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Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C.
ESTUDIOS ESTRUCTURALES DE ENZIMAS
INVOLUCRADAS EN EL METABOLISMO
DE NUCLEÓTIDOS DE CAMARÓN BLANCO
Litopenaeus vannamei
Por:
Alonso Alexis López Zavala
TESIS APROBADA POR LA
COORDINACIÓN DE ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL
Como requisito parcial para obtener el grado de
DOCTOR EN CIENCIAS
Hermosillo, Sonora Julio de 2014
iv
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al CONACYT por el apoyo financiero para el desarrollo de mis
estudios de posgrado.
Al Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C. (CIAD), por el
apoyo prestado durante estos años así como también a su programa de posgrado.
Agradezco el apoyo financiero del proyecto CB-2009-01-131859 “Inhibición del
metabolismo de nucleótidos como estrategia contra el virus del síndrome de la mancha
blanca” otorgado por CONACYT y que gracias a él fue posible la realización de esta
tesis.
A mi director de tesis, Dr. Rogerio R. Sotelo Mundo, por apoyarme y darme su
guía durante mis estudios de posgrado y sobre todo por las críticas influyeron
notablemente en mi formación profesional. Gracias por apoyarme para conocer el
mundo de la cristalografía. 12 años espero sean un buen comienzo de una larga amistad
y colaboración.
Le agradezco al Dr. Enrique Rudiño Piñera que en gran medida ha sido una
influencia directa en mis conocimientos sobre cristalografía. Gracias por tus enseñanzas
y por tu apoyo tanto personal como profesional. Te agradezco sobre todo tu amistad.
A la Dra. Elisa M. Valenzuela Soto y al Dr. Enrique F. Velázquez Contreras por
sus comentarios y sugerencias que enriquecieron el contenido de esta tesis. Además les
agradezco sus críticas que influyeron notablemente en mi formación profesional.
Al personal de la línea de Luz X6A del National Synchrotron Light Source del
Laboratorio Nacional de Brookhaven por su apoyo en los experimentos de difracción de
rayos X.
v
A la M.C. Karina García Orozco por su paciencia, amistad y su ayuda en la
conclusión de esta tesis. Así como a los demás integrantes del laboratorio (Salvador,
Eduardo, Lucia, Alberto y Daniel) por su compañía y apoyo.
Agradezco a Gerardo Reyna Cañez, encargado de la biblioteca, su valioso apoyo
técnico en la búsqueda de material bibliográfico y soporte documental de este trabajo de
investigación.
A todas aquellas personas que de alguna u otra manera influenciaron en el
desarrollo de esta tesis y por supuesto en mi formación.
A mis compañeros y amigos: Ana Luisa, Adriana, Jorge, Aarón, Enrique,
Fernando, Edgar Iván y a todos aquellos que me brindaron y amistad. A Gaby por tu
apoyo en el desarrollo de este proyecto.
Le doy las gracias a mi familia por todo su apoyo en mi formación profesional.
Gracias por estar conmigo y motivarme para seguir adelante. Los quiero!.
vi
DEDICATORIA
A mi hijo, Matias Alonso.
vii
CONTENIDO
Página
Lista de Figuras…………………………………………………………..……... viii
Resumen…………………………………………………………..………....….. x
Abstract…………………………………………….……………..………....….. xii
Sinópsis…………………………………………...………………………….. 1
Capítulo I. Antedecentes……...……...…..………….…….............................. 8
Introducción…………………………………………...………………………...
8
Nucleósido di-fosfato cinasa: metabolismo de nucleótidos y activación de fármacos antivirales……….…………………………...……..…………………
14
Fosfágeno cinasas: cambios conformacionales por unión de sustrato………….. 22
Capítulo II. Publicación número 1 …….………………................................... 28
Crystallization and X-ray diffraction studies of arginine kinase from the white Pacific shrimp Litopenaeus vannamei…..….………………................................
29
Capítulo III. Publicación número 2…….…...................................................... 33
Crystal structure of shrimp arginine kinase in binary complex with arginine—a molecular view of the phosphagen precursor binding to the enzyme…………...
34
Capítulo IV. Manuscrito en revisión editorial .................................................. 42
Structure of nucleoside diphosphate kinase from the Pacific Shrimp (Litopenaeus vannamei) in binary complex with purine and pyrimidine nucleoside diphosphates..……….…………………………...……..……………
43
Referencias……………….………...……...……………………………………. 62
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura
Página 1 Estructuras de los componentes que forman a los nucleósidos. Se
muestran las diferencias en el tipo de base nitrogenada y en el 2´-C de la ribosa. (Matthews et al., 2012).
10
2 Tipos de fosfágenos de diferentes fuentes. Tomado de (Bush et al., 2011).
13
3 Reacción catalizada por la NDK. Modificado de (Lascu y Janin, 2000).
15
4 Estructura trimérica de a NDK de humano en complejo con ADP-Mg+2 (PDB 1UCN). Los monómeros se muestran en representación de listones con un color diferente para cada cadena. El complejo ADP- Mg+2 se muestra en esferas coloreadas por tipo de átomo.
17
5 Sitio activo de la NDK de Dictiostelium discoideum en complejo binario con dADP-Mg+2 (PDB 1NDC). Se muestran las cadenas de los aminoácidos (cilindros) del sitio activo. H122 es el aminoácido catalítico y se encuentra en la cercanía del b-fosfato del ADP. K16 y N116 interaccionan con el grupo 3-OH de la ribosa mediante puentes de hidrógeno (líneas alargadas). La purina del ADP se encuentra en medio de la cavidad hidrofóbica que se crea entre F64 (del lazo de unión de nucleótido) y V116 (de lazo kpn). El ADP se muestra en representación de bolas (oxígenos en color rojo) y palillos de color morado. Figura tomada de (Gallois-Montbrun, et al., 2002).
18
6 Representación en listones de la estructura terciaria de un monómero de la NDK en complejo con ADP- Mg+2 (PDB 1UCN). El lazo kpn esta localizado hacia el centro del trímero. Este lazo forma parte del sitio activo interaccionando con la ribosa y la base nitrogenada del nucleótido. Se observa la extensión final del C-terminal de la cadena vecina (azul). El nucleótido se muestra en bolas y palillos (coloreados por tipo de átomo) mientras que el ión magnesio como una esfera de color gris.
19
ix
LISTA DE FIGURAS (continuación)
Figura Página 7 Reacción enzimática catalizada por la AK.
24
8 Sobre-posición de la estructura de la AK de LpAK en forma abierta (PDB 3M10, en rojo) y en complejo TSAC (PDB 1M15, en amarillo). El lazo 310-320 se muestra en color azul claro. Los ligandos y el ión magnesio se muestran en representación de esferas y están coloreados por tipo de átomo.
25
x
RESUMEN
Los nucleósidos tri-fosfato son las unidades elementales que componen el ADN y el
ARN y las enzimas encargadas de añadir grupos fosfatos son las cinasas. En este esta
tesis abordamos el estudio de dos cinasas, una que fosforila nucleótidos y otra que
fosforila un aminoácido. La primera corresponde a la nucleósido di-fosfato cinasa
(NDK), que cataliza la tercera fosforilación de los nucleósidos difosfatos usando
adenosina tri-fosfato (ATP) como donador. La segunda enzima es la arginina cinasa
(AK), quien fosforila a arginina, para que este compuesto funcione como un almacén
energético a partir del cual se puede obtener rápidamente ATP. En este trabajo se
estudiaron ambas enzimas en el camarón blanco (Litopenaeus vannamei) que no es un
modelo de estudio, pero que tiene alto valor comercial. Los genes que codifican para la
AK y la NDK se expresan abundantemente cuando el camarón está infectado con el
virus de la mancha blanca (WSSV). Este es un virus de ADN y por tanto requiere de la
poza de nucleótidos del camarón para su propia replicación.
Se obtuvieron tres estructuras cristalográficas de la AK de camarón en diferentes
etapas de la reacción: sin ligandos (apo-LvAK), en complejo binario con arginina (ARG-
LvAK) y en complejo ternario simulando el estado de transición con ADP-ARG y nitrato
(TSAC-LvAK). Las estructuras de apo-LvAK y ARG-LvAK se encontraron en la forma
abierta (lazo 310-320 desordenado), y TSAC-LvAK en la forma cerrada (lazo
ordenado). La estructura de la ARG-LvAK nunca había sido reportada y confirma que el
cambio conformacional hacia la forma cerrada depende de la unión del donador de
fosfatos. Respecto a la NDK se determinaron cuatro estructuras cristalográficas en
complejo con aceptores (dADP, dCDP y dTDP) y con ADP emulando la conformación
del donador ATP. Se encontró que ninguno de los compuestos provoca cambios
conformacionales en la enzima. Sin embargo, la unión de desoxi y ribo nucleótidos es
xi
compensada por una molécula de agua que forma un puente de hidrógeno con K11. Esto
permite que K11 mantenga una conformación catalíticamente favorable independiente
del tipo de nucleótido. Por lo tanto, la LvNDK podría fosforilar análogos nucleosídicos
para combatir enfermedades virales que afectan al camarón.
En conclusión encontramos que estructuralmente ambas enzimas conservan los
mecanismos de reacción. Por tanto podrían fosforilar análogos nucleosídicos que son
terminadores de cadena en la replicación y tendrían una acción antiviral ante el WSSV.
Palabras clave: Estructura, cristalografía, difracción, rayos X, nucleósido di-fosfato
cinasa, arginina cinasa, nucleótido, fosfágeno, camarón, Litopenaeus vannamei,
complejo enzima-sustrato.
xii
ABSTRACT
The nucleosides triphosphates are the basic units that compose DNA and RNA
and the enzymes that add phosphates are the kinases. In this thesis I studied two
kinases, one that phosphorylates nucleotides and another that phosphorylates an
amino acid. The first one is nucleoside diphosphate kinase (NDK), which catalyzes
the third phosphorylation using adenosine triphosphate (ATP) as a phosphate-donor.
The second one is arginine kinase (AK), which phosphorylates arginine to arginine
phosphate. That compound is an energy storage (phosphagen) that can later be used
to obtain ATP easily by the back reaction in the muscle. Crystallographic studies
provide information about the structure-relationship in enzymes and in this thesis we
used a non-model organism such as the whiteleg Pacific shrimp Litopenaeus
vannamei. Both AK and NDK are encoded by genes which expression is up-
regulated upon infection with the white spot syndrome virus (WSSV) and therefore
require the nucleotide pools for its own DNA replication.
I obtained three shrimp AK crystal structures in different stages of the reaction:
without ligands (apo-LvAK), in binary complex with arginine (ARG-LvAK) and in
ternary complex emulating the transition state with arginine, ADP and a nitrate ion
(TSAC-LvAK). The apo-LvAK and ARG-LvAK were found in the open
conformation (where loop 310-320 is disordered) and TSAC-LvAK in the closed
conformation, where the loop is ordered. The structure of an AK-binary complex
with arginine was never reported before and confirms that the conformational change
towards the closed conformation is dependent of binding of the phosphate donor.
Respect to NDK, I obtained four crystallographic structures in complex with
phosphate acceptors (dADP, dCDP and dTDP) and with ADP emulating the
conformation of the phosphate-donor ATP. In all four structures, none of the ligands
induced a global conformational change. However, the binding of ribo and desoxy
xiii
nucleotides is compensated by a water molecule. Specifically a crystallographic
water molecule substitutes a hydrogen bond between the 2´-OH of ribonucleotides
with Lys11 compared to where NDK binds 2´-deoxy nucleotides. This allows that
K11 keeps a conformation catalytically favorable independently of the kind of sugar
found in the nucleotide. Because of this, shrimp NDK may phosphorylate nucleotide
analogs to inhibit viral infections that attack this organism. In conclusion, both AK
and NDK have conserved reaction mechanisms. Therefore, nucleosidic analogs may
work as drugs by terminating the DNA replication and therefore viral replication will
not occur.
Keywords: Crystal structure, X-ray diffraction, nucleoside di-phosphate kinase,
arginine kinase, nucleotide, phosphagen, shrimp, Litopenaeus vannamei, enzyme-
substrate complex.
1
SINOPSIS
La célula requiere de los nucleótidos para realizar funciones esenciales como la
síntesis de energía, la replicación y la transcripción de genes entre otras. Los nucleótidos
son indispensables para la vida pues son las unidades elementales que componen el
ADN y el ARN. Tanto los 2´-desoxi nucleótidos (dNTP) como los nucleósido trifosfato
(NTP) son metabolitos esenciales en todos los organismos vivos. Estas moléculas se
clasifican básicamente por el tipo de base nitrogenada que las forman en purinas
(adenosina y guanosina) y pirimidinas (citidina, timidina y uridina) y por el tipo de
azúcar que las componen (ribosa o 2´-desoxi ribosa). Todos los nucleótidos contienen de
1 a 3 grupos fosfato unidos mediante un enlace éster con el carbono 5´ de la ribosa. Por
lo tanto, requieren de fosforilaciones secuenciales que realizan enzimas cinasas para
obtener la forma final tri-fosfato del nucleósido (NTP).
La última etapa de estas reacciones de fosforilación es catalizada por la
nucleósido di-fosfato cinasa (NDK). De aquí que esta enzima es clave durante la
división celular, ya que provee los elementos básicos para la replicación del ADN y
ARN. Esta enzima cataliza la transferencia de grupo γ-fosfato entre el ATP y cualquier
tipo de nucleósido di-fosfato para producir el correspondiente NTP. Se sabe que la NDK
es una enzima con “baja especificidad” de sustrato, debido a que puede fosforilar
cualquier nucleótido independientemente de la base nitrogenada o del tipo de azúcar.
Las NDKs son enzimas muy conservadas de aproximadamente 150 aminoácidos
con un peso molecular promedio de 17 kDa. Además se encuentran ampliamente
distribuidas desde virus, procariotes y eucariotes. Todas las NDKs catalizan una
reacción reversible a través de un mecanismo ping-pong, en el cual se forma un
intermediario covalente de fosfo-histidina (H117 en la NDK de humano). Las
principales diferencias se encuentran en la estructura cuaternaria, la cual puede ser de
dos tipos: homo-hexámeros y homo-tetrámeros. La forma hexamérica es la mas común
2
tanto en eucariotas como procariotas. La forma tetramérica se ha reportado únicamente
en algunas bacterias como Escherichia coli y Myxococcus xanthus.
Cada subunidad contiene un sitio activo y la misma cavidad puede unir cualquier
tipo de nucleótido. El sitio activo de la NDK es muy conservado con H117 en el fondo
de la cavidad catalítica. Tanto el 2´-OH como 3´-OH de la ribosa de los NTP
interaccionan mediante puentes de hidrógeno con dos residuos de aminoácidos (K y N)
que son invariantes en las NDKs. Mientras que en los 2´-desoxi-nucleótidos la ausencia
de grupo 2´-OH se sustituye con una molécula de agua para mantener el puente de
hidrógeno con K11.
