caracterización de farmacos por rmn
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Yamila Garro Linck
Director: Gustavo A. Monti
LaNAIS de RMS – FaMAF - UNC
CARACTERIZACIÓN DE NUEVOS FÁRMACOS POR RMN EN ESTADO SÓLIDO
ESQUEMA DE LA CHARLA
• Objetivos
• Mínima Introducción a la Resonancia Magnética Nuclear
• Parte I (Complejos)
• Conclusiones (Parte I)
• Parte II (Sacarinatos y Polimorfos)
• Conclusiones (parte II)
Objetivos
Contribuir a la caracterizacion de nuevos fármacos y su asociación a vehículos que permitan una liberación controlada, a través de la técnica de RMN en Sólidos.
Realizar aportes para lograr un mejor diseño y control del comportamiento de la droga.
Estudio de polimorfismos y pseudopolimorfismos
Caracterización de la asociación del principio activo a materiales transportadores tales como polielectrolitos, surfactantes, emulsificantes, etc.
Resonancia Magnética Nuclear
Los núcleos atómicos poseen momento magnético µ, en presencia de un campo magnético, precesará alrededor de él con frecuencia ω0.
00Hγω =
zZIHhH
00γµ −=⋅−=Η 0
0
Si se aplica un campo magnético dependiente del tiempo de la forma
iHH )tcos(211
ω=
En la terna de laboratorioxzLabIthHIhH )cos(
10ωγγ −−=Η
Definiendo la terna rotante como
z=z’
x
y
y’
x’ωt
xzrotIhHIHh
10γ
γωγ −
−−=Η
En esta representación H1 es constante y los espines precesan alrededor de un campo efectivo Hef
( ) 21
220ef Hγωωγ +−=≡Ω H
Pulsos de radio frecuencia
Si estamos en condición de resonancia ωω =0
iHH ˆ1=ef
El momento magnético, inicialmente en la dirección z’, precesa en el plano z-y en torno a H1
Si aplicamos el campo H1 por un tiempo corto τw el momento girará un ángulo de volteo θ medido desde z’ dado por
111 donde Hw γωτωθ ==
z’
y’
t < τw
H1
z’
y’
x’H1
µ
t= 0
y
x
µy’
x’ t = τw
H1
z’
x’
De esta manera se da un pulso de θ alrededor del eje x’Para el caso particular de un pulso de π/2
Sólidos vs. Líquidos
Interacción dipolarCorrimiento QuímicoInteracción Cuadrupolar
12cos3 −θ
Rotación de la muestraalrededor de un eje inclinado a un ángulo
θ=54.7º (Ángulo Mágico)
Promedia a cero las Interacciones anisotrópicas
Parte I
Norfloxacin (NOR)Ciprofloxacin (CIP)
(Antibioticos)
Infecciones UrinariasFormulaciones OftálmicasFormulaciones Óticas
Irritacion intestinalBaja solubilidad a Ph neutro
Solución: acomplejamiento con Aluminio Aumenta la solubilidad acuosa. Se preservan las propiedades biológicas
CIPROFLOXACINO
NN
O
N+H2
OF
O H
N1
C4
C2
C3
C8C9
C6
C7
C5C10
N14
C13
C12
N11
O18
O17
C3a
C15
C16
O19
F20
C1cC1b
C1a N
NN
O
H2+
OF
O H
C H3
N1
C4
C2
C3
C8C9
C6
C7
C5C10
N14
C13
C12
N11
O18
O17
C3a
C15
C16
O19
F20
C1b
C1a
NORFLOXACINO
Complejos
Complejos con Aluminio
El motivo del acomplejamiento de estos antibióticos con Aluminio es aumentar la solubilidad acuosa preservando las propiedades biológicas
Estos nuevos compuestos son sólidos estables con relación estequiometrica 3:1
Estudios preliminares de difraccion de rayos X muestran que ambos métodos tienen un alto porcentaje de material amorfo
Método I Método II
Precipitación con acetona Granulación con etanol
Métodos de elaboración
Técnicas empleadas
Transferencia de polarización de los espines abundantes ( 1H) a los espines diluidos ( 13C)
Condición de Hartman-Hahn HHCC BB γγ =
MAS Rotación al ángulo mágico (54.7º)
Interacción Dipolar
Corrimiento Químico Anisotrópico12cos3 −θ
CPMAS (Cross Polarization Magic Angle Spinning)
CP
CP
DesacopleHeteronuclear
1H
13CAdquisición
Durante el delay entre la CP y la adquisición, la magnetización de 13C decae debido a las interacciones 1H - 13C, lo que lleva a un espectro donde los carbonos de los grupos metinos y metilenos estan ausentes.
