castellanos sanchez maria elena
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Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRIA EN MICROBIOLOGÍA
INCIDENCIA DE ADENOVIRUS Y CALICIVIRUS EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS DE LA COMUNIDAD DE NAZARETH DEL MUNICIPIO
MARA- ESTADO ZULIA.
Trabajo de Grado presentado ante la División de Estudios para Graduados
para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología
Autor: María Elena Castellanos Sánchez C.I: 14.134.762
Tutora: MgSc. Luciana Costa de León
Co-Tutora: MgSc. Leticia Porto
Maracaibo, Febrero 2008
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
INCIDENCIA DE ADENOVIRUS, CALICIVIRUS Y ENTEROVIRUS EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS DE LA COMUNIDAD DE NAZARETH
DEL MUNICIPIO MARA- ESTADO ZULIA.
Autor: Lic. Castellanos Sánchez María Elena ___________________________
C.I: V-14.134.762 Firma
Dirección: Urbanización San Francisco calle 160
sector 6 casa Nº 01
Teléfono: 0261-7612135 / 0414-0702991
Correo electrónico: [email protected]
____________________
MgSc. Luciana Costa de León.
C.I. 4..517.843
Tutor
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
El jurado nombrado por el Comité Académico de la Maestría en Microbiología, para evaluar el Proyecto de Trabajo de Grado, titulado:” INCIDENCIA DE ADENOVIRUS, CALICIVIRUS Y ENTEROVIRUS EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS DE LA COMUNIDAD DE NAZARETH DEL MUNICIPIO MARA- ESTADO ZULIA”, presentado por la Lic. María Elena Castellanos Sánchez., C.I: 14.134.762, ante la División de Estudios para Graduados como requisito para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología
Maracaibo, Enero 2007.
Jurado Evaluador
____________________________ ______________________ MgSc. Luciana Costa de León MgSc. Francisca Monsalve C.I: 4.517.843 C.I: 13.624.773 ____________________________ MgSc. Deynis Leon C.I: 10.405.136
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INDICE GENERAL
Resumen
Abstract
Dedicatoria
Índice de Tablas
Índice de Anexos
Introducción………………………………………………………………………………………6
Objetivo General..............................................................................................................14
Objetivos Específicos......................................................................................................14
Materiales y Métodos
1-Población…………………………………………………………………..…………..…15
2- Recolección de la información………………………………………….……………..15
3- Recolección de la muestra…………………::……………….………………………..16
4- Métodos…………………………………………………………………………...……..16
4.1- Determinación de Adenovirus mediante la técnica de ELISA ……………..16
- Preparación de las muestras fecales para la
determinación de Adenovirus…………………………………………………16
- Procedimiento para la determinación de Adenovirus…………………….17
- Resultados para la determinación de Adenovirus…………………..........18
4.2- Determinación de Calicivirus y Enterovirus…..……...……………………..19
- Muestras fecales para la determinación de
Calivirus y Enterovirus…………………………………………………..…..19
- Extracción del RNA para Calicivirus y Enterovirus……………………….19
- Trascripción reversa para la obtención de ADN complementario
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para la determinación de Calicivirus y Enterovirus………………..……..20
- PCR para la determinación de Calicivirus……………………………….20
- Electroforesis………………………………………………………………...21
4.3- Determinación de Enterovirus…………………………………...…………..22
5- Consideraciones éticas………….……………………………………………………..…22
6- Metodología estadística aplicada………………………………………..........................23
Resultados………………………………………………………………………………………24
Discusión………………………………………………………………………………………..30
Conclusiones……………………………………………………………………………………35
Recomendaciones….………………………………………………………………………….36
Referencias Bibliográficas...............................................................................................37
Anexos…………………………………………………………………………………………..41
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
Castellanos, María. INCIDENCIA DE ADENOVIRUS Y CALICIVIRUS EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS DE LA COMUNIDAD DE NAZARETH DEL MUNICIPIO MARA- ESTADO ZULIA. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. División de Estudio para Graduados, Maestría de Microbiología. Maracaibo, Venezuela. 2008
RESUMEN
Las diarreas virales, constituyen una de las principales causas de morbi-mortalidad en niños de los países subdesarrollados. Objetivo: Determinar la incidencia de Adenovirus, Calicivirus y Enterovirus en niños menores de 5 años de la comunidad de Nazareth del Municipio Mara Estado Zulia. Metodología: Fueron tomadas 46 muestras de heces de niños menores de 5 años, a los padres se les realizó una encuesta. La determinación de Adenovirus fue realizada por la técnica de ELISA y para la determinación de Calicivirus y Enterovirus fue usada PCR. Resultados: Ausencia de infección por los virus Adenovirus y Calicivirus y 47,63% de positividad para Enterovirus. Conclusiones: La lactancia materna y la adquisición de anticuerpos de la madre, pueden ser factores de protección en el caso de Calicivirus. Para Adenovirus, posiblemente la recolección de muestras al azar disminuyó la posibilidad de detectar el virus, el mismo ha sido detectado principalmente en muestras con diarreas. El elevado porcentaje de incidencia de Enterovirus, indica su presencia en la zona Palabra Clave: Adenovirus, Calicivirus, Enterovirus, diarreas, niños, PCR.
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
Castellanos, María. INCIDENCE OF ADENOVIRUSES AND CALICIVIRUSES IN CHLIDRENS MINO OF 5 YEAR IN THE COMUNITI OF NAZAREHT- MUNICIPIO MARA- ZULIA. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. División de Estudio para Graduados, Maestría de Microbiología. Maracaibo, Venezuela. 2007.
ABSTRACT
The viral diarrheas constitute one of the principal reasons of morbimortality in the infantile population of sub developed countries. Objective: Determine the incidence of Adenoviruses, Caliciviruses and Enteroviruses in the 5 year old minor children’s of Nazareth’s community, Municipality Mara, Zulia. Methodology: There took 46 dregs samples of children’s of 5 year old minor, to the parents was realized a survey. The determination of Adenoviruses was realized by the ELISA technique and for determination of Caliciviruses and Enteroviruses, was used PCR. Results: Absence of positives samples for Adenoviruses and Caliciviruses and a 47,82% of positives samples of Enteroviruses. Conclusions: The mother’s nourishment and the acquisition of mother antibodies can be protection factors in case of Caliciviruses. For Adenoviruses possibly the capture of sample at random diminishes the possibility of detecting the virus since the same one has been detected principally in samples with diarrheas. The high value of Enteroviruses incidence, indicate the presence in the zone.
Key words: Calicioviruses, Adenoviruses, Enteroviruses, PC
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DEDICATORIA
En esta oportunidad me he rodeado de personas invalorables que de una u otra forma
se convirtieron en pilares sólidos para la culminación de una de mis metas
profesionales.
Dios, por su luz que ilumina mis pasos aun en la oscuridad, por guiarme y llevarme de
la mano durante todos estos años de vida.
Papi, el mejor papá del mundo, que aunque no este a mi lado ahora, me acompaña
todos los días desde ese lugar maravilloso a donde seguro Dios lo guió, si no fuera por
ti que me incentivaste hoy no viera cristalizado este sueño.
Mami, por ser mi apoyo en todo sentido, por ayudarme a rectificar en tantas ocasiones,
por haberse convertido desde hace casi 2 años en Mamá y Papá, gracias por estar
siempre conmigo.
Eugenia, mi hermana, mi amiga, mi confidente, con la que comparto casi todas mis
experiencias en esta vida, gracias hemanita por estar siempre a mi lado.
Antonio, mi hermano al que a pesar de todo quiero como al mejor hermano que pude
haber tenido, si no fuera por ti muchas sonrisas no existirían.
Mi tutora MgSc. Luciana Costa, no pude haber tenido mejor tutora, a lo largo de
aproximadamente 3 años, se ha convertido en mi ejemplo a seguir como profesional.
Mi cotutora MgSc. Leticia Porto, en mejores manos no pude estar, merece todo mi
respecto como profesional dedicada a su insigne labor.
MgSc Mariangela Bracho, sin su invaluable colaboración mi tesis no estaría completa.
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MgSc. Francisca Monsalve y Dr. Jesús Estevez, gracias por aportar su granito de
arena.
Yenddy y Raimy, si no fuera por Uds. Los días en el laboratorio seria algo monótono,
definitivamente son el toque divertido, sin dejar a un lado su profesionalismo.
Marina, Yaritza, Lourdes, Ricardo, y a todos los integrantes del Laboratorio Regional de
Referencias Virológicas que formaron parte de mis días durante este largo recorrido.