Esta característica del sitio activo de la NDK ha sido ampliamente explotada en
la activación de análogos nucleosídicos retrovirales con diferentes geometrías en el
dominio de la ribosa (como la azido-timidina, entre otros). Al igual que los nucleótidos,
estos compuestos requieren de una fosforilación secuencial por enzimas cinasas del
hospedero para poder desarrollar su función. Se ha reportado que la NDK es la enzima
clave para realizar la fosforilación final de estos compuestos para que puedan ser
incorporados a la cadena de ADN o ARN por la polimerasa viral. Así mismo, se ha
propuesto utilizar esta estrategia en otro tipo de patógenos que afectan humanos como:
Tripanosoma cruzi y Leishmania major y bacterias del genero Burkholderia sp.
Por lo tanto, los estudios bioquímicos, cinéticos, biofísicos y estructurales (de la
interacción con sustratos cognados y análogos) de la NDK permiten una mejor
comprensión de su papel en la función bioenergética y el metabolismo de nucleótidos en
organismos de interés comercial como el camarón blanco. En nuestro grupo de trabajo
se ha reportado que la NDK de camarón es capaz de fosforilar y unir los diferentes tipos
de nucleótidos. Sin embargo, se desconocen los detalles estructurales de la interacción
con los diferentes sustratos. Por lo tanto, el objetivo de esta etapa del trabajo fue
determinar la estructura cristalográfica de la NDK de camarón en complejo binario con
los diferentes tipos de nucleótidos.
Se determinaron cuatro estructuras cristalográficas de la NDK de camarón
blanco (LvNDK) en complejo binario con diferentes nucleótidos. De las cuales, se
obtuvieron 3 estructuras con desoxi-nucleósidos di-fosfato: adenosina (dADP-LvNDK),
timidina (TDP-LvNDK) y citidina (CDP-LvNDK) y 1 estructura con adenosina di-
3
fosfato (ADP-LvNDK) a una resolución entre 1.9 y 2.2 Å. El sitio activo de cada
monómero se encontró ocupado por el nucleótido correspondiente. No se observaron
cambios conformacionales en la estructura de la LvNDK con los diferentes tipos de
nucleótidos.
El análisis comparativo de los diferentes complejos binarios de la LvNDK, indica
que los aminoácidos del sitio activo son invariantes independientemente del tipo de
nucleótido que se encuentre unido. Se identificó el aminoácido catalítico (H117) al
fondo de la cavidad catalítica en una posición cercana al grupo β-fosfato del nucleótido.
Así como otros residuos de aminoácidos que son importantes en el sitio activo como:
R87 que interacciona con el β-fosfato y F59 y V111 los cuales forman una cavidad
hidrofóbica que estabiliza ambos tipos de base nitrogenada (purina o pirimidina).
Además, se encontró que las cadenas laterales de K11 y N114 de la LvNDK son los
aminoácidos que interaccionan con el azúcar del nucleótido, independientemente del
tipo de pentosa del nucleótido. K11 forma dos puentes de hidrógeno con los grupos 2´-
OH y 3´-OH de la ribosa del ADP.
Por otro lado, cuando en el sitio activo se encuentra un 2-desoxi-nucleótido
(dTDP, dCDP o dADP) una molécula de agua sustituye el grupo OH faltante y por lo
tanto uno de los puentes de hidrógeno con K11. Esta sustitución permite que K11
mantenga una orientación adecuada para que ambos tipos de nucleótidos se unan al sitio
activo de la NDK.
Al igual que otras NDKs, la enzima de camarón presenta un sitio activo
preformado, lo cual permite la unión de los diferentes tipos de nucleótidos y análogos de
los mismos. Esta característica ha sido ampliamente utilizada como una ventaja para el
diseño de análogos con modificaciones en esas posiciones de la ribosa (como la
estavudina) que son inhibidores de la replicación de ARN de patógenos que afectan a
humanos. En base a lo anterior y a los resultados obtenidos en esta tesis, la LvNDK
podría unir y activar análogos nucleosídicos que son inhibidores de la replicación de
virus de ADN como el virus de la mancha blanca que afecta el cultivo de camarón
blanco.
El ATP es un nucleótido considerado como la molécula energética por
excelencia. Los niveles celulares de ATP dependen de las necesidades energéticas de la
4
célula. Es decir, a mayor necesidad energética mayor consumo de ATP y, por lo tanto,
inherentemente mayor producción de ADP. Derivado de lo anterior, la cantidad de ATP
disponible depende directamente de la relación ATP/ADP. Cuando la concentración de
ATP disminuye, este debe ser rápidamente regenerado para cubrir los requerimientos
energéticos celulares. Además del ATP, existen otras moléculas como reservas
energéticas para situaciones en las que la producción de energía por las rutas
metabólicas tradicionales (glicólisis y fosforilación oxidativa) sería demasiado lenta.
Los fosfágenos como la creatina fosfato (en vertebrados) y la arginina fosfato
(en invertebrados) son moléculas de alta energía que pueden donar el grupo fosfato al
ADP en una reacción para producir ATP. Estas reacciones son catalizadas por enzimas
cinasas como la creatina cinasa y la arginina cinasa (AK) las cuales pertenecen a la
familia de la fosfágeno cinasas. Al igual que los otros miembros de esta familia la AK
utiliza dos sustratos, ATP y arginina. El sitio activo de la enzima tiene sitios de unión
independientes para cada sustrato y siguen un mecanismo catalítico tipo bi-bi al azar. La
reacción es reversible y el equilibrio de la reacción esta determinado por los
requerimientos de energía de la célula. Prácticamente todas la AK son enzimas
monoméricas de aproximadamente 40 kDa, con excepción de la AK del pepino de mar
que es un homo-dímero de 80 kDa. Independientemente de su estructura cuaternaria, el
plegamiento de los monómeros es muy conservado y estos están compuestos de 2
dominios: el N-terminal (residuo 1 al 100) y dominio C-terminal (residuo 101- 350).
La AK se ha cristalizado en diferentes estadios de la reacción y se caracteriza por
presentar cambios conformacionales en el lazo comprendido entre el residuo 310 al 320,
el cual es importante para la función de la enzima. Cuando la enzima se encuentra sin
ligandos en el sitio activo esta lazo se encuentra desordenado (llamada forma abierta de
la enzima). Por otro lado, este lazo se ordena (forma cerrada) cuando el sitio activo de la
enzima se encuentra en un estado de transición análogo (AK-ADP-arginina y el ión
nitrato) al complejo ternario catalítico. Este lazo contiene residuos de aminoácidos
(E314 en la AK de cangrejo cacerola) que son importantes para la catálisis. Por otro
lado, en estudios realizados en solución (dispersión de rayos X de ángulo pequeño) se
encontró que la AK no tiene cambios en su conformación global en complejo binario
con arginina.
5
A la fecha no se ha reportado una estructura cristalográfica de una fosfágeno
cinasa en complejo binario (arginina u otro fosfágeno) que explique a nivel atómico las
características de esta interacción. Por lo anterior, el presente trabajo pretendió abordar
esta temática y realizar la descripción de la interacción de la AK en complejo binario
con arginina. Los resultados aportaron información respecto a la relación estructura-
función en la primeras etapas de la reacción (unión del fosfágeno), de este grupo de
enzimas que son de gran importancia en el metabolismo energético tanto en vertebrados
como en invertebrados.
En este trabajo se determinaron 3 estructuras tridimensionales de la AK de
camarón blanco (LvAK) mediante cristalografía de rayos X. La enzima se purificó
directamente del músculo de camarón. Se obtuvieron cristales de la enzima sin ligandos
(apoLvAK), en complejo binario con arginina (arg-LvAK) y en complejo análogo al
ternario con ADP-Mg-arginina-nitrato (TSAC-LvAK). Las 3 estructuras cristalográficas
se determinaron por el método de reemplazo molecular y se depositaron en el banco de
datos de proteínas (PDB) con los número de acceso: 4AM1, apo-LvAK; 4BHL, arg-
LvAK y 4BG4, TSAC-LvAK.
El análisis de las estructuras indica que la apo-LvAK se encuentra en la
conformación abierta con el lazo 310-320 desordenado como se ha reportado para otras
AKs sin ligandos. El resto de la estructura tiene un plegamiento típico de una AK en
conformación abierta. El dominio N-terminal esta compuesto por un conjunto de
hélices-α mientras que el C-terminal contiene hojas-β rodeadas por hélices-α. Se
identificaron los residuos de aminoácidos que son determinantes para la catálisis (E225)
y de unión del sustrato arginina (G64, V65 y G66). Como se ha reportado para otras AK
en complejo ternario, la estructura de TSAC-LvAK también presenta el lazo 310-320
ordenado y sobre el sitio activo. Los ligandos (ADP-arginina-ion nitrato) se observaron
unidos al sitio activo.
La sobre-posición de los carbonos-α en las estructuras de la apo- y TSAC-LvAK
muestran los cambios conformacionales de la enzima en el lazo 310-320 y en el dominio
C-terminal. Específicamente, en la conformación TSAC-LvAK los residuos catalíticos
(E225 y E314) adoptan la geometría necesaria que permite la transferencia del grupo
fosfato entre ambos sustratos. Por otro lado, la estructura del complejo binario arg-LvAK
6
muestra el sustrato arginina en el sitio activo. El análisis comparativo con las otras dos
estructuras indica que el plegamiento del complejo arg-LvAK se encuentra en la forma
abierta con el lazo 310-320 desordenado. Por lo tanto, el complejo binario presenta un
plegamiento muy similar al de la apo-LvAK.
No se observaron cambios conformacionales en el plegamiento global de la
enzima por la unión de la arginina. Estos resultados son consistentes con los estudios
reportados para la AK del cangrejo cacerola y la CK de humano. Los residuos de
aminoácidos (E225, C271 y Y58) del sitio activo y de lazo de unión de la arginina
(Gly64-Val65-Gly66) prácticamente ocupan las misma posición respecto a la arginina
en el complejo ternario, excepto Glu314 que pertenece al lazo desordenado. Sin
embargo, se observa un cambio ligero en la rotación de la cadena lateral de Glu225
respecto a la posición en la estructura de la apo-LvAK. Este ajuste permite que E225 y el
grupo guanidinio de la arginina adopten la posición catalítica que se observa en la
estructura de la TSAC-LvAK. Estos resultados sugieren que la orientación de los
sustratos y de los residuos del sitio activo tienen un papel importante en la función de
este tipo de enzimas.
La estructura en complejo binario de la LvAK con arginina es el primer reporte
de una fosfágeno cinasa en complejo con el precursor del fosfágeno (arginina, creatina,
etc.). Esta estructura cristalográfica aporta información importante en el entendimiento
del mecanismo catalítico de esta familia de enzimas durante las primeras etapas de la
reacción. Además, nuestros resultados en conjunto con otros estudios reportados de
fosfágeno cinasas en complejo binario con el nucleótido (ATP), indican que la unión de
uno de los sustratos no promueve el plegamiento final del lazo 310-320 como en el
TSAC. Por lo tanto, la unión de ambos sustratos en este tipo de enzimas es necesaria
para lograr los cambios conformacionales adecuados asociados con la catálisis.
En conclusión, se encontró que tanto la AK como la NDK de camarón conservan
las características estructurales en relación a su función para este tipo de enzimas. En la
AK se demostró que es necesario que ambos sustratos se unan al sitio activo para que la
enzima adopte su conformación catalítica llamada TSAC. Es importante resaltar que las
condiciones cristalográficas encontradas, permitieron que el ADP y el ión magnesio
emularan la conformación del ATP como se ha reportado en otras publicaciones. Por
7
otro lado, en la NDK se encontró que el sitio activo de la enzima presenta una
conformación preformada mediada por una molécula de agua que permite que la enzima
pueda fosforilar diferentes tipos de nucleótidos, es decir, pueda unir de manera indistinta
tanto desoxi como ribonucleótidos. Esta característica es de suma importancia para la
activación de análogos nucleosídicos que son terminadores de la replicación tanto del
ADN como del ARN, por lo que podrían funcionar como antivirales en contra del
WSSV. Finalmente, esta tesis deja sentadas las bases para que en futuros trabajos se
aborde el estudio cristalográfico de proteínas del camarón y sus patógenos como una
nueva alternativa para generar opciones a mediano y largo plazo en la generación de
fármacos contra estos patógenos emergentes.
8
ANTECEDENTES
1. Introducción
La célula requiere de los nucleótidos para realizar funciones esenciales como
síntesis de energía, la síntesis de proteínas, la replicación y la transcripción de genes
entre otras. Los nucleótidos son indispensables para la vida pues son las unidades
elementales que componen el ADN y el ARN, además de la molécula energética por
excelencia, la adenosina trifosfato (ATP) (Mathews et al., 2012). Los nucleótidos se
componen de una base nitrogenada, un azúcar tipo ribosa y uno o varios grupos fosfato
unidos al azúcar (Figura 1). Estas moléculas se diferencian básicamente por el tipo de
base nitrogenada en purinas (adenosina y guanosina) y pirimidinas (citidina, timidina y
uridina) y por el tipo de azúcar que las compone (ribosa o 2´-desoxi ribosa). Cabe
señalar que los nucleótidos de timidina solo participan en la síntesis de ADN mientras
que la uridina en la del ARN.
Todos los nucleótidos contienen de 1 a 3 grupos fosfato unidos mediante un
enlace éster con el carbono 5´ de la ribosa (Figura 1). Por lo tanto, requieren de
fosforilaciones secuenciales que realizan enzimas cinasas para obtener la forma final tri-
fosfato del nucleósido (NTP). La última etapa de estas reacciones de fosforilación es
catalizada por la nucleósido di-fosfato cinasa (NDK, EC 2.7.4.6). Esta enzima cataliza la
transferencia de grupo γ-fosfato entre el ATP y cualquier tipo de nucleósido di-fosfato
para producir el correspondiente NTP. Se sabe que la NDK es una enzima con “baja
especificidad” de sustrato, pues puede fosforilar cualquier nucleótido
independientemente de la base nitrogenada o la modificación de la ribosa. Por lo que
esta enzima es clave durante la división celular, ya que provee los elementos básicos
para la replicación del ADN y ARN.
9
A nivel farmacológico se considera que la NDK es una enzima clave para la
activación de análogos nucleosídicos que interrumpen la replicación de ADN o ARN de
patógenos de humanos (Lascu y Gonin, 2000). Por lo anterior, la NDK ha sido
ampliamente estudiada tanto bioquímica, como cinética y estructuralmente. Por otro
lado se ha descrito su participación en otras funciones celulares como en el transporte de
energía de la mitocondria al núcleo (Gerbitz et al., 1996). Mas adelante se discutirán los
detalles mecanísticos y estructurales de la NDK, así como su participación en la
activación de análogos nucleosídicos.
El ATP es la fuente primaria de energía en cualquier proceso metabólico
(Mathews et al., 2012). La hidrólisis de una molécula de ATP puede darse en diferentes
puntos de los 3 grupos fosfatos que contiene. La reacción mas común es la transferencia
del tercer grupo fosfato (γ-fosfato) a otros compuestos (nucleótidos, proteínas, lípidos,
etc.) generando como uno de los productos ADP (adenosina di-fosfato). Cualquier
reacción bioquímica desfavorable energéticamente es posible si se acopla a la hidrólisis
del ATP. Así mismo, la cantidad de ATP circulante depende de las necesidades
energéticas de la célula. Es decir, a mayor necesidad energética mayor consumo de ATP
y, por lo tanto, inherentemente mayor producción de ADP. Derivado de lo anterior, la
cantidad de ATP disponible depende directamente de la relación ATP/ADP. Cuando la
concentración de ATP disminuye, este debe ser rápidamente regenerado para cubrir los
requerimientos energéticos celulares. Bajo condiciones normales, el ATP es sintetizado
durante o por medio de la glicólisis y fosforilación oxidativa (Gerbitz et al., 1996; Dzeja
y Terzic, 2003).