Objetivo: simplificar el espectro removiendo las señales de l os núcleos directamente ligados a protones
Supresión No Cuaternaria (NQS)
CP
CP
DesacopleHeteronuclear
1H
13C
Adquisición
Chattah et al, Magn. Reson. Chem. 2007; 45: 850–859
En este experimento, una CP es seguida por un spín-lock en carbono durante un tiempo variable t. Durante t se produce la relajación espín-red de 13C en la terna rotante
La relajación en la terna rotante es sensible a movimientos en la escala de los kHz, dando información de compuestos espacialmente no homogéneos.
Tiempo de Relajación en la Terna Rotante T1ρC
1H
13C
DesacopleHeteronuclear
Adquisición
CP
CP Spin Lock
Compuestos no homogéneos con al menos dos fases con diferentes órdenes o movilidades
Chattah et al, Magn. Reson. Chem. 2007; 45: 850–859
100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80 -100
CiprofloxacinaMétodo 1
ppm
100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80 -100
CiprofloxacinaMétodo 2
ppm
Núcleo Cuadrupolar (I=5/2)
Corrimiento químico relacionado con la coordinación con Oxígeno
La señal alrededor de 0 ppm nos dice que el Aluminio tiene coordinación octahédrica
Diferencias
Segundo orden de la interacción Cuadrupolar
Aluminio en sitios no equivalentes
Espectro de 27Al
Aluminio
• Asignación de las distintas señales en el espectro de 13C.
• Caracterización de los compuestos obtenidos mediante los 2 métodos de elaboración.
• No se observan restos de droga pura en los complejos.
• De las mediciones de T1ρC se puede determinar la coexistencia de al menos dos fases con diferentes movilidades.
• El T1ρC del complejo obtenido mediante el método I es más corto que el del método II, esto puede deberse a una mayor cristalinidad de este último.
Conclusiones (Parte I)
Parte II
Baja solubilidad y sabor amargo Solución: formación de sacarinatos.La sacarina es uno de los endulzantes mas conocidos y mas utilizados.Los derivados de SAC muestran mejoras en la solubilidad, mejor sabor, estabilidad y biodisponibilidad
O31 NN
O
N+H2
OF
OH
N1
C4
C2
C3
C8
C9
C6
C7
C5
C10
N14
C13
C12
N11
O18
O17
C3a
C15
C16
O19
F20
C1cC1b
C1a
SN-
OO
O
C24
C23
S22
N21
C25
C26
C27
C28
C29
O30
O32
CIPROFLOXACINSACCHARINATE
SN
OO
O
C24
C23
S22
N21
C25
C26
C27
C28
C29
O30
O31
O32
-
ENROFLOXACINSACCHARINATE
NN
NH
+
O
OF
OH
CH3
N1
C4
C2
C3
C8
C9
C6
C7
C5
C10
N14
C13
C12
N11
O18
O17
C3a
C15
C16
O19
F20
C1cC1b
C1a
C14aC14b
NORFLOXACINSACCHARINATE
N
NN
O
H2+
OF
OH
CH3
N1
C4
C2
C3
C8
C9
C6
C7
C5
C10
N14
C13
C12
N11
O18
O17
C3a
C15
C16
O19
F20
C1b
C1a
SN-
OO
O
C24
C23
S22
N21
C25
C26
C27
C28
C29
O30
O31
O32SN-
OO
O
C24
C23
S22
N21
C25
C26
C27
C28
C29
O30
O31
O32
OFLOXACINSACCHARINATE
OO17
N
O
NNH
+
O
F
OH
CH3 CH3
N1
C4
C2
C3
C8
C9
C6
C7
C5
C10
N14
C13
C12
N11
O18
C3a
C15
C16
O19
F20
C1b
C1a
C14a
O9
C1c
Sacarinatos y Polimorfismo
DifferentesDifferentes polimorfospolimorfos poseenposeen diferentesdiferentes propiedadespropiedades ::
DensidadDensidad DurezaDureza FluidezFluidez PropiedadesPropiedades óópticaspticas y y elelééctricasctricas PuntoPunto de de fusifusi óónn HigroscopicidadHigroscopicidad EstabilidadEstabilidad QuQuíímicamica SolubilidadSolubilidad TasaTasa de de disolucidisoluci óónn BiodisponibilidadBiodisponibilidad y y BioequivalenciaBioequivalencia
Polimorfismo: habilidad que posee una sustancia para existir como dos o mas fases cristalinas que tienen diferentes arreglos y/o
conformaciones moleculares en la red cristalina(H. G. Brittain, “Polymorphism in Pharmaceutical Solids” 1999)
δ13C/ppm
23,25,262
24,27
28,10,3
9
1b,1c
1a
5
12,13,15,16
87
76
4,29,3a
2,79
1b,1c
1a5
12,13,15,16
8
6
4,3a3,10
24,27
28
25,26
23
29
150 100 50 200 0
25,26
2,7 24,27
28,10,3
9,233a29
12,13,15,16
1b,1c1a5,8
6
4
CIP
CIP-SAC (I)
CIP-SAC (II)
SAC
Los polimorfos no son la mezcla física de CIP y SAC y no hay residuos de los precursores.
