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GUÍA DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

SMEC-PR-GVM CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y

CONTAMINANTES 2018.07 Ver. 00

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CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA

DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINANTES

“GUÍA DE VALIDACIÓN

DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS”




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DIRECTORIO

MVZ Enrique Sánchez Cruz

Director en Jefe del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria

MVZ Hugo Fragoso Sánchez

Director General de Inocuidad Agroalimentaria, Acuícola y Pesquera

QA Mayrén Cristina Zamora Nava

Directora del Centro Nacional de Referencia de Plaguicidas y Contaminantes

MVZ Linda Coatlicue García López

Subdirectora de Monitoreo y Vigilancia de Contaminantes y Residuos Tóxicos.

LAE Daniel González Ávila

Subdirector de Monitoreo y Evaluación de Calidad

QA Víctor Manuel López Herrera

Jefe de Departamento del LDDOP

Biol. Said Efren Nuñez Armenta

Coordinador de Validación de Métodos del LDDOP




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CONTENIDO

1 PROPÓSITO. .................................................................................................................................................................. 4

2 ALCANCE. ................................................................................................................................................................. 4

3 REFERENCIAS ......................................................................................................................................................... 4

4 DEFINICIONES ......................................................................................................................................................... 4

5 DESARROLLO .......................................................................................................................................................... 5

5.1 Criterios de Validación y Verificación de Métodos ............................................................................................. 5

5.1.1 Evaluación del desempeño de métodos: .............................................................................................. 5

5.2 Consideraciones previas .................................................................................................................................... 8

5.2.1 Selección de la matriz .............................................................................................................................. 8

5.2.2 Pruebas preliminares ............................................................................................................................... 8

5.3 Selección del método ......................................................................................................................................... 8

5.3.1 Método Normalizado ................................................................................................................................ 9

5.3.2 Método No Normalizado .......................................................................................................................... 9

5.4 Establecimiento del Protocolo de Validación ó Verificación de Métodos ........................................................ 10

5.5 Diseño experimental ........................................................................................................................................ 10

5.5.1 Preparación del inoculo ........................................................................................................................ 10

5.5.2 Preparación de la muestra .................................................................................................................... 11

5.5.3 Inoculación de muestras ....................................................................................................................... 12

5.5.4 Tabla de contingencias ......................................................................................................................... 12

5.6 Informe de Validación / Verificación de Métodos ............................................................................................. 12

6 ANEXOS .................................................................................................................................................................. 13

6.1 Categorías de matrices .................................................................................................................................... 13

6.2 Etapas y parámetros de validación .................................................................................................................. 14




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1 PROPÓSITO.

Establecer los lineamientos y criterios para la evaluación del desempeño de métodos aplicados para el análisis de

microorganismos patógenos, aportando evidencia objetiva que permita establecer la veracidad de los resultados

particulares para su uso.

2 ALCANCE.

El presente documento es aplicable a aquellos laboratorios interesados en coadyuvar con la Dirección General de

Inocuidad Agroalimentaria, Acuícola y Pesquera del SENASICA, mediante la obtención del reconocimiento de

competencia técnica para la detección de organismos patógenos en productos vegetales , superficies de contacto

(vivas e inertes) y agua de uso agrícola.

3 REFERENCIAS

NMX-EC-17025-IMNC-2006 “Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de

calibración”.

CRITERIOS DE APLICACIÓN DE LA NORMA NMX-EC-17025-IMNC-2006 / ISO/IEC 17025:2005 de la

Entidad Mexicana de Acreditación (ema®)

UNE-EN ISO 16140 Microbiología de los alimentos para consume humano y animal – Protocolo de

Validación de métodos alternativos.(ISO 16140:2016).

4 DEFINICIONES

Analito: Componente medido por el método de análisis. En el caso de métodos microbiológicos esto es el

microorganismo sus componentes o productos asociados (enzimas o toxinas).