Además del ATP, existen otras moléculas llamadas fosfágenos que se utilizan
como reservas energéticas en situaciones en las que la producción de energía por las
rutas metabólicas tradicionales sería demasiado lenta (Moyes y Schulte, 2013). Cuando
se tiene este requerimiento rápido de energía, el fosfágeno dona su grupo fosfato al ADP
para rápidamente producir ATP. Los fosfágenos mas conocidos son la arginina fosfato
10
Figura 1. Estructuras de los componentes que forman a los nucleósidos. Se muestran las diferencias en el tipo de base nitrogenada y en el 2´-C de la ribosa. (Matthews et al., 2012).
11
en invertebrados y la creatina fosfato en vertebrados (Ellington, 2001). En invertebrados
se han identificado otros fosfágenos como: lombricina fosfato, glicociamina fosfato,
taurociamina fosfato, entre otros (Figura 2). Todas estas moléculas contienen un grupo
guanidinio en uno de sus extremos que es tanto el aceptor como donador del grupo
fosfato. Sin embargo presentan características fisicoquímicas muy diferentes, como el
peso molecular y su composición química; lo cual es de suma importancia durante la
interacción enzima:sustrato.
Tomando en cuenta esto, cada fosfágeno es sintetizado por una fosfágeno cinasa
en específico. En invertebrados la mas estudiada es la arginina cinasa (AK) y en
vertebrados la creatina cinasa (CK). Además, los fosfágenos también cumplen otras
funciones fisiológicas como transportadores intracelulares de energía desde los lugares
de síntesis (mitocondria) hasta los compartimentos de uso (citoplasma y núcleo). Este
transporte de energía es llevado a cabo por diversos mecanismos como el sistema
creatina/creatina fosfato en humanos. Este sistema consiste en la movilización de
energía mediante reacciones simultáneas de transferencia del grupo fosfato entre la
creatina y la creatina fosfato que son catalizadas por la creatina cinasa en vertebrados
(Wallimann et al., 1992; Wallimann, 1994; Dzeja y Terzic, 2003). Además se ha
reportado que existen otros dos sistemas con funciones similares como el catalizado por
la adenilato cinasa (llamado: cable de adenilatos) y la NDK (llamado: canal de
nucleósidos trifosfato) (Gerbitz et al., 1996; Dzeja y Terzic, 2003).
Lo anteriormente descrito muestra la importancia que tienen tanto los
nucleótidos como los fosfágenos en el metabolismo energético y en el mantenimiento de
la poza de nucleótidos en actividades celulares esenciales como la replicación del ADN.
En invertebrados poco se ha reportado respecto a la función que tiene la AK y la NDK
en el transporte de energía. Por otro lado, se ha descrito ampliamente la importancia de
los fosfágenos como almacén de energía y de su importancia en la homeóstasis celular y
por lo tanto, la función de la AK en dicho proceso. Así mismo se han descrito a detalle
las características estructurales de diferentes etapas del mecanismo enzimático de la AK.
Sin embargo, se desconocen los detalles estructurales durante la unión del sustrato
arginina. A continuación se discuten y presentan los estudios de estructura- función que
12
se han reportado para ambas enzimas en modelos de estudio tradicionales de cada
sistema.
13
Figura 2. Tipos de fosfágenos de diferentes fuentes. Tomado de (Bush et al., 2011).
14
2. Nucleósido di-fosfato cinasa: metabolismo de nucleótidos y activación de
fármacos antivirales
Tanto los 2-desoxi nucleótidos (dNTP) como los nucleósido trifosfato (NTP) son
metabolitos esenciales en todos los organismos vivos. Son utilizados como fuente de
energía y en diversas rutas metabólicas como biosíntesis de proteínas, lípidos y la
replicación de ácidos nucleicos como el ADN y ARN (Mathews et al., 2012). La NDK
es la enzima que cataliza la fosforilación final tanto de dNTP como de NTP usando ATP
como donador del grupo fosfato (Lascu y Gonin, 2000) (Figura 3).
Las NDKs son enzimas muy conservadas de aproximadamente 150 aminoácidos
(peso molecular promedio de 17 kDa) y ampliamente distribuidas desde virus, bacteria y
mamíferos superiores (Lascu et al., 2000; Jeudy et al., 2006). Por ejemplo, en
organismos tan divergentes como Escherichia coli y humano la identidad de estructura
primaria es mayor al 40% (Lascu et al., 2000). Todas las NDKs catalizan una reacción
reversible por medio de un mecanismo tipo ping-pong en el cual se forma un
intermediario covalente de fosfo-histidina (H117 en humano) (Figura 3). Este es el
residuo nucleofílico de la reacción y se encuentra en todas las secuencias de NDK
reportadas a la fecha (Lascu y Gonin, 2000).
Por otro lado, tanto los estudios bioquímicos como estructurales indican que la NDK se
asocia en dos tipos de estructura cuaternaria: homo-hexámeros y homo-tetrámeros
(Lascu et al., 2000). Siendo la forma hexamérica las mas común tanto en eucariotas
como procariotas. La forma tetramérica se ha reportado únicamente en algunas bacterias
como Escherichia coli y Myxococcus xanthus (Williams et al., 1993; Almaula et al.,
1995). Los tetrámeros de NDK están formados por un dímero de dímero mientras que
los hexámeros presentan una arreglo de trímero de dímeros o de un dímero de trímeros
(Lascu et al., 2000). La NDK hexamérica de Dictyostelium discoideum es una de las mas
estudiadas (Morera et al., 1994); y como otras NDK, cada monómero tiene motivos
estructurales tipo βαββαβ similar al plegamiento tipo ferredoxina. Las hélices-α se
empaquetan sobre el motivo de hojas-β anti-paralelas creando una región central
hidrofóbica muy conservada (Janin et al., 2000).
15
Figura 3. Reacción catalizada por la NDK. Modificado de Lascu y Janin (2000).
16
Cada subunidad contiene un sitio activo y la misma cavidad puede unir ambos
tipos de nucleótidos (Figura 4). El sitio activo de la NDK es muy conservado y esta
formado por H117 que se localiza en el fondo de la cavidad y un grupo de aminoácidos
polares (L11, R87, N114) que interaccionan con el grupo fosfato y la ribosa. Además, el
sitio activo está compuesto por un lazo que comprende del residuo 51 al 60 que
estabilizan la base nitrogenada del sustrato (Figura 5) (Dumas et al., 1992; Janin et al.,
2000). Otras dos características estructurales que se identifican en este grupo de enzimas
son el lazo kpn (killer-of-prune, llamado así por mutantes P96A letales realizadas en
Drosophila melanogaster) y la parte final dominio C-terminal (aprox. 20 residuos)
(Janin et al., 2000). El lazo kpn es una estructura pequeña (residuo 96 al 117 en NDK de
humano) compuesta de hélices-α que se encuentra situado en la interface central de la
estructura cuaternaria de la NDK (Figura 6) (Lascu et al., 1992). Este lazo se ha
relacionado directamente con la unión del nucleótido y en la estabilidad de la estructura
cuaternaria.
Estudios estructurales y de mutagénesis dirigida en la NDK de Dictiostelium
discoideum indican que la variante P100S causa la desestabilización del hexámero a
través de un cambio en la red de puentes de hidrógeno en la interface de los trímeros
(Lascu et al., 1992; Karlsson et al., 1996). Por otro lado, la extensión del C-terminal es
de aproximadamente 20 residuos aminoácidos en las NDKs hexaméricas. Cada
extensión interacciona directamente vía puentes de hidrógeno con una red de moléculas
de agua con la subunidad vecina y participa en la estabilización del hexámero (Janin et
al., 2000; Lascu et al., 2000). Mientras que en las NDK tetraméricas de bacterias este
lazo es mas corto (entre 10 y 12 residuos) y no se ha relacionado con la estabilidad de la
estructura cuaternaria (Figura 6) (Williams et al., 1993).
El sitio activo de la NDK contiene una histidina que participa en la formación del
intermediario catalítico (fosfohistidina). Esta enzima se ha cristalizado sin ligandos
(apo-enzima) y en complejo binario tanto con desoxi- como nucleósidos di-fosfato de
ambos tipo de bases nitrogenadas (purina y pirimidina). Se ha reportado que la unión de
los sustratos al sitio activo causa cambios conformacionales en el lazo de
reconocimiento del nucleótido en la NDK de Leishmania major y Tripanosoma cruzi
(residuo 51-63) respecto a la enzima sin ligandos (Souza et al., 2011). Este lazo contiene
17
Figura 4. Estructura trimérica de a NDK de humano en complejo con ADP-Mg+2 (PDB 1UCN). Los monómeros se muestran en representación de listones con un color diferente para cada cadena. El complejo ADP- Mg+2 se muestra en esferas coloreadas por tipo de átomo.
18
Figura 5. Sitio activo de la NDK de Dictiostelium discoideum en complejo binario con dADP-Mg+2 (PDB 1NDC). Se muestran las cadenas de los aminoácidos (cilindros) del sitio activo. H122 es el aminoácido catalítico y se encuentra en la cercanía del b-fosfato del ADP. K16 y N116 interaccionan con el grupo 3-OH de la ribosa mediante puentes de hidrógeno (líneas alargadas). La purina del ADP se encuentra en medio de la cavidad hidrofóbica que se crea entre F64 (del lazo de unión de nucleótido) y V116 (de lazo kpn). El ADP se muestra en representación de bolas (oxígenos en color rojo) y palillos de color morado. Figura tomada de (Gallois-Montbrun, et al., 2002).
19
Figura 6. Representación en listones de la estructura terciaria de un monómero de la NDK en complejo con ADP- Mg+2 (PDB 1UCN). El lazo kpn esta localizado hacia el centro del trímero. Este lazo forma parte del sitio activo interaccionando con la ribosa y la base nitrogenada del nucleótido. Se observa la extensión final del C-terminal de la cadena vecina (azul). El nucleótido se muestra en bolas y palillos (coloreados por tipo de átomo) mientras que el ión magnesio como una esfera de color gris.
20
residuos muy conservados como fenilalanina 59 (F59) y leucina (L63) que son
importantes para la unión del nucleótido. Valina 112 (V112) es otro residuo que
participa en esta interacción pero éste se encuentra en la parte complementaria (parte del
lazo kpn) de una cavidad hidrofóbica que estabiliza ambos tipos de bases nitrogenadas
(Janin et al., 2000).
Como se mencionó anteriormente, el azúcar de los nucleótidos se ancla hacia el
interior del sitio activo de la enzima mediante interacciones polares (Janin et al., 2000).
En el caso de la ribosa, tanto el 2´-OH como 3´-OH interaccionan mediante puentes de
hidrógeno con dos residuos de aminoácidos que son invariantes en todas las NDKs:
lisina 11 (K11) y asparagina 115 (N115) como se observa en la estructura cristalográfica
de la NDK-ADP (Figura 6) (Morera et al., 1994; Janin et al., 2000). Mientras que en los
2´-desoxi-nucleótidos la ausencia de grupo 2´-OH se sustituye con una molécula de agua
para mantener el puente de hidrógeno con K11 como reportaron Cherfils et al. (2000)
(Cherfils et al., 1994). Este ajuste del solvente permite que el sitio de unión de la
pentosa, específicamente K11 y N115, mantenga una conformación preformada que
permite la unión de ambos tipos de azúcar de los nucleótidos.
Esta característica del sitio activo de la NDK ha sido ampliamente explotada en
la activación de análogos nucleosídicos con diferentes geometrías en el dominio de la
ribosa (Gallois-Montbrun et al., 2002; Gallois-Montbrun et al., 2004). Los análogos
nucleosídicos como la azido-timidina (grupo azida en el 3´-C de la ribosa) y el d4TDP
(2',3'-dideoxi-2',3'-di-dehidrotimidina difosfato) son compuesto retrovirales (en contra
de virus como: VIH y Herpes virus) que actúan como inhibidores de la replicación.
Estos compuestos requieren de una fosforilación secuencial por enzimas cinasas del
hospedero.
Se han reportado estructuras cristalográficas y estudios cinéticos que indican que
la NDK puede realizar la activación final de estos compuestos para obtener su forma tri-
fosfato (forma activa) (Schneider et al., 2000; Gallois-Montbrun et al., 2002). Si bien la
substitución o falta del grupo 2-OH y 3-OH en la ribosa de estos compuestos es
favorable para inhibir la replicación del ARN también afecta la afinidad y eficiencia
catalítica (hasta 104 veces menor) de la NDK (Schneider et al., 2000; Gallois-Montbrun
et al., 2002). En años recientes, se ha propuesto utilizar esta estrategia en otro tipo de
21
patógenos que afectan humanos como algunos tripanosomatidos como: T. cruzi y L.
major y bacterias del genero Burkholderia sp (Souza et al., 2011; Baugh et al., 2013).
Si bien la NDK ha sido ampliamente caracterizada en muchos organismos, poco
se sabe de este tipo de enzimas en invertebrados marinos y su papel en la interacción con
patógenos que afectan a especies de interés comercial como lo es el camarón blanco. En
nuestro grupo de trabajo se reportó que la NDK de camarón es capaz de fosforilar los 4
tipos de desoxi-nucleósidos di-fosfato (Quintero-Reyes et al., 2012). Así mismo, se
determinaron las constantes de disociación por calorimetría de titulación isotérmica para
los diferentes sustratos. Se encontró que la guanidina di-fosfato tiene mayor afinidad
respecto a los otros 3 sustratos. Sin embargo, no se observó calor de interacción cuando
la enzima se encontraba en presencia de dCDP.
Por otro lado, se desconocen los detalles estructurales de la interacción de la
NDK de camarón con los diferentes tipos de sustratos. Por lo tanto, el presente trabajo
tuvo como objetivo describir las características estructurales de la unión de la NDK de
camarón en complejo binario tanto con aceptores (dCDP, dADP, TDP) como donadores
(ADP) del grupo fosfato. Los resultados obtenidos aportaron información para explicar
la función de esta enzima en el metabolismo de nucleótidos en camarón, así como
información para el potencial desarrollo de estrategias para combatir infecciones virales
que afectan a esta especie.
22
3. Fosfágeno cinasas: cambios conformacionales por unión de sustrato
Las fosfágeno cinasas son un grupo de enzimas que regulan en gran medida las
necesidades energéticas celulares manteniendo la homeóstasis de ATP (Ellington, 2001).