CIP-SAC (I) : corrimiento de C(29) a ppm mas altos luego de la formación de la sal debido a modoficaciones en la interacción puente hidrógeno.
La señal correspondiente a C(28) en el sacarinato se ha movido lejos de su posición original.
C(4) y C(3a) están superpuestos a 173 ppm, mostrando el carácter zwitteriónico de CIP.
Las señales del grupo piperazina de CIP (C(12),C(13),C(15) y C(16)) muestran pocasmodificaciones en los polimorfos, esto se debe al carácter zwitteriónico de CIP.
La resonancia correspondiente a C(6) estádesdoblada debido a la interacción con 19F.En CIP se puede ver sólo un par de señales (1 sólamolécula por celda unidad), lo mismo ocurre en CIP-SAC (II). En CIP-SAC (I) se observan dos pares de señales, indicando que hay al menos dos moléculaspor celda.
Polimorfos de Sacarinato de CiprofloxacinoCIPROFLOXACIN
NN
O
N+H2
OF
OH
N1
C4
C2
C3
C8
C9
C6
C7
C5
C10
N14
C13
C12
N11
O18
O17
C3a
C15
C16
O19
F20
C1cC1b
C1a
O31
SN-
OO
O
C24
C23
S22
N21
C25
C26
C27
C28
C29
O30
O32
CIPROFLOXACINSACCHARINATE
CORRELACIÓN HETERONUCLEAR (HETCOR)(van Rossum et al. J. Mag. Reson. 124, 516–519 (1997) )
Se cancelan los términos seculares del Hamiltoniano Dipolar
2
1
1
=∆ωLG
LEE GOLDBURG
Se aplica un campo de RF fuera de resonancia de acuerdo a
El protón del grupo carboxilato H(3a), aparece en casi todos los espectro de 1H en estado sólido. Las correlaciones asociadas a estos protones hacen posible la asignación de C(3a) en los sacarinatos. En el espectro de 1Hcorrespondiente a CIP, H(3a) no esta presente, lo cual está de acuerdo con el carácter zwitteriónico del compuesto. Este proton del grupo carboxilato aparece en el espectro de CIP-SAC, confirmando que el carácter zwitteriónico es revertido luego de la formación de la sal.
En el espectro de los sacarinatos la señal de protones del grupo piperazina está corrida a ppm más altos (alrededor de 1-2 ppm). Esto está de acuerdo con la interacción iónica previamente observada por IR.
Los protones de los anillos aromáticos H(2), H(5) y H(8), muestran un claro corrimiento en el sacarinato, indicando la existencia de nuevas interacciones. Estoas corrimientos están asociados a cambios en interacciones puente hidrógeno o interacciones π–π.
Romañuk et al, Journal of Pharmaceutical Sciences DOI 10.1002/jps
REPT – HSQC (Correlación Heteronuclear)(Kay Saalwächter, Robert Graf and Hans W. Spiess. J. Mag. Reson. 140, 471-476 (1999) )
Secuencia de Pulsos
Los períodos de reacople dipolar son los responsables de la transferencia de polarización. Luego de un pulso de π/2 en I, -IY queda bajo el efecto de HD
IS por
un período NτR
Hamiltoniano dipolar heteronuclear
El estado mixto IxSz, experimenta la evolución del corrimiento químico de I durante t1 de acuerdo a HICS =
ωICS*Iz
Las componentes de la señal , Sx y Sy del espectro HSQC estan dadas por
I
S
• Correlación heteronuclear basada en los acoples dipolares entre 1H y 13C.
