., 2004; Hertl et al., 2010). Estas citoquinas
producidas en la GM o en cualquier otro sitio provocan la liberación de prostaglandinas e
inducen aumentos de temperatura que afectarían el desarrollo del cuerpo lúteo o el
desarrollo embrionario (Hansen et al., 2004). De lo anterior explicaría como una IIM afecta
los índices reproductivos.
Por lo anterior, aunque las IIMs y los problemas reproductivos tienen un componente
multifactorial, es importante prevenir las enfermedades del periparto y en especial las IIMs
con el fin de no afectar los índices reproductivos. Se concluye que tanto las IIM como la
reproducción en el bovino están íntimamente unidas y son un importante componente de la
rentabilidad del hato, donde las IIM y una baja fertilidad aumentan los costos de
producción y disminuye la producción de leche y el número de terneros nacidos por año
afectando la taza de reemplazo en el hato.
Recuento diferencial de células somáticas en leche y hemoleucogramas
El S. uberis fue la mayor causa de IIM subclínica posparto en los hatos del estudio, lo que
concuerda con lo observado por Compton et al. (2007a) en vacas en pastoreo. El promedio
± EE para el LnRCS en las vacas con IIM fue 6,2 ± 0,3 (en miles/mL), mientras que en las
93
vacas sin IIM fue 3,6 ± 0,3. Coincidiendo con que los patógenos mayores inducen un
incremento superior a 2 unidades en el LnRCS comparado con los patógenos menores que
inducen aumentos menores a una unidad (Schepers et al., 1997).
La determinación del RDCS en leche mediante microscopía convencional es una
herramienta útil para la identificación de células inflamatorias en procesos infecciosos y los
neutrófilos en leche de las vacas con IIM tuvieron un aumento significativo en comparación
con lo observado en leche de vacas sanas, lo contrario sucedió con los linfocitos que fueron
menores en leche de vacas con IIM, lo anterior se ajusta a lo observado por Pilla et al.
(2012). El aumento de los neutrófilos no supero el 50,2%, contrario a lo observado por
otros autores (Burvenich et al., 1994). Lo anterior se explicaría, posiblemente, por la
cronicidad de la IIM, que favorecen una menor migración de los neutrófilos en
comparación con infecciones agudas (Leitner et al., 2003).
Los leucocitos sanguíneos con el RCS en leche no se correlacionaron, lo que indica que la
respuesta inmunológica a nivel de la GM es independiente de la respuesta sistémica.
Existen diferencias importantes desde el punto de vista inmunológico a las infecciones por
Gram negativos y Gram positivos a nivel de la GM; las infecciones causadas por E. coli
generan una respuesta inmunológica dramática y más rápida, mientras que las causadas por
S. uberis, el más prevalente en este estudio, promueve una respuesta memos dramática y
más lenta y las moléculas secretadas por esta bacteria inhiben la función bactericida de los
neutrófilos (Field et al., 2003; Rambeaud et al., 2003; Bannerman, 2009). Mientras que el
S. aureus tiene la particularidad de ser inmunosupresor generando una baja respuesta
inmunológica y causando infecciones persistentes (Bannerman, 2009).
Por lo anterior, y aunque son muchos los adelantos científicos acerca de la inmunopatología
de la GM y las diferencias en la respuesta inmune que producen los patógenos en la GM es
importante seguir comprendiendo la patogénesis de las IIM para buscar modificar la
respuesta inmune y mejorar la resistencia a la mastitis (Schukken et al., 2011).
De otra parte, las variables del hemoleucograma, las PT, la albúmina y el fibrinógeno
94
estuvieron dentro de valores normales para la especie y las Ig se encontraron altas en las
vacas sin y con IIM. Lo que confirmaría la falta de respuesta sistémica en las vacas durante
el puerperio y con IIM subclínica.
Finalmente, este estudio provee información que permitió determinar que la cetosis
subclínica es una patología que está presente en los hatos de leche de nuestra región y es
preciso investigar la asociación de esta patología con otras enfermedades propias del
periparto como desplazamiento de abomaso, metritis, cojeras entre otras.
Se encontró en la zona de influencia del estudio que las IIM tienen impacto en la
reproducción, por lo tanto, los profesionales del sector y los productores deben establecer
programas de sanidad mamaria a nivel del hato lechero con el fin de mejorar los índices
reproductivos.
