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CARACTERIZACIÓN DE MECANISMOS DE ESTRÉS ASOCIADOS CON APOPTOSIS
Y SEÑALES INMUNOGÉNICAS EN CÉLULAS DE MELANOMA MURINO TRATADAS
CON UN EXTRACTO DE PLANTAS RICO EN POLIFENOLES
KAROL MILDRED PRIETO SARMIENTO
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
DOCTOR EN CIENCIAS BIOLOGICAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE POSGRADO
Bogotá D.C, Colombia, 2019
CARACTERIZACIÓN DE MECANISMOS DE ESTRÉS ASOCIADOS CON APOPTOSIS
Y SEÑALES INMUNOGÉNICAS EN CÉLULAS DE MELANOMA MURINO TRATADAS
CON UN EXTRACTO DE PLANTAS RICO EN POLIFENOLES
KAROL MILDRED PRIETO SARMIENTO, MSc.
DIRECTOR:
Alfonso Barreto Prieto, MSc. PhD.
CODIRECTORA:
Susana Fiorentino Gómez, MSc. PhD
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE POSGRADO
Bogotá D.C, Colombia, 2019
NOTA DE ADVERTENCIA
"La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia"
Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946
TABLA DE CONTENIDO
1. RESUMEN EJECUTIVO ............................................................................ 1
2. ABSTRACT ................................................................................................ 3
3. INTRODUCCION ....................................................................................... 5
4. JUSTIFICACION ........................................................................................ 8
5. MARCO TEORICO Y ESTADO DEL ARTE ............................................. 10
4.1 Estrés celular ........................................................................................... 10
4.1.1 Respuesta al estrés y homeostasis .......................................................... 11
4.1.2 Estrés celular y tumorigenésis ................................................................. 12
4.1.3 Estrés celular y respuesta a la terapia ..................................................... 13
4.2 Estrés de retículo endoplasmático y las vías de la respuesta a proteínas
mal plegadas ..................................................................................................... 14
4.2.1 Respuesta integrada al estrés .................................................................. 17
4.2.2 Estrés de retículo en cáncer ..................................................................... 18
4.2.3 Inducción de estrés de retículo endoplásmico por alteración en la
homeostasis de los niveles de calcio ................................................................. 19
4.3 Autofagia como mecanismo de respuesta al estrés ................................. 20
4.3.1 Autofagia en cáncer ................................................................................. 22
4.4 Melanoma: Papel del estrés de retículo endoplasmático y de la autofagia ..
................................................................................................................. 23
4.4.1 PERK y su papel en melanoma ............................................................... 25
4.5 Tipos de muerte celular asociados a la terapia en cáncer ....................... 26
4.5.1 Muerte celular inmunogénica en la terapia antitumoral. ........................... 27
4.5.2 Autofagia y estrés de retículo endoplásmico en la muerte celular
inmunogénica .................................................................................................... 29
4.6 Respuesta inmune en cáncer ................................................................... 30
4.6.1 Activación de la respuesta inmune en el contexto de la muerte
inmunogénica .................................................................................................... 31
4.7 Productos naturales y polifenoles: una alternativa terapéutica en cáncer.32
4.7.1 Polifenoles e inducción de estrés celular ................................................. 35
4.7.2 Polifenoles y modulación de la respuesta inmune ................................... 36
4.8 Actividad antitumoral de la planta Caesalpinia spinosa............................ 37
4.8.1 Descripción general y distribución geográfica de Caesalpinia spinosa .... 37
4.8.2 Actividades biológicas de Caesalpinia spinosa ........................................ 37
4.8.3 Antecedentes del extracto P2Et obtenido de Caesalpinia spinosa .......... 38
5 OBJETIVOS ............................................................................................. 42
5.1 Objetivo General ...................................................................................... 42
5.2 Objetivos específicos ............................................................................... 42
6 METODOLOGÍA ...................................................................................... 43
6.1 Reactivos y Anticuerpos ........................................................................... 43
6.2 Líneas celulares y condiciones de cultivo ................................................ 44
6.3 Obtención del Material vegetal y del extracto P2Et .................................. 44
6.4 Ensayos de edición genómica utilizando CRISPR/Cas9 .......................... 46
6.4.1 Generación de líneas celulares con knock-out de genes involucrados en la
UPR. ................................................................................................................. 47
6.4.2 Generación de líneas celulares con knock-out de beclina-1 para inhibición
de autofagia. ...................................................................................................... 48
6.5 Evaluación de la actividad citotóxica del extracto P2Et, AG y EG sobre las
células B16-F10 salvajes y modificadas. ........................................................... 49
6.5.1 Ensayos de citotoxicidad por MTT ........................................................... 49
6.5.2 Ensayos de anexina V y Ioduro de propidio ............................................. 50
6.5.3 Ensayos de clonogenicidad ...................................................................... 51
6.6 Evaluación del estrés del retículo endoplásmico ...................................... 51
6.6.1 Ensayos para evaluación del volumen del RE ......................................... 51
6.6.2 Ensayos de Western Blot para estrés de RE ........................................... 52
6.6.3 Ensayos de extracción de ARN y análisis mediante q-PCR ..................... 52
6.6.4 Ensayos para evaluación de niveles de Calcio ........................................ 53
6.6.5 Ensayos para detección de ROS ............................................................. 54
6.7 Evaluación de disfunción mitocondrial ..................................................... 54
6.7.1 Ensayos de integridad mitocondrial.......................................................... 54
6.7.2 Medición del potencial de la membrana mitocondrial ............................... 54
6.7.3 Ensayos de Seahorse .............................................................................. 55
6.8 Evaluación de la inducción de autofagia .................................................. 56
6.8.1 Ensayos de monodansilcadaverina y LC3 I/II por microscopia confocal .. 56
6.8.2 Ensayos de Western Blot para proteínas de autofagia ............................ 58
6.9 Evaluación de muerte celular inmunogénica ............................................ 59
6.9.1 Ensayos de evaluación de Ecto-calreticulina ........................................... 59
6.9.2 Evaluación de ATP vesicular .................................................................... 59
6.9.3 Evaluación de HMGB-1 ............................................................................ 60
7 RESULTADOS ......................................................................................... 61
7.1 Papel del estrés de retículo endoplasmático en la inducción de muerte
celular mediada por el extracto P2Et y sus polifenoles asociados ..................... 61
7.1.1 El extracto P2Et y los polifenoles ácido gálico y etil galato presentan
actividad citotóxica e inducen apoptosis en células B16-F10. ........................... 61
7.1.2 P2Et induce estrés de RE y este es necesario para la inducción de
apoptosis en células B16-F10 ............................................................................ 64
7.1.3 Inducción de apoptosis por P2Et depende de la activación de PERK ..... 68
7.1.4 La apoptosis inducida por P2Et es independiente de la respuesta
integrada al estrés y de la producción de ROS .................................................. 70
7.2 Papel de la autofagia en la muerte celular mediada por el extracto P2Et y
los polifenoles ácido gálico y etil galato. ............................................................ 77
7.2.1 El P2Et y el EG inducen autofagia con flujo autofágico completo, mientras
que el AG bloquea el flujo autofágico. ............................................................... 77
7.2.2 La inhibición del flujo autofágico con cloroquina aumenta la muerte celular
mediada por P2Et, AG y EG. ............................................................................. 80
7.2.3 En células B16F10 (knock-out para beclina-1) se observa un aumento en
la muerte celular mediada por P2Et y una disminución por AG. ........................ 81