Como se mencionó anteriormente, se encuentran tanto en vertebrados (CK) como en
invertebrados (AK). La AK (EC: 2.7.3.3) ha sido la más estudiada bioquímica y
estructuralmente en invertebrados por mas de dos décadas (Babbitt et al., 1986;
Ellington, 1989; Ellington, 2001). La AK cataliza una reacción reversible de
transferencia del grupo γ-fosfato entre el ATP y el grupo guanidinio (N1) de la creatina o
arginina. (Figura 7). La enzima sigue un mecanismo enzimático al azar en equilibrio
rápido de unión y liberación de sustratos/productos con sitios independientes para la
unión de sustrato/producto (Blethen, 1972). La dirección de la reacción es dependiente
de los requerimientos de ATP celular. Ante una demanda de energía la reacción se
desplaza hacia la síntesis de ATP y viceversa.
La mayoría de la AKs descritas a la fecha son monoméricas con un peso molecular
promedio de 40 kDa y una secuencia primaria de aproximadamente. 357 residuos de
aminoácidos. Una excepción a lo anterior es la AK del pepino de mar (Stichopus
japonicus) la cual se reportó como un homodímero de 80 kDa (Suzuki et al., 1997).
Todas las AK reportadas son citosólicas y se han determinado varias estructuras
cristalográficas. Siendo la mas estudiada la AK del cangrejo cacerola Limulus
polyphemus (LpAK) tanto como apo-enzima (forma abierta) (Yousef et al., 2003) y en
un complejo análogo al ternario con ADP-Mg y el ión nitrato (forma cerrada, TSAC)
(Figura 8) (Zhou et al., 1998).
Estas enzimas son muy conservadas con una identidad de secuencia de aminoácidos
mayor al 70% y tienen un plegamiento muy similar. Están compuestas por dos
dominios: el dominio N-terminal (dominio pequeño) que comprende del residuo 1 al 100
y el dominio grande (C-terminal) del residuo 101 al 357. Cada uno de los dominios tiene
características funcionales y estructurales particulares. El N-terminal tiene un
plegamiento con un arreglo irregular que consiste de 6 hélices-α. Mientras que el C-
terminal esta compuesto por una estructura tipo “sándwich”. Este dominio contiene ocho
23
hojas-β anti-paralelas localizadas en el centro y esta flanqueado por siete hélices-α
(Zhou et al., 1998).
En el dominio C-terminal se encuentra el sitio de unión del ATP el cual está
compuesto principalmente por aminoácidos con carga positiva como: arginina 124, 229
y 309 que interaccionan con el grupo fosfato, y otros como: histidina 284 y serina 122
que estabilizan la base nitrogenada del nucleótido. Además, el dominio C-terminal
contiene otros residuos que son importantes para la catálisis como los glutámicos 225 y
314 (E225 y E314). Se ha reportado que estos dos residuos están implicados
directamente (pero no esenciales) en la catálisis mediante un mecanismo acido/base. Las
mutantes de ambos residuos por asparagina y glutamina, respectivamente, han
demostrado que la actividad de la LpAK se reduce al menos en un 95% respecto a la
enzima nativa (Pruett et al., 2003).
Por otro lado, la estructura cristalográfica de la LpAK en complejo ternario (TSAC)
muestra un cambio conformacional drástico en el lazo 310-320, cuando ambos sustratos
están unidos al sitio activo. Este lazo se encuentra en el dominio C-terminal y se vuelca
sobre el sitio activo como una tapa, participando directamente en la estabilización,
alineamiento y evitando la hidrólisis no deseada del ATP durante la catálisis (Figura 8)
(Zhou et al., 1998). Este cambio conformacional es una de las características
estructurales mas significativa de las fosfágeno cinasas, tanto de vertebrados como
invertebrados como se ha reportado para la CK citosólica de la manta raya (PDB 1VRP),
de humano (PDB 3B6R), la mitocondrial de retina bovina (PDB 1G0W) y la AK
dimérica del pepino de mar (PDB # 3JU6).
En la forma abierta (sin ligandos) de la enzima este lazo se encuentra desordenado y
no es posible obtener los mapas de densidad electrónica correspondiente en los
experimentos de difracción de rayos X (Yousef et al., 2003). Así mismo, se han
reportado algunas estructuras cristalográficas de fosfágeno cinasas en complejo binario
con el nucleótido (ADP-enzima) en las que se observa un estado de transición
intermediario del lazo 310-320. La estructura cristalográfica de la lombricina cinasa en
complejo con ADP reportada por Bush y cols. (2011) muestra que la unión del
nucleótido provoca un cambio conformacional de este lazo muy similar (diferencia de 4
Å) al que se observa en la estructura del complejo TSAC (Bush et al., 2011). Resultados
24
Figura 7. Reacción enzimática catalizada por la AK.
25
Figura 8. Sobre-posición de la estructura de la AK de LpAK en forma abierta (PDB 3M10, en rojo) y en complejo TSAC (PDB 1M15, en amarillo). El lazo 310-320 se muestra en color azul claro. Los ligandos y el ión magnesio se muestran en representación de esferas y están coloreados por tipo de átomo.
26
similares también han sido reportados para otras fosfágeno cinasas como la CK de
cerebro de humano (PDB 3DRB) y la CK octamérica de músculo de conejo (PDB
1U6R) en complejo binario con el ATP.
En las fosfágeno cinasas el sitio de unión del fosfágeno se encuentra en el
dominio N-terminal. Una característica importante de esta cavidad es el llamado lazo de
especificidad del fosfágeno, el cual esta comprendido del residuo 61 al 64 en la LpAK.
En la estructura cristalográfica de la LpAK se ha identificado que el grupo carboxilato
de la arginina hace puentes de hidrógeno con el esqueleto (grupo amida) de los
aminoácidos que comprenden este lazo. Dichas interacciones son las responsables de
unir y estabilizar el sustrato para un correcto alineamiento y facilitar la catálisis (Zhou et
al., 1998). Se ha reportado que la longitud de este lazo es inversamente proporcional al
tamaño del ligando. Es decir, el lazo es mas pequeño (4 residuos) en fosfágeno cinasas
que unen sustrato mas grandes, como la lombricina cinasa (Bush et al., 2011), y mas
largo (8 residuos) en aquellas enzimas que unen sustratos mas pequeños como en la CK.
Además mediante experimentos de mutagénesis dirigida se reemplazó este lazo en la
LpAK por su homólogo en la CK (Azzi et al., 2004). Estas modificaciones demostraron
que la LpAK es capaz de unir creatina pero no de realizar la catálisis con este sustrato
(Azzi et al., 2004).
Como se mencionó anteriormente, este lazo esta relacionado con la especificidad
por sustrato. En estudios recientes en la LpAK se ha reportado la interacción de este lazo
en la unión de análogos de fosfágenos (D-arginina, ornitina y citrulina) en complejo
TSAC (Clark et al., 2012). Las estructuras cristalográficas muestran que el lazo de unión
del fosfágeno se encuentra en una conformación muy similar respecto al complejo
TSAC con el sustrato cognado (L-arginina). Aunque la enzima puede unir estos
análogos, no se detectó actividad enzimática de la LpAK cuando se usaron estos
compuestos como sustrato. Estos autores concluyeron que la interacción del lazo de
unión del fosfágeno con los sustratos no es determinante en la función de la enzima,
pero que este lazo tiene un papel crítico en el correcto alineamiento del sustrato durante
la catálisis (Clark et al., 2012).
En gran medida los reportes de estructura-función de las fosfágeno cinasas se
han enfocado en el sitio de unión del nucleótido, ya sea en complejo enzima-nucleótido
27
o en el TSAC. Como se mencionó, las fosfágeno cinasas catalizan reacciones bi-sustrato.
Sin embargo han sido pocos los trabajos estructurales que describen la interacción del
complejo binario entre el sustrato-guanidinio (fosfágeno) con la enzima. Tanto en la AK
como en la CK se han reportado estudios en solución por difracción de rayos X de
ángulo pequeño (SAXS) que indican que la unión del sustrato-guanidinio genera
cambios conformacionales globales muy pequeños en la conformación de la proteína
(Dumas y Janin, 1983; Forstner et al., 1998). A la fecha, no existe ningún reporte
estructural en el PDB (banco de datos de proteínas) de alguna fosfágeno cinasa en
complejo binario con el sustrato tipo guanidinio que describa a nivel atómico esta
interacción. Por lo anterior, el presente trabajo tuvo como objetivo abordar esta temática
y realizar la descripción de la interacción atómica de la AK en complejo binario con
arginina.
Los resultados obtenidos aportaron información respecto a la relación estructura-
función en las primeras etapas de la reacción (unión del fosfágeno) de este grupo de
enzimas que son de gran importancia en el metabolismo energético tanto en vertebrados
como en invertebrados.
28
CAPITULO II
Publicación número 1
electronic reprintActa Crystallographica Section F
Structural Biologyand CrystallizationCommunications
ISSN 1744-3091
Editors: H. M. Einspahr and M. S.Weiss
Crystallization and X-ray diffraction studies of arginine kinasefrom the white Pacific shrimp Litopenaeus vannamei
Alonso A. Lopez-Zavala, Rogerio R. Sotelo-Mundo, Karina D.Garcia-Orozco, Felipe Isac-Martinez, Luis G. Brieba and EnriqueRudino-Pinera
Acta Cryst. (2012). F68, 783–785
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Acta Crystallographica Section F
Structural Biologyand CrystallizationCommunicationsEditors: H. M. Einspahr and M. S. Weiss
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ISSN 1744-3091
Volume 67
Part 1
January 2011Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communicationsis a rapid all-electronic journal, which provides a home for short communications onthe crystallization and structure of biological macromolecules. Structures determinedthrough structural genomics initiatives or from iterative studies such as those used in thepharmaceutical industry are particularly welcomed. Articles are available online whenready, making publication as fast as possible, and include unlimited free colour illus-trations, movies and other enhancements. The editorial process is completely electronicwith respect to deposition, submission, refereeing and publication.
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Acta Cryst. (2012). F68, 783–785 Lopez-Zavala et al. · Arginine kinase
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Acta Cryst. (2012). F68, 783–785 doi:10.1107/S1744309112020180 783
Acta Crystallographica Section F
Structural Biologyand CrystallizationCommunications
ISSN 1744-3091
Crystallization and X-ray diffraction studies ofarginine kinase from the white Pacific shrimpLitopenaeus vannamei
Alonso A. Lopez-Zavala,a
Rogerio R. Sotelo-Mundo,a*Karina D. Garcia-Orozco,a
Felipe Isac-Martinez,a Luis G.Briebab and Enrique Rudino-Pinerac*
aLaboratorio de Biologıa Molecular de
Organismos Acuaticos, Centro de Investigacion
en Alimentacion y Desarrollo A.C. (CIAD),
Carretera a La Victoria km 0.6, Apartado
Postal 1735, 83304 Hermosillo, SON, Mexico,bLaboratorio Nacional de Genomica para la
Biodiversidad (LANGEBIO), Centro de
Investigacion y Estudios Avanzados
(CINVESTAV Unidad Irapuato), Km 9.6
Libramiento Norte Carretera Irapuato-Leon,
Apartado Postal 629, 36500 Irapuato, GTO,
Mexico, and cDepartamento de Medicina
Molecular y Bioprocesos, Instituto de
Biotecnologıa (IBT), Universidad Nacional
Autonoma de Mexico (UNAM), Avernida
Universidad #2001, Col. Chamilpa,
62210 Cuernavaca, MOR, Mexico
Correspondence e-mail: [email protected],
Received 5 March 2012
Accepted 4 May 2012
Crystals of an unligated monomeric arginine kinase from the Pacific whitelegshrimp Litopenaeus vannamei (LvAK) were successfully obtained using themicrobatch method. Crystallization conditions and preliminary X-ray diffractionanalysis to 1.25 A resolution are reported. Data were collected at 100 K onNSLS beamline X6A. The crystals belonged to space group P212121, with unit-cell parameters a = 56.5, b = 70.2, c = 81.7 A. One monomer per asymmetric unitwas found, with a Matthews coefficient (VM) of 2.05 A3 Da!1 and 40% solventcontent. Initial phases were determined by molecular replacement using ahomology model of LvAK as the search model. Refinement was performed withPHENIX, with final Rwork and Rfree values of 0.15 and 0.19, respectively.Biological analysis of the structure is currently in progress.
1. Introduction
The phosphagen kinase (PK) family, also known as the guanidinekinase group, is comprised of enzymes that play an essential role inregulating the cellular ATP pool via high-energy phosphagen storage(Ellington, 2001). These enzymes catalyze the reversible transfer ofthe !-phosphate group of ATP to a guanidine substrate (creatine,arginine or lombricine). Despite structural variation of the phosphateacceptor (also known as the phosphagen), PKs are well conserved,with approximately 40% amino-acid sequence identity between them(Dumas & Camonis, 1993). Arginine kinase (AK) and creatine kinase(CK) are the most representative enzymes of the PK family; AK isfound in invertebrates, while its homologue CK is found in verte-brates (Babbitt et al., 1986). AK (EC 2.7.3.3) is present as a monomerof 40 kDa, except in the sea cucumber (Stichopus japonicas) andother equinoderms, where it is found as a homodimer of 80 kDa (Guoet al., 2003). Despite these quaternary-structural differences, all AKsuse arginine as a substrate,
ATP-Mg + arginine !ADP-Mg + arginine-PO4 þHþ:
In recent decades, several AKs have been described by biochem-ical, kinetic and structural studies (Ellington, 2001). Crystal structuresof AK and other PKs from several sources are available: octamerichuman ubiquitous mitochondrial CK (Fritz-Wolf et al., 1996), dimericCK from human brain and muscle, Torpedo californica, chicken brainand bovine retinal (Bong et al., 2008; Lahiri et al., 2002; Tisi et al.,2001), dimeric AK from sea cucumber (Wu et al., 2010) and mono-meric AK from Trypanosoma cruzi (Fernandez et al., 2007) and thehorseshoe crab Limulus polyphemus (Zhou et al., 1998). MonomericAK is comprised of two domains: a small N-terminal domain (#100residues), which has a mainly " orthogonal bundle fold consistingof an irregular array of six short "-helices, and a larger C-terminaldomain (#250 residues). The C-terminal domain has an "# two-layersandwich fold consisting of seven "-helices with a central core ofeight-stranded antiparallel #-sheets (Zhou et al., 1998). A detailedanalysis of the crystal structure of the ternary dead-end complex ofhorseshoe crab AK revealed a large conformational change uponsubstrate binding and closure of both domains (Yousef et al., 2002).The substrate-free enzyme is in the ‘open form’ and changes to the‘closed form’ upon substrate binding. This conformational changerequires a 15$ rotation between the N-terminal domain and theC-terminal domain. In the ‘closed form’ a nitrate ion mimics the
# 2012 International Union of Crystallography
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trigonal !-phosphoryl geometry that occurs during phosphatetransfer between arginine and ADP-Mg to form the ternary dead-endcomplex (Zhou et al., 1998). In addition to the domain rotationsmentioned above, large conformation changes occur in the loopcomprising residues 309–320. This loop serves as a ‘lid’ that protrudesinto the active site when it is in the ‘closed form’ to provide an extra‘wall’ for active-site stabilization, specifically through interactionbetween residues Arg309, Thr311 and Glu314 and both the ATP-Mgand arginine moieties. In contrast, in the ‘open form’ this loop is fullydisorganized and is not visible in electron-density maps.