Angela, porque a pesar de los años seguimos siendo amigas, siempre he contado con
tu apoyo incondicional.
Jessica, compañera de esta historia, con la que compartí muchos momentos y que a lo
largo de los días se sumo a i lista de amigos verdaderos.
Angel, que desde hace 1 año te has convertido en quien me da ánimos, en quien borra
mis lagrimas, en quien siempre esta conmigo a pesar de la distancia, te has convertido
en alguien con un significado único para mi.
A todos muchas gracias, sin la presencia de cada uno de ustedes mi vida no seria igual.
Maria Elena Castellanos S.
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INDICE DE TABLAS
Pag.
Tabla 1
Distribución de los niños menores de 5 años de la
comunidad de Nazareth por sexo y grupo etario…………………………………26
Tabla 2
Distribución de los factores de riesgo relacionados con
el estilo de vida de los niños menores de 5 años de la
comunidad de Nazareth……………………………………………………………..27
Tabla 3
Resultados para la determinación de Enterovirus según el sexo…………….28
Tabla 4
Resultados por edad realizado en 46 muestras de niños
menores de 5 años de la comunidad de Nazareth para
determinar la presencia de Enterovirus……………………………………………28
Tabla 5
Distribución de casos positivos para Enterovirus según los
factores involucrados en su aparición……………………………………………...29
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INTRODUCCION
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INTRODUCCION
Las enfermedades diarreicas en niños menores de 5 años, constituyen una de las
principales causas de morbi - mortalidad en países en vías de desarrollo, reportándose
un elevado número de episodios al año 1- 3
La Organización Mundial de la Salud (OMS) asocia las enfermedades diarreicas
frecuentemente al consumo de agua o alimentos contaminados 2. Los factores
ambientales y sanitarios son considerados importantes, en la aparición de estas
enfermedades y su propagación en poblaciones de bajo nivel socioeconómico.
Constituyéndose estas comunidades en reservorio considerable de las enfermedades
virales 3.
Múltiples episodios de diarrea en el primer año de vida pueden deteriorar el estado
nutricional y causar graves secuelas. Se ha estimado que, en Asia, África y América
Latina, cada año mueren alrededor de 3,3 millones de niños menores de 5 años por
diarrea y ocurren más de mil millones de episodios 3-5.
En Venezuela, la diarrea aguda representa uno de los principales problemas de salud
pública. Constituye el 60% de la morbi - mortalidad de las enfermedades de notificación
semanal del país 3,5. Su incidencia es considerablemente elevada en la edad pediátrica,
especialmente en los niños menores de 1 año en quienes la letalidad alcanza el 0,95%;
seguido de el grupo de 1 a 5 años con una letalidad de 0,28% 5,6.
Para el año 2000, la mortalidad por diarrea en Venezuela ocupó el 12º lugar de las 25
primeras causas de mortalidad general y la 3° en las causas de mortalidad infantil, lo
que demuestra la importancia de esta patología principalmente en la población menor
de 5 años 6.
Para la semana epidemiológica Nº 52 (25 de al 31 del Diciembre del año 2005), en
Venezuela fueron diagnosticados 37.843 casos de diarreas, con 3 defunciones
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registradas, encontrándose el mayor número de casos en menores de 15 años, con
24.225 (64%). Los estados con la más alta incidencia son: Zulia, Carabobo, Bolívar,
Anzoátegui, Miranda, Aragua, Falcón y Monagas, en los cuales se concentró el 69,08%
de los casos reportados 7.
Según el anuario de mortalidad del 2006, publicado por el Ministerio del Poder Popular
para la Salud; en Venezuela se registraron 1329 muertes producidas por diarreas de
tipo infecciosas en niños menores de 5 años, de las cuales 231 fueron reportadas en el
estado Zulia, para el grupo etario antes mencionado 8.
De acuerdo con las estadísticas venezolanas en el 2007, se reportaron más de
1.815.385 casos de diarrea en todo el país, de estos 5640, ocurrieron en el Zulia,
siendo este el Estado que presentó el mayor número de casos de síndrome diarreico
durante todo el año 9.
La existencia de partículas víricas en muestras de heces de pacientes que sufrían de
enfermedades diarreicas agudas fue demostrada en la década del año 1970, con la
microscopía electrónica. Los principales virus productores de gastroenteritis en humano
son los Rotavirus, Calicivirus, Astrovirus y Adenovirus. Otros virus con menor
trascendencia epidemiológica son: Coronavirus,y Torovirus 10.
Rowe et al., (1953) describieron por primera vez el Adenovirus; reconocieron que un
agente transmisible estaba destruyendo a las células epiteliales mientras intentaban
establecer cultivos celulares de amígdalas y tejido adenoideo, de allí deriva su
nombre11.
Adenovirus pertenece a la familia Adenoviridae y comprende los géneros
Mastadenovirus y Avianadenovirus que afectan respectivamente, a mamíferos y aves.
Describiéndose hasta 49 serotipos relacionados con la infección en los humanos10.
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Adenovirus es un virus de ADN, sin envoltura. La partícula vírica presenta un tamaño
de 70 nm de diámetro (12). La cápside, de naturaleza proteica, se compone de 252
capsómeros que conforman una estructura icosaédrica. Dichos capsómeros pueden ser
de 3 tipos morfológicos: hexones, pentones y unas estructuras que se proyectan al
exterior, llamadas fibras que presentan un nódulo terminal. La longitud de las fibras
difiere de unos subgéneros a otros 13.
Los serotipos 40 y 41, constituyen el 59 % de los Adenovirus encontrados en las heces
causando un 7% de casos de diarrea en niños (2). Las infecciones producidas por
Adenovirus no han demostrado estar asociadas a ciertas épocas del año, no obstante
se ha descrito una disminución de los casos de gastroenteritis por Adenovirus en el
verano (14,15). La adquisición de anticuerpos sucede a temprana edad, de los 4 a 5 años
el 50% de los niños han adquirido anticuerpos contra adenovirus entéricos.
El diagnóstico de las infecciones por adenovirus entéricos se establece habitualmente
por ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), aglutinación de látex o inmunocromatografía.
Otros métodos de caracterización de Adenovirus entéricos son el análisis de
polimorfismo de fragmentos de restricción (RFLPs), Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) y la hibridación en dot-blot 10,13.
Las infecciones por Adenovirus presentan una elevada morbilidad que se acompaña de
una baja mortalidad. Aparecen de forma epidémica por brotes a lo largo de todo el año,
y estos afectan a numerosos y variados sistemas de nuestro organismo. Los síndromes
más frecuentes son producidos a nivel respiratorio y gastrointestinal 16.
Giordano et al. (2001) señalan que los serotipos de Adenovirus productores de diarreas,
son responsables del 4 al 10% de las diarreas nosocomiales al igual que de las
extrahospitalarias a nivel mundial 17.
Según Gutierrez et al. (2005) la mayoría de los estudios epidemiológicos sobre las
diarreas agudas en infantes se han realizado en países en los que a lo largo del año se
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observan las 4 estaciones pero no en países en los que solo se dan periodos, como lo
es el caso de Colombia y Venezuela, donde las enfermedades diarreicas agudas son
endémicas con repuntes de epidemias 18.
Los Calicivirus humanos pertenecen a la familia de virus ARN denominado Caliciviridae.
Tras la secuenciación del genoma del virus Norwalk o Norovirus 19 y de otros virus de la
familia 18, el Comité Internacional sobre Taxonomía de Virus estableció la existencia de
4 géneros dentro de la familia Caliciviridae, dos de ellos de Calicivirus de animales
(Lagovirus y Vesivirus) y dos de Calicivirus humanos, los virus tipo Norwalk (Norwalk
like viruses = NLVs) y virus tipo Sapporo (Sapporo like viruses = SLVs) 15.
Hoy en día Calicivirus es considerado uno de los principales agentes virales asociados
a brotes de diarrea no-bacteriana, brotes estos que usualmente ocurren en
comunidades cerradas 20.
Morales et al. (2007) señalan que los Norovirus representan una de las principales
causas de diarreas endémicas en todos los grupos etarios, a diferencia de los
Saporovirus, los cuales han sido principalmente asociados a diarreas endémicas en
niños 21. Los Calicivirus son virus altamente resistentes al ambiente y son trasmitidos
por vía la fecal- oral a través del contacto directo entre personas, así como también a
través del agua y alimentos contaminados 21. En Venezuela, existen reportes de
circulación de Calicivirus entre adultos y niños señalándolo como causa importante de
diarrea, tal vez la segunda en importancia después de Rotavirus 22,23.
