celular

Cultivos celulares y sus aplicaciones

Instituto de Oncología

“Angel H. Roffo”

Área de Investigación

Dpto. Biología Celular

El cultivo celular

Téc. Alicia Rivelli

Breve introducción histórica

En 1907 el Dr. Harrison cultivó células del tubo neural de embrión de rana

En 1910 el Dr. Burrows cultivó explantos de tejido de embrión de pollo y junto con el Dr.Carrel fueron los primeros investigadores en intentar cultivo de células de mamíferos.

Entre 1940-1945 se logran replicar virus sobre células cultivadas. En 1952 se establece la línea celular HeLa (primera línea celular de

origen humano) Durante la década del 70 los cultivos celulares se incorporan a la

ingeniería genética. En 1975 los Drs. Koehler y Milstein establecen la primera línea

celular productora de anticuerpos monoclonales. En los últimos años la aplicación de la tecnología del cultivo

celular a permitido grandes avances en la comprensión de los mecanismos implicados en procesos intra e intercelulares.

¿Para qué cultivar células in vitro?

ESTUDIOS DE INVESTIGACIÓN: comprender la fisiología celular, toxicología, y virología.

INGENIERIA DE TEJIDOS: transplantes , injertos (piel, hígado, hueso, cartílago).

PRODUCCIÓN DE BIOLOGICOS: anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas, vacunas virales (polio, aftosa, moquillo etc.)

CITOGENÉTICA: estudios cromosómicos.

TRANSGENICOS: organismos genéticamente modificados.

Diferentes tipos de cultivos de tejidos:

Cultivo de órganos: mantenimiento de órganos o parte de órganos in vitro (por ejemplo corazón).

Cultivo de tejidos y explantes: mantenimiento de tejidos in vitro.

Cultivo de células

Cultivo de células:

Se define como el conjunto de técnicas de aislamiento de células y obtención de poblaciones celulares in vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

Diferentes tipos de cultivos celulares

Primario: iniciado a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo.

Líneas celulares: se origina del cultivo primario, a partir del primer subcultivo exitoso.

Línea celular continua: células que han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Expectativa de vida “infinita”.

Cultivo primario:

Pasos: Aislamiento del tejido de interés.

Disociación mecánica y enzimática del tejido

Obtención de la suspensión celular.

Siembra en soporte adecuado para la proliferación en monocapa o en suspensión.

Subcultivos

Una vez que el cultivo alcanza la confluencia (máxima proliferación posible en el soporte en que se encuentra), es necesario tomar una porción células y transferirlas a un nuevo soporte (repique o pasaje).

Crecimiento celular:

En monocapa

Las células crecen

En suspensión

Células en monocapa

Los cultivos cuyas células son dependiente de anclaje crecen formando monocapas de células adheridas al plástico o vidrio.

Para despegar las células se utilizan enzimas que disgregan la matriz extracelular como la tripsina y la colagenasa.

Células en monocapa

Células en suspensión

Las células que proliferan sin necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje (característico de células hematopoyéticas) crecen en suspendidas en el medio de cultivo correspondiente.

El repique se realiza mediante una dilución de la suspensión celular.

Líneas celulares continuas

BHK: fibroblastos de riñón hámster cirio dorado.CrFK: fibroblasto de riñóngato doméstico.MDCK: epitelio de riñón canino.CHO: epitelio de ovario dehámster chino.HeLa: epitelio tumoral decuello uterino humano.MDBK: epitelio de riñón adulto.HUVEC: endotelio de vena umbilical humana

Línea celular LM3

Línea celular establecida a partir de pasajes sucesivos in vitro de un cultivo primario del adenocarcinoma mamario murino M3.

El adenocarcinoma mamario M3 surgió espontáneamente en una ratona BALB/c endocriada en el bioterio del Instituto de Oncología “Ángel H. Roffo”.

Las células LM3 presentan un fenotipo altamente invasivo y metastásico al ser inoculadas en ratones singeneicos y en cultivo muestran una morfología epitelial poliédrica

ABAC

Asociación BancoArgentino de Células

Desde 1987 mantiene y administra líneas celulares en distintos centros de investigación, proveyendo células congeladas o en cultivo a cambio de un arancel.

Mantenimiento de líneas celulares

Repique o pasaje: para mantener las células en cultivo.

Congelación (criopreservación): para preservar las células a lo largo del tiempo (años) y mantener un stock para los próximos usos.