Cepas de referencia: Son cultivos conservados y distribuidos por Colecciones de Cultivo, cuyos microorganismos

se encuentran definidos como mínimo a nivel de género y especie. Los laboratorios microbiológicos deben utilizar

estas como el control de sus técnicas.

Matriz.-Es el tipo de muestra (vegetal, agua, esponja, etc.) que puede o no contener al analito de interés.

Método Normalizado.-Aquellos publicados como Normas Oficiales Mexicanas (NOM), Normas Mexicanas (NMX)

ó los emitidos por organizaciones de normalización, extranjeras, regionales e internacionales; todas reconocidas,

tales como FDA (Food And Drug Administration), USDA (United States Department of Agriculture), ISO

(International Organization for Standardization), etc.

Método no Normalizado.- Los métodos, propios o desarrollados por el laboratorio, los métodos obtenidos de

publicaciones científicas, así como los métodos normalizados modificados, ampliados o usados fuera de su alcance

propuesto

Método alternativo.-Método de análisis que determina o estima, para una categoría de productos determinada, el

mismo analito que el método normalilzado correspondiente; el cual ha sido validado por comparación con el método

Normalizado (método confirmatorio).




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Método confirmatorio.- Método que se emplea para confirmar los resultados positivos de los métodos alternativos,

obteniendo un microorganismo aislado.

Muestra: cantidad representativa de un total que posee todas las características físicas, fisicoquímicas y

microbiológicas del producto que se toma para someterla a estudio, análisis o experimentación.

Organismo Diana (Blanco).-Organismo definido según el alcance del método, que debe ser detectado o

enumerado.

Organismo No Diana (No blanco).-Organismo definido según el alcance del método, que no debe ser detectado

o enumerado.

Validación del método.- Confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los

requisitos para una utilización o aplicación específica prevista para métodos No normalizados.

Verificación del método.- Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han cumplido los

requisitos especificados para métodos Normalizados.

5 DESARROLLO

5.1 Criterios de Validación y Verificación de Métodos

5.1.1 Evaluación del desempeño de métodos:

Proceso que se realizara en el laboratorio para demostrar que un método produce consistentemente resultados

confiables en las condiciones particulares del laboratorio evaluando los siguientes aspectos divididos en las etapas 1,

2, 3 y 4 (Ver Anexo 6.2).

5.1.1.1 Límite de detección

Demostrar la concentración más baja en la que el método es capaz de recuperar al microorganismo de las muestras

inoculadas con un nivel bajo de inoculo (menor a 5 UFC´s).

LD= VP x 100

Ni

Dónde:

VP= Resultados Positivos de muestras con inoculación baja

Ni = Muestras inoculadas (menos a 5 UFC´s)

Criterio de aceptación: Mayor o igual 80%.

5.1.1.2 Repetibilidad (R)

Grado de concordancia entre resultados sucesivos e independientes obtenidos por el mismo método empleando un

material idéntico bajo las mismas condiciones (aparatos, operadores, laboratorio e intervalos de tiempos cortos, es

decir condiciones de repetibilidad)




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R= N x 100

VP

Criterio de aceptación: Mayor o igual a 90%.

5.1.1.3 Reproducibilidad

Grado de concordancia entre resultados de análisis individuales en materia de análisis idéntico empleando el mismo

método y obtenido por operadores en diferentes laboratorios empleando equipos diferentes (es decir unas

condiciones de reproducibilidad)

El análisis es realizado por al menos dos personas y se evalúan los criterios de Eficacia Relativa, Especificidad

Relativa y Sensibilidad Relativa de forma independiente.

Criterio de aceptación: Mayor o igual al 95% de eficacia relativa por cada analista

5.1.1.4 Eficacia Relativa (ER)

Grado de correspondencia entre la respuesta obtenida por el método con las muestras inoculadas y las que no

están inoculadas

ER= VP+VN x 100

N

Criterio de aceptación: Mayor igual a 95%

5.1.1.5 Especificidad Relativa (ES) (Exclusividad)

Capacidad del método para distinguir al microorganismo diana, de otros organismos similares, pero

genéticamente distintos o no diana,

ES = VN x 100

Ns

Criterio de aceptación: Mayor igual al 95%

5.1.1.6 Sensibilidad Relativa (SR) (Inclusividad)

Capacidad del método para detectar el microorganismo diana cuando se encuentra presente, en una amplia gama

de microorganismos no diana. Por ejemplo: clasificación taxonómica, composición inmunológica, genética, etc.