Los viriones se componen de una única proteína estructural de la cápside. Las técnicas
de criomicroscopía electrónica revelan la estructura de simetría icosaédrica de la
cápside 24. La proteína estructural, constituida por 180 moléculas, se pliega en 90
dímeros formando una cubierta continua con protusiones en forma de arco. Una
característica clave es la existencia de 32 depresiones en forma de copa, situadas en
los ejes del icosaedro, de cuya denominación latina, calix, deriva su nombre 25.
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El genoma de los Calicivirus humanos consiste en una cadena sencilla de ARN de
polaridad positiva. El genoma de los NLVs se organiza en tres secuencias de lectura
abierta (ORF). La ORF1 codifica una poliproteína precursora de las proteínas no
estructurales, la ORF2 codifica la proteína de la cápside y la ORF3 codifica una proteína
pequeña cuya función no se conoce 25. Estudios recientes indican que se trata de una
proteína estructural menor 26.
El genoma de los SLVs difiere del anterior, de manera que la ORF1 codifica las
proteínas no estructurales y, además, la proteína estructural de la cápside. La ORF2
codifica una proteína pequeña de función desconocida similar a la ORF3 del virus
Norwalk. En los SLVs se ha visto también un ORF3 de significado incierto todavía. Los
estudios sobre las diferencias entre ambos genomas han llevado a la subdivisión en
géneros dentro de los genogrupos 27,28.
El virus Norwalk es el prototipo de los Calicivirus humanos, durante mucho tiempo
también denominados "pequeños virus redondos estructurados" (small round-structured
viruses, SRSV), y actualmente considerado un miembro del género "virus Norwalk-like"
(NLV). Otro género lo constituyen los "virus Sapporo-like" (SLV). Los NLV se dividen en
tres genogrupos, GGI, GGII y GGIII. Los genogrupos GGI y GGII infectan a los
humanos, e incluyen 5 y 10 clusters genéticos, respectivamente. Los virus del GGIII se
han detectado en ganado bovino y porcino. Al genogrupo GGI pertenecen, por ejemplo,
los virus Norwalk, Southampton y Desert Shield, mientras que en el GGII se incluyen los
virus Hawaii, México, Lordsdale y Grimsby, entre otros. Los Calicivirus humanos no se
han conseguido propagar en cultivos celulares, lo que ha supuesto una importante
limitación para su estudio. Sin embargo, la expresión de la proteína de la cápside vírica
en células de insecto mediante el sistema de baculovirus recombinantes ha permitido
producir partículas pseudovíricas (virus-like particles o VLP) que se han utilizado como
fuente de antígeno para obtener sueros y anticuerpos monoclonales. El diagnóstico de
las infecciones gastrointestinales por Calicivirus humanos se realiza actualmente
mediante la detección del ácido nucleico por técnica de RT-PCR, utilizando distintos
pares de oligonucleótidos 10,21.
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Aunque determinados enterovirus se asocian con frecuencia a brotes epidémicos,
dando lugar a un síndrome específico, los mismos serotipos pueden, en otras
ocasiones, ser responsables de infecciones esporádicas, con distintas manifestaciones
clínicas, incluso asintomáticas. Por otro lado, diferentes virus pueden producir el mismo
síndrome. Por estas razones, las manifestaciones clínicas no son una base satisfactoria
para el diagnóstico 29.
Los Enterovirus pertenecen a la familia Picornaviridae, que consta de cuatro género, a
su vez los Enterovitrus se clasifican en: Poliovirus tipos 1, 2, 3; Coxsackievirus A: 23
tipos, A1-A24 (el Coxsackie 23 es conocido como Echovirus 9); Coxsackievirus B: tipos
B1-B6; Echovirus (Enteric Cytopathogenic Human Orphan): 31 tipos; Enterovirus tipos
68-71: previamente clasificados como Echovirus o Coxsackievirus. Los Enterovirus
presentan una cápside de simetría icosaédrica, sin envoltura; tienen un tamaño
pequeño (20-30 nm), poseen ARN de cadena única y polaridad positiva. Su genoma se
divide en 4 regiones que codifican proteínas estructurales y 2 regiones no codificadoras,
reguladoras. Sus cuatro proteínas estructurales: VP1, VP2, VP3 y VP4 se sintetizan
como una poliproteína en la que el extremo 5´ está unido covalentemente a una
pequeña proteína VPg. Dentro de cada grupo, existe un número de serotipos definidos
por los epítopos de la cápside que se deben a modificaciones estructurales de la
superficie del virión. Los epítopos antigénicos, que definen a cada serotipo, estimulan la
formación de anticuerpos específicos que se comportan como neutralizantes de la
infección, ya que no permiten su unión al receptor celular. La evolución de los serotipos
sigue un proceso de deriva antigénica, en el que durante el proceso de copia del
genoma se producen errores que introducen mutaciones puntuales. Estas mutaciones
son acumulativas y modifican progresivamente la estructura de la cápside 29.
Debido al ciclo biológico de los Enterovirus, estos virus penetran por vía oral, donde
pueden ser detectados durante largos períodos, y se excretan de forma muy prolongada
en heces. Por este motivo, los aislamientos realizados en estas muestras clínicas son
muy difíciles de valorar en cuanto a su significación clínica, en el caso de los poliovirus,
puede tratarse de un virus vacunal si el paciente ha sido vacunado hace poco o ha
tenido contacto con alguna persona vacunada 30- 32.
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Según Cinek et al. (2006), las infecciones por Enterovirus son comunes en la infancia,
causando numerosas infecciones asintomáticas, sin embargo esas infecciones
asintomáticas pueden ser asociadas con el desarrollo de enfermedades crónicas no
infecciosas(33).
La población de Nazareth ha sido considerada una de las mas pobres del Municipio
Mara, la misma se encuentra ubicada a orillas del Lago de Maracaibo del Estado Zulia,
cabe resaltar el estado de contaminación en que se encuentra el lago, debido a los
múltiples desechos que son vertidos cada día por las industrias y las poblaciones
cercanas, haciéndolo reservorio de diferentes agentes productores de diarreas, entre
ellos los virus. Las viviendas se caracterizan por ser de 2 tipos, una corresponde a las
construcciones en tierra construidas con diferentes materiales (bloques, zinc, cartón) y
la otra construida sobre el agua, denominadas palafitos, lo que implica un contacto
directo con aguas contaminadas. No poseen red de aguas negras, el agua de consumo
la obtienen de camiones cisternas o de una tubería común. Se observa falta de
asfaltado y cúmulos de basura. Todas estas características hacen a esta comunidad
propicia para la aparición, propagación y circulación de numerosos agentes virales ente
ellos Adenovirus, Calicivirus y Enterovirus, que pueden atentar contra la salud de los
niños menores de 5 años, por ser este grupo etario el de mayor susceptibilidad a
padecer enfermedades virales.
OBJETIVO GENERAL
Determinar la incidencia de Adenovirus, Calicivirus (Sapporo y Normovirus) y
Enterovirus en niños menores de 5 años en la población de Nazareth del Municipio
Mara del Estado Zulia.
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OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar la presencia de Calicivus y Enterovirus mediante la técnica de: PT-
PCR en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio Mara del
Estado Zulia.
Determinar la presencia de Adenovirus mediante la técnica de ELISA en
muestras de niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio Mara
del Estado Zulia.
Determinar los factores de riesgo en la aparición de Calicivirus, Adenovirus y
Enterovirus en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio
Mara del Estado Zulia.
Correlacionar de la incidencia de Calicivirus, Adenovirus y Enterovirus con los
factores de riesgo en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del
Municipio Mara del Estado Zulia.
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MATERIALES Y METODOS
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MATERIALES Y METODOS 1- Población: La población objeto de estudio estuvo constituida por 46 niños menores de 5 años de la
comunidad de Nazareth, del Municipio Mara del Estado Zulia; para el año 2005 la
comunidad estimada era de 276 niños menores de 5 años 34.
2- Recolección de la información: Se realizó una encuesta a cada representante, la cual incluyó: datos personales,
familiares, económicos y sociales, entre otros, se consideraron además datos
relacionados con la alimentación, el agua de consumo, los depósitos de basura, y otros
aspectos relacionados con la vivienda. (Anexo1)
3- Recolección de las Muestras: Se recolectaron muestras de heces, de los niños seleccionados previamente al azar; las
muestras fueron trasladadas en refrigeración mediante un medio de transporte
adecuado al laboratorio de Referencias Virológicas de la Facultad de Medicina de La
Universidad del Zulia.