AK has been isolated from several invertebrate species and isa well conserved enzyme with approximately 70% amino-acidsequence identity. The arginine kinase from the Pacific white shrimpLitopenaeus vannamei (LvAK; GenBank ABI98020.1) was purifiedfrom shrimp muscle (yield of !2 mg AK per gram of tissue) forbiochemical and structural studies. The amino-acid sequence wasdeduced by cDNA sequencing and was confirmed by mass spectro-metry of tryptic peptides from the purified protein (Garcıa-Orozcoet al., 2007). Proteomic expression analysis indicates that LvAK isup-regulated in shrimps infected with yellow head virus (YHV;Rattanarojpong et al., 2007). Biophysical and structural studies willhelp to understand the role of LvAK in energy metabolism and itspossible relation to the antiviral response mechanism to YHV in thewhite shrimp.
In this paper, we report the crystallization and preliminary struc-tural analysis of arginine kinase from the marine crustacean decapodshrimp L. vannamei in the absence of substrate or ligands.
2. Materials and methods
2.1. LvAK purification and crystallization
LvAK was purified from shrimp tail muscle as reported previously(Garcıa-Orozco et al., 2007). Briefly, 5 g white shrimp tail muscle washomogenized in 50 ml 100 mM Tris–HCl pH 8.0, 10 mM "-mercapto-ethanol, 1 mM EDTA, 25 mM PMSF, incubated overnight at 277 Kwith constant stirring and clarified by centrifugation. The supernatantwas precipitated using 70 and 90% saturated ammonium sulfate andcentrifuged at 30 000g for 20 min at 277 K. The pellet was redissolvedin 10 mM Tris–HCl pH 8.0, 10 mM "-mercaptoethanol, 0.1 mMEDTA. The homogenate was spun down (30 000g, 30 min, 277 K) andthe supernatant was loaded onto a Q-Sepharose column (GEHealthcare). The enzyme was eluted using a linear gradient from 0 to1 M NaCl. The purity was verified by the presence of a single proteinband (!40 kDa) on silver-stained SDS–PAGE. The protein wasstored at 277 K until use. The protein concentration was determinedby the bicinchoninic acid method (Pierce; Smith et al., 1985) usingbovine serum albumin as a standard. The LvAK activity wasmeasured using a direct colorimetric assay in the forward directionfollowing the synthesis of arginine phosphate (Yu et al., 2003).
LvAK was extensively dialyzed against 10 mM Tris–HCl pH 8.0,1 mM DTT and concentrated with a 10 kDa ultrafiltration membrane(Amicon, Millipore) to a final protein concentration of 20 mg ml"1.This protein was immediately used in crystallization trials withCrystal Screen (Hampton Research) using the microbatch method(Greiner plates, Hampton Research). The plates were prepared asfollows: 1 ml concentrated LvAK solution was mixed with 1 ml of eachcrystallization solution and 10 ml paraffin oil in each well and incu-bated at 290 K. After 3 d, a large cluster of LvAK crystals appearedin a condition consisting of 0.2 M sodium acetate, 0.1 M sodiumcacodylate pH 6.5, 30%(w/v) PEG 8000 (solution No. 28 of CrystalScreen). 3 d later, a small individual LvAK crystal appeared bound to
the well plate under the same condition (Fig. 1a). These crystals weresmall; the conditions were thus refined in a single matrix using thecondition described above, varying the pH from 5.8 to 7.4 in incre-ments of 0.2 pH units. Single LvAK crystals appeared at pH valuesranging from 6.6 to 7.4 and grew over 3 d until they reacheddimensions of 0.44 # 0.23 # 0.14 mm (Fig. 1b). A cat whisker wasused to carefully separate a crystal from the well. Before cryocooling,the crystal was transferred to a cryoprotectant solution obtained byreplacing the water and PEG 8000 in the mother liquor with 30%(v/v)PEG 400. A single crystal grown at pH 7.4 was soaked in the cryo-protectant solution for 5 min, loop-mounted and flash-cooled at100 K using a dry nitrogen steam.
2.2. X-ray data collection and crystallographic analysis
Data collection from the LvAK crystals was performed onbeamline X6A of the National Synchrotron Light Source (NSLS),Brookhaven National Laboratory, Upton, New York, USA using anADSC Quantum 270 detector. X-ray diffraction data were collectedfrom a single crystal at 0.9795 A (12 672 eV). The crystal-to-detectordistance was kept at 110 mm, with an oscillation range per image of0.5$, collecting a data set with a total oscillation range of 180$ andexposing each frame for 10 s. For data collection, crystals were soakedin a cryoprotectant solution as described above, loop-mounted and
crystallization communications
784 Lopez-Zavala et al. % Arginine kinase Acta Cryst. (2012). F68, 783–785
Figure 1LvAK crystals were obtained by the microbatch method using Greiner plates. (a) Alarge cluster of crystals appeared in a condition consisting of 0.2 M sodium acetate,0.1 M sodium cacodylate pH 6.5, 30%(w/v) PEG 8000 within 3 d at 290 K. (b)LvAK crystals obtained after refinement of the initial condition to pH 7.4 withdimensions of 0.44 # 0.23 # 0.14 mm. These crystals were used for X-ray datacollection.
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flash-cooled in a dry nitrogen stream at 100 K. Diffraction imageswere integrated using XDS, scaling was performed with XSCALEand mtz conversion was performed with XDSCONV, all from theXDS suite (Kabsch, 2010).
The LvAK crystal belonged to space group P212121, with unit-cellparameters a = 56.5, b = 70.2, c = 81.7 A. A total of 654 679 reflectionswere integrated to a resolution of 1.25 A and were merged to obtain91 314 unique reflections with an overall Rmerge and Rmeas of 0.05 anda completeness of 100%. Matthews coefficient calculations indicatedthat there was one molecule per asymmetric unit (VM = 2.05 A3 Da!1,40% solvent content; Matthews, 1968). Data-collection statistics arelisted in Table 1.
Initial phases for LvAK were determined by molecular replace-ment in Phaser (McCoy et al., 2007) using a homology model of theLvAK amino-acid sequence (GenBank ABI98020.1) based on thethree-dimensional structure of arginine kinase from L. polyphemus(PDB entry 3m10; Niu et al., 2011). The best solution from Phaserwas obtained after the search model was divided into two domainscomprising 91 residues from the N-terminus and 255 residues fromthe C-terminus and had a log-likelihood gain of !1.844, an RFZ of10.5 and a TFZ of 15.9. After the first electron-density map from thesolution obtained in Phaser was visually inspected, most of the main-chain atoms were properly fitted; however, several residues wereadjusted and/or constructed by hand in several cycles of modelrebuilding and phase calculation (this process was made less difficultowing to the high resolution available). The original Rwork and Rfree
values calculated after molecular replacement were 0.48 and 0.49,respectively. Refinement was performed using the programsPHENIX (Adams et al., 2010) and Coot (Emsley et al., 2010), givingfinal Rwork and Rfree values of 0.15 and 0.19, respectively. The atomic
coordinates and structure factors have been deposited in the ProteinData Bank as entry 4am1. Biological analysis of the crystallographicstructure is in progress.
AAL-Z was supported by a PhD fellowship from CONACyT(Mexico’s National Science and Research Council). RS-M acknowl-edges financial support from CONACyT grants CB-2009-131859and E0007-2011-01-179940 and grant 2011-050 from the TexasA&M–CONACyT Collaborative Grant Program. ER-P gratefullyacknowledges financial support from PAPIIT project IN204611(UNAM) and CONACyT 102370. We thank the staff at BNL NSLSbeamline X6A for data-collection facilities. Beamline X6A is fundedby NIGMS (GM-0080) and the US Department of Energy (contractNo. DE-AC02-98CH10886). The authors thank Luis Leyva-Duran,Adalberto Murrieta-Valenciana, Jose L. Aguilar-Valenzuela andMartin Peralta-Contreras for their computational technical support.
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crystallization communications
Acta Cryst. (2012). F68, 783–785 Lopez-Zavala et al. " Arginine kinase 785
Table 1Crystallographic data and data-collection statistics for LvAK.
Values in parentheses are for the highest resolution bin.
X-ray source NSLS X6AWavelength (A) 0.9795Space group P212121
Unit-cell parameters (A) a = 56.5, b = 70.2, c = 81.7Resolution range (A) 28.10–1.25 (1.28–1.25)Total reflections 654679 (47535)Unique reflections 91314 (6709)Rmerge† 0.054 (0.545)Rmeas‡ 0.058 (0.588)Completeness (%) 100 (100)hI/!(I)i 22.2 (3.9)Multiplicity 7.1 (7.0)Rwork 0.1584Rfree (5% of reflections) 0.1968Mean B value (A2) 16.0B value from Wilson plot (A2) 16.4PDB code 4am1
† Rmerge =P
hkl
Pi jIiðhklÞ ! hIðhklÞij=
Phkl
Pi IiðhklÞ, where Ii(hkl) and hI(hkl)i
represent the diffraction-intensity values of the individual measurements and thecorresponding mean values. The summation is over all unique measurements. ‡ Rmeas
is a redundancy-independent version of Rmerge: Rmeas =P
hklfNðhklÞ=½NðhklÞ ! 1&g1=2
'P
i jIiðhklÞ ! hIðhklÞij=P
hkl
Pi IiðhklÞ.
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33
CAPITULO III
Publicación número II
Crystal structure of shrimp arginine kinase in binary complexwith arginine—a molecular view of the phosphagen precursorbinding to the enzyme
Alonso A. López-Zavala & Karina D. García-Orozco & Jesús S. Carrasco-Miranda &
Rocio Sugich-Miranda & Enrique F. Velázquez-Contreras & Michael F. Criscitiello &
Luis G. Brieba & Enrique Rudiño-Piñera & Rogerio R. Sotelo-Mundo
Received: 13 March 2013 /Accepted: 3 July 2013# Springer Science+Business Media New York 2013
Abstract Arginine kinase (AK) is a key enzyme for energeticbalance in invertebrates. Although AK is a well-studied sys-tem that provides fast energy to invertebrates using thephosphagen phospho-arginine, the structural details on theAK-arginine binary complex interaction remain unclear. Here-in, we determined two crystal structures of the Pacific whitelegshrimp (Litopenaeus vannamei) arginine kinase, one in binary
complex with arginine (LvAK-Arg) and a ternary transitionstate analog complex (TSAC). We found that the arginineguanidinium group makes ionic contacts with Glu225,Cys271 and a network of ordered water molecules. On thezwitterionic side of the amino acid, the backbone amide nitro-gens of Gly64 and Val65 coordinate the arginine carboxylate.Glu314, one of proposed acid–base catalytic residues, did notinteract with arginine in the binary complex. This residue islocated in the flexible loop 310–320 that covers the active siteand only stabilizes in the LvAK-TSAC. This is the first binarycomplex crystal structure of a guanidine kinase in complexwith the guanidine substrate and could give insights into thenature of the early steps of phosphagen biosynthesis.
Keywords Arginine kinase . Binary complex .
Phosphagen . Crystal structure . Shrimp . Litopenaeusvannamei
Introduction
Under certain physiological situations in which fast energyproduction is required, phosphagens support cellular activityuntil catabolic pathways such as glycolysis and oxidative phos-phorylation are turned on to replenish ATP levels (McGilveryand Murray 1974; Wallimann et al. 1992; Yousef et al. 2002).Phosphagens, such as phosphoarginine (in invertebrates) andphosphocreatine (in vertebrates) play an important role as“energy storage” molecules due to their highly energetic phos-phate moiety that can be rapidly transferred to ADPwhen thereis a sudden cellular requirement for ATP (Ellington 2001).
Arginine kinase (EC 2.7.3.3) (AK) plays an important role ininvertebrate physiology by buffering the ATP pool accordinglyto cellular energy requirements (Fig. 1). AK and its vertebrate
A. A. López-Zavala :K. D. García-Orozco :J. S. Carrasco-Miranda : R. Sugich-Miranda :R. R. Sotelo-Mundo (*)Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo,A.C. (CIAD). Carretera a Ejido La Victoria Km 0.6, ApartadoPostal 1735, Hermosillo, Sonora 83304, Mexicoe-mail: [email protected]
R. Sugich-Miranda : E. F. Velázquez-Contreras :R. R. Sotelo-MundoDepartamento de Investigación en Polímeros y Materiales (DIPM),Universidad de Sonora, Blvd. Luis Encinas y Rosales S/N,Col. Centro, Hermosillo, Sonora 83000, Mexico
M. F. CriscitielloComparative Immunogenetics Laboratory, Department ofVeterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine andBiomedical Sciences, Texas A&M University, College Station,TX 77843, USA
L. G. BriebaLaboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad(LANGEBIO), Centro de Investigación y Estudios Avanzados(CINVESTAV) Km 9.6 Libramiento Norte CarreteraIrapuato-León, Irapuato Guanajuato, 36500, Mexico
E. Rudiño-Piñera (*)Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto deBiotecnología (IBt), Universidad Nacional Autónoma de México(UNAM), Av. Universidad #2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca,Morelos 62250, Mexicoe-mail: [email protected]
J Bioenerg BiomembrDOI 10.1007/s10863-013-9521-0
homolog creatine kinase (CK) belong to the guanidine kinase(GK) family (Stroud 1996). Although there are structural var-iations in their substrates, all GK family members have aguanidine group as the final phosphate acceptor (Ellington2001). AK has been isolated from multiple sources as a mono-meric 40 kDa protein, and in some cases as an homodimer ofapproximately 80 kDa (Guo et al. 2003; Wu et al. 2010; Shiet al. 2012). Several biochemical, kinetic and structural dataindicate that the detailed AK catalytic mechanism consists of areversible, direct, in-line phosphate transfer between ATP andthe arginine-guanidine group (Ellington 2001). Arginine andATP bind randomly to the active site and products are individ-ually released with a rapid equilibrium of enzyme:substrate andenzyme:product complexes (Blethen 1972).
Crystal structures of GKs from several sources have beenreported: dimeric CK from human muscle (PDB entry3B6R), Pacific electric ray (Torpedo californica, PDB entry1VRP), and cytosolic bovine retinal-type CK (PDB entry1G0W) (Tisi et al. 2001; Lahiri et al. 2002; Bong et al. 2008);as well as dimeric AK from sea cucumber (PDB entry 3JU6)(Wu et al. 2010), and monomeric AK from Trypanosomacruzi (PDB entry 2J1Q) (Fernandez et al. 2007), horseshoecrab, Limulus polyphemus (PDB entry 1BG0) (Zhou et al.1998) and recently, the white shrimp Litopenaeus vannamei(PBD entry 4 AM1) (Lopez-Zavala et al. 2012). MonomericAK contains 357 amino acid residues comprising two do-mains: a small N-terminal domain of ~100 residues arrangedin an irregular array of 6 short α-helices, and a larger C-terminal domain (~250 residues) formed by an alpha-betatwo-layer sandwich fold consisting of a central core of aneight-stranded antiparallel β-sheet flanked by seven α-helices (Zhou et al. 1998). The Limulus polyphemus AK(LpAK) crystal structure, forming a ternary state analogcomplex (TSAC) bound to ADP-Mg+2, arginine and a nitrateion, showed that when both substrates bound the AK activesite, a conformational change occurred in loop 309–321leading to a “closed ternary complex” (PDB entry 1BGO).This loop is located in the larger C-terminal domain and“covers” the active site as a lid, providing active site stabili-zation, substrate alignment, and avoiding wasteful ATP hy-drolysis during catalysis (Zhou et al. 1998). Moreover, in thesubstrate-free enzyme LpAK, known as the “open” form, thisloop is disorganized and it is not visible in electron density
maps. This observation is consistent with other AK struc-tures in the open form, including AK from Pacific whiteshrimp (PDB entry 4 AM1) and T. cruzi (PDB entry 2J1Q).Meanwhile, the loop 59–64 located in the small domain isalways ordered and it has been implicated in guanidine sub-strate specificity via hydrogen bridges from the backbone-loop to the arginine-carboxylate group (Zhou et al. 1998).