7.3 Participación del estrés en el RE y la autofagia en la generación de
señales inmunogénicas en células B16-F10 tratadas con el extracto P2Et y los
polifenoles asociados ........................................................................................ 86
7.3.1 Los polifenoles AG y EG tienen menor potencial inmunogénico que el
extracto complejo P2Et ...................................................................................... 86
7.3.2 El knock-out de PERK inhibe la generación de señales de peligro en
células B16-F10 tratadas con P2Et ................................................................... 89
7.3.3 La autofagia es necesaria para la liberación de ATP en células B16-F10
tratadas con EG y P2Et ..................................................................................... 92
8 DISCUSION ............................................................................................. 95
9 CONCLUSIONES................................................................................... 108
10 PERSPECTIVAS .................................................................................... 110
11 FINANCIAMIENTO................................................................................. 112
12 REFERENCIAS ...................................................................................... 113
13 ANEXOS ................................................................................................ 127
13.1 Anexo 1. Lentivectores CRISPR/Cas9 utilizados para la generación de los
clones knock-out .............................................................................................. 127
13.2 Anexo 2. Productos relacionados con este trabajo ................................ 128
13.3 Anexo 3. Premios y distinciones ............................................................ 129
13.4 Anexo 4. Participación en congresos y eventos ..................................... 130
13.5 Anexo 5. Otros productos no relacionados ............................................ 133
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Vías de señalización involucradas en la respuesta a proteínas mal plegadas. . 16
Figura 2. Fases durante la inducción de autofagia y proteínas involucradas. .................. 23
Figura 3. Fotografías Caesalpinia spinosa. ..................................................................... 37
Figura 4. Huella cromatográfica del extracto P2Et y compuestos asociados. .................. 39
Figura 5. Procedimiento para la obtención de P2Et a grado laboratorio. ......................... 45
Figura 6. Evaluación de la expresión de XBP-1 y PERK en los clones generados con el
sistema CRISPR/Cas9. .................................................................................................... 48
Figura 7. Evaluación de la expresión de beclina-1 en los clones generados con el sistema
CRISPR/Cas9. ................................................................................................................. 49
Figura 8. Actividad citotóxica de P2Et y los polifenoles AG y EG sobre la línea celular B16-
F10. ................................................................................................................................. 62
Figura 9. Alteraciones morfológicas presentadas en las células B16-F10 tratadas con P2Et
y los polifenoles AG y EG. ............................................................................................... 63
Figura 10. El extracto P2Et y los polifenoles AG y EG inducen muerte por apoptosis de
células B16-F10. .............................................................................................................. 64
Figura 11. El P2Et a diferencia de AG y EG aumenta la masa del RE y la expresión relativa
de BiP y CHOP en células B16-F10. ................................................................................ 66
Figura 12. La inducción de estrés de RE es necesaria para la muerte celular mediada por
P2Et. ................................................................................................................................ 67
Figura 13. La apoptosis mediada por P2Et es dependiente de PERK e independiente de
XBP-1. ............................................................................................................................. 69
Figura 14. La inhibición de la respuesta integrada al estrés no afecta la actividad del P2Et.
........................................................................................................................................ 71
Figura 15. El tratamiento con P2Et en las células B16-F10 no modula la producción de ROS
como mecanismo de inducción de apoptosis. .................................................................. 73
Figura 16. P2Et incremento de los niveles citoplasmáticos de Ca+2 vía PERK para la
inducción de apoptosis. ................................................................................................... 75
Figura 17. P2Et induce disfunción mitocondrial dependiente de Ca+2 y PERK. ............... 76
Figura 18. P2Et y EG inducen autofagia con flujo autofágico completo. .......................... 79
Figura 19. La inhibición del flujo autofágico con cloroquina aumenta la muerte celular en
células B16-F10 tratadas con P2Et, AG y EG. ................................................................. 81
Figura 20. La inducción de autofagia fue inhibida en células B16-F10 utilizando el sistema
CRISPR/Cas9. ................................................................................................................. 84
Figura 21. La autofagia inducida por P2Et y EG es protectora y es dependiente de Beclina-
1. ..................................................................................................................................... 85
Figura 22. La inducción de señales de muerte inmunogénica es menor en las células
tratadas con AG y EG en comparación con P2Et. ............................................................ 88
Figura 23. PERK es necesario para la generación de las 3 principales señales de peligro
inducidas en el tratamiento con P2Et. .............................................................................. 91
Figura 24. La autofagia es necesaria para la exposición de CRT y la liberación de ATP
durante el tratamiento con P2Et y EG. ............................................................................. 93
Figura 25. Modelo de la inducción de muerte y la generación de señales inmunogénicas
por P2Et, AG y EG. .......................................................................................................... 97
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de polifenoles naturales................................................................. 34
Tabla 2. Resumen del análisis de fragmentación de los compuestos obtenidos del P2Et. 40
Tabla 3. Actividad citotóxica (CI50) de P2Et, ácido gálico y etil galato sobre células B16-
F10 .................................................................................................................................. 62
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
ADN: Ácido desoxirribonucleico
ADNm: ADN mitocondrial
AF: Autofagosoma
AG: Ácido gálico
AL: Autolisosoma
ARN: Ácido ribonucleico
ARNm: ARN mensajero
ATF: Factor de transcripción
ATP: Adenosín trifosfato
BiP: Binding immunoglobulin protein
Ca2+: Calcio
CHOP: CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein
CI50: Concentración inhibitoria 50
CQ: Cloroquina
CRT: Calreticulina
DAMPs: Damage-associated molecular patterns
CRISPR: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
DOXO: Doxorubicina
Ecto-CRT: Exposición de calreticulina en la membrana celular
EG: Etil Galato
eIF2α: Factor de iniciación eucariótica 2α
ERAD: ER-associated degradation pathway
ESM: Error medio estándar
FS: Fosfatidil serina
GCN2: General control non-derepressible-2
GRP78: 78kDa glucose-regulated protein
HPLC/MS: Cromatografía de Alta Resolución Acoplado a Masas
HMGB-1: High mobility group box 1 protein
HSP: Proteínas de choque térmico (Heat Shock Protein)
IFN: Interferon
IMF: Intensidad Media de Fluorescencia
IP: Ioduro de propidio
IRE-1: Inositol-requiring enzyme-1 alpha
ISR: Integrated Stress Response
ISRIB: Inhibidor de la ISR
LC3: Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3
LMP: Lisosomal membrane permeabilization
MCI: Muerte celular inmunogénica
MDR: Multi-Drug Resistance
MDSC: Células mieloides supresoras
METF: Metformina
MTT: Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue
MTX: Mitoxantrona
PBS: Buffer fosfato
PERK: Protein kinase RNA-like endoplasmatic reticulum kinase
PERK KO: Células B16-F10 knock-out para PERK
PKR: Protein kinase double-stranded RNA-dependent
QC: Quinacrina
q-PCR: PCR en tiempo real
RE: Retículo endoplásmico
RIDD: Regulated IRE1-Dependent RNA Decay
ROS: Especies reactivas de oxígeno
UPR: Unfolded Protein Response (Respuesta a proteínas mal plegadas)
Sal: Salubrinal
SCR: Scrambled
TAPS: Tapsigargina
TERF: Terfenadine
TUDCA: Ácido Tauroursodeoxicólico
TUNI: Tunicamicina
XBP-1: X-Box binding protein
XBP-1 KO: Células B16-F10 knock-out para XBP-1