4- Métodos: Para el diagnóstico de Adenovirus se realizó un Inmunoensayo Enzimático (ELISA),
cuya sensibilidad es de 95%
Para el diagnóstico de Calicivirus y Enterovirus, las muestras fueron sometidas a una
RT-PCR, para determinar los principales serotipos circulantes, que atacan a los niños
de esta comunidad.
4.1- Determinación de Adenovirus mediante la técnica de ELISA El ensayo IDEIATM Adenovirus es un enzimoinmunoenzayo enzimático cualitativo para
la detección de Adenovirus en heces humanas o en cultivos celulares infectados.
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- Preparación de las muestras fecales para la determinación de Adenovirus Se añadió 1ml de diluyente de muestra a un recipiente, para preparar una suspensión
de 10% de la muestra fecal añadiendo aproximadamente 0,1 g de heces sólidas o
aproximadamente 100ul de heces líquidas. Mezclar y dejar reposar 10 minutos.
Las suspensiones fecales anteriormente preservadas en formalina deben diluirse, en
diluyente de muestras IDEIATM Adenovirus, para preparar una suspensión al 10% antes
de hacer el ensayo.
El ensayo IDEIATM Adenovirus utiliza un anticuerpo monoclonal en un inmunoensayo
enzimático tipo “sándwich” de fase sólida para detectar un epítopo hexon específicoal
género de Adenovirus. Los micropocillos separables se revisten de un anticuerpo
monoclonal específico para el Adenovirus. Se añade una suspensión fecal o líquido
puro de cultivo celular al micropocillo y se incuba simultáneamente con un anticuerpo
monoclonal específico para el Adenovirus conjugado con peroxidasa de rábano. El
antígeno de Adenovirus que existe en la muestra es capturado entre el anticuerpo en la
fase sólida y el anticuerpo conjugado con la enzima. Después de una incubación de 60
minutos a temperatura ambiente, se lavan los micropocillos con tampón de lavado
diluido para quitar el exceso de la muestra y cualquier anticuerpo libre que no esté
conjugado con enzima. Se añade un cromógeno a los pocillos y se incuba durante 10
minutos a temperatura ambiente.
- Procedimiento para la determinación de Adenovirus Se utilizaron suficientes pocillos para muestras y controles. Añadiéndole 2 gotas (100ul)
de cada muestra fecal diluida, control negativo o control positivo a los micropocillos
individuales.
Se añadió 2 gotas de conjugado a cada pocillo y se mezcló suavemente.
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Se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se aspiró el contenido de los pocillos y se lavaron con solución tampón, mínimo 5
ciclos.
Se añadió 1 gota de sustrato parte A seguida de 1 gota de sustrato parte B y se mezcló.
Se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos.
La reacción del sustrato fué bloqueada añadiendo 1 gota de solución de parada a cada
pocillo. Se mezcló y se procedió a la lectura de los resultados.
- Resultados para la determinación de Adenovirus Control negativo: Visualmente este control presenta una ausencia de color y en la
determinación fotométrica su valor debe ser inferior a 0,150 unidades de absorbancia.
Cálculo del cut-off: Se calculó el valor del límite añadiendo 0.100 de una unidad de
absorbancia al valor del control negativo o al valor medio cuando se incluye más de un
valor negativo.
Control positivo: En este caso debe observarse un color azul y en la determinación
fotométrica su valor debe ser superior a 0,500 unidades de aborbancia.
Muestras
Determinación visual
Se debe considerar positiva, cualquier muestra que tenga un color azul de mayor
intensidad que el control positivo.
Determinación fotométrica
Cualquier muestra clínica que tenga un valor superior al cut-off. El valor debe ser
superior a 0.500 unidades de absorbancia.
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4.2- Determinación de Calicivirus y Enterovirus - Muestras fecales para la determinación de Calivirus y Enterovirus:
Se realizó una suspensión de las muestras de heces aproximadamente al 10% con
agua libre de nucleasa se mezcló por vorterización y fue clarificada por centrifugación a
10,000 xg por 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue guardado a -20ºC hasta su
utilización.
- Extracción del RNA de Calicivirus y Enterovirus. El RNA viral fue extraído mediante la técnica en columna utilizando el kit Q1Aamp Viral
RNA (QIAGEN, Alemania):
Procedimiento en heces para la extracción del ARN de Calicivirus y Enterovirus:
1- Se agregó 560 ul del buffer AVL en un tubo de 1,5 ml.
2- Se vorterizaron y centrifugaron las muestras durante 10 segundo a 6000, se
agregaron 140ul de la muestra al tubo que contenía el buffer AVL y vorterizó
nuevamente 15 segundos.
3- Se Incubaron las muestras a temperatura ambiente (15- 25 ºC) durante 10
minutos.
4- Las muestras fueron centrifugadas brevemente a 6000rpm.
5- Se adicionó 560ul de etanol (96- 100%) y se vorterizó durante 15 segundos,
luego, se centrifugó a 6000rpm.
6- Se agregó 630 ul de la solución del paso 5 por las paredes del tubo, sin tocar la
columna en tubos de 2 ml, luego se centrifugaron a 8000 rpm durante 1, 30
minutos.
7- Repetir el paso 6 hasta pasar toda la muestra por la membrana.
8- Se trasladó cada columna a un tubo limpio de 2 ml y se agregó 500ul de buffer
AW1, se centrifugó a 8000 rpm, durante 1 minuto.
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9- Se añadió a la membrana 500 ul de AW2 en un tubo nuevo y se centrifugó
durante 3 minutos a 13000 rpm, se descartó el contenido del tubo y se centrifugó
durante 1 minuto a 13000 rpm para eliminar cualquier resto de AW2
10- Se colocó la columna en un tubo nuevo eppendorf con tapa de 1,5ml,
cuidadosamente se abrió el tubo que contenía la columna y se agregaron 40ul
del buffer AVE a temperatura ambiente, se incubó a temperatura ambiente
durante 1 minuto, se centrifugó a 8000rpm por 1 minuto.
11- Se repite el paso 10.
12- La muestra extraída fue almacenada a -20ºC hasta el momento de su
procesamiento.
- Trascripción reversa para la obtención de ADN complementario para la determinación de Calicivirus y Enterovirus. Fué realizada con el kit de Promega ImProm- II Reverse Transcription System, según el
siguiente protocolo: se utilizó 5 ul de la muestra extraída previamente, la cual fue
mezclada con una solución de reacción constituida por: 0,01ul de Random primer 0,5
ug/ por reacción, 4ul de Improm II buffer 5X, 3ul de MgCl2, 1ul de dNTP, 0,5 ul de
Inhibidor de la RNAsa, 1ul de Improm II transcriptasa reversa, 5,49ul de agua libre de
nucleasa, para un volumen de reacción final de 20ul; luego se procedieron a incubar a
25ºC durante 5 minutos y se llevaron al termociclador para un ciclo de 1 hora a 42ºC,
uno de 5 minutos a 99ºC para finalizar con un enfriamiento inmediato.
- PCR para la determinación de Calicivirus. Se utilizó la mezcla de master mix de Promega, con una concentración final de 1X; a la
cual a 25 ul de mastermix, se le adicionaron, 1ul de los respectivos primer al 10 uM,
18ul de agua libre de nucleasa y 5ul de ADNc, para un total de volumen de reacción de
50 ul, luego fueron llevados al termociclador para llevarse a cabo los siguientes ciclos:
94ºC- 3 minutos
94ºC 30 segundos 35 ciclos
55ºC 30 segundos 35 ciclos
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72ºC 60 segundos 35 ciclos
72ºC 7 minutos
4ºC infinito
Para la determinación de Calicivirus, se utilizaron los primers sugeridos por Jiang y
col35. Pimers Localizacion Polaridad Secuencia
P290 (23 mer) 4568–4590 Positiva 5´-GATTACTCCAAGTGGGACTCCAC-3´
P289 (22 mer) 4865–4886 Negativa 5´-TGACAATGTAATCATCACCATA- 3´
Como control interno se utilizó un patrón de peso molecular (durante la visualización)
por limitaciones en la adquisición del control respectivo.
- Electroforesis. El producto de la PCR, fué sometido a electroforesis en gel de agarosa al 2%, con
Bromuro de etidio (EtBr 0,5 ug/ml) por 1 hora, luego se visualizo bajo luz ultravioleta.