SR = VP x100

Ni

Criterio de aceptación: Mayor igual al 95%

5.1.1.7 Robustez

La robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analítico de no ser afectado por variaciones

deliberadas de los parámetros del método; proporciona una indicación de la fiabilidad del procedimiento en un uso




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normal. En este sentido el objetivo de la prueba de robustez es optimizar el método analítico desarrollado o

implementado por el laboratorio, y describir bajo qué condiciones analíticas (incluidas sus tolerancias), se pueden

obtener resultados confiables.

Un método de ensayo es más robusto entre menos se vean afectados sus resultados frente a una modificación de

las condiciones analíticas.

Entre las condiciones analíticas que podrían afectar a un método se encuentran:

· Analistas

· Equipos

· Reactivos

· pH

· Temperatura

· Tiempo de reacción

· Matriz

· Entre otros; dependiendo las variaciones que considere pertinentes el laboratorio.

Para realizar en análisis de robustez se aplica el test de Youden y Steiner aplicado de la siguiente forma:

Prueba de Robustez de Younden y Steiner

Letra Descripción Valor

Nominal

Valor Alto Valor

Bajo

A/a Condición 1 X A a

B/b Condición 2 Y B b

… … … … …

Se deben establecer las comparaciones posibles, es decir las diferencias entre la variable de alto valor contra la de

valor bajo; esta prueba nos permite evaluar de 4 a 7 condiciones:

(A – a), (B – b), (C – c), (D – d), (E – e), (F – f) y (G – g)

Condición 1 2 3 4 5 6 7 8

A/a A A A A a a a a

B/b B B B b B b b b

C/c C c C c C c C c

D/d D D d d d d D D

E/e E e E e e E e E

F/f F f f F F f f F

G/g G g g G g G G g

Resultado*

Resultado*

Resultado*

* Estos resultados son por las cada una de las tres replicas

Donde los resultados obtenidos se reportan como presencia (1) o ausencia (0)

Criterio de aceptación:




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Para las variables (A y a), (B y b)…. :

Donde el promedio de A se calcula: (A+A+A+A) = X;

4

Donde se espera un resultado igual a X=1,

cuando el método es lo suficientemente robusto

para no ser afectado por condiciones evaluadas.

Donde el promedio de A se calcula: (a+a+a+a) = X;

4

Donde se espera un resultado igual a X=1,

cuando el método es lo suficientemente robusto

para no ser afectado por condiciones evaluadas.

5.2 Consideraciones previas

5.2.1 Selección de la matriz

Los criterios para la selección de matriz para la evaluación del desempeño del método, se basan en la Categoría

de matrices (Anexo 6.1) y en el siguiente orden de importancia:

Matrices de la región con mayor probabilidad de analizar

Registro histórico de muestras analizadas

Categorías de matrices (Ver Anexo 6.1 Categorías de matrices)

Alertas / Notificaciones sanitarias

Vinculación epidemiológica entre la matriz y el organismo diana

Programas de Monitoreo y Vigilancia establecidos por el SENASICA

Petición explicita del cliente

5.2.2 Pruebas preliminares

Es recomendable realizar pruebas preliminares para asegurar (o en su caso controlar) que no existe algún factor

que no permita la detección del organismo de interés por el método empleado.

Las pruebas preliminares se realizan para determinar:

El efecto o interferencia de la matriz sobre el método

Evaluar reactivos que van a ser utilizados

La preparación de las muestras, etc.

Es necesario documentar todas las actividades realizadas junto con los resultados obtenidos.