WT: Wild type (fenotipo salvaje)
1
1. RESUMEN EJECUTIVO
El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial, los tratamientos para
controlar esta enfermedad se basan en la inducción de la muerte de la célula tumoral. En
condiciones fisiológicas esa inducción de muerte celular es inmunológicamente silenciosa
(tolerogénica) [1]. Sin embargo, durante el tratamiento con algunas terapias antitumorales
(como antraciclinas, radioterapia y terapia fotodinámica) se puede generar una muerte
celular que estimula la respuesta inmune antitumoral. Esta muerte celular denominada
muerte celular inmunogénica (MCI) se caracteriza por el incremento de señales de peligro,
entre las que se encuentran la exposición de calreticulina en la membrana celular (Ecto-
CRT) y la liberación de ATP y de la proteína HMGB-1 (high mobility group box 1) [2, 3]. Se
ha descrito que la mayoría de los inductores de MCI, directa o indirectamente inducen estrés
oxidativo con la generación de estrés de retículo endoplásmico (RE) y autofagia, para la
liberación de señales inmunogénicas [4-6]. Estos mecanismos de estrés indistintamente
pueden contribuir con la sobrevivencia o la inducción de la muerte celular durante el
tratamiento, o incluso algunos de ellos favorecen en el microambiente tumoral la generación
de células con capacidad inmunosupresora [7-10]. Debido a la alta resistencia presentada
en cáncer como consecuencia del uso de medicamentos que presentan un solo blanco
molecular, se han empezado a utilizar combinaciones farmacológicas para tratar de mejorar
la muerte celular, en la MCI por ejemplo, se propone combinar fármacos que activen la
respuesta al estrés en diferentes organelos para lograr la inducción de todas las señales de
peligro [11]. Por otra parte, en la búsqueda de nuevas y eficientes terapias antitumorales
que puedan modular positivamente la respuesta inmune, se han venido desarrollando una
serie de medicamentos derivados de plantas, los cuales son ricos en polifenoles
(compuestos antioxidantes con diferentes actividades antitumorales, antiinflamatorias y
antimetastásicas), entre otros [12, 13]. En este sentido, en el grupo de Inmunobiología y
Biología Celular de la Pontificia Universidad Javeriana se obtuvo un extracto rico en
polifenoles derivado de la planta Caesalpinia spinosa, denominado P2Et. El P2Et ha
demostrado tener actividad antitumoral in vitro sobre líneas de cáncer de seno y melanoma,
a través de la inducción de apoptosis, autofagia y de señales involucradas con MCI. Estos
resultados fueron confirmados en modelos in vivo de cáncer de seno y melanoma en los
2
que se mostró que el tratamiento con P2Et disminuye el tumor de una forma dependiente
de la respuesta inmune con la generación de linfocitos T más eficientes y una disminución
en células mieloides supresoras [14-16]. Para determinar cuáles mecanismos utilizan los
extractos de plantas ricos en polifenoles como el P2Et y los polifenoles que se asocian a
ese tipo de extractos, para favorecer la inducción de MCI, en este trabajo se hizo un análisis
mecanístico en donde se evaluó el papel del estrés de retículo y la autofagia en la inducción
de muerte celular y en la generación de señales inmunogénicas. Para ello se utilizaron
células B16-F10 de melanoma murino, las cuales fueron tratadas con P2Et o con los dos
polifenoles más abundantes en el extracto ácido gálico (AG) y etil galato (EG, y se
combinaron con inhibidores químicos de estrés de RE y de autofagia. Por otra parte, se
generaron clones de células B16-F10 carentes de genes necesarios para la activación de
estrés de RE y de autofagia utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y se trataron con el extracto
y los polifenoles. Cuando se evaluó la inducción de estrés de RE, se observó un incremento
significativo en las vías de señalización de PERK e IRE-1 con P2Et llamando la atención
que no hubo incremento de las especies reactivas de oxígeno. Por otra parte, no se observó
incremento en la inducción de estrés de RE con AG y solo un ligero incremento con EG que
no fue significativo. La muerte celular mediada por P2Et fue totalmente dependiente de la
activación de PERK, que llevo al incremento en los niveles de calcio citoplasmático y a su
vez, estos se asociaron con pérdida del potencial de la membrana mitocondrial y la
inducción de muerte por apoptosis. Por otra parte, la inhibición de la autofagia aumento la
muerte mediada por P2Et y EG, mientras que disminuyó la muerte en células tratadas con
AG, sugiriendo que este último induce una autofagia citotóxica. Adicionalmente, se encontró
que de los dos polifenoles solo el EG induce señales de MCI pero en menor proporción
comparado con P2Et. Interesantemente, se identificó que la vía PERK es necesaria también
para la expresión de los tres marcadores de muerte inmunogénica estudiados en células
tratadas con P2Et y que la autofagia contribuye con la liberación de CRT y ATP. Estos
resultados demuestran que el mecanismo por el cual P2Et induce MCI es diferente a los
mecanismos previamente descritos para otros inductores de MCI, además que el uso del
extracto complejo es ventajoso frente al uso de los polifenoles aislados, lo cual confirma el
potencial que tienen los extractos complejos en el tratamiento del cáncer.
3
2. ABSTRACT
Cancer is the second leading cause of death globally; treatments to control of cancer are
based on tumor cell death. Under physiological conditions, cell death is silent without
immune activation (tolerogenic) [1]. However, during the treatment with some antitumor
therapies (such as anthracyclines, radiotherapy, and photodynamic therapy) the cell death
can induce an antitumor immune response. This form of cell death is called immunogenic
cell death (ICD) and it is characterized by an increase in the danger-associated molecular
pattern (DAMPS) like the exposure of calreticulin in the cell membrane (Ecto-CRT) and
release of ATP and HMGB-1 (high mobility group box 1 protein) [2, 3]. Appropriate cellular
stress responses are necessary for the production of danger signals during ICD including
the activation of mediators related to oxidative stress, endoplasmic reticulum (ER) stress
and autophagy [4-6]. The stress response also has several functions: it can increase tumor
cells survival or it has immunosuppressive functions over immune tumor infiltrate, otherwise,
the stress response is involved in cell death [7-10]. Therapies derived from natural
compounds have demonstrated antitumor potential along with a low risk of side effects also
have more tolerable toxicity profiles than conventional chemotherapeutic drugs. Plant
extracts contain a diverse range of compounds including polyphenols, which may exert their
therapeutic functions by increasing ER stress, inducing oxidative stress or promoting
apoptosis of tumor cells. For these reasons, natural compounds have been considered a
resource for developing new chemotherapeutic drugs or chemosensitizing agents [12, 13].
In this sense, our group has been working with P2Et, a polyphenol-rich extract obtained from
plant Caesalpinia spinosa that promotes antitumor activities through the induction of
immunogenic cancer cell death (ICD). Vaccination with P2Et-treated cells induced an
immune-mediated reduction in tumor volume; while immunocompetent mice exhibited
decreased tumor growth, the tumor-protective effect was abolished in immunodeficient mice.
[14-16]. Here, we sought to elucidate the mechanism used by P2Et and associated
polyphenols in apoptosis and ICD induction in murine melanoma cells. In this work, a
mechanistic analysis was carried out to determine the role of ER stress and autophagy on
cell death and ICD induction. We treated B16-F10 melanoma cells with P2Et, Gallic acid
(GA) or Ethyl gallate (EG) (most abundant polyphenols in P2Et extract). On the other hand,
we used the CRISPR/Cas9 system to generate knock out in genes involved with ER stress
and autophagy. After, B16-F10 treatment we observed that P2Et increases ER stress
mediated through PERK and IRE-1 activation. Besides, GA is not an inducer of ER stress
and EG only has a slight increase. Interestingly, P2Et-mediated cell death was PERK-
dependent, followed by an increase in calcium levels, without alteration in reactive oxygen
species. Therefore, P2Et treatment induces mitochondrial membrane potential loss to
generate apoptosis. Otherwise, autophagy inhibition increases cell death mediated by P2Et
4
and EG, while apoptosis decreased in cells treated with GA, suggesting that GA induces a
cytotoxic autophagy. In addition, it was found that only EG induced MCI signals but in less
proportion compared with P2Et. Remarkably, we showed that PERK pathway is necessary
for the expression of the immunogenic cell death markers in P2Et treated cells. In the same
way, autophagy contributes to Ecto-CRT and ATP release. These results showed that P2Et
induces MCI through a different mechanism comparing with other MCI inducers.
Furthermore, we observed that complex extracts use could be advantageous compared to
the use of isolated compounds, these results confirm the potential of complex extracts in the
treatment of cancer.