• Con 1 período de rotor se obtienen correlaciones entre núcleos a una ligadura de distancia.
• Espectro de protones de alta resolución
• Cambios en el CS de H(2), H(5) y H(8) indicaninteracciones π−π.
• Con 2 períodos de rotor se pueden identificar claramente los carbonos cuaternarios.
• Puente hidrógeno entre O(18) y O(19) es observado a través de C(4) y C(3a)
• Interacciones iónicas pueden identificarse debido a cambios en el corrimiento químico de los protones pertenecientes al grupo piperazina.
1τR
13C
1 H
2τR
13C
1 H
I
S
REPT – HSQC (Correlación Heteronuclear)(Kay Saalwächter, Robert Graf and Hans W. Spiess. J. Mag. Reson. 140, 471-476 (1999) )
DQMAS – BABA (Correlación Homonuclear)(M. Feike, D. E. Demco, R. Graf, J. Gottwald, S. Hafner, and H. W. Spiess. J. Mag. Reson. A 122, 214-221 (1996) )
xexcitation evolution reconversion detection
τexc t1 τ0=τR t2
τexc=nexcτR τexc=nexcτR
-x-yy-yy-x x y
τexc
Cómo generar Coherencias Cuánticas Dobles
Para un sistema de espines bajo MAS el Hamiltoniano es
Respuesta del sistema a la secuencia de pulsos BABA
En el regimen de altas velocidades
A partir de estas ecuaciones se obtiene el Hamiltoniano promedio de orden cero
CIP - SAC (II)
ABCDE
FGH
CIPROFLOXACINSACCHARINATE
NN
O
N+H2
OF
O H
N1
C4
C2
C3
C8
C9
C6
C7
C5C10
N14
C13
C12
N11
O18
O17
C3a
C15
C16
O19
F20
C1cC1b
C1aS
N-
OO
O
C24
C23S22
N21
C25
C26
C27C28
C29
O30
O31
O32
B
C
G
HE
FD
• H(1b) y H(1c) pueden ser claramenteidentificados• H(1b) y H(1c) muestran una fuerte interaccióncon los protones de la sacarina• H(2) sólo muestra interacciones intramoleculares• El protón acoplado con el N14 correlaciona con protones de sacarina• H(1a) presenta interacciones con H(2) y H(8)• H(3a) muestra una clara interacción con protones de sacarina
A
CIP - SAC (I)
ABCD
E
F
CIPROFLOXACINSACCHARINATE
NN
O
N+H2
OF
O H
N1
C4
C2
C3
C8
C9
C6
C7
C5C10
N14
C13
C12
N11
O18
O17
C3a
C15
C16
O19
F20
C1cC1b
C1aS
N-
OO
O
C24
C23S22
N21
C25
C26
C27C28
C29
O30
O31
O32
B
C
E
D
A
FLas interacciones observadas en CIP-SAC (I) son similares a las observadas en CIP-Sac (II).Se obtiene menos resolución en este caso, sin embargo se puede realizar una claraasignación en el espectro de 1H.
Todos estos resultados estan en concordancia con los resultados obtenidos por RX de single crystal
Espectros 1H
------0.1---------------6 ?
-----------0.4----------5 ?
------0.9---------------4 ?
------2.2-2.2----------3 ?
-----14.414.9----------2 ?
11.411.0---------------1 ?