The structure of AK in a TSAC shows that precise pre-alignment of substrates contribute to catalysis (Zhou et al.1998; Yousef et al. 2002). Therefore, local and global con-formational changes in the entire molecule occur when theactive site is fully occupied by the substrates (Zhou et al.1998; Lahiri et al. 2002). However, lombricine kinase fromUrechis caupo (UcLK) crystal structure in complex withADP (without Mg2+) showed minimal conformationalchanges when compared to the substrate-free form (rootmean square deviation r.m.s.d.=0.54 Å) (Bush et al. 2011).
Small-angle X-ray scattering (SAXS) experiments provid-ed additional information about overall conformationalchanges to both AK and CK that occur upon nucleotide-Mg2+ binding. Similar results were reported by Liu et al. byintrinsic fluorescence emission spectra in AK fromMetapenaeus ensis (greasyback shrimp) when nucleotide in-teracts with the enzyme (Liu et al. 2011). Also, SAXS studiesshowed only small global changes when guanidine substrate(arginine or creatine) binds to the active site (Dumas and Janin1983; Forstner et al. 1998).
Structural work with GKs has focused on nucleotidebinding and TSAC complexes. As mentioned before, AKand other GKs catalyze bi-substrate random-ordered reac-tions. Therefore, the binding of guanidine-substrate is alsoimportant but remarkably less studied. Structural solutionstudies revealed that only small global changes occur uponarginine binding (Dumas and Janin 1983; Forstner et al.1998). Atomic details of arginine interactions alone withAK active sites have not been described to date. Actually,there are no available structural reports in the Protein DataBank related to the AK (or other GKs) in binary complexwith the substrate arginine.
Previously, we reported the purification, enzymatic activity(Garcia-Orozco et al. 2007) and crystallization of the marineshrimp Litopenaeus vannamei AK (LvAK) without any li-gands (open form) (Lopez-Zavala et al. 2012). AK has beenstudied from several crustacean species, with high amino acidsequence identity among them (>70 %). Biochemical andproteomic studies have found that LvAK is up regulatedduring the shrimp immune response mechanisms against viralinfection and in response to pattern recognition moleculesrepresentative of bacteria and yeast such as peptidoglycanand laminarin (Rattanarojpong et al. 2007; Yao et al. 2009).Interestingly, the β-subunit of the shrimp ATP synthase(Muhlia-Almazan et al. 2008; Martinez-Cruz et al. 2011)physically interacts with capsid proteins of the white spot
Fig. 1 The reversible reaction catalyzed by AK. In the forward reac-tion, AK synthetizes phosphagens for energy-cell storage. Under rapidcellular-energy requirements, AK hydrolyzes the phosphagen to supplythe ATP cellular necessities, backward direction
J Bioenerg Biomembr
syndrome virus (Liang et al. 2010; Zhan et al. 2013),suggesting that a connection between the innate immuneresponse of this crustacean and the bioenergetics machineryexists.
In this paper we report the crystallization and three-dimensional structure determination of LvAK in a binarycomplex with the substrate arginine (LvAK-Arg) at 1.9 Åresolution and “closed” form (LvAK-TSAC) at 1.6 Åresolution. To the best of our knowledge, this is the firstcrystal structure of a GK in binary complex with theguanidine substrate. On the other hand, the overall struc-ture of LvAK-Arg is more similar to ligand-free apo-LvAK than TSAC crystal structure. This LvAK-Arg crys-tal structure will provide information towards understand-ing how AK binds the guanidine substrate in the firstcatalytic stages.
Experimental procedures
LvAK purification and crystallization of the binaryLvAK-Arg complex and LvAK-TSAC
The LvAK was purified from white shrimp abdominal mus-cle as previously reported (Garcia-Orozco et al. 2007). LvAKpurity was verified by the presence of a single band(~40 kDa) in silver-stained SDS-PAGE. The LvAK activitywas measured with a direct colorimetric assay in the forwarddirection detecting the synthesis of arginine phosphate (Yuet al. 2002). For crystallization trials, LvAK was extensivelydialyzed against 10 mM Tris–HCl pH 8.0, 1 mM DTT andconcentrated with a 10-kDa ultrafiltration membrane(Amicon, Millipore, USA) to 20 mg/mL.
The LvAK-Arg binary complex was obtained by incubat-ing LvAK with 4 mM L-arginine for 30 min at 4 °C beforecrystallization trials. Successful crystallization experimentswere prepared using the micro batch method in Greinerplates (BioOne, USA) and solution #28 from the CrystalScreen I kit (Hampton Research, USA). The plates wereprepared setting on each well 1 μL LvAK-Arg binary com-plex mixed with 1 μL of the crystallization solution #28(0.2 M sodium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5and 30 % (w/v) PEG 8000), then 10 μL paraffin oil wasadded to cover the drop. The plates were incubated at 16 °Cand the crystals grew after 3 weeks to a size of0.35×0.2×0.15 mm. The LvAK (20 mg/mL) was co-crystallized with several reagents to form the TSAC: ADP16 mM, MgCl2 20 mM, L-arginine 40 mM and NaNO3
75 mM (all from Sigma-Aldrich, Mexico). The complexLvAK-TSAC was incubated for 30 min at 4 °C before thecrystallization droplets were prepared. The crystals wereobtained by vapor diffusion using the hanging drop methodin 24-well Limbro plates (Hampton Research, USA). The
drop was setup by mixing 2 μl of LvAK-TSAC with 2 μl ofsolution #28 from crystal screen I kit (Hampton Research).0.5 mL solution # 28 were added to the well, sealed withvacuum grease and stored at 16 °C. Crystals were grown aslarge square bars which were broken to small crystals(0.1×0.1×0.3 mm) using an acupuncture needle.
Before cryo-cooling, the crystal was transferred to a cryo-protectant solution (Milli-Q water and PEG 8000 in themother liquor were replaced with 30 % (v/v) PEG 400). Eachsingle crystal was soaked in the cryoprotectant solution for5 min, and then it was loop-mounted and flash-cooled underliquid nitrogen (100 K). For cryo-cooling of LvAK-TSACcrystals, all ligands (ADP, MgCl2, L-arginine and NaNO3)were added to the cryoprotectant solution to give the samefinal concentration as in the crystallization drop.
X-ray data collection, phase solving and crystal structuredetermination
Data collection was performed on beamline X6A of the Na-tional Synchrotron Light Source (NSLS), Brookhaven Na-tional Laboratory (BNL, Upton, NY, USA), using an ADSCQuantum 270 detector. X-ray diffraction data were collectedfrom single crystals at −0.9795 Å (12672 eV) and 0.9184 Å(13500 eV) (Table 1). The crystal-to-detector distance waskept at 200 mm and 230 mm (for LvAK-TSAC andLvAK-Arg, respectively) with an oscillation range per imageof 0.5 o. The crystals were exposed for 5 s for LvAK-TSAC,and for 10 s for LvAK-Arg to the beam under a nitrogenstream at 100 K. Data sets were analyzed using XDS (Kabsch2010) and SCALA softwares from the Collaborative Compu-tational Project Number 4 (CCP4) (Winn et al. 2011). TheLvAK-Arg crystal belonged to the P212121 space group, withunit-cell parameters a=56.4 Å, b=70.4 Å, c=82.1 Å.Matthews’s coefficient calculations indicated that there wasone molecule per asymmetric unit (VM=2.03 Å3 D−1, 39.5 %of solvent content) (Matthews 1968). Data analysis of theLvAK-TSAC crystal showed that it belongs to the P21 spacegroup with unit-cell parameters a=63.3 Å, b=67.2 Å,c=78.8 Å, β=92.1° and a Matthews’s coefficient parametersof VM=2.09 Å3 D−1 and 41.2 % of solvent content. Thesecalculations are in accordance with two molecules per asym-metric unit. Data-collection statistics are listed in Table 1.Phases for LvAK-Arg and LvAK-TSAC sets were determinedby molecular replacement in PHASER (McCoy et al. 2005),using the LvAK (PDB entry 4 AM1) coordinates previouslydetermined by our group (Lopez-Zavala et al. 2012) and thehorseshoe crab TSAC complex LpAK (PDB entry 1 M10)(Zhou et al. 1998) as search molecules, respectively. Refine-ment was performed using several cycles comprising theprograms PHENIX (Adams et al. 2010) and COOT for man-ual building (Emsley et al. 2010).
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Results and discussion
Analysis of guanidine binding site in LvAK-Arg crystalstructure
The AK catalytic mechanism has been extensively describedby classical methods (Blethen 1972). AK is one of most studiedenzymes of the GK family; these enzymes have a bi-substraterandom mechanism for transferring a γ- phosphate groupbetween ATP and the guanidine end of arginine. Each side ofthis reversible reaction has different physiological functions, inone direction to produce phosphagen (phosphoarginine) energystores and in the other direction to use it for ATP synthesis(Fig. 1). Each substrate has an independent binding site thatthrough a strong conformational change in the entire moleculecomes close together to facilitate the reaction (Zhou et al.1998). Several crystal structures of AKs both free and fullyoccupied by ligands have been reported. A few reports of othermembers of the GK family are in a binary complex with ADP-Mg+2 showingminimal conformational changes that are crucialfor catalysis (Bong et al. 2008; Bush et al. 2011). However,there is hardly any structural work related to binding of argininein AK (Dumas and Janin 1983; Forstner et al. 1998).
Crystal structures reported here shows the LvAK in a binarycomplex with arginine at 1.9 Å resolution and in a ternarycomplex with ADP-Mg+2, nitrate and arginine at 1.6 Å resolu-tion that represents the ternary transition state analog complex(TSAC) (Tables 1 and 2). The overall LvAK-Arg crystal struc-ture shows a canonical AK foldingwith anα-helical N-terminaldomain and a α-β C-terminal domain, the active site is located
between both domains (Fig. 2a). Interestingly, the LvAK binarycomplex shows a typical “open” conformation as in the apo-LvAK (Lopez-Zavala et al. 2012). A superposition betweenboth structures indicates no significant changes between them(r.m.s.d=0.20 Å for the C-α atoms) (Fig. 2a). Likewise, theUcLK crystal structure bound to ADP-Mg+2 suffers little con-formational changes related to the unbound substrate-free form(r.m.s.d.=0.54 Å considering only the C-α atoms) (Bush et al.
Table 1 Data reduction and re-finement statistics from binaryand ternary AK structures.Values in parenthesis representthe statistics at the highest reso-lution bin
a Rsymm=∑hkl∑ i|Ii(hkl)−(I(hkl))|/∑hkl∑ iIi(hkl), where Ii(hkl)and(I(hkl)) represent the diffraction-intensity values of the individualmeasurements and the corre-sponding mean values. Thesummation is over all uniquemeasurementsb Rmeas is a redundancy-indepen-dent version of Rsymm,Rmeas=∑h√nh/nh−1∑nh
i|Îh–Ih,i|/∑h
∑nhiIh,i, where Îh–1/nh∑nh
iIh,i
Data set LvAK-Arg LvAK-TSAC
X-ray source NSLS X6A NSLS X6A
Detector Quantum 270 CCD Quantum 270 CCD
Wavelength (Å) 0.9795 Å 0.9184 Å
Space group P212121 P21Unit-cell parameters (Å) a=56.4, b=70.4, c=82.1 a=63.3, b=67.2, c=78.8; β=92.1°
Number of residues 356 712
Monomers per asymmetric unit 1 2
Mathews coefficient (Å Da−1) 2.03 2.00
Solvent content (%) 39.5 41.2
Resolution range (Å) 19.1–1.9 (2.01–1.9) 14.8–1.6 (1.7–1.6)
Total reflections 189,792 (28,192) 325,408 (51,061)
Unique reflections 26,516 (4060) 86,195 (13,556)
Rsymma 0.060 (0.198) 0.049 (0.281)
Rmeasb 0.065 (0.213) 0.057 (0.328)
Completeness (%) 100 (96.1) 99.1 (98.2)
I/σ(I) 22.3 (5.4) 20.9 (4.9)
Wilson plot B value 15.15 11.73
Redundancy 7.1 (6.9) 6.3 (6.3)
Table 2 Refinement statistics
Data set LvAK-Arg LvAK-TSAC
Rwork/Rfree(5%) 0.1666/0.2155 0.1889/0.2157
Content of asymmetric unit
Protein atoms 2850 5784
Ligands 12 88
Water molecules 314 599
R.M.S.D. form ideal
Bond length (Å) 0.006 0.007
Bond angles (°) 0.998 1.208
Mean overall B value (Å2)
Protein 14.29 15.20
Solvent 39.85 18.20
Ramachandran plot, residues in
Most favored regions 348(98 %) 690 (97.0 %)
Additionally allowed regions 5(1.43 %) 12 (1.8 %)
Outliers 2(0.57 %) 8 (1.1 %)
PDB code 4BHL 4BG4
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2011). Also, the dimeric Torpedo californica creatine kinase(TcCK) crystal structure bound to ADP-Mg+2 was obtained inthe same crystal as TSAC. These results show that TcCKnucleotide complex has an open conformation and that theresidues involved in nucleotide binding did not change inrelation to the TcCK closed form (Lahiri et al. 2002).
GKs have different substrate specificities, which are di-verse in structural and physicochemical properties. In allGKs, the guanidine-binding loop is located in the N-terminaldomain and it has been proposed that the loop length isinversely correlated with substrate size. GKs with a small loopbind the largest guanidine substrate (Azzi et al. 2004). LvAK
has high amino acid sequence identity (≈70%) related to othermonomeric AKs, and a well-conserved guanidine-bindingloop comprised from residues 59 to 64. Figure 2b depicts asuperposition of LvAKbinary complex (black) and apo-LvAK(gray) residues that comprise the guanidine-binding site.