- PCR para la determinación de Enterovirus Se utilizo el protocolo descrito anteriormente para Calicivirus a excepción de los ciclos
utilizados para la amplificación, y los primers específicos, en este caso; los ciclos
fueron:
42 ºC- 45 minutos
95ºC- 3 minutos
92ºC 90 segundos 30 ciclos
55ºC 90 segundos 30 ciclos
72ºC 120 segundos 30 ciclos
72ºC 5 minutos
4ºC infinito
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Se utilizaron los primers, descritos por Grow y cols 36
Virus Posicion Primer Producto Secuencia
CV B4 (5´NTR) Ent 1 540 5´-CGGTACCTTTGTACGCCTGT-3´
Polio 1 (5´NTR) Ent 2 5´-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3´
Como control positivo se utilizo la vacuna de polio con el virus atenuado, además de un
patrón de peso molecular Wizard (durante la visualización).
5- Consideraciones éticas: Previo a la recolección de la muestra el presente estudio fue aprobado por el
Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia. A todos los
representantes les fue solicitado el consentimiento por escrito para la inclusión en el
estudio según los lineamientos de la declaración de Helsinki (2000)(37) par estudio en
humanos. (Anexo 2)
6- Metodología estadística aplicada Se utilizó el test exacto de Fisher y la prueba del Chi2 (según el caso) para determinar la
significancia de los resultados obtenidos, utilizando como margen de eficacia el 95% y
alfa menor a 0,05, con el paquete estadístico SPSS 10.0.
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RESULTADOS
RESULTADOS
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Durante el mes de Febrero del año 2007, fueron recolectadas 46 muestras al azar de
niños de 0 a 5 años, de ambos sexos en la comunidad de Nazareth del Municipio Mara
del Estado Zulia, 21 muestras pertenecientes a niños lactantes (2 meses a 2 años), de
las cuales 13 pertenecían al sexo femenino (28,26%) y 8 al sexo masculino (17,39%);
por otro lado en los niños en edad pre- escolar(3 años a 5 años) fueron estudiadas 25
muestras, 15 (32,60%) representadas por el sexo femenino y 10 (21,73%) por el sexo
masculino (Tabla 1).
En la Tabla Nº 2 se muestran los diferentes factores (leche materna, disposición de
excretas, agua de consumo, vacunación, hacinamiento, presencia de animales
domésticos) que pudieran estar relacionados con la aparición de Adenovirus,
Calicivirus y Enterovirus.
Se observó ausencia de infección por Adenovirus y Calicivirus, en niños menores de 5
años de la comunidad de Nazareth.
En la tabla 3, se observa el número de casos positivos para Enterovirus relacionados
los casos con las variables sexo y edad; en los niños de 2 meses a 2 años, se muestra
un mayor numero de casos positivos para el sexo femenino, con 7 casos (31,81%), y el
sexo masculino 4 casos (18,18%); en relación al los niños de 3 años a 5 años,
igualmente se muestras que para el sexo femenino la incidencia fue mayor con 8
muestras positivas (36,36%) y en el sexo masculino 3 muestras positivas (13,63%). No
encontrándose diferencia significativa (p>0,05) en las variables estudiadas.
En la tabla 4 se muestran los factores involucrados en la aparición de Enterovirus.
Según los resultados obtenidos en la presente investigación, se observa que en niños
con esquema de vacunación completa, se encontraron 15/46 muestras positivas
(32,60%) y en aquellos niños con vacunación incompleta 7/46 fueron positivas
(15,21%). A los niños en lactancia materna para el momento de la recolección de las
muestras, 9 (19,46%) resultaron positivas para Enterovirus, mientras que a los niños
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que no se les suministraba lactancia materna 13 (28,26%) arrojaron resultados positivos
para la determinación del antígeno viral.
Otros factores involucrados en la aparición de Enterovirus, se muestran en la tabla 4:
de 22 casos positivos, 17 (36,95%) viven en condiciones de hacinamiento, los 5
(10,89%) restantes no están en estas condiciones. En 12 (26,08%) de los casos, los
representantes refirieron, presencia de animales domestico en sus viviendas, los 10
restantes no poseen animales domésticos, encontrándose una diferencia significativa
(p<0,05). Al relacionar la disposición del agua de consumo con el número de muestras
positivas, se encontró que en 19 (41,30%) el agua es obtenida a partir de tanques y 3
(6,52%) provenía de camiones cisterna. Según el tipo de excretas utilizadas, se
observa que la letrina es la más frecuente con 14 (30,43%) casos positivos, seguido
por las heces lanzadas al agua 4 (8,69%); los pozos séptico 3 (6,52%) y por ultimo las
cloacas 1 (2,17%).
Tabla 1
Distribución por edad y sexo de los niños menores de 5 años de la comunidad de
Nazareth Municipio Mara Estado Zulia.
Edad n Sexo Frecuencia (%) 2 meses a 2 años 21 Femenino 13 (28,26) Masculino 8 (17,39)
3 años a 5 años 25 Femenino 15 (32,60) Masculino 10 (21,73)
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Tabla 2
Distribución de los factores de riesgo relacionados con el estilo de vida de los niños
menores de 5 años de la comunidad de Nazareth
Factores de riesgo
n (%)
46 (100) Leche materna Si No
0 (0)
Si 46 (100) Leche formulada No
80 (0)
Completa 36 (78,26) Inmunización Incompleta 10 (21,74) Si
34 (73,91)
Hacinamiento No 12 (26,09)
Si
46 (100)
Presencia de vectores No 0 (0)
Si
32 (69,57)
Animales domésticos
No 14 (30,43) Cloacas
2 (4,35)
Disposición de excretas
Pozos sépticos Letrina Directo al agua Monte
9 (19,56) 26 (56,53) 6 (13,04) 3 (6,52)
Tanque 40 (86,97) Calle 6 (13,04)
Agua de consumo Depósitos de basura
Quemada 46 (100)
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Tabla 3
Determinación de Enterovirus en niños menores de 5 años de la comunidad de
Nazareth Municipio Mara Estado Zulia según sexo y edad
Casos Edad n Sexo positivos (%) 2 meses a 2 años 21 Femenino 7 (15,21) Masculino 4 (8,51) 3 años a 5 años 51 Femenino 8 (17,39) Masculino 3 (6,52)
Total 46 22 (47,63)
No se observó diferencia significativa
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Tabla 4
Distribución de casos positivos para Enterovirus según los factores involucrados en su
aparición
Casos Factores involucrados positivos (%) Vacunación
Completa Incompleta
15 (32,60) 7 (15,21)
Lactancia materna
Si No
9 (19,56) 13 (28,26)
Hacinamiento
Si No
17 (36,95) 5 (10,89)
Animales domésticos
*Si No
12 (26,08) 10 (21,73)
Agua de consumo
Tanque Camion cisterna
19 (41,30) 3 (6,52)
Tipo de excretas
Cloacas Pozos sépticos Letrinas Al agua
1 (2,17) 3 (6,52) 14 (6,52) 4 (8,69)
* Diferente significativamente (p<0,05) entre los que tenían animales domésticos con
respecto a los que no tenían
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DISCUSION
DISCUSION
Las diarreas virales, representan una de las principales causas de muertes en niños,
especialmente en Asia, África y América Latina, en donde anualmente causan millones
de muertes, principalmente en niños menores de 5 años. Algunos de los principales
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factores de riesgo son: consumo de agua contaminada, un inadecuado saneamiento
ambiental, y una nutrición inadecuada1-3.
Los serotipos 40 y 41 de Adenovirus, son comúnmente encontrados en las muestras de
heces de niños con gastroenteritis, ubicándose a nivel mundial en el 4 º lugar entre los
virus productores de diarreas, con una distribución global del 10 % 31,32.
Al comparar los resultados obtenidos en el presente estudio, en relación a la presencia
de Adenovirus con otras investigaciones realizadas con anterioridad, se observa
claramente la diferencia existente, que aunque en porcentajes relativamente bajos,
indican la presencia de Adenovirus, entre los que se encuentran países de
Latinoamerica, Europa y África en donde los niveles de incidencia se ubican entre
1,26% y 14% 17,18,38-40, hecho este que difiere de los resultados obtenidos en nuestro
estudio, en el que no se detectó la presencia del antígeno de Adenovirus.
El hecho de haber seleccionado las muestras al azar de niños con y sin sintomatología,
pudo contribuir a la ausencia de casos positivos para Adenovirus, ya que estudios
previos reportan la presencia del virus en muestras diarreicas. La diarrea y el vómito
son los síntomas predominantes en infecciones entéricas por Adenovirus, y sucede en
el 97% y 79% de los niños respectivamente, con una duración promedio de 9 a 12 días.