5.3 Selección del método

Para verificar o validar un método, en necesario definir el tipo de Método (Normalizado o No Normalizado) con la

finalidad de establecer los parámetros de validación o verificación correspondientes.




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Diagrama1. Selección del método

5.3.1 Método Normalizado

Para métodos o procedimientos normalizados el laboratorio debe realizar y presentar evidencia objetiva de la

verificación del método para demostrar que cumple las especificaciones del mismo y cuenta con la competencia

técnica para realizarlo adecuadamente, tomando en consideración sus propias instalaciones, equipo y personal.

La verificación del método debe considerar los siguientes criterios:

Eficacia Relativa.

Especificidad Relativa

Sensibilidad Relativa

5.3.2 Método No Normalizado

Para métodos o procedimientos no normalizados, el laboratorio debe realizar y presentar evidencia objetiva de la

validación del método para demostrar que el método es capaz de detectar el microorganismo de interés.

La validación de estos métodos debe considerar los siguientes criterios:

Límite de Detección.

Repetibilidad.

Reproducibilidad.

Método

Normalizado (NOM, ISO, FDA, etc.)

No Normalizado (normalizado

con modificación)

Certificado (AOAC, AFNOR,

etc.)

Protocolo de validación

Protocolo de verificación

Informe de validación o verificación

Registros Validación

Verificación




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Eficacia Relativa.

Especificidad Relativa

Sensibilidad Relativa

Robustez

Los métodos no normalizados se consideran como análisis “Tamiz”, por lo que cada resultado positivo, deberá ser

confirmado por el método Normalizado o Confirmatorio (aislamiento de microorganismo; tanto en la validación del

método como en el método de rutina), para poder emitir resultados confiables y demostrar que el método es

equivalente al método Normalizado.

5.4 Establecimiento del Protocolo de Validación ó Verificación de Métodos

Antes de iniciar con la validación o verificación de un método, se debe contar con el “Protocolo de Validación” o

con el “Protocolo de Verificación” (Según la selección del método) con la finalidad de planificar y organizar las

actividades correspondientes.

Para ello, se deberán definir:

Objetivo

Alcance

Personal que participara en las actividades

Metodología

Diseño experimental

Listado de equipos, instrumentos, materiales, medios de cultivo, reactivos y cepas de referencia

Parámetros y criterios de aceptación del método

Método estadístico

Formatos y Registros asociados

5.5 Diseño experimental

5.5.1 Preparación del inoculo

La validación y verificación de métodos debe de contemplar el uso de materiales de referencia adecuados al

alcance de la metodología para dar confiabilidad a los resultados obtenidos en el laboratorio. Por lo tanto, el uso de

materiales de referencia es un requisito necesario en los métodos realizados en los laboratorios.

Para realizar las diluciones de los microorganismos diana y no diana que se van a emplear en la validación o

verificación, se siguen las indicaciones de trabajo para diluciones bacterianas establecidas en el laboratorio, las

cuales deberán tomar en cuenta la verificación de los microorganismos empleando el método normalizado. La

verificación de microorganismos no diana, se realizará siempre y cuando se cuente con un método de identificación.

Es importante señalar que para los parámetros de especificidad y sensibilidad relativa en las etapas 3 y 4, es

necesario considerar las muestras estimadas para cada una de ellas con las inoculaciones del microorganismo

diana y no diana.

Las concentraciones de los microorganismos no diana deberán ser 10 veces mayor a la concertación del

microorganismo diana y este a su vez debe ser 10 veces mayor al límite de detección del método.




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Ejemplo:

Se contemplan 20 muestras para especificidad y sensibilidad relativas para cada etapa (3 y 4) de las cuales, las 10

primeras se deben inocular con 4 microorganismos no diana (verdaderos negativos) y las 10 restantes se deberán

inocular con el microorganismo diana (verdaderos positivos) con los 4 microorganismos no diana (Ver Tabla 1).

Microorganismo diana. La concentración de inoculo debe ser de 10 a 100 veces mayor que el límite de detección

del método a validar.