5
3. INTRODUCCION
Las células son sistemas complejos dentro de los cuales diversos mecanismos moleculares
deben trabajar en conjunto para contribuir a su buen funcionamiento, es así como cada uno
de los organelos en el interior de la célula tiene funciones específicas que les permiten
responder ante cambios fuertes que alteran la homeostasis [17]. Durante condiciones de
estrés como hipoxia, deficiencia de nutrientes o daño por toxinas, cada organelo genera
una respuesta que le permite a la célula alcanzar la homeostasis. Sin embargo, cuando las
condiciones adversas son prolongadas, estos sistemas de respuesta al estrés pueden
activar mecanismos de muerte celular. Los procesos moleculares asociados con la
respuesta al estrés son muy importantes para la célula y es por lo que alteraciones en estos
procesos moleculares han sido ampliamente asociados a diferentes enfermedades, entre
ellas el cáncer [17, 18]. Las células tumorales tienen la capacidad de adaptarse al estrés
usando diferentes estrategias, como son el incremento de mecanismos antioxidantes, la
respuesta al daño del ADN, la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR, del inglés
Unfolded Protein Response) en el retículo endoplásmico y/o la mitocondria y la inducción
de autofagia, todos estos mecanismos pueden contribuir con la muerte de la célula tumoral
o permitir la adaptación de estas células y resistir a la terapia [18, 19]. Por ejemplo, las
células con fenotipo multirresistente a drogas (MDR, del inglés: Multidrug resistance) tienen
mayor estrés de RE que las células parentales lo que las hace más sensibles a inductores
de estrés de RE como tunicamicina [20], y por lo tanto esto puede constituirse en blanco de
terapias que induzcan estrés de RE para llevarlas a la muerte. Adicionalmente, estos
mecanismos también pueden contribuir con la supervivencia de la célula, por ejemplo,
durante condiciones de deprivación de nutrientes la autofagia se activa y le proporciona a
la célula ATP a partir de la degradación de organelos y proteínas ayudándola a resistir a la
muerte, en casos como estos se propone el uso de inhibidores de autofagia para contribuir
con la muerte mediada por la terapia en cáncer [21, 22]. Por tanto, ha sido propuesto que
el destino de una célula tumoral depende de las condiciones del microambiente en el que
se encuentre, así como de la clase y la dosis de estrés que se genere frente a la terapia
[23].
6
Por otra parte, el estrés celular también tiene un papel importante en la generación de
señales que activan la respuesta inmune antitumoral, entre ellas la exposición de
calreticulina (CRT) en la membrana plasmática y la liberación de ATP y HMGB-1. Estas
señales se generan en respuesta a algunas terapias antitumorales como las antraciclinas
o la terapia fotodinámica con hipericina y dependen de mecanismos de respuesta al estrés
principalmente de estrés de RE y autofagia [24-26]. Este tipo de muerte es denominada
muerte celular inmunogénica (MCI) y se caracteriza principalmente por la liberación de
estas señales de peligro que conllevan a la activación de la respuesta inmune, la cual
permite eliminar las células tumorales residuales y disminuir la reaparición de tumores y las
metástasis [27, 28]. Hasta la fecha los inductores de MCI que se conocen, aumentan la
producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés reactive oxygen species)
como parte del proceso de inducción de apoptosis, lo cual contribuye también con la
inducción de estrés de RE y autofagia [5, 29]. Aunque los ROS contribuyen a esta
generación de señales de MCI, también han sido asociados con efectos pro-tumorigénicos
en el microambiente tumoral, entre ellos la generación de fibroblastos asociados a tumor
(CAF) y el efecto inmunosupresor sobre diferentes células del sistema inmune [30, 31]
En la actualidad se propone utilizar nuevas estrategias terapéuticas, las cuales se pueden
combinar con terapias convencionales tales como quimioterapia y radioterapia, activando
de forma prolongada las señales de estrés, y contribuyendo con la inducción de muerte de
las células tumorales [20, 32]. Es así como nuevas terapias alternativas han empezado a
investigarse, entre ellas la terapia con productos naturales también llamados
fitomedicamentos, dentro de los cuales se encuentran los extractos producidos a partir de
plantas medicinales con actividades antitumorales [33]. Los fitomedicamentos tienen una
alta variedad de compuestos, que los hacen más complejos y que pueden actuar sobre el
tumor para modular diferentes blancos moleculares y con ello disminuir la multiresistencia,
a su vez estas terapias naturales han tenido buenos resultados en estudios clínicos, ya que
pueden reducir los efectos adversos y la toxicidad de la quimioterapia [34]. Dentro de los
componentes más abundantes en los fitomedicamentos se encuentran los polifenoles, los
cuales tienen un alto potencial en la terapia en cáncer ya que se ha descrito que pueden
modular el incremento de ROS, la inducción de autofagia y de estrés de RE, para promover
la muerte en células tumorales [35-37]. Aunque se conoce que estos polifenoles también
7
pueden ser inmunomoduladores, no es del todo claro su papel en la generación de señales
inmunogénicas en el tumor [12]. Adicionalmente, el uso de polifenoles en la terapia cobra
más valor por su efecto protector en células normales [38].
En este sentido, en el grupo de inmunobiología y biología celular se ha venido trabajando
en la búsqueda de extractos derivados de plantas con potencial antitumoral. Entre ellos se
ha obtenido el extracto P2Et de la planta Caesalpinia spinosa, el cual es un extracto rico en
polifenoles, entre los cuales se encuentran el ácido gálico y el etil galato [39]. Los trabajos
con P2Et sobre diferentes líneas tumorales mostraron que induce apoptosis acompañada
de autofagia y de la liberación de señales de MCI. Estos resultados fueron confirmados en
modelos in vivo en los cuales células tumorales de cáncer de seno (4T1) y melanoma (B16-
F10) fueron tratadas con P2Et y usadas como vacuna en ratones sanos. Posteriormente
cuando se inyectaron células tumorales vivas, se encontró que los ratones vacunados con
células tratadas con P2Et reducían el crecimiento del tumor, revelando que estas células
son altamente inmunogénicas, aumentan la respuesta inmune especifica mediada por
linfocitos T y la activación de células dendríticas de una forma comparable con resultados
obtenidos con otros inductores de MCI [14, 15].
Teniendo en cuenta que el uso de fitomedicamentos ha sido creciente en los últimos años
y que los mecanismos moleculares a través de los cuales los polifenoles pueden estar
contribuyendo a la muerte tumoral con activación de la respuesta inmune no se conocen en
detalle, se hace necesario conocer los mecanismos a través de los cuales el P2Et, un
extracto rico en polifenoles y sus polifenoles asociados, puede participar en la generación
de muerte celular y de señales inmunogénicas en un modelo de melanoma murino. Por ello,
el propósito de este trabajo fue evaluar los mecanismos moleculares de respuesta al estrés
que utiliza el P2Et para la generación de señales inmunogénicas y la muerte de la célula
tumoral.