Criopreservación

Técnica:

Se levanta la monocapa por tripsinización Se obtiene una suspensión celular. Se centrifuga 800-900 rpm durante 10 min,

para separar la fracción celular del medio de cultivo.

El pellet celular se resuspende en medio de congelación (SFB o medio enriquecido mas DMSO o Glicerol –anticongelantes-)

Criopreservación

Se fraccionan en criotubos. Colocar en recipiente adecuado 20 minutos en

heladera y luego se la lleva a freezer -80°C durante 24-48 hs

Se guardan en tanque de nitrógeno líquido

Componentes del medioambiente del cultivo:

Medio de cultivo:( aporta nutrientes, vitaminas etc.)

Suplementos: (ej suero que aporta factores de crecimiento)

pH: ( ej: 7,4 )

Temperatura: (ej. 37° C)

Gas: Dióxido de carbono (ej. 5-7%)

Soportes: materiales adecuados para el crecimiento (ej vidrio, plástico, biológicos etc.)

Medios de cultivo

Suplementos

Atmósfera y temperatura

Estufa de cultivo con atmósfera de Dióxido de carbono

Soportes

Estériles Generalmente se utiliza material de plástico:

Soportes

Biológicos:

El laboratorio de cultivo celular

Además del equipamiento usual se requiere:

Microscopios: invertido con contraste de fase, de fluorescencia, etc.


Flujo Laminar o campana de seguridad biológica: mantienen la esterilidad del área de trabajo.


Espacios fríos:- Heladeras (4°C)- Freezer (-20, -40,-80 °C)- Tanque de Nitrógeno Liquido (- 196°C)

Factores críticos

No biológicos: orden, limpieza, vestimenta adecuada para cada sector, etc.

Biológicos: CONTAMINACIONES

La contaminacióncontaminación puede ser visible o no, destructiva o no, pero en todos los casos

tiene efectos adversos

Contaminaciones Biológicas

Microorganismos:

Bacterias

Hongos/Levaduras

Mycoplasmas

Otras células

Contaminaciones Biológicas

Efectos adversos sobre el metabolismo celular

Pobre calidad de resultados experimentales Pérdida de células valiosas Pérdida de productos celulares (por

ejemplo producción de antígenos para vacunas, etc.)

Pérdida de tiempo, dinero y esfuerzo

MUCHAS GRACIAS!!!

Aplicaciones en Oncología

Téc. Silvina Romero

Instituto de Oncología “Angel H. Roffo”

Aplicaciones de los cultivos celulares en la Investigación en cáncer

Investigación en Oncología

Se realizan ensayos tendientes a:

Caracterizar el comportamiento de las células tumorales in vitro e in vivo.

Revertir la agresividad tumoral mediante drogas y herramientas genéticas tanto in vitro como in vivo.

Introducción

El cáncer es un conjunto de enfermedades en las cuales el organismo produce un exceso de células, con crecimiento y división más allá de los límites normales, invasión del tejido circundante y, a veces, metástasis.

La metástasis es la propagación a distancia de las celulas tumorales, por vía linfática o sanguínea, lo que implica el crecimiento de nuevos tumores en un lugar diferente al tumor original (primario).

Estas propiedades diferencian a los tumores malignos de los benignos, que son limitados y no producen metástasis.

Celulas normales vs tumorales

Células normales

Células tumorales

Características de las células tumorales

1. Forma (pleomorfismo): cambio de en la morfología y tamaño del citoplasma.

2. Adhesión/ Movilidad: la reducción de la adhesión entre células y con la matriz celular facilita la movilidad celular favoreciendo la aparición de metástasis

Cambios en el citoesqueleto: estos cambios afectan:


Cambios nucleares: tiene valor diagnóstico Número: celulas multinucleadas Forma: mas grandes o mas

pequeños Organización de los núcleos:

(nucleolos prominentes) Hipercromasia: por la presencia

de mayor cantidad de ADN.


Producción de enzimas proteolíticas: permiten invadir los tejidos adyacentes facilitando la migración y la propagación de las células tumorales.


Grado de diferenciación celular: las células neoplásicas por su alta tasa de proliferación se desdiferencian pareciéndose al tipo celular que le dio origen.

Alteraciones en el crecimiento: crecen de manera desordenada, pierden la polaridad celular y no respetan límites por contacto célula-célula.