7.6 – 7.7 - 8.07.6 – 7.7 - 8.0-----7.8-----23,24,27,28
13.013.0---------------3a
7.37.39.58.78.42
6.66.68.57.67.25
7.07.07.37.77.48
3.43.44.9----------1a
1.6 – 3.31.6 – 3.34.4 – 4.33.73.5 – 3.612,13,15,16
1.82.21.71.51.41c
0.90.91.71.21.11b
CIP-SAC (II)CIP-SAC (I)CIPCIP-SAC(I)CIP
ESTADO SÓLIDO
CS (ppm)
SOLUCIÓN
CS (ppm)Señal
Presencia de protones ligadosy no ligados
Corrimientos a ppm negativos, estoindica una interacción fuerte entre
protones del grupo metilo con protones de grupos aromáticos
• Corrimientos a ppm más altos de protones en el grupo piperazina en CIP• H(1b) y H(1c) muestran corrimientos a ppm más altos en CIP• H(2), H(5) y H(8) presentan corrimientos a ppm más bajos en SAC-CIP (I) y (II)• H(3a) puede ser claramente identificado en ambos sacarinatos• Nuevas interacciones puente hidrógeno en estado sólido
Cambios observados en estado sólido
Espectro de 1H @ 60 kHz
20 15 10 5 0 -5 -10
Espectro de 1H en Solución
0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0 0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0
δδδδ1H////ppm
CIP
CIP-SAC(I)
CIP-SAC(II)
CIP
CIP-SAC(I)
δδδδ1H////ppm
CODEX (Centerband Only Detection of Exchange)(Wenbin Luo and Mei Hong, JACS 2006, 128, 7242 – 7251)
)0()(ˆMetM tKrr
−=
La constante kij que indica la transferencia de polarización entre espines Xi y Xj a velocidades de rotación menores que el
acomple dipolar 1H-X puede aproximarse por una ecuación derivada de la caso estático:
Acople DipolarHomonuclear
Integral de Overlap que describe la probabiliad de que se produzcan transiciones single-quantum a la
misma frecuencia para espines i y j
La evolución temporal del vector n-dimensional de la magnetización M(t), está dada por
Matriz de intercambio n-dimensional que contiene las constantes kij
La solución formal para una dada magnetización inicial M(0) es
2
)cos31(1
4
2
3
20 ij
ij
ijr
θγ
πµω
−= h
)0(2
1 2
ijijij Fk πω=
ωωωωω dffFjjiiij)()()0( −−= ∫
∞
∞−
CODEX (19F- 19F)19F Spectra
- 115 - 120 - 125 - 130 - 135 - 110 - 140 δ19F/ppm
CIP-SAC (II)
CIP-SAC (I)
1
342
5
Å4.12
==n
r
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,10,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
S/S
0
t [s]
4
5
Å1.12
==n
r
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,10,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
S/S
0
t [s]
2
2
Å9.7
==n
r
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,10,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
S/S
0
t [s]
3
2
Å6
==
n
r
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,250,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
S/S
0τ [s]
1
Conclusiones (Parte II)
• CIP-SAC (II) fue estudiado y comparado con CIP-SAC(I).
• Las características generales y corrimientos en las resonancias observadas en CIP-SAC (II) pueden tambienser observadas en CIP-SAC (I). Por ejemplo los corrimientos en C(3), C(10), C(28), C(29). Luego, lasinteracciones encontradas para CIP-SAC(II) combinando RX y RMN pueden extrapolarse a CIP-SAC(I).
• Experimentos bidimensionales (Heteronucleares y Homonucleares) nos permitieron identificar interaccionesinter e intra moleculares en los tres compuestos.
• Diferencias y similitudes en las estructuras de los compuestos fueron determinadas.
• Los espectros bidimensionales 1H-1H son similares para CIP-SAC (I) y CIP-SAC (II), esto nos lleva a concluirque la mayoría de las interacciones que se observan son intramoleculres.
• Se pudieron determinar distancias internucleares entre los núcleos de Flúor (r).
• En CIP-SAC (I) se observaron dos distancias entre 19F una de 7.9 A y la otra de 12.4 A. También se observaron dos números de moléculas por celda unidad diferentes.
• El experimento CODEX y los espectros de 13C CP-MAS nos permiten concluir que CIP-SAC (I) es una mezclade dos estructuras: algunas moléculas en la celda unidad presentan orientaciones similares a las encontradas en CIP-SAC (II).
Agradecimientos
We acknowledge financial support received from Fundación Antorchas, ANPCyT, CONICET, MinCyT-Córdoba and SeCyT-UNC.
Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias QuímicasCarolina RomañukMaría Eugenia OliveraRubén Manzo
Facultad de Matemática, Astronomía y FísicaKarina ChattahRodolfo H. AcostaGustavo A. Monti
Laboratoire de RMN de la Matière Condensèe, Institut Le Bel, Universitè Louis Pasteur, Strasbourg, FranceJesus RayaJèrôme Hirschinger
Partner Group for NMR Spectroscopy with high spin polarization MPIP-FaMAF.
Max Planck Institute for Polymer Research, Mainz, GermanyRobert GrafHans-Wolfgang Spiess
Agencia Córdoba Ciencia. Unidad CEPROCOR, CórdobaSilvia L. Cuffini
GRACIAS!!!