8
4. JUSTIFICACION
El cáncer es una enfermedad altamente compleja que se caracteriza por presentar una
variedad de alteraciones genéticas que dificultan su control y eliminación. Dentro de los
diferentes tipos de cáncer que existen se encuentra el melanoma cutáneo que es el tumor
de piel más agresivo y maligno, sigue siendo uno de los cánceres humanos más difíciles
de tratar y su incidencia sigue incrementando dramáticamente cada año [40]. En Colombia,
el Instituto Nacional de Cancerología informó que la incidencia de melanoma es de 3,0 x
100,000 habitantes para hombres y 2,7 x 100,000 para mujeres [41]. El melanoma solo
representa el 4,0% en todos los cánceres de piel, pero es responsable del 70,0% al 80,0%
de todas las muertes por este tipo de cáncer, las tasas de mortalidad también han
aumentado debido a que el tratamiento oportuno para los pacientes con melanoma
depende de muchos factores, principalmente del acceso económico a servicios de salud
[42]. Sumado a esto, siguen apareciendo diferentes mecanismos de resistencia en las
células tumorales en parte porque la mayoría de los fármacos están dirigidos a un solo
blanco terapéutico y la célula tumoral puede tomar vías alternas de respuesta para
sobrevivir, lo que hace que en la actualidad a pesar de usar terapias muy costosas no se
pueda controlar el cáncer con un 100% de efectividad. Es por lo que, el uso de terapias
alternativas y complementarias que ayuden a potenciar las terapias usadas en cáncer se
hace cada vez más necesario; en ese sentido se ha venido desarrollando el uso de
fitomedicamentos, los cuales disminuyen la multiresistencia, los efectos secundarios y
adicionalmente por su complejidad pueden actuar sobre diferentes blancos moleculares
[43]. En Colombia gracias a la alta biodiversidad, tenemos un mayor potencial para acceder
a este recurso y trabajar en la generación de terapias más económicas, que sean accesibles
y efectivas, y de esta forma respondan a las necesidades actuales de la terapia en cáncer.
En nuestro grupo de investigación se ha mostrado el papel del extracto P2Et de Caesalpinia
spinosa en la eliminación del tumor a través de la generación de señales inmunogénicas y
de la inducción de la respuesta inmune, sin embargo, hasta el momento los mecanismos
intracelulares responsables de la actividad antitumoral del P2Et no se han esclarecido a
profundidad y tener este conocimiento es fundamental para potencializar el uso del extracto.
Por otra parte, la evaluación del comportamiento de los polifenoles presentes en el extracto
en comparación con el P2Et ayudará en la comprensión de como la complejidad de los
9
extractos de plantas contribuye en la respuesta al estrés de la célula y en la generación de
señales inmunogénicas en la terapia con fitomedicamentos.
10
5. MARCO TEORICO Y ESTADO DEL ARTE
4.1 Estrés celular
Todas las células eucarióticas dentro del proceso de desarrollo y a lo largo de la vida son
expuestas constantemente a diferentes situaciones de estrés debido a cambios en el
ambiente que las rodea, de hecho, estas células tienen una alta capacidad de adaptación
[17, 18]. La respuesta al estrés celular es un proceso altamente conservado que se activa
cuando existe algún daño molecular como consecuencia de situaciones tales como
inanición o depleción de ATP, hipoxia, estrés oxidativo, hipertermia, depleción de nutrientes,
daño del ADN por exposición a radiación UV o a medicamentos y estrés hormonal o
mecánico entre otros [44, 45]. En el interior de la célula cada organelo utiliza mecanismos
de respuesta al estrés alternos y la combinación de todos ellos le permite volver a su
condición normal (homeostasis); sin embargo, la respuesta depende en parte de la
amenaza que reciba la célula, el tiempo de duración y el lugar que se vea afectado. Los
principales organelos involucrados en la respuesta al estrés son el retículo endoplasmático,
el aparato de Golgi, la mitocondria, los lisosomas y el núcleo. Ellos se encargan de activar
diferentes vías que permiten mantener la integridad de células y tejidos, por tanto,
alteraciones en estas vías de señalización pueden también estar relacionadas con
enfermedades como el cáncer [46]. Cuando el estrés es sostenido la célula produce
cambios metabólicos y expresión de genes de supervivencia que disminuyen la
proliferación a través de la detención del ciclo celular (senescencia), pero cuando el daño
es muy alto y la causa de estrés se mantiene, se activan una serie de señales que
finalmente llevan a la muerte celular [17, 18]. En cualquiera de estos casos: la activación
de la respuesta al estrés, la entrada en senescencia o la activación de vías de muerte
celular, el objetivo principal es llegar a una homeostasis sistémica [18]
11
4.1.1 Respuesta al estrés y homeostasis
Durante la inducción de estrés celular el daño se produce principalmente en
macromoléculas como ADN y proteínas, por lo tanto, los mecanismos de respuesta se
basan principalmente en reparar el ADN y en conseguir que la cantidad y la calidad de las
proteínas sea la adecuada (proteostasis). Aunque muchas vías de señalización pueden ser
activadas para el control del estrés celular, cuatro mecanismos principales son involucrados
en la respuesta al estrés: (i) la respuesta a daños en el ADN, (ii) la respuesta del retículo
endoplásmico, (iii) la respuesta de la mitocondria y (iv) la inducción de autofagia [18].
La respuesta a daños en el ADN se basa principalmente en la activación de diferentes
mecanismos de reparación, existe una gran variedad de mecanismos de reparación que
son específicos del daño inducido y por lo general ellos por si solos pueden eliminar el
peligro. Cuando estos mecanismos no son suficientes, el núcleo inicia un proceso conocido
como tolerancia al ADN dañado en el cual se detiene la replicación hasta que el ADN sea
completamente reparado, en este proceso se activan polimerasas menos eficientes que
aumentan el rango de mutaciones. Finalmente, si ninguno de estos procesos permite
alcanzar la homeostasis se hace una detención del ciclo celular a través de la activación de
p53 y se mantienen las células senescentes; solo cuando se encuentra una alta cantidad
de alteraciones en el ADN se activan las señales de muerte celular. Adicionalmente, este
mecanismo de respuesta a daños en el ADN esta también activo durante los procesos de
proteostasis [47, 48].
Durante condiciones de estrés, como se mencionó previamente la proteostasis también se
pierde, en algunos casos por alteración en los mecanismos postranscripcionales que llevan
a la acumulación de proteínas mal plegadas y en otros por el daño directo a las proteínas
ya formadas [48, 49]. Como parte de la respuesta a estas proteínas defectuosas se activa
la transcripción de una alta variedad de chaperonas entre las que se encuentran las
proteínas de choque térmico (HSP, del inglés Heat Shock Proteins) que contribuyen con el
plegamiento de proteínas. Además, esta la UPR que se da principalmente en el RE y tiene
como objetivo disminuir la carga proteica a través de la traducción de proteínas y aumentar
la eliminación de estas proteínas dañadas. El RE tiene varios mecanismos para dirigir esta
respuesta, estos mecanismos y los mecanismos involucrados con la autofagia que también
contribuyen con la respuesta al estrés serán descritos en detalle posteriormente [49, 50].
Las proteínas dañadas también activan una UPR a nivel mitocondrial, uno de los
12
mecanismos más involucrados con la activación de esta respuesta es el estrés oxidativo
que se presenta en las células tumorales. En la mitocondria se activa una serie de señales
que aumentan las chaperonas HSP70, HSP60 y mtDnaJ, las cuales contribuyen al
plegamiento de proteínas y a la activación de otras proteínas involucradas en la respuesta
integrada al estrés [50, 51].
4.1.2 Estrés celular y tumorigenésis
Hanahan y Weinberg han propuesto un modelo que ha sido ampliamente aceptado, en el
que definen las propiedades o sellos que adquieren y caracterizan las células malignas.
Entre ellos encontramos un potencial replicativo ilimitado, evasión de la apoptosis,
inestabilidad genómica, alteración del metabolismo energético y evasión de la respuesta
inmune [52]. Además, estas células que son altamente proliferativas, necesitan de una
mayor producción de proteínas y presentan una elevación en la tasa de glicolisis, lo cual
hace que estén sometidas a estrés constante [23]. Por ello, durante el proceso de
adaptación de la célula transformada la inducción de estrés celular es necesaria para el
proceso de resistencia a la muerte y de senescencia que sufren las células tumorales y que
promueven el crecimiento tumoral [53, 54]. También ha sido descrito que las células
tumorales tienen la capacidad de adaptarse al estrés constante que se produce en el
microambiente, algunos trabajos han demostrado que bajo condiciones de estrés moderado
los hepatocitos activan vías preapoptóticas que son reversibles (translocación al núcleo de
pro-caspasa 9 y Bax), esto permite la adaptación de las células al estrés e inhiben la
apoptosis en vez de promoverla. Esto sucede si no existe una señal de estrés más fuerte
que lleve a la activación completa de las vías apoptóticas [55, 56]. En este sentido, todos
los mecanismos homeostáticos como por ejemplo el estrés de RE y la autofagia pueden ser
aprovechados por las células tumorales para sobrevivir y por tanto son prometedores
blancos terapéuticos [57, 58].