Microorganismo no diana. La concentración de inoculo de cepas debe ser mayor al nivel del microorganismo diana

(10 veces más), y emplear como mínimo 4 microorganismos no diana por ensayo.

Tabla 1. Inoculación de muestras.

Nivel de inoculación de los Microorganismos

Muestras Diana

No diana

1

No diana

2

No diana

3

No diana

4

Eficacia

Rela

tiva

Especific

idad r

ela

tiva (

verd

adero

s

nega

tivos)

1 N/A 1X101 1X101 1X101 1X101

2 N/A 1X101 1X101 1X101 1X101

3 N/A 1X101 1X101 1X101 1X101

4 N/A 1X101 1X101 1X101 1X101

5 N/A 1X101 1X101 1X101 1X101

6 N/A 1X101 1X101 1X101 1X101

7 N/A 1X101 1X101 1X101 1X101

8 N/A 1X101 1X101 1X101 1X101

9 N/A 1X101 1X101 1X101 1X101

10 N/A 1X101 1X101 1X101 1X101

Sensib

ilidad

rela

tiva (

verd

adero

s

positiv

os)

11 1X101 1X102 1X102 1X102 1X102

12 1X101 1X102 1X102 1X102 1X102

13 1X101 1X102 1X102 1X102 1X102

14 1X101 1X102 1X102 1X102 1X102

15 1X101 1X102 1X102 1X102 1X102

16 1X102 1X103 1X103 1X103 1X103

17 1X102 1X103 1X103 1X103 1X103

18 1X102 1X103 1X103 1X103 1X103

19 1X102 1X103 1X103 1X103 1X103

20 1X102 1X103 1X103 1X103 1X103

5.5.2 Preparación de la muestra




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La preparación de la muestra debe mantener la microflora natural presente en la matriz y adicionar las cepas diana

y no diana según el parámetro a evaluar.

Los registros de inoculación de muestras, deben contener la siguiente información

Identificación de la muestra

Cantidad de la muestra

Concentración de Inoculo de organismo diana

Concentración de Inoculo de organismos no diana

5.5.3 Inoculación de muestras

Las muestras debe considerar la microflora natural presente y considerando que los microorganismos, no presentan

una distribución uniforme de contaminación, se puede presentar una inhibición propia de la matriz, un estrés

microbiano, o una lesión de los microorganismos, por lo que es necesario realizar una contaminación artificial con

el organismo diana, y en su caso la inclusión de organismos no diana según el parámetro a evaluar.

La inoculación de las muestras se realiza en condiciones asépticas, preferentemente dentro de una cabina de

seguridad biológica.

La inoculación artificial debe asegurar la uniformidad de la contaminación en la matriz, que permita la recuperación

del microorganismo en la porción de la matriz utilizada, considerando la cantidad establecida en la metodología.

Durante la ejecución del protocolo de validación se deberán documentar todas las actividades realizadas junto con

los resultados obtenidos.

5.5.4 Tabla de contingencias

Al tratarse de pruebas cualitativas los resultados se dan en dos categorías, Presencia (Positivo) / Ausencia

(Negativo) y se establece una tabla de comparación respecto con el valor esperado y el valor obtenido por lo de

esta forma se pueden ingresan los datos en una tabla de resultados de validación, donde se realice la captura y

análisis de resultados.

Tabla de contingencias

Respuesta Muestra inoculada Muestra no inoculada

Resultado Positivo Verdadero positivo (VP) Falso Positivo (FP)

Resultado

Negativo

Falso negativo (FN) Verdadero Negativo (VN)

5.6 Informe de Validación / Verificación de Métodos

El informe debe reflejar, además de lo especificado en el numeral 5.4:

Resultados obtenidos

Conclusiones y declaración de conformidad sobre la aptitud del método, fundamentada en la evaluación de los

parámetros de desempeño respecto a los criterios establecidos.