La diarrea persistente se puede encontrar en el 33% de los niños infectados por el
serotipo 40. La adquisición de anticuerpos en suero sucede a edades temprana de la
vida, a los 4-5 años el 50% de los niños han adquirido anticuerpos contra Adenovirus
entéricos, dado a su mecanismos de transmisión (vía oral- fecal y aguas estancadas) 21.
En la presente investigación no se tomó como parámetro de exclusión la
sintomatología, a fin de conocer la posible existencia de estos virus en pacientes
asintomáticos.
La presencia de Calicivirus, no fue detectada en este estudio, resultados que coinciden
con los reportados en el año 2004 en la maternidad Concepción Palacios en Venezuela
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por Morales y cols.; sin embargo, otras investigaciones indican incidencia entre 2,3% y
14% 21, 41,42.
Se considera que la leche materna es importante en la alimentación del recién nacido y
el niño en edad preescolar. Existen estudios que señalan que la leche materna posee
oligosacáridos protectores contra la infección causada por virus43. La inmunidad
lactogénica, se define como la protección conferida por la continua presencia de
anticuerpos en el intestino y que dicha protección es proporcionada por la continua
secreción de inmunoglobulina A (IgA) en la leche materna, así como la inmunoglobulina
G (IgG) 4, La leche materna también contiene otros factores capaces de proveer
protección a nuevas infecciones, tales como: lactoferrina, lisozimas, complementos,
factores bifidus, peroxidasa, antitripsina e inerferon. La presencia de los inhibidores de
la tripsina presentes en la leche materna y en el intestino, podrían ser responsables, de
desencadenar la replicación viral, y su ausencia implicaría la inhibición de este proceso.
Además linfocitos y macrófagos podrían jugar papel importante en la proporción de la
inmunidad 44. En el presente estudio las muestras provenían de niños los cuales fueron
alimentados con leche materna.
Morrow y cols.(2004), determinó la asociación de el contenido de 2-linked fucosylated
oligosacarido en la leche materna y las diarreas producidas por Campilobacter y
Calicivirus, encontrando que los niños cuya leche materna contenía altos niveles de
lacto-N-difucohexaose (LDFH-I), y 2-linked fucosyloligosaccharide, la infección por
Calicivirus era baja, esto evidencia que los oligosacaridos presentes en la leche
materna son clínicamente relevantes para la protección del infante contra este agente45.
La alimentación con leche materna contribuye a la disminución de las diarreas
producidas por Calicivirus, bien sea por el paso de anticuerpos de la madre al hijo, o por
la relevancia de los oligosacaridos contenidos en la misma.
La ausencia de Adenovirus y Calicivirus en la presente investigación, pudo ser
consecuencia del desarrollo de tolerancia inmunitaria (proceso activo, dependiente del
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reconocimiento antigénico), en la cual se produce una ausencia de respuesta
inmunitaria en condiciones normales 46. Múltiples factores pueden influir la respuesta
inmune tras el primer contacto con el antígeno para el desarrollo de la tolerancia
inmunológica 47.
Los factores genéticos influyen considerablemente en la tolerancia inmunologiaca,
sobre todo en lo que respecta a los niveles de IL-4 y síntesis de IgE. Otros factores
también importantes como la edad a la que se produce la primera exposición del
antígeno, naturaleza del mismo, dosis, frecuencia y vía de exposición 47.
En la presente investigación se obtuvo un 47,80% de positividad para Enterovirus,
hecho que concuerda con los resultados obtenidos por diferentes investigadores en
estudios realizados a nivel mundial, quienes indican una incidencia de 7,4% a 56% 33,48-
50, sin embargo en su mayoría. En América Latina, Enterovirus representa uno de los
principales géneros que afecta la población infantil, con una mayor incidencia en niños
menores de 5 años, produciendo diferentes patologías y en algunos casos cursando
asintomáticamente. En cualquier caso resulta de suma importancia determinar los
factores que pudieran estar relacionados con la presencia de Enterovirus.
En el presente estudio, se podría inferir que muchos de los casos positivos para
Enterovirus, podrían ser el resultado de la excreción de antígenos vacunales en las
heces, ya que estos son excretados durante varias semanas (4 a 6 semanas). La
vacuna (virus atenuado de la polio) en un inicio se dirige a los ganglios linfáticos y llega
luego a la corriente sanguínea, provocando así una doble respuesta anticuerpos locales
y circulantes en el 98-100% de los vacunados. El antígeno vacunal excretado en heces
interfiere con el poliovirus salvaje y crea barreras epidemiológicas, evitando su
diseminación. Por otra parte inmuniza a los contactos no vacunados, esta capacidad de
recirculación de las cepas atenuadas contribuye a que la cobertura de inmunización sea
mucho mayor que el número de individuos realmente vacunados 51.
La replicación intestinal del virus de la vacuna genera, con mucha frecuencia, mutantes
con capacidad de transmisión y neurovirulencia, la excreción de los poliovirus vacunales
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en heces en los pacientes con deficiencias de células B puede prolongarse muchos
meses o años. Los programas de vacunación plantean el problema de la circulación de
los poliovirus vacunales, que pueden dificultar la erradicación global de la poliomielitis.
La aparición de casos por contacto con personas que excretan el virus o por exposición
ambiental, puede ser un peligro cuando se decida detener totalmente la vacunación
frente a la poliomielitis. Algunos brotes de poliomielitis por poliovirus derivados de la
vacuna ilustran el problema de la circulación de los virus, así como su capacidad de
transmisión y neurovirulencia. Entre 1988 y 1993 se produjeron en Egipto 32 casos de
poliomielitis por un poliovirus vacunal, no obstante, el problema de la circulación de los
poliovirus vacunales va más allá de su excreción por las heces de las personas
vacunadas, el contagio por exposición ambiental es teóricamente posible, ya que se
han aislado poliovirus del agua de los ríos 52.
Los factores anteriormente descritos, pueden estar influyendo en la aparición de
Enterovirus en la comunidad de Nazareth, bien sea que los antígenos detectados sean
vacunales o por contaminación del agua que bordea la zona; por lo que se hace
necesario realizar nuevas investigaciones que permitan determinar el o los géneros de
Enterovirus presentes, para tomar las medidas necesarias en el mejoramiento de la
calidad de vida de esta población.
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CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
- Ausencia de Adenovirus y Calicivirus en niños menores de 5 años de la comunidad de
Nazareth Municipio Mara Estado Zulia.
-La lactancia materna es un factor protector contra Calicivirus, tanto por sus
componentes como por el paso de anticuerpos de la madre al hijo.
-Se encontró un porcentaje de positividad de 47,63 para el diagnostico de Enterovirus.
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RECOMENDACIONES
RECOMENDACIONES
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
- Realizar charlas dirigidas a explicar como prevenir la aparición, propagación y
recirculación de los agentes virales.
- Crear conciencia en la comunidad sobre la importancia de las normas higiénicas y el
saneamiento ambiental.
- Realizar investigaciones dirigidas a determinar el género de Enterovirus circulante en
la población de Nazareth.
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
BIBLIOGRAFIA
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
1.-Avendano, P.; Matson, D.; Long, J.1993. Costs associated with office visits for diarrhea in infants ant toddlers. Pediatr Infect Dis, 12 pp.897-902
2- World Health Organization. Water, Sanitation and Health. GENEVA: WHO; 2004. www.who.int/water_sanitation_health
3- Calleja, D.; Blitz- Dorfman, J.; Estévez, J.; García, D. 1998. Epidemiología molecular de subgrupos y serotipos de Rotavirus en niños menores de 4 años en la ciudad de Maracaibo con síndrome diarréico. Inv. Clínicas 31(2) pp39-51. 4- Urrestarazu, M.; Liprandi, L.; Pérez, E.; González, R.; Pérez, I. 1999. Características etiológicas, clínicas y sociodemográficas de la diarrea aguda en Venezuela. Rev Panam Salud Publica/Pan Am J Public Health 6 (3) 5- Bishop, R.; Bugg H.; Masendyez P.; Lund J.;Gorrel R.; Barnes . 1996. Serum, fecal, and breast milk Rotavirus antibobies as indices of infection in mother- infant pairs. J. Infect Dis 174 pp522-259. 6 - Anuarios de Epidemiología y Estadística. Ministerio de Salud y Desarrollo Social. 2000 7- Direccion De Epidemiologia Y Analisis Estrategico Direccion De Vigilancia Epidemiologica- Boletin Epidemiologico Semanal- Republica Bolivariana De Venezuela- Ministerio De Salud- Año 54. Semana Epidemiológica Nº 52. Período Del 25 De Diciembre Al 31 De Diciembre De 2005. 8- Republica Bolivariana de Venezuela. Ministerio del Poder Popular para la Salud. Anuario de mortalidad 2006. Dirección general de epidemiología- Dirección de información estadísticas de salud 9- Boletín Epidemiológico Regional Semanal 50. 2007. Direccion de epidemiologia y análisis estratégico del Ministerio del Poder para la Salud. 10-Buesa, J.; López, P. y Rodríguez, J. 2002. Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina y Hospital Clínico Universitario, Universidad de Valencia. Diagnóstico de las infecciones víricas gastrointestinales. 19 pp 501- 506 11- Bernaola, G.; Luque W. 2002. Fisiopatología e las infecciones por Adenoivirus. Asociación de Médicos Residentes del Instituto Especializado de Salud del Niño. 4 (2)pp41–47. http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/Paediatrica/v04_n2/fisiopatolog%C3%ADa.htm 12- Steward PL, Burnett RM, Cyrklaff M, Fuller SD. 1991.Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell 1991; 67: 145-154.