13
4.1.3 Estrés celular y respuesta a la terapia
Como se describió previamente las células tumorales presentan una tolerancia mayor a
condiciones extremas en comparación con las células normales del mismo tejido, ellas
pueden ser resistentes a la terapia de forma inherente, o pueden adaptarse para sobrevivir
a esta activando mecanismos de inestabilidad genómica, generando mutaciones, alterando
programas de expresión de genes y reprogramando vías metabólicas para evadir las
señales de inhibición del crecimiento [23]. Igual que en el proceso de tumorigenésis el
aumento de la respuesta al estrés en la célula tumoral puede tener un rol dual durante la
terapia antitumoral, de esta forma, los mecanismos de respuesta al estrés entre ellos el
estrés de RE y la autofagia han sido involucrados en la resistencia de las células tumorales
a las terapias convencionales como la quimioterapia y en otros casos se ha visto que
contribuyen a la muerte celular por activación de vías proapoptóticas [59, 60]. Durante la
resistencia al tratamiento con quimioterapéuticos o con inhibidores metabólicos en
glioblastoma y melanoma se ha observado el incremento de la autofagia como principal
mecanismo de protección, además, la inhibición de este mecanismo lleva a una mayor
muerte celular confirmando su papel protector [61, 62]. Además, la resistencia en cáncer
también puede ser mediada por la UPR, algunas de las vías que se activan en el RE en
respuesta a las terapias antitumorales pueden contribuir a generar señales que le permiten
a la célula adaptarse [63]. Sin embargo, la generación de estrés es inherente a cualquier
terapia antitumoral, por ello se ha tratado de entender como dirigir una señal que sea lo
suficientemente fuerte para contribuir con la muerte celular y no con la supervivencia [23].
En este sentido, se encontró en un modelo de células MDR de cáncer gástrico generado
con adriamicina, que estas células MDR presentan un incremento en el estrés de RE en
comparación con las células normales del mismo tejido y con las células tumorales
parentales, lo cual sugiere que este mecanismo contribuye con la resistencia. Sin embargo,
este incremento fue utilizado para potenciar la terapia, ya que estas células fueron más
sensibles a la muerte mediada por inductores de estrés de RE porque el aumento de la
UPR es letal para ellas [20]. Trabajos como estos, muestran que probablemente sea mejor
y más eficiente utilizar la respuesta al estrés para mejorar la muerte durante la terapia
antitumoral.
14
4.2 Estrés de retículo endoplasmático y las vías de la respuesta a proteínas mal plegadas
El retículo endoplásmico es un sistema extenso de membranas que se extiende alrededor
del núcleo y abarca una gran parte del citoplasma, su importancia radica en la variedad de
procesos que se realizan allí, necesarios para el mantenimiento de la célula. Entre las
funciones más importantes se encuentra la síntesis, plegamiento, procesamiento y
secreción de proteínas, además la reserva y modulación de los niveles de calcio y la síntesis
de lípidos y esteroides [64]. Aproximadamente un tercio de las proteínas celulares son
sintetizadas y procesadas en el RE a través de chaperonas, enzimas de glicosilación y
oxido-reductasas. La mayor parte de las proteínas que se sintetizan en el RE sufren varias
modificaciones postranscripcionales (glicosilación y plegamiento) para que puedan dirigirse
a la membrana celular, el aparato de Golgi o los lisosomas; por lo tanto, alteraciones en el
proceso de modificación postranscripcional lleva a la acumulación de proteínas en el RE
[9]. Generalmente durante condiciones adversas se altera en primer lugar la proteostasis,
lo que hace que el RE, aunque tiene una alta capacidad de secreción de proteínas no pueda
responder a las necesidades de la célula y sea uno de los principales sensores frente al
estrés. En este proceso conocido como estrés de RE, este organelo responde a las
alteraciones intrínsecas y extrínsecas que se presentan activando la UPR y programas de
expresión génica para aliviar el estrés celular y volver a la homeostasis [65].
La UPR se compone de tres elementos centrales que consisten en proteínas
transmembranales del RE las cuales actúan en paralelo y usan mecanismos únicos de
transducción de la señal. Estas proteínas de iniciación se encuentran en la membrana del
RE unidas a GRP78 (del inglés: 78kDa glucose-regulated protein) también conocida como
BiP o proteína de unión a inmunoglobulina (binding immunoglobulin protein, en inglés), esta
proteína es una chaperona encargada del plegamiento de proteínas, la cual durante la
acumulación de proteínas en el lumen se disocia de la unión y permite la activación de las
vías de señalización IRE-1, PERK y ATF-6 (Figura 1) [9, 65]. La vía más conservada y por
tanto la más estudiada es la vía IRE-1 (del inglés: Inositol-requiring enzyme-1), una
15
quinasa y endoribonucleasa, que forma oligómeros para catalizar el splicing no
convencional de un intron de 26 nucleótidos en el ARNm del factor de transcripción XBP-1
(X-Box binding protein, en inglés) dejándolo en su forma activa (XBP-1s). Este factor de
transcripción regula la síntesis de chaperonas y proteínas involucradas con el plegamiento
de proteínas. Adicionalmente activa la síntesis de lípidos que contribuye al aumento del
tamaño del RE y también activa el sistema denominado ERAD (del inglés: ER-associated
degradation) que se encarga de enviar proteínas del lumen del RE hacia el proteasoma
para su degradación [9, 65]. Todas estas funciones contribuyen con la homeostasis celular,
pero en los casos en los que el estrés es sostenido y la respuesta del RE no es suficiente
para alcanzar la proteostasis, IRE-1 activa el sistema RIDD (del inglés: Regulated IRE1-
Dependent RNA Decay) asociado con la muerte celular por degradación de ARN mensajero
(ARNm) y microARN; este es uno de los mecanismos por los cuales se puede controlar el
destino celular bajo condiciones de estrés de RE [65, 66].
El segundo elemento es PERK (del inglés: protein kinase RNA-like endoplasmatic reticulum
kinase), cuando esta proteína se libera de BiP se dimeriza, lo cual lleva a activación de su
dominio quinasa llevando a la fosforilación e inactivación del factor de iniciación eucariótica
2α (eIF2α); como consecuencia disminuye la traducción de ARNm y con ello disminuye la
acumulación de nuevas proteínas en el lumen del RE. Cuando eIF2α es fosforilado se
favorece la transcripción de ARNm que contienen cortos marcos de lectura en su región 5´
denominados cremalleras de leucina (dominios bZIP), uno de ellos es el factor de
transcripción ATF-4, que induce la transcripción de CHOP (del inglés: CCAAT-enhancer-
binding protein homologous protein) asociado con la activación de genes proapoptóticos y
este a su vez activa GADD34 (del inglés: growth arrest and DNA damage–inducible 34) que
defosforila eIF2α para regular la actividad de PERK. Además de estas señales PERK
también contribuye con la homeostasis regulando el estrés oxidativo a través de la
activación del factor de transcripción NRF-2 que regula una gran variedad de genes
antioxidantes [67].