The LvAK-Arg structure shows that the substrate arginineis stabilized via backbone hydrogen bonds (Gly64, Val65and Gly66) to the carboxylate moiety and from the hydroxylof Tyr68 to the substrate amino group (Fig. 2b). Gly66backbone hydrogen bond is not shown. This result is consis-tent with the previously determined LpAK structure in theclosed form in which the active site is filled with all the
Fig. 2 Crystallographicstructures free-ligand andarginine-complex LvAK. aSuperposition of binary complex(yellow) and the free substrate ofLvAK (blue). No conformationalchanges in overall structure werefound after arginine binding(rmsd=0.26 Å). The guanidinesubstrate arginine is shown asspheres and colored by element.b The substrate arginine is wellstabilized via hydrogen bondsthrow the guanidine-bindingloop (residues 64–66). LvAK-Arg is shown in grey and apo-LvAK in black, both as widebonds. Glu224 is aligned towardthe guanidine end of Argininesubstrate (cylinders). Hydrogenbonds are shown as a dotted lineusing LvAK-Arg structure asreference. Arginine electrondensity is displayed as a bluemesh in a 2Fo-Fc map at 2.5σcontour
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ligands in the ternary analog complex (Zhou et al. 1998).Cys271 is another highly conserved residue that has beenshown catalytic important as noted by chemical modificationwith sulfhydryl-specific reagents performed by Marletta andKenyon and others authors (Marletta and Kenyon 1979;Buechter et al. 1992; Furter et al. 1993). This residue wasfound in the same orientation in both LvAK complexesreported here (Figs. 2b and 3b). Also, Glu225 is one of thetwo bases (along with Glu314) involved as catalytic acid–base assisting the nucleophile attack for phosphate transfer.
Besides, these two residues are directly implicated inprecise substrate guanidine-end alignment toward the
nucleotide phosphate group during catalysis (Pruett et al.2003). Surprisingly, in the LvAK-Arg structure almost allresidues in the guanidine-binding site are in the same posi-tion as in the free-ligand of LvAK structure, except theGlu225 side chain that is slightly rotated to be positionedperfectly towards the arginine guanidine-end via ionic bonds(Fig. 2b). Pruett et al. mutated this residue to Asp and Gln inLpAK to study the acid–base contribution during catalysis(Pruett et al. 2003). Crystal structures and enzymatic kineticstudies of these mutants show that the mutant enzymes havesignificantly less residual enzymatic activity (2–3 orders ofmagnitude) relative to the native LpAK and subtle
Fig. 3 a Superposition ofLvAK-Arg binary (yellow) andLvAK-TSAC (red) crystalstructures. In the guanidine-substrate binary complex loop310–320 was disordered as in the“open form” of the enzyme. Thisloop is stabilized in the closedform of LvAK-TSAC and servesas a “lid” to the active site(shown in green). ADP-Mg++
and Arginine are shown asspheres and nitrate ion ascylinders, all they are colored byelement. b The arginine-bindingsite did not show substantialconformational changes whensubstrates occupy the active sitein LvAK-TSAC (black) whencompared with LvAK-Arg(grey). Except, Glu314 (widebonds) stabilize and align thearginine (cylinders colored byelement) guanidine-end to thenitrate ion (cylinders) thatmimics the γ-phosphate of ATPin LvAK-TSAC. Substratescoordinates belong to the LvAK-TSAC. Arginine in the binarycomplex is presented as blackcylinders. Hydrogen bonds areshown as a dotted line. LvAK-TSAC Arginine electron densityis displayed as a blue mesh in a2Fo-Fc map at 3σcontour. Theelectron density and surroundingresidues for the ADP-Mg ++ arealso shown. Magnesium ion isshown as a yellow sphere
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perturbations of 5–14° toward the phosphagen guanidine-end. Substrate pre-alignment could be the most importantrole of Glu225 to facilitate the phosphate transference medi-ated by AK (Pruett et al. 2003). LvAK-Arg structure showsthat in the binary guanidine intermediate, small local confor-mational changes take Glu225 to its catalytic final position asin the enzyme ternary analog complex (Fig. 3b).
In comparison with the other two LvAK structures, theLvAK-TSAC has significant differences, most drastically anoverall closing towards the substrates. This is clearly shownwhen the binary LvAK-Arg (Fig. 3a, yellow) and the LvAK-TSAC (Fig. 3a, red) complexes were superimposed using theN-terminal (residues 1–99, r.m.s.d=1.40 Å for the C-α atoms)as fixed domain (Fig. 3a). Changes were observed in almost theentire C-terminal domain (residues 100–356), which orientsboth substrates in close proximity favoring catalysis as in otherAK structures (Zhou et al. 1998; Fernandez et al. 2007). Indetail, major conformational movements were found in loop310–319 (shown in green) since it positions over both sub-strates and serves as a “lid” to the enzyme active site. This loopis highly conserved in all monomeric AKs, LpAK(GTRGEHTESE) and LvAK (GTRGEHTEAE), and it is wellordered in crystallographic structures only when both substratesoccupy the active site in the transition state complex (Zhou et al.1998). Other kinases have similar conformational changes dur-ing nucleotide binding. Adenylate kinase is one well-studiedexample among the nucleoside monophosphate (NMP) kinasefamily (Randak and Welsh 2007; Daily et al. 2010).
Adenylate kinases, as other NMP kinases, consist of threetypical domains related to nucleotide binding: the NMP-binding, the CORE and the LID domains. The LID domainis known to have the largest conformational change duringnucleotide binding (~60 Å hinge bending) avoiding waste ofenergy during catalysis.
In AKs, Glu314 is located in loop 310–320 and it has beenproposed as an important base during catalysis. This residuehas interactions via salt bridge and hydrogen bond with thearginine guanidine-end, specifically with Arginine-Nη andNη2,respectively (Fig. 3b). Also, Glu314 positions the arginineguanidine-end in the right orientation toward the γ-phosphateof ATP (Pruett et al. 2003). However, in the binary LvAK-Argstructure no electron density was observed for loop 310–320.Therefore, this loop is disordered and did not appear over theactive site as in the LvAK-TSAC. Similarly, the structure of Tc-CK bound to the nucleotide substrate in a binary complex didnot show a well-ordered flexible loop (in CK residue Val325 isthe homologous position to Glu314 in AK). This loop movesto the correct place only when the guanidine substrate is boundto the active site as in the transition state providing a bindingpocket for creatine (Lahiri et al. 2002).
Similar experiments have been performed in other kinasesfrom different protein families (hexokinase or phosphoglyceratekinase) (McDonald et al. 1979; Pickover et al. 1979). It was
found from crystallographic studies of free ligand form and non-nucleotide substrate binary complex (glucose or 3-phosphoglicerate) that a large conformational change takes placein the entire molecule. In hexokinase, glucose binding results ina movement of up to 9 Å in one of the two domains and aclosure of the glucose binding pocket (McDonald et al. 1979).In contrast, binding ofMg-nucleotide does not cause changes inthe overall structure of these enzymes. As mentioned, in theLvAK-Arg structure the loop 310–320 is disordered, thereforeGlu314 was not visible in the binary-arginine complex crystalstructure. Hence, this residue appears to be not essential forarginine binding to the LvAK active site. Kinases avoid waste-ful ATP hydrolysis by the mechanism of induced fit, whichengages large conformational changes binding upon both sub-strates. This movements traps substrates and avoids the escapereaction intermediates (Koshland 1958; Knowles 1991).
Our findings are consistent with other previously reportedGKs binary nucleotide complex structures suggesting that thebinding of one substrate to the active site does not promote theloop 310–320 final catalytic position as in the ternary analogcomplex. Likewise, both SAXS studies and X-ray crystalstructures findings of individual binding of either two sub-strates (3-phospohoglicerate and Mg-ATP) to phosphoglycer-ate kinase do not lead to substantial domain rearrangements.Only binding of both substrates promotes the complete con-formational changes associated with catalysis (Harlos et al.1992; Varga et al. 2006). The LvAK-Arg structure showsarginine bound to the enzyme active site nearly in the sameposition as in the LvAK-TSAC. The guanidine substrate iscoordinated consistently in both reaction intermediates viahydrogen bonds with the backbone of residue Tyr68 of theguanidine specificity loop and salt bridges to Glu225. All ofthese residues did no show significant changes going frombinary-open to ternary-closed form.
Conclusions
In this work we present a previously undescribed stage of thereaction mechanism of AKs. Interestingly, the overall struc-ture of LvAK-Arg is more similar to apo-LvAK than to theternary-closed form. Also, arginine binding to the AK activesite does not causes global conformational changes. This isconsistent with SAXS experiments performed by Dumas andJanin (1983) and in CK (Dumas and Janin 1983; Forstneret al. 1998 #18). Furthermore, The LvAK-Arg structureshows in detail that upon arginine binding no major localconformational changes occur in the guanidine-binding site.Our findings together with other previously reported GKbinary complex structures suggest that binding of one sub-strate to the active site does not promote the proper arrange-ment of loop 310–320 as in the ternary analog complex.Binding of both substrates appears to be strictly necessary
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to achieve the appropriate AK conformational changes asso-ciated with catalysis. Future studies will allow a better un-derstanding of the guanidine substrate interaction with theenzyme during the first reaction stages.
Acknowledgements R.R. Sotelo-Mundo and M.F. Criscitiello thankgrant 2011–050 from the Texas A&M-CONACYT (Mexico’s NationalResearch Council for Science and Technology) Collaborative GrantProgram and CONACYT grants CB-2009-131859 and E0007-2011-01-179940 and COFUPRO RNIIPA-2012-024 grant. A.A. López-Zavala and J.S. Carrasco-Miranda thank CONACYT for their doctoralfellowship. Dr. Sugich-Miranda was a postdoctoral fellow at Dr.Sotelo’s Lab during this investigation, supported by Universidad deSonora. We thanks Dr. Vivian Stojanoff and the staff at BNL NSLSbeamline X6A for data-collection facilities. Beamline X6A is funded byNIGMS (GM-0080) and the US Department of Energy (No. DE-AC02-98CH10886). Dr. Sotelo-Mundo thanks support for a sabbatical leave atDIPM, Universidad de Sonora.
References
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J Bioenerg Biomembr
41
42
CAPITULO IV
Manuscrito en revisión editorial
Structure of nucleoside diphosphate kinase from the Pacific Shrimp (Litopenaeus vannamei) in binary complex with
purine and pyrimidine nucleoside diphosphates
Journal: Protein Science
Manuscript ID: Draft
Wiley - Manuscript type: Protein Structure Reports
Date Submitted by the Author: n/a
Complete List of Authors: Lopez-Zavala, Alonso; CIAD, Quinterio-Reyes, Idania; Universidad de Sonora, Carrasco-Miranda, Jesus; CIAD, Stojanoff, Vivian; Brookhaven National Laboratory, National Synchrotron Light Source Weichsel, Andrzej; University of Arizona, Chemistry and Biochemistry Rudiño-Piñera, Enrique; UNAM, Instituto Biotecnologia Sotelo-Mundo, Rogerio; Centro de Investigacion en Alimentacion y Desarrollo A.C., Recombinant Proteins Lab.
Keywords: nucleoside diphosphate kinase, shrimp, crustacea, Litopenaeus vannamei
John Wiley & Sons
Protein Science
Protein Science – Protein Structure Reports 1
Structure of nucleoside diphosphate kinase from the Pacific Shrimp (Litopenaeus 2
vannamei) in binary complex with purine and pyrimidine nucleoside 3
diphosphates 4
5
Alonso A. López-Zavala1, Idania E. Quintero-Reyes2, Jesús S. Carrasco-Miranda1, 6
Vivian Stojanoff 3, Andrzej Weichsel4, Enrique Rudiño-Piñera5, Rogerio R. Sotelo-7
Mundo1,* 8
9 1 Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. (CIAD). Carretera a 10
Ejido La Victoria Km 0.6, Apartado Postal 1735, Hermosillo, Sonora, 83304, 11
México. 12 2 Universidad de Sonora, Campus Cajeme. Blvd. Bordo Nuevo s/n, Ejido 13
Providencia, Cd. Obregón, Sonora, 85039 México. 14
3 National Synchrotron Light Source, Brookhaven National Laboratory, Upton, New 15
York, 11973 United States of America. 16 4 Macromolecular Crystallography Core. The University of Arizona, Biological 17
Sciences West, 1041 E. Lowell St. Tucson AZ, 85721 United States of America. 18 5 Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología 19
(IBT), Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) Av. Universidad 20
2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos 62210, México. 21
22
23
* Authors to whom correspondence should be addressed: Rogerio R. Sotelo-Mundo, 24
Ph.D., CIAD ([email protected]) Tel.: +52-662-289-2400 ext 352 25
Page 1 of 18
John Wiley & Sons
Protein Science
2
26
Keywords: Nucleotide diphosphate kinase, deoxyadenine binary complex, crystal 27
structure, shrimp, Litopenaeus vannamei, 28
29
Abstract 30
Nucleoside diphosphate kinase (NDK EC2.7.4.6) is an enzyme that catalyzes the third 31
phosphorylation of nucleoside diphosphates leading to nucleoside triphosphates for 32
DNA replication. The NDK from Litopenaeus vannamei (LvNDK) expression is 33
known to be regulated under a viral infection. Also, as determined by isothermal 34
titration calorimetry LvNDK binds both purine and pyrimidine deoxynucleoside 35
diphosphates with high binding affinity for dGDP and dADP and no binding 36
interaction heat for dCDP. In order to investigate the differences in selectivity, 37
LvNDK was crystalized as binary complex with both acceptor (dADP and dCDP) and 38
donor (ADP) phosphate group nucleosides diphosphate substrates. 39
40
Introduction 41
Nucleoside diphosphates coming from either a de novo or a salvage pathway require a 42
final phosphorylation stage that leads to substrates for DNA polymerase. Nucleoside 43
diphosphate kinase (EC 2.7.4.6; NDK) is responsible to catalyze the final 44
phosphorylation reaction of nucleoside diphosphates. This reaction is a reversible 45
phosphate transfer to both ribo- and deoxyribonucleoside diphosphates using ATP as 46
energy donor to provide adequate nucleosides for RNA or DNA synthesis (1). All 47
NDKs are known to have a relaxed substrate specificity, since they phosphorylate 48
both deoxy and riborybonucleotides (2; 3). The reaction follows a ping-pong 49
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mechanism, which involves a covalent intermediate phospho-histidine residue in the 50
active site (4; 5). This enzyme has been characterized from several prokaryotic and 51
eukaryotic sources, and was described as an important housekeeping enzyme 52
maintaining and controlling the intracellular nucleotides pool (6). 53
Several crystallographic and biochemical studies indicated that most NDKs 54
are hexameric except the tetrameric NDK from bacteria Myxoccocus xhantus (7-10). 55
Tetramers of NDKs are formed through a dimer of dimers, while the hexameric 56
arrangement is achieved either by a trimer of dimers units or dimer of trimers units (1; 57
5). Hexameric Dictyostelium discoideum NDK is one of the most well characterized 58
enzyme from this family. As other NDK, it shows a characteristic fold with a βαββαβ 59
motif, similar to the ferredoxin fold where α-helices pack onto β-sheet motif creating 60