Resistencia a la apoptosis: muerte celular programada

Biología Molecular del Cáncer

La transformación maligna implica la adquisición progresiva de una serie de cambios genéticos y bioquímicos específicos que actúan desobedeciendo los fuertes mecanismos antitumorales presentes en las células normales.


Se trabaja con dos modelos

Celulares: Líneas celulares cancerígenas (in vitro)

Animales de experimentación: Ratones (in vivo) a los cuales por inyección de la celulas tumorales se les genera la enfermedad experimentalmente.

Estudios in vitro


Lineas celulares tumorales usadas en nuestro laboratorio.– LM3 : Ca mamario murino– MCF7: Ca mamario humano– MB49: Ca de vejiga murino– T24: Ca de vejiga humano– LP07: Ca de pulmón murino– Entre otras…

Estudios celulares

Estudios celulares:

Morfológicos

Funcionales

Mixtos

Cromosómicos

Estudios Morfológicos:

Observación en fresco o post fijación (formol neutro) de monocapas celulares, en microscopio óptico invertido, contraste de fase, fluorescencia etc.

Estudios funcionales:

1. Viabilidad celular2. Adhesión *3. Ensayos clonogénicos*4. Migración*5. Actividad enzimática*6. Citotoxicidad

*evalúan la capacidad invasiva y metastásica.


1- Viabilidad celular: Se siembra en placas multipozo una cantidad

conocida de células Se las somete a “hambreado” colocando

medio de cultivo sin suero (SFB) durante 72hs Se evalúa la actividad celular (viabilidad) por

fotocolorimetría. La producción del color se debe a la

metabolización del reactivo (MTS) llevado a cabo por las células vivas.


1- Viabilidad celular:


2- Ensayo clonogénico en agar:

Capacidad de crecer en un medio independiente de anclaje .

Formación de colonias celulares a partir de una única celula.


2- Ensayo clonogénico:


3- Migración: Ensayo de cicatrización de heridas

Se realiza una herida en la monocapa y se deja a las células crecer durante un tiempo determinado en presencia de tratamientos o condiciones específicas. La migración se evaluará a través del porcentaje de cubrimiento del área inicial.


3- Migración: Ensayo de cicatrización de heridas

Tipo celular 1

Tipo celular 2

Tipo celular 3


4- Citotoxicidad celular:

Se utiliza para encontrar la dosis justa de drogas o reactivos que generen el efecto deseado sin dañar la monocapa.

Se puede buscar la muerte de la totalidad de las células (ej. Drogas quimioterápicas).


5- Citotoxicidad celular:

Igual cantidad de celulas en cada posillo.Dosis creciente de reactivo o drogaEl resultado se evalua con una curva dosis respuesta.

Estudios mixtos

Mofológicos y funcionales: Inmunofluorescencia: empleo de

Ac.fluorescentes

Estudios cromosómicos

Cariotipo: estudia la morfología y número de los cromosomas

Nos da una idea de la evolución de los cultivos celulares.

Regiones homogéneamente

teñidas Translocaciones

Estudios cromosómicos

Estudios Moleculares


Se utiliza:

Lisados celulares: el producto de la destrucción celular y purificación de la fracción a utilizar (proteínas, ácidos nucleicos, etc)

Partes celulares: obtención de núcleos, citoplasmas, membrana celulares etc.

Medios condicionados: se utilizan los medios en los que crecieron las células y se estudian factores de crecimiento, proteínas, etc. secretadas al exterior.

Fundamento:

Migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico

estas partículas migran hacia el polo – o positivo+ según la combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.

Separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas.

Aportan un potente criterio de pureza

Electroforesis en gel

Utilidades:

Electroforesis en gel:

Gel de Poliacrilamida: para separar proteínas.

Gel de Agarosa: para separar Ácidos Nucleicos.

Separación de moléculas Electroforesis en gel


Biomoléculas mas importantes en investigación:

ADN

ARN

PROTEINAS

Estudios del ADN

Electroforesis en gel

El ADN extraído por lisis celular, se corta con enzimas para obtener diferentes fragmentos.

Se realiza la corrida electroforética en gel de agarosa para separar fragmentos de ADN e identificarlos según su peso (kb)

Luego de la electroferesis, se tiñe el gel con colorantes que emiten fluorescencia al ser excitado con luz UV:

Estudios del ADN

Colorantes fluoerescentes BROMURO DE ETIDIO: altamente tóxico y

mutagénico.