Finalmente, el tercer elemento es el factor de transcripción ATF6, el cual se disocia de BiP
para ser transportado en vesículas al aparato de Golgi en donde es escindido por las
proteasas S1P y S2P, la fracción citoplasmática liberada es un factor de transcripción que
incrementa chaperonas como BiP y regula la vía ERAD [9]. Aunque muchos trabajos han
mostrado que PERK e IRE-1α son los primeros en activarse, esto depende del inductor de
16
estrés de RE, por ejemplo, como consecuencia de la depleción de calcio se activan
preferencialmente PERK e IRE-1α, mientras que en condiciones de estrés oxidativo o
deprivación de glucosa ATF-6 puede activarse también rápidamente, mostrando que la
UPR puede ser regulada de forma específica. De igual forma se ha visto que la atenuación
de la vía IRE-1α puede contribuir con la apoptosis si se mantiene activa la vía PERK, estos
datos sumados al hecho de que la exposición a bajos niveles de estrés activa las tres vías
y no aumenta la expresión de genes proapoptóticos como CHOP, sugieren que durante
estímulos fuertes de estrés solo vías que promueven la apoptosis son activadas [68]
Figura 1. Vías de señalización involucradas en la respuesta a proteínas mal plegadas.
Las tres principales vías activadas durante la inducción de estrés de retículo endoplásmico son A. IRE-1 B. PERK y C. ATF-6. La descripción detallada de cada una de las vías se puede encontrar en el texto. Imagen creada en Biorender.com modificada de Walter y Ron, 2011 [65]
17
4.2.1 Respuesta integrada al estrés
Como se describió previamente, una de las vías de respuesta al estrés de RE es la
fosforilación de eIF2α y corriente abajo la activación de ATF-4 y CHOP para atenuar la
transcripción de proteínas y aumentar la síntesis de otras chaperonas. PERK es un
importante mediador de este proceso, sin embargo, además de PERK otras tres quinasas
también están involucradas con la fosforilación de eIF2α, estas quinasas son: PKR, GCN2
y HRI (respectivamente en inglés: Protein kinase double-stranded RNA-dependent, General
control non-derepressible-2 y Heme-regulated inhibitor) [69]. Las cuatro quinasas tienen
una alta homología en su dominio quinasa, entonces, todas se dimerizan y autofosforilan
durante su activación, aunque, la variación en el dominio regulatorio hace que cada una de
ellas se active en respuesta a diferentes estímulos [69, 70]. PKR se encuentra en el
citoplasma y es activada en respuesta a estrés de RE y a estrés oxidativo, principalmente
responde al ADN de doble cadena de los virus para inhibir su replicación [71]. GCN se
activa durante la deprivación de aminoácidos por presencia de ARN de transferencia que
no pueden ser cargados con aminoácidos. Finalmente, la quinasa HRI la cual se encontró
inicialmente en eritrocitos, se activa en respuesta a la deficiencia de hierro durante la
producción de hemoglobina. Aunque no se conoce completamente el mecanismo también
puede activarse por la inhibición del proteasoma o en respuesta a la producción de HSP70
y HSP90 [69].
La función de cada una de las quinasas es la fosforilación de eIF2α en respuesta al estrés
celular, esto disminuye la cantidad global de proteínas de la célula y aumenta la
transcripción de ATF-4 que a su vez, aumenta la transcripción de genes de respuesta al
estrés para favorecer la transcripción de chaperonas y la síntesis de lípidos que contribuyen
con la supervivencia de la célula [70]. Por otra parte, ATF-4 favorece la activación de otros
factores de transcripción entre los cuales se encuentra CHOP, y en conjunto todas las
proteínas activadas regulan el metabolismo de aminoácidos, la traducción del ARNm, la
UPR y la autofagia [70]. A este proceso completo de respuesta se le ha denominado la
respuesta integrada al estrés (ISR, por sus siglas en inglés: Integrated Stress Response)
[72] y actualmente es de gran interés en cáncer debido a que puede estar involucrada con
resistencia a la terapia; de hecho, un trabajo reciente mostró que el incremento de ATF-4 y
CHOP podían contribuir con la progresión y las metástasis en melanoma [73].
18
4.2.2 Estrés de retículo en cáncer
En varias clases de tumores incluyendo melanoma se observa una expresión incrementada
de todas las proteínas de la UPR, en comparación con las áreas peritumorales [74]. En
cáncer de seno también se ha observado un incremento de BiP y de otras proteínas
involucradas con estrés de RE como XBP-1, la cual ha sido asociada a mayor agresividad
y menor respuesta a la terapia [75]. Adicionalmente, durante el tratamiento las células
tumorales pueden entrar en reposo y detener su ciclo celular hasta que la amenaza se haya
eliminado. Estas células en reposo se han asociado con metástasis y se ha visto que tienen
un aumento en ATF-6 siendo este asociado con mal pronóstico, metástasis y resistencia a
la terapia [76, 77]. PERK entre otras funciones ha sido asociado con tumorigenesis por su
contribución con la reducción de estrés oxidativo de la célula tumoral y con ello la
disminución del daño del ADN [78, 79]. Estos son solo algunos ejemplos de la forma en que
la UPR puede estar relacionada con cada algunos de los sellos del cáncer propuestos por
Hanahan y Weinberg, contribuyendo con la resistencia a la muerte, inestabilidad genómica,
invasión y proliferación [58]. Adicionalmente, las células transformadas tienen la capacidad
de transformar el tejido adyacente, generando un microambiente que promueve la evasión
inmune, la adquisición de más nutrientes y la protección frente a la terapia. Se ha descrito
que células tumorales sometidas a estrés de RE pueden aumentar la liberación de factores
transmisibles que pueden aumentar el estrés en las células del microambiente, entre ellas
las células inmunes [80, 81]. El uso de medio de cultivo condicionado de células tumorales
sobre macrófagos aumento la expresión BiP, GADD34, CHOP y XBP-1, permitiendo la
ampliación y expansión de la respuesta pro-inflamatoria de la célula tumoral [82]. Por otra
parte, se ha observado que las células dendríticas maduras del tumor también son
sensibles a estos factores solubles de estrés de RE, y se ha demostrado que en el infiltrado
tumoral tienen un incremento en XBP-1 y en RIDD este último mecanismo puede llevar a la
degradación de ARNm involucrados con la presentación antigénica por el complejo mayor
de histocompatibilidad clase I (CMH-I). Adicionalmente los trabajos en los que se inhibe
XBP-1 en estas células dendríticas lleva a la restauración de la actividad
inmunomoestimuladora [8, 80]. Otra de las principales evidencias, es con tapsigardina, un
inductor de estrés de RE, la cual induce crecimiento del tumor con incremento de células
mieloides supresoras (MDSC); adicionalmente, el knockout de CHOP en estas MDSC
disminuye su potencial supresor, aumentando la habilidad para activar linfocitos T (LT) y
19
mejorando la repuesta inmune frente al tumor [7, 83]. Los LT también pueden disminuir su
capacidad efectora por incremento en CHOP y en XBP-1, dos trabajos independientes
mostraron mecanismos por los cuales las modificaciones metabólicas del microambiente
pueden aumentar estas vías en los LT e inhibir su actividad [84, 85]. En resumen, hasta
ahora el papel del estrés de RE en cáncer sigue siendo muy controversial ya que no solo la
inducción de estrés de RE puede contribuir con el crecimiento del tumor, sino que también
en muchos modelos se ha visto que el estrés de RE puede contribuir con la inducción de
apoptosis e incrementar señales para activar la respuesta inmune frente al tumor. PERK
además contribuye con la transmisión de estrés de RE hacia la mitocondria para promover
la apoptosis [86-88]. Aunque aún no es del todo claro el momento en que las señales
cambian de supervivencia hacia apoptosis, se ha sugerido que la inducción de estrés de
RE de forma crónica o exagerada puede hacer que las señales sean más proapoptóticas
[9], esto puede ser usado como una estrategia terapéutica, pero teniendo en cuenta siempre
el papel inmunosupresor que podría tener el incremento de la UPR en el microambiente.