a high conserved hydrophobic central core (11). Other two typical features that 61
complete the NDK monomer folding are the Kpn loop (called by Drosophila killer-of-62
prune mutant) and the C-terminus. The Kpn loop is a small compact structure 63
comprised by residues 96-113 in human NDK. The C-terminal fragment is composed 64
of the last 20 residues in hexameric NDKs and this small domain interacts with 65
neighboring subunit residues. This interaction is associated with enzymatic activity 66
lose and quaternary stabilization of hexameric NDK. In tetrameric Myxococcus 67
xhantus the C-terminus is shorter by 10 residues and is not implicated in NDK 68
function (12). In most of NDK crystal structures in complex with nucleoside di-69
phosphate, the active site present a phosphate substrate binds to the side of β sheet 70
and the purine or pyrimidine base is located between a hydrophobic pocket formed by 71
a conserved Phe and Iso/Val. Also binary complex indicates that the active site as a 72
preformed rigid core with very little change in protein conformation after nucleotide 73
binding and in the covalent phosphorylated histidine intermediate. 74
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The NDK from marine shrimp (Crustacea Decapoda) Litopenaeus vannamei 75
(LvNDK) contains 151 residues, and as other NDKs show high amino acid identity 76
(>75%) with hexameric human and D. discoideum NDKs and only ≈ 42% identity 77
with tetrameric NDKs from M. xhantus and E. coli (12; 13). In general LvNDK is 78
highly conserved among eukaryotic and bacterial NDKs (40% and 60% identity, 79
respectively). 80
We have studied shrimp NDK in solution, it is a homo-trimer of ≈ 57 kDa, and 81
binds and phosphorylates nucleoside diphosphates (14). The aim of this work is to 82
experimentally characterize the structural interaction between an invertebrate NDK 83
with either acceptors (dADP and dCDP) or donor (ADP) phosphate substrates in their 84
binary complexes. Since this enzyme appears to be key in the viral infection with the 85
white spot syndrome virus, it may provide clues towards novel antiviral strategies. 86
87
Results and Discussion 88
89
Overall LvNDK binary complex structures 90
To achieve the nucleotide phosphorylation reaction, the active site of LvNDK 91
has a nucleotide binding site and a catalytic nucleophile histidine (H117), which is 92
part of a phosphorelay, transferring a phosphate ion obtained from ATP to the 93
nucleoside diphosphate (11). LvNDK was not an exception as previously reported by 94
our group using enzymatic activity and isothermal titration calorimetry assays (14). 95
As we have previously shown recombinant LvNDK is active and it binds 96
tightly nucleoside diphosphates, thus we proceeded to co-crystallize it with 97
deoxynucleotides (dADP and dCDP) and one ribonucleotide (ADP), including in all 98
cases Mg2+
. All crystals obtained belonged to space group C2221 with similar unit cell 99
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parameters, and highest resolution limits from 1.8 to 2.3 Å. The Matthews coefficient 100
indicates one trimer per asymmetric unit (p.e LvNDKdADP,VM = 2.4 3 D-1, 49.5 % of 101
solvent contents) (15) (see Table 1 for details). This is consistent with our previous 102
data showing that LvNDK is a trimer in solution by size exclusion chromatography 103
studies (16). 104
Overall structure of each LvNDK monomer shows a typical α/β folding 105
including six α-helixes with a central core formed by four-stranded antiparallel β-106
sheet (see Fig. 1.). This β-sheet, a small flexible loop (55-59 residues) and the Kpn 107
loop (called killer-of-prune in a Drosophila mutant) participate in the nucleotide-108
binding site. Also, the Kpn loop located at the center of the trimer also plays an 109
important role in stabilizing quaternary structure (9). Likewise, the C-terminus of 110
each monomer makes inter subunit contacts with neighboring side chains, providing 111
structural stability to the enzyme (17). 112
The Cα atoms root mean square deviation (RMSD) of each monomer within 113
the complete structure is less than 0.6 Å. In this work, the nucleotide-Mg2+ complex 114
occupies each active site. One striking feature of NDK is the lack of specificity 115
towards the nucleoside base. The positioning of a purine (ADP) vs. a pyrimidine 116
(dCDP) is superimposable, as the phosphate-binding pocket and the ribose contacts 117
(K11 and N114) and invariant in position (Fig. 2). The nitrogenous bases are 118
contacted by an hydrophobic sandwich comprised by F59 and V111, which are 119
conserved among all known NDKs. 120
121
LvNDK nucleotide binding site: comparison with ribo- and deoxyribo-nucleosides 122
diphosphates 123
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To understand structural details of nucleotide binding, LvNDK was co-crystalized 124
with both ribo- (LvNDKADP) and desoxy- (LvNDKdADP and LvNDKdCDP) nucleoside 125
diphosphates. 126
Figure 3 shows the superposition of the active site in the LvNDK binary 127
complex with dADP and ADP. The position of amino acid residues R87 and K11, and 128
also F59, V111 and H117 (not shown) are identical (RMSD < 0.22 Å). The 129
hydrophobic “sandwich” made by side chain of F59 and V111 to the purine ring is 130
remarkable, so the electron density strongly supports the ligands modeled in two 131
different structures. 132
The LvNDK binary complex with ADP (Figure 3, ligand in green) has two 133
hydrogen bonds between K11 and the 2´- and the 3´-OH ribose group. These contacts 134
are consistent with those reported by Cherfils et al (1994) in the crystal structure of 135
NDK-ADP from Dictyostelium discoideum and also by other authors (18; 11; 19). 136
When dADP is co-crystallized with LvNDK (Figure 3, ligand in magenta), the 137
position of the ribose is identical besides the lack of electron density for the 2´- 138
hydroxyl group. Nonetheless, “replacing” the ribose hydroxyl with a water interaction 139
with K11 conserves the hydrogen-bonding pattern. The same water-K11 hydrogen 140
bonding was also observed in LvNDK complex with dCDP. K11 and N114 are well 141
conserved among all NDK kinases creating a preformed rigid pocket that includes an 142
ordered water molecule as needed (18). 143
Although all structures reported here appear very similar, the main 144
conformational change for NDKs occur during binding of nucleoside 145
monophosphates or with the ligand-free structures, as reported by Souza (19). 146
We conclude that the LvNDK broad substrate recognition is achieved through 147
a hydrophobic interaction between Phe and Ile residues and the heterocyclic base, and 148
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binding of deoxynucleosides is assisted through a hydrogen bond with a water 149
molecule. This suggests that invertebrate NDKs could phosphorylate analog 150
nucleosides that could act as chain terminators for DNA viruses like the white spot 151
syndrome virus (20). 152
153
Materials and Methods 154
Recombinant nucleotide diphosphate kinase from L. vannamei (GenBank 155
DQ907945) was obtained from a synthetic gene optimized for expression in E. coli, 156
and its purification has been describe elsewhere (16). 157
158
LvNDK binary complex co-crystallization with different nucleosides diphosphate 159
A screening of crystallization conditions of LvNDK was made using Crystal 160
Screen I kit from Hampton Research (Aliso Viejo, CA, USA) by the micro batch 161
method in Greiner plates. Four different nucleotide complexes were obtained by 162
incubating LvNDK (20 mg mL-1) with ADP, dCDP and dADP at 20 mM 163
concentration in solution containing also: 100 mM NaCl, 40 mM MgCl2 and 4 mM 164
DTT. Each nucleotide complex was incubated for 30 min at 277 K before the 165
crystallization trials. The drops were set up by mixing 1 µL of nucleotide-enzyme 166
complex solution with 1 µL of Crystal Screen I crystallization solutions (50 solutions) 167
and covered with 10 µl of paraffin oil. The plates were incubated at 289 K and 168
monitored every 3 days until crystals appeared.. 169
After a week, crystals grew up in three different crystallization buffers for all 170
the LvNDK-nucleotide complexes. Specifically, LvNDK binary complex crystals were 171
obtained: Solution # 6 (0.2 M Magnesium Chloride hexahydrate, 0.1 M Tris-HCl pH 172
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8.5 and 30% (w/v) PEG 4,000) and solution # 22 (0.2 M Sodium acetate trihydrate, 173
0.1 M Tris-HCl pH 8.5 and 30% (w/v) PEG 4,000) for all nucleotides (LvNDKdADP, 174
LvNDKdCDP, LvNDKADP); Solution # 19 (0.2 M Ammonium acetate, 0.1 M Tris-HCl 175
pH 8.5 and 30% (v/v) 2-propanol) only for dCDP binary complex. Before freezing, 176
the crystals were transferred into a cryo-cooling solution containing 30% (v/v) PEG 177
400 as a PEG 4,000 substituent in the mother liquor. Cryoprotectant solutions were 178
supplemented with appropriate ligands to give the same final concentration as in the 179
crystallization drops. Twenty-four single-crystals, including all binary complexes, 180
were mounted using cryo loops according to its size, flash-cooled in liquid N2 and 181
stored at 100 K. 182
183
X-ray data collection and solving structure 184
LvNDK crystals were transported to the National Synchrotron Light Source 185
(NSLS), Brookhaven National Laboratory (BNL, Upton, USA.) for data collection. 186
Diffraction experiments were performed in beamline X6A facilities using an ADSC 187
Quantum 270 detector. Data set for each binary complex was collected from single 188
crystal at wavelength 0.979 Å (12672 eV) at 100 K. 200 images were collected for 189
each crystal with an oscillation range of 1.0 o in all the cases. The crystal-to-detector 190
distance was kept at 250, 290 and 230 mm for LvNDKADP, LvNDKdCDP and 191
LvNDKdADP crystals, respectively. Data sets were reduced and scaled using XDS 192
package (21). Data-collection statistics are listed in Table 1. Initial analysis was 193
performed with LvNDKdADP data set which phase problem solution was solved by 194
molecular replacement using NDK crystal structure from bovine retina as search 195
model (PDB entry 1BE4) (22). Phases were obtained by molecular replacement using 196
PHASER in the Collaborative Computational Project Number 4 suite (CCP4) (23; 197
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24). LvNDKdADP structure was refined and used as a starting model in refinements of 198
the other LvNDK binary complexes. Several refinement cycles were performed using 199
the programs PHENIX (25) and COOT for manual building (26). Ligands were added 200
manually by visual inspection of the electron density at the active site using a 2Fo-Fc 201
map. All figures were build in CCP4mg program (27). 202
203
204
Acknowledgments 205
A.A. Lopez-Zavala, I.E. Quintero-Reyes and J.S. Carrasco-Miranda were 206
supported by a Ph.D. fellowship from CONACyT (Mexico´s National Science and 207
Research Council). R. Sotelo-Mundo acknowledges financial support from 208
CONACyT grant CB-2009-131859, E0007-2011-01-179940 and grant 2011-050 from 209
the Texas A&M-CONACyT Collaborative Grant Program. We thank for technical 210
support at BNL NSLS X6A to Edwin Laso, and to Gerardo Reyna, Felipe Isac, Luis 211
Leyva, Adalberto Murrieta, Jose Luis Aguilar and Martin Peralta for bibliographical 212
and computational support from CIAD. 213
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FIGURES AND TABLES LEGENDS 317 318 Table 1. Data reduction and refinement statistics of LvNDK binary complex 319 structures. 320 321 Figure 1. Ribbon representation of trimeric LvNDK structure with one ligand 322 molecule bound to each monomer. Inter subunits contacts are made mainly by C-323 terminal and the killer-of-prune loop of each neighboring monomer. Each subunit is 324 showed with different color (yellow, blue and green) and nucleoside diphosphate is 325 presented as spheres colored by atom type. 326 327 Figure 2. Superposition of LvNDK active site in binary complex with dCDP-Mg2+ (as 328 green cylinders) and ADP-Mg2+ (as red-crimson cylinders). Catalytic histidine (H117) 329 and other amino acid residues that interact with phosphate group (R87), sugar moiety 330 (K11 and N114) and F59 and V111 that stabilize the nitrogen base of nucleoside 331 diphosphate substrate are invariant and no conformational changes were observed 332 upon ligand binding (RMSD = 0.22 Å). In the figure, a magnesium ion is shown as a 333 grey sphere. 334 335 336 Figure 3. Specific K11 interaction with both deoxy and ribo ADP is mediated by one 337 water molecule in LvNDK nucleotide binary complex structures. H-bonds are noted 338 between R87 and K11 with nucleotide substrate. The LvNDK in complex with ADP 339 (in green) structure shows that K11 amide group makes tow H-bonds with 2´- and 3-340 OH ribose group. One of these contacts is absent when deoxy-nucleotides are bound 341 to active site (dADP, magenta) and water 205 interacts with K11 replacing the lacking 342 interaction with 2-OH ribose group. Electron density map shows that 2-OH group is 343 absent in the dADP binary complex but is clearly present in the LvNDK with ADP 344 structure. Nucleotide electron density map is displayed as a blue mesh for the 2Fo-Fc 345 map at 3ȪȪȪȪcontour level. Magnesium ion was omitted to simplify the illustration. 346 LvNDKdADP main chain is show as white ribbon, while LvNDKADP as orange ribbon 347 representation. Hydrogen bonds are presented as a dotted line. 348
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TABLE 1
Data reduction and refinement statistics of LvNDK binary complex structures.
Values in parenthesis represent the statistics at the highest resolution bin.
Data set ADP dADP dCDP
X-ray source NSLS X6A NSLS X6A NSLS X6A
Detector Quantum 270 CCD Quantum 270 CCD Quantum 270 CCD
Wavelength (Å) 0.979 Å 0.979 Å 0.979 Å
Space group C2221 C2221 C2221
Unit-cell parameters (Å) a = 69.8, b =120.8, c = 103.3 a= 70.1, b= 134.3, c=104.7; a= 70.1, b= 135.3, c=104.8
Number of residues 430 453 453
Monomers per asymmetric unit 3 3 3
Mathews coefficient (Å Da-1
) 2.1 2.4 2.4
Solvent content (%) 42.5 49.2 49.6
Resolution range (Å) 34.8 - 2.0 (2.1 - 2.0) 19.8 - 2.10 (2.2 - 2.1) 19.3 - 2.3 (2.4 - 2.3)
Total reflections 242,640 (23,658) 207,177 (10,259) 176,768 (18,322)
Unique reflections 29,462 (2,912) 26,320 (2,111) 21,500 (2,199)
Rsymm §
0.145 (0.735) 0.142 (0.621) 0.171 (0.702)
Completeness (%) 99.6 (96.4) 91.2 (95.1) 95.2 (97.7)
I/σ(I) 16.7 (3.4) 15.4 (2.7) 13.4 (3.5)
Wilson plot B value (Å2) 24.01 20.36 22.50
Redundancy 8.2 (8.1) 7.8 (5.4) 8.2 (8.3)
Rwork/Rfree(5%) 0.178/ 0.217 0.189/0.248 0.188/ 0.256
Content of the asymmetric unit
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Protein atoms 3371 3579 3579
Ligand atoms 56 81 75
Water molecules 422 481 221
R.M.S.D. form ideal
Bond length (Å) 0.012 0.013 0.015
Bond angles (°) 1.27 1.87 1.55
Mean overall B value (Å2)
Protein 24.7 21.70 21.80
Ligand 27.2 25.70 33.90
Solvent 31.1 26.80 25.00
Ramachandran plot, residues in
Most favored regions 421 (98%) 439 (97.0%) 439 (97 %)
Additionally allowed regions 6 (1.3%) 9 (2.1%) 10 (2.3%)
Outliers 3 (0.7%) 4 (0.9%) 3 (0.7 %)
PDB code 4UOH 4UOF 4UOG
PDB Structure factors code r4uohsf r4uofsf r4uogsf
Rsym = Σhkl Σi |Ii(hkl) - (I(hkl)| / Σhkl Σi Ii (hkl), where Ii(hkl)and (I(hkl)) represent the diffraction-intensity values of the individual measurements and the corresponding mean
values. The summation is over all unique measurements.
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