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
13- Wadell G, Allard A, Hierholzer JC. 1999. Adenoviruses. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds). Manual of Clinical Microbiology. Washington: ASM Press p. 970-982 14. Lambden PR, Caul EO, Ashley CR, Clarke IN.1993. Sequence and genome organization of a human small round-structured (Norwalk-like) virus. Science 259: 516-519. 15. Green KY, Ando T, Balayan MS. 2000. Taxonomy of Caliciviruses. J Infect Dis. 181 (Suppl 2): S322-330. 16- Calicó,I. 2002. Diagnóstico de las infecciones por Adanovirus. Servicio de Microbiología.Cuitat. Sanitaria Vall d´Hebron. http://www.seimc.org/control/revi_viro/adeno.htm
17- Giordano, M.; Ferreyra, L.; Isa, M.; Martinez, L.; Yudowsky,S. y Nates, S. 2001. Revista do Instituto de Medicina Tropical Sao Paulo. The epidemiology of acute viral gastroenteritis in hospitalizad children in Cordoba city, Argentina: An insight of disease burden. 43 (4).
18 -Gutierrez, M.; Urbina, D.; Matiz, A.; Puello, M.; Mercado, M.; Parra, M. y Ajami, N. 2005. Revista Colombia Médica. Comportamiento de la diarrea causada por virus y bacterias en regiones cercanas a la zona ecuatorial. 36 (4). 19. Jiang X, Graham DY, Wang K, Estes MK. 1990. Norwalk virus genome cloning and characterization. Science. 250: 1580-1583. 20. Green, K.; Chanock, R.; Kapikian, A. 2001. Human caliciviruses. En: Knipe DM, Howley PM, editores. Fields Virology, 4ta ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins.1 pp. 841-74 21- .Morales, M.; Marrugo, M.; Angulo, G. 2007 . Rev. Soc. Ven. Microbiol. 27(1) pp349-363. <http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1315-25562007000100004&lng=es&nrm=iso>. ISSN 1315-2556.
22. Pujol, F.; Vasquez, G.; Rojas, A.; Fuenmayor, M., Loureiro, C.; Perez, I. 1998. Norwalk virus infection in Venezuela. Ann Trop Med Parasitol. 92 pp205-11.
23- Rodríguez, L.; Bici, E.; Alcalá, A.; Pujol, F.; Liprandi, F.; Ludert, J. 2005. Calicivirus infection in human immunodeficiency virus seropositive children and adults. J Clin Virol. 33 pp104-9.
24- Prasad BVV, Hardy ME, Dokland T, Bella J, Rossmann MG, Estes MK.1999. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science; 286: 287- 290.
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
25- Atmar RL, Estes MK. 2001. Diagnosis of noncultivatable Gastroenteritis viruses, the Human Calicivirus. Clin Microbiol Rev 2001, 14: 15-37. 26- Glass PJ, White LJ, Ball JM, Leparc-Goffart I, Hardy ME, Estes MK. Norwalk virus open reading frame 3 encodes a minor structural protein. J Virol 2000; 74: 6581-6591. 27. Liu BL, Clarke NI, Caul EO, Lambden PR. 1995 Human enteric Caliciviruses have a unique genome structure and are distinct from the Norwalk-like viruses. Arch Virol; 140:1345-1356. 28. Liu BL, Clarke NI, Caul EO, Lambden PR. 1995. The genomic 5’ terminus of Manchester Calicivirus.Virus Genes 1995; 15:25-28 29- Lerna, M.; Farga, M. 1999. Enterovirus: Características y diagnostico. Servicio de Microbiología. Hospital Clínico Universitario de Valencia. Control de Calidad SEIMC. http://www.seimc.org/control/revi_viro/enterovi.htm 30- Cherry JD. 1998. Enteroviruses: Coxsackieviruses, Echoviruses and Polioviruses. Textbook of pediatric infectious diseases. Filadelfia: WB Saunders Co. 4 pp 1787-1839. 31- Melnick, J; 1996. Enteroviruses: Polioviruses, Coxsackieviruses, Echoviruses and newer enteroviruses. Fields Virology. Filadelfia: Lippincott-Raven.3 pp 655-712.
32- Reina, J.; Ballesteros, F.; Munar, M.; Mari, M.; Subirast, M. 2000. Evaluación de diferentes muestras clínicas y líneas celulares en el aislamiento de Enterovirus en pacientes pediátricos. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 18. (3) pp116-1189
33- Cinek, O.; Witso, E.; Jeansson, S.; Rasmussen, P.; Wetlesen, T.; Vavrinec, J.; Grinde, B.; Ronningen, K. (2006). Longitudinal observation of enterovirus and adenovirus in stool samples from Norwegian infants with the highest genetic risk of type 1 diabetes. J. Clin. Virol. 35 (1):33-40. Disponible en: www.pubmed.gov 34- Medina, G.; Mayor, G. 2005. Trabajo de investigación Diagnostico social realizada en el sector Nazareth- Parroquia San Rafael- Municipio Mara- Zulia. Datos no publicados.
35- Jiang, X., Wang, M., Wang, K., Estes, M.K., 1993. Sequence and genomic organization of Norwalk virus. Virology 195 (1), 51–61. 36- Gow, J. W., W. M. H. Behan, G. B. Clements, C. Woodall, M. Riding, and P. O. Behan. 1991. Enteroviral RNA sequences detected by polymerase chain reaction in muscle of patients with postviral fatigue syndrome. Br. Med. J. 302:692–696. 37-Manzini, J. 2000. Declaracion de Helsinki:Principios éticos para la investigación medica sobre sujetos humanos. Acta bioética. 6 (2) pp 321-334
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
38- Vizzi, E.; Ferraro, D.; Cascio, A.; Di Estefano, F.; Arista, S. 1996. Detection of enteric adenoviruses 40 and 41 in stool specimens by monoclonal antibody-based enzyme immunoassays.Res. virol. 147(6) pp 333-9. www.pubmed.gov
39- Bon, F.; Fascia,P.; Dauvergne, M.; Tenenbaum, D.; Planson, H.; Petion, A.; Pothier, P.; Kohli, E. 1999. Prevalence of Group A Rotavirus, Human Calicivirus, Astrovirus, and Adenovirus Type 40 and 41 Infections among Children with Acute Gastroenteritis in Dijon, France. J Clin Microbiol. 37(9) pp 3055–3058. 40-Topkaya, A.; Aksungar, B.; Özakkafl, F.; Çapan, N. 2006. Examination of rotavirus and enteric adenovirus in children with acute gastroenteritis. Türk Mikrobiyol Cem Derg.36 (4) pp210-213. 41- Nakata, S.; Honma, S.; Numata, K.; Kogawa, K.; Ukae, S.; Adachi, N.; Jiang, X.; Estes, M.; Gatheru, Z.; Tukei, P.; Chiba, S. (1998). Prevalence of Human Calicivirus Infections in Kenya as Determined by Enzyme Immunoassays for Three Genogroups of the Virus. Journal of Clinical Microbiology 36 (11) pp 3160-3163. 42-Gutiérrez, M.; Matiz, A.; Trespalacios, A.; Parra, M.; Riaño, M.; Mercado, M. 2006. Diversidad de los virus causantes de diarrea aguda en zonas altas del trópico. Rev Latinoam Microbiol. 48 (1) pp17-23.