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Criterios de revalidación: justificar y fundamentar apropiadamente si se considera al método adecuado, aún

cuando se hayan producido desviaciones del protocolo o, cuando uno de los puntos del informe no concuerde

con el requisito establecido previamente, por ejemplo los criterios de aceptación.

Se deben adjuntar al informe los registros originales o hacer referencia de su ubicación y/o resguardo.

El método estadístico utilizado para la evaluación del método debe incluir la eliminación de resultados aberrantes,

tales como:

Controles negativos (sin inocular) que arrojen un resultado positivo, son indicadores de un error del

laboratorio/operador.

Evidencia de no homogeneidad o uniformidad del material inoculado.

Valores atípicos

6 ANEXOS

6.1 Categorías de matrices

FRUTAS FRUTILLAS

• Frutas de hueso (Ej. durazno) • Bayas y otras frutas pequeñas

(Ej. fresas, zarzamora, uva)

• Frutas pomáceas (Ej. manzana)

• Frutas tropicales y subtropicales variadas

• (de piel comestible) (Ej. higo)

• Frutas tropicales y subtropicales variadas

(de piel no comestible) (Ej. papaya)

Frutos cítricos (Ej. naranja)

HORTALIZAS HIERBAS AROMATICASY ESPECIAS

Brasicáceas (Ej. brócoli) • Especias (Ej. Tomillo)

• De Bulbo (Ej. cebollín) • Hierbas aromáticas (Ej. Epazote)

• Cucurbitáceas (Ej. calabaza)

De fruto (Ej. tomate, chile) OTROS

De hojas verdes (Ej. espinaca, lechuga) Setas

• De tallo (Ej. apio) Brotes de semilla (Ej. Germen de alfalfa)

• Brasicáceas (Ej. brócoli)

Leguminosas (Ej. ejote)

SUPERFICIES DE CONTACTO

(Vivas e inertes)

AGUA

• Hisopo • Agua de Riego en producción primaria

• Esponja • Agua potable proceso de empaque




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6.2 Etapas y parámetros de validación y/o verificación

ETAPAS DE

VALIDACIÓN Y/O

VERIFICACIÓN

PARÁMETROS

DE VALIDACIÓN

Y/O

VERIFICACIÓN

MUESTRAS REPETICONES

(REPETIBILIDAD)

TOTAL DE

MUESTRAS

TOTAL DE

ANÁLISIS CÁLCULO

CRITERIO DE

ACEPTACIÓN

Etapa 1 Límite de

Detección 10** N/A 10 10 LD=VP/Ni X 100

Mayor o igual 80%.

Etapa 2 Robustez 24* N/A 24 24 --- ---

Etapa 3.

Reproducibilidad

Especificidad

Relativa 10** X 3 10 30

SR=VP/Ni x100 Mayor igual a 95%

Sensibilidad

Relativa 10** X 3 10 30

ES=VN/Ns X100 Mayor igual a 95%

Eficacia relativa*** --- --- --- --- ER=

(VP+VN)/NX100 Mayor igual a 95%

Etapa 4.

Reproducibilidad (una

semana después

como mínimo)

Especificidad

Relativa 10** X 3 10 30

SR=VP/Ni x100 Mayor igual a 95%

Sensibilidad

Relativa 10** X 3 10 30

ES=VN/Ns X100 Mayor igual a 95%

Eficacia relativa*** --- --- --- --- ER=

(VP+VN)/NX100 Mayor igual a 95%

74 154 --- ---

* Son 8 muestras, haciendo tres replicas en las mismas condiciones (24 muestras)

** Este es el número mínimo, en medida de lo posible realizar un mayor número de muestras.

***Eficacia relativa: Esta se calcula usando los resultados de Especificidad Relativa y Sensibilidad Relativa, empleando la tabla de contingencias.

Considerar los controles positivos y negativos para cada etapa de validación.

Para el desarrollo de Validaciones de métodos, es necesario considerar para las Etapas 3 y 4 un mínimo de 10 muestras con el microrganismo diana

Sensibilidad relativa y 10 sin el microorganismo diana Especificidad relativa (por etapa) y

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