Estudios del ADN

Colorantes fluoerescentes SYBR green, SYBR safe, SYBR gold. No es mutagénico ni tóxico.

Estudios del ADN

PCR: Reacción en cadena de la Polimerasa

Usos: Detección de mutaciones Amplificación de genes de interés Estudios diagnósticos

Estudios del ADN

Transfección: Introducción de un fragmento de ADN externo a una célula animal.

Para qué? Caracterizar oncogenes Confirmar la identidad de genes Síntesis de ARN Expresión de proteínas, etc Estudio de síntesis y transporte intracelular

Cómo se introduce el ADN a la célula?

Una de técnicas es usando virus. El proceso se llama INFECCIÓN Una vez que el virus infecta las células en cultivo:

1. El fragmento de ADN de interés pasa del citoplasma al núcleo celular.

2. Se expresa produciendo el efecto deseado.

3. El ADN puede incorporarse en las células transfectadas de dos formas:

Momentánea: transfección transiente. Llevada a cabo por Adenovirus

Estable: implica la integración del ADN genoma celular. Retrovirus.

Selección de las células transfectadas

Junto con el ADN a insertar se incorporan genes que nos permiten identificar en cultivo a las células

transfectadas.

Genes mas utilizados: Resistencia a antibióticos: Hygromicina G418

Las células que no incorporaron el ADN durante la transfección mueren al colocar estos atb.

Permiten la expresión de GFP (proteína verde fluorescente)

Proteína verde fluorescente GFP

Cultivos celulares Animales de laboratorio

La proteína GFP fluorece bajo luz UV, la presencia esta proteína en la célula nos da la idea de una transfección exitosa: si está la proteína en la celula también esta nuestro ADN de interés.

Estudios de ARN

Electroforesis en gel:

Gel tenido con BrEty mirado con UV

Estudios de ARN

Recientemente:

Transfección con ARN

ARN interferente

Suprime la expresión de un gen en particular.

Es un ARN complementario al ADNm y al unirse a éste promueve su degradación.

Estudios de Proteínas

Se usan lisados celulares Sirve para identificar, cuantificar y evaluar la

función de proteínas como: Enzimas Proteínas estructurales Receptores

Sirve para evaluar indirectamente la funciones de genes a través de su producto:

Las Proteínas!

Estudios de Proteínas: Western Blot

Western Blot

Western Blot

Para la identificación de la proteína de interés se utiliza un “marcador de peso molecular”, que indica PM correspondiente a cada altura del gel.

Western Blot

Estudios In vivo


Animales de experimentación: contamos con un bioterio con cria propia de ratones. BALB/C

C57 B16/ J-GFP

Estudios in vivo

Objetivo: Estudiar el comportamiento in vivo de los modelos

celulares que generados in vitro.

Metodología: Inyección subcutánea, endovenosa, intraperitoneal,

etc., de las células en estudio.

Colocación de parches de las drogas en estudio en ratones a los cuales se les provocó experimentalmente la enferemdad.

Estudios in vivo

Se evalúa: Capacidad tumorigénica: porcentaje de toma

tumoral. Capacidad metastásica espontánea: producción

de metástasis por inoculación de celulas tumorales in situ.

Capacidad metastásica experimental: producción de metástasis por inoculación ev de las células en estudio.

Estudios in vivo

Capacidad tumorigénica

Estudio in vivo

Metástasis experimentales:

- via e.v.

- 21 días post inyección se cuentan las mts pulmonares

Aplicaciones en otros campos

Otras aplicaciones:

Virología:

Aislamiento y multiplicación de virus Producción de vacunas Estudio y producción de antivirales Detección de virus desconocidos Estudios de oncogénesis viral

Otras aplicaciones:

Transplantes/Injertos: Cultivo de piel Cultivo de celulas stem (pluripotentes) Cultivo de islotes pancreaticos,

hepatocitos, etc

Otras aplicaciones:

Fertilización in vitro Producción de biológicos (proteinas,

anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas).

Producción de transgénicos: GMOs (organismos geneticamente modificados: soja, arroz, ovinos, caprinos, etc.)

Transgenesis parcial: Terapia génica en humanos.

Agradecimientos:

Área de Investigación Instituto Roffo:

- Dra Lydia Puricelli

- Dr Martin Krasnapolski

- Lic. Maria Ines Diaz Bessone

- Lic. Denis Belgoroski

MUCHAS GRACIAS!!!

celular

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