43- Morrow AL, Ruiz-Palacios GM, Altaye M, Jiang X, Guerrero ML, Meinzen-Derr JK, y col. Human milk oligosaccharide blood group epitopes and innate immune protection against Campylobacter and calicivirus diarrhea in breastfed infants. Adv Exp Med Biol; 2004; 554:443-6.
44- Bhan, M.; Lew, J.; Sazawoal, S.; Das, B.; Gantsch, J.; Glass, R.(1993). Protection conferrecd by neonatal rotavirus infection against subsequend rotavirus diarrhea. J. Infect Dis. 168 (2) pp282-287.
45- Morrow, A.; Ruiz, G.; Altaye, M.; X, Jiang.; Guerrero, M.; Meinzen, J.; Farkas, T.; Chaturvedi, P.; Pickering, L.; Newburg, D. 2004. The Journal of Pediatrics. 145 (3) pp 297-303. 46- Garavito, E.; Rojas, A.; Mendez, P.; Iglesias, A. 2002. Tolerancia inmunológica. Revista colombiana de reumatología. 9(2): pp124-129
47- Lorente, F.; Lanffond, E.; Davila, Moreno, E. 2001. Mecanismos de tolerancia imunológica. Prevención primaria de La alergia a alimentos. Alergol Inmunol Clin. 16(2);pp 58-75
Castellanos M. Trabajo Especial de Grado- Facultad Experimental de Ciencias 2008
48- Abbott, M.; Cloonan, M.; Montgomery, J.; Smith, D. 1984. Pathogens detected in the faeces of children with diarrhoea in a Sydney hospital. Arch. Virol. 141 (1) pp 26-8. www.pubmed.gov 49- Liste, M.; Natera, I.; Suarez, J.; Pujol, F.; Liprandi, F.; Ludert, J. 2000. Enteric virus infections and diarrhea in healthy and human immunodeficiency virus-infected children. J. Clin. Virol. 38 (8) pp2873-7. www.pubmed.gov
50- Phan, T.; Nguyen, T.; Yan, H.; Okitsu, S.; Ushijima, H. 2005 A novel RT-multiplex PCR for enteroviruses, hepatitis A and E viruses and influenza A virus among infants and children with diarrhea in Vietnam. Arch Virol. 150 (6) pp1175-85. www.pubmed.gov
51- Marcó, J. 2002, Poliomelitis: que tipo de vacunas debemos utilizar? Arch. Argent. Pediatr. 100(1): pp 3-8
52- Ruiz, J.; Hernandez, M. 2003. Vacunas antipoliomeliticas: VPI frente a VPO. Anales de pediatria. 58(5): pp12-17
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ANEXOS
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ANEXO1
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DATOS PERSONALES:
Nombre________________________________ Edad:_______ Fecha de nac._________ Lugar de naciminento:______________
INMUNIZACIONES: BCG:__________ Triple:___________ Polio:__________ Sarampión:_________ ALIMENTACION: Leche materna:_______ Leche de formula:________ Hasta que edad tomó leche materna?_________________
VIVIENDA Rancho:
__________
____
Casa:
__________
_____
Vecindad:
__________
__
TENENCIA DE LA VIVIENDA
Propia:
__________
_____
Alquilada:
__________
_____
Cedida:
__________
_____
Compra a
crédito:
__________
HACINAMIENTO:
Total de ambiente:
__________ Ventilación:
B R M
Para dormir: ___________
Iluminación: B R M
No. de Camas: _________
Baño: ___________
y/o hamacas: __________
Cocina: _______ Leña:
________
Tipo de cocina: Kerosene
____ Gas- Planta _____
Patio: _____________
ANIMALES: Perros________
Gatos_________
Otros____________________
_
ABASTECIMIENTO DE AGUA. IntradomiciliarioBotellón
Pozo:
__________
Pública:
____________
__
Camión
Cisterna:
__________
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ALMACENAMIENTO
DE AGUA PARA TOMAR.
Pipas: _________________ Otras: __________________ Especificar. Tapada: _______ Limpia: _______ Frecuencia del lavado: _____ Consumo de agua Directa filtrada o hervida ANTECEDENTES FAMILIARES Cáncer:_______ Cardiopatías:_______ Diabetes:______ Hipertensión:_______ Otras:____________________________
DISPOSICIÓN DE EXCRETAS:
Cloacas: _______________ Letrina: ________________ Pozo séptico: ____________ Se mantiene limpio: ________ Con que lo limpia: _________ suelo Red de aguas blancas:______ Red de aguas negras:_________
RECOLECCIÓN DE BASURA. Recipiente con tapa: ______________ Aseo Urbano: __________ Recipiente sin tapa: _______________ Frecuencia: _____________ Otros: _________________________ Campo raso: ________________ Especificar ANIMALES DOMESTICOS Insectos: ____________________ Roedores: ___________________ Animales domésticos: Perros: _____________ Gatos:_______________ Otros: _______________________________________
ESTADO NUTRICIONAL OBSERVABLE: ____________________ OBSERVACIONES:_
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ANEXO 2
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CONSENTIMIENTO PREVIA INFORMACION.
En el Laboratorio Regional de Referencias Virológicas de la Escuela de Bioanálisis de la Facultad de Medicina de La Universidad del Zulia ubicado en el Instituto de Investigaciones Clínicas, se esta realizando el proyecto de investigación titulado “Incidencia de Adenovirus y Calicivirus en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio Mara del Estado Zulia” con el objeto de determinar la presencia de Adenovirus, Rotavirus, Calicivirus, y Hepatitis A en los niños menores de 5 años, utilizando las técnicas de ELISA y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), respectivamente, además de la realización de exámenes parasicológicos (directo y concentrado) y hematología completa. Yo, C.I:____________________ Nacionalidad:________________EstadoCivil:______________________Domiciliado en: ______________________________ siendo mayor de 18 años en USO pleno mis facultades mentales y sin que medie coacción ni violencia alguna en completo conocimiento de la naturaleza, forma, duración, propósito, inconveniente y riesgos relacionados con el estudio que mas abajo indico, en calidad de padre o representante legal del paciente___________________________, edad: _________, declaro mediante la presente: 1.- Haber sido informado de manera clara y sencilla, por parte del grupo de investigadores del Laboratorio Regional de Referencias Virológicas, coordinados por la Magíster Lic. Luciana Costa de todos los aspectos relacionados al proyecto de Investigación titulado “Incidencia de Adenovirus y Calicivirus en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio Mara del Estado Zulia” y los exámenes parasicológicos y hematológicos. 2.- Tener conocimiento claro de que el objetivo fundamental del trabajo antes señalado es: “Determinar la incidencia de Enterovirus, Adenovirus y Calicivirus en niños menores de 5 años de la población de Nazareth del Municipio Mara del Estado Zulia” 3.- Haber sido informado de que mi participación en el proyecto consiste en facilitar de manera voluntaria al Laboratorio Regional de Referencias Virológicas una muestra de heces. 4.- Que la muestra de heces facilitar así como la información que suministre al equipo de investigadores será utilizada para determinar: la incidencia de Adenovirus, Rotavirus y Calicivirus. 5.- Que el equipo de investigadores me ha garantizado absoluta confidencialidad relacionada tanto a mi identidad como de cualquier información relativa a mi persona a la que tenga acceso por concepto de mi participación en el proyecto antes mencionado. 6.- Que estoy de acuerdo en el USO, para fines de investigación, de los resultados obtenidos en el presente estudio. 7.- Que mi participación en dicho estudio no implica riesgo ni inconveniente alguno para mi salud. 8.- Que la participación en la investigación no agravara ni causara efectos colaterales en la patología ya existente, si no por el contrario esta investigación ayudara a dilucidar mi diagnostico permitiendo una mejor terapéutica. Que cualquier pregunta o duda que yo tenga en relación con este estudio, me será respondida y aclarada oportunamente por parte del equipo de investigadores antes mencionado con quienes me puedo comunicar por el teléfono (Laboratorio Regional de
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Referencia Virológica): 02617597273 con la Lic: Luciana Costa en el horario de 7:30 a.m. a 5:00 p.m. 9.- Que bajo ningún concepto se me ha ofrecido ni pretendo recibir algún beneficio de tipo económico producto de los hallazgos que puedan producirse en el referido proyecto de investigación. 10.- Que los resultados de las pruebas me serán entregados oportunamente DECLARACION DEL VOLUNTARIO: Luego de haber leído, comprendido y recibido las respuestas a mis preguntas con respecto a este formato de consentimiento y por cuanto mi participación en este estudio es totalmente voluntaria acuerdo: A.- Aceptar las condiciones estipuladas en el mismo y a la vez autorizar
__________________________ Firma