Con respecto a RDCS mediante microscopía óptica es una técnica promisoria para estudiar
la salud de la GM desde el punto de vista inmunológico. No se encontró relación entre los
leucocitos sanguíneos con los existentes en leche en vacas con infección intramamaria
corroboran que la respuesta inmune en la GM es independiente de la respuesta sistémica.
Por lo tanto, se debe seguir estudiando la respuesta leucocitaria que genera cada patógeno
causante de IIM subclínica y conociendo el patrón inmunológico se podrá establecer
estrategias de tratamiento, control y prevención.
95
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97
Lista de anexos
Anexos
Anexo 1.
98
Anexo 2.
ASSOCIATION BETWEEN UDDER HEALTH AND REPRODUCTIVE PERFORMANCE IN HOLSTEIN
AND NORMANDE COWS, IN CALDAS, COLOMBIA*
NéstorA.Villa1,PauloC.Duque1,Sebas ánSánchez1,LauraM.Lasso1,JuanVelasco-Bolaños1,JuanC.Rodriguez-Lecompte2,andAlejandroCeballos-Marquez1
1AgriculturalProduc onDepartment,UniversidaddeCaldas.Manizales,Caldas,Colombia2DepartmentofPathologyandMicrobiology,UniversityofPrinceEdwardIsland.Charlo etown,Canada
*FoundedbytheOfficeofResearchandGraduateStudiesofUniversidaddeCaldas
I NTRODUCTI ON
MATERI ALS AND METHODS
RESULTS AND DI SCUSSI ON The reproductive failures associated with mastitis in dairy cows have became important in the last
decade (Lavon et al., 2011). There is a negative association between clinical and subclinical
mastitis and the reproductive performance in the beginning of the lactation in high yielding cows
(Schrick et al., 2001). Therefore, the aim of this study was to determine the association between
the infection status of the udder during the first month of lactation and the calving to first service
interval (CFSI) and the calving to conception interval (CCI) in Holstein and Normande cows from
dairy herds in Caldas, Colombia.
• The breeding time started at 35 days after calving with an overall mean of
84±36 days.
• The CCI was on average 117±61 days. The longest follow-up period for a
cow was 336 days with 172 failures (pregnancies) in total (84.3%). The
median survival time from calving to first service fell in the range between 63
and 84 days, while the range to get a pregnancy was between 105 and 126
days.
• The survival curves for pregnant and non-pregnant cows are showed in Fig.
1a and 1b. There were no differences according to infection status in the
CFSI (P = 0.62), while cows with an IMI took longer to become pregnant (P =
0.02). In Chile, Pinedo et al (2009) reported a significant impact on the
reproductive performance when cows had a high SCC. Some other studies
revealed a negative association between clinical mastitis, caused by any
mastitis-causing pathogen, and the reproductive performance in dairy cows
(Santos et al 2004).
• Under the conditions of this study, data showed evidence indicating that cows
with no IMIs around calving had a higher hazard of conception compared to
those cows with an IMI.
Fig1a.Kaplan-Meiersurvivalcurvestoes matethedaysfromcalvingtofirstserviceforcowswithout(0)andwith
(1)anintramammaryinfec on
REFERENCES
0.0
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0
0 50 100 150 200 250analysis time
infeccion = 0 infeccion = 1
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infeccion = 0 infeccion = 1
Fig1b.Kaplan-Meiersurvivalcurvestoes matethedaysfromcalvingtofirstserviceintervalforcowswithout(0)
andwith(1)anintramammaryinfec on
• The observational study was carried out in five dairy herds from Caldas, Colombia. Including
208 cows, of them 165 were multiparous cows, and 43 were heifers.
• Two milk samples were collected weekly, starting in the first week after calving until four weeks
after in order to establish the udder health status. One sample was used to determine the
somatic cell count (SCC), and the other for microbiological analysis (Ceballos et al., 2011).
• An intramammary infection (IMI) was declared when the arithmetic mean of the SCC for those
four weeks after calving was higher than the criteria, and at least one of the cultures was
positive for a mastitis causing pathogen (Dohoo et al., 2011).
• The association between an IMI and the reproductive parameters was evaluated by graphical
methods using Kaplan-Meier survival graphs. Survival graphs were compared using a
Wilcoxon test. Cox models were used to evaluate the effect of IMI on the reproductive indices.
Main effects of breed and parity were also evaluated after controlling for the effect of herd
(Dohoo et al., 2009).
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