4.2.3 Inducción de estrés de retículo endoplásmico por alteración en la homeostasis de los niveles de calcio
El RE es el principal reservorio de calcio (Ca2+) en la célula, y alteraciones en la homeostasis
de este metabolito son suficientes para la activación de la UPR [89]. El Ca2+ es un
importante segundo mensajero y regula un sin número de actividades en las células bajo
condiciones normales. Las altas concentraciones de Ca2+ en el RE aproximadamente de
100-800μM son importantes para mantener un gradiente con el citoplasma y otros
organelos como la mitocondria en donde las concentraciones se encuentran en un rango
de 100 a 500nM. Esto permite mantener pulsos pequeños de Ca2+ para la adecuada
señalización celular y para regular una amplia gama de funciones celulares entre las que
se encuentran la modulación del metabolismo, la fosforilación y defosforilación de proteínas,
la proliferación, división y diferenciación celular, la transcripción de genes y la regulación de
programas de muerte celular [90].
La preservación de niveles adecuados de Ca2+ a nivel intracelular es regulada por tres
mecanismos principales: por un lado están una serie de chaperonas moleculares que se
20
unen a Ca2+ y regulan los niveles de este, un ejemplo es la CRT; en segundo lugar están
los mecanismos de importación de Ca2+ al RE y en tercer lugar está la modulación de
canales, poros y bombas que permiten la liberación de Ca2+ al citoplasma [89]. Además de
estos mecanismos se ha observado que PERK puede interactuar con filamina y permitir los
contactos entre la membrana plasmática y el RE; permitiendo la localización de canales de
Ca2+ en estos puntos de contacto, lo cual mantiene el adecuado flujo de Ca2+ en la célula
[91]. PERK además es necesario para la conformación de las MAMs, estos puntos de
contacto entre el RE y la mitocondria tienen un papel muy importante en la regulación de la
señalización del Ca2+ para una diversidad de actividades metabólicas en la mitocondria así
como para la señalización de muerte celular bajo condiciones de estrés sostenido en el RE
[88, 92].
En las células tumorales se ha observado una variedad de oncogenes que han sido
involucrados con el aumento del Ca2+ intracelular y de la señalización por aumento de la
transferencia entre organelos, contribuyendo con la proliferación, invasión y metástasis [93].
Teniendo en cuenta esto, la regulación de los niveles de Ca2+ se ha convertido en un blanco
terapéutico en cáncer y se han propuesto una serie de inhibidores de la entrada de Ca2+ los
cuales puedan disminuir la proliferación y la invasión en cáncer de seno, de próstata,
cervical y de piel entre otros [94, 95]. Sin embargo la modulación de la entrada de Ca2+ a la
célula puede ser insuficiente si las señales de transmisión de Ca2+ entre el RE y la
mitocondria no se mantienen, sugiriendo que el mecanismo más adecuado es el incremento
de la transferencia de Ca2+ a la mitocondria a través de las MAMs para la inducción de
muerte mediada por Ca2+ [93, 96].
4.3 Autofagia como mecanismo de respuesta al estrés
Como se mencionó anteriormente, la autofagia es otro de los mecanismos principales de
respuesta al estrés en la célula. La autofagia es descrita como un proceso catabólico
evolutivamente conservado, y al igual que el estrés de RE la autofagia le permite a la célula
responder ante situaciones de estrés endógeno y exógeno manteniendo la homeostasis a
través de la digestión de organelos, proteínas y otros componentes del citoplasma [97]. Tres
clases de autofagia han sido descritas: (1) Microautofagia, es un proceso en el que partes
21
del citoplasma son internalizadas directamente en el lisosoma a través de invaginaciones
de la membrana lisosomal; (2) La autofagia mediada por chaperonas, en la cual ciertos
dominios proteicos son reconocidos específicamente por una HSP70 denominada HSPA8
o Hsc70 y son traslocados al interior del lisosoma a través de la proteína asociada a la
membrana lisosomal 2 (LAMP2), lo cual ayuda a mantener la calidad de las proteínas [98].
El tercer mecanismo es conocido como la macroautofagia a la cual nos referiremos como
autofagia en adelante, esta se inicia con la formación de una vesícula de doble membrana
(fagosoma), que al fusionarse con el lisosoma (fagolisosoma) permite la digestión del
contenido, el reciclaje de moléculas, la eliminación de proteínas y organelos dañados y con
esto el mantenimiento de las funciones normales de la célula [99]. En este proceso actúan
una serie de proteínas relacionadas con la autofagia (denominadas Atg). Muchas proteínas
Atg funcionan principalmente en los estadios tempranos de formación del autofagosoma,
su participación se puede resumir en 5 pasos principales como se observa en la figura 2:
(1) Formación del complejo ULK1 (Atg1 en levaduras), (2) reacciones de conjugación de
Atg5-Atg12 (3), lipidación de la proteína LC3 (del inglés: microtubule-associated protein
1A/1B-light chain 3) de su forma citosólica (LC3-I) a la forma fosfatidiletanolamina (LC3-II)
en la superficie del autofagosoma, (4) interacción entre beclina-1 (Atg6) con el complejo
PI3K y (5) formación del complejo Atg9, Atg2-Atg18 que media el desensamblaje de las
proteínas Atg del autofagosoma y finalmente (6) la fusión del autofagosoma con el lisosoma
[100, 101]. Este proceso completo de eventos se conoce como flujo autofágico y para que
la autofagia sea funcional debe ser completo hasta la formación del autolisosoma y la
degradación del contenido. La autofagia además de activarse de forma independiente
durante condiciones de estrés también se integra fácilmente con otros mecanismos de
respuesta como la UPR. Cuando se presenta acumulación de proteínas en el RE la
activación de ERAD induce la salida de estas proteínas hacia el citoplasma para mitigar el
estrés en el RE, entre tanto en el citoplasma las proteínas no plegadas provenientes del RE
o de otras partes de la célula se acumulan en sitios específicos denominados agregosomas
los cuales son degradados a través de autofagia (agregofagia) [102]. Adicionalmente,
también en respuesta al estrés puede degradar organelos completos como la mitocondrial
(mitofagia) o partes del RE (reticulofagia) [103, 104]. La contribución de la autofagia a la
respuesta al estrés como vimos previamente puede determinar el destino de la célula, en
22
algunos casos aliviando el estrés celular y ayudando a la homeostasis y en otros
contribuyendo con la muerte celular, generalmente por acumulación de autofagosomas [10].
4.3.1 Autofagia en cáncer
En cáncer la autofagia también tiene un papel controversial, puede ser supresora de tumor
durante las primeras etapas de la oncogénesis, pero en estados avanzados del tumor
puede promover la supervivencia [10, 60]. El interés en conocer el papel de la autofagia en
cáncer ha crecido sustancialmente por algunas observaciones que demuestran que genes
necesarios para la formación del autofagosoma se encuentran alterados en cáncer, un
ejemplo es la deleción monoalélica del gen beclina-1 en cáncer de seno, próstata y ovario,
la cual parece estar implicada en el crecimiento del tumor [97, 105]. En pacientes con
melanoma cutáneo maligno se encontró una baja expresión de esta proteína lo cual fue
asociado con mal pronóstico [106]. Adicionalmente, muchas proteínas oncogénicas regulan
el aumento o la disminución de genes relacionados con la autofagia y favorecen el
crecimiento tumoral, pero también se ha visto que la inducción de autofagia es un
mecanismo utilizado para mantener las células y tejidos sanos por lo cual también podría
ser oncosupresor, un ejemplo de esto, es que los ratones con alteración de beclina-1 o
Atg4C incrementan el desarrollo de tumores, mientras que la inyección de células con
modificaciones en Atg7 inducen la formación de lesiones benignas [107]. En conclusión, la
inhibición de la autofagia en las fases tempranas del tumor puede estar más asociada a la
progresión tumoral. Por otra parte, además de su papel en el desarrollo de tumores la
autofagia puede tener otras funciones en el tumor; por ejemplo, ha sido asociada con
resistencia al estrés metabólico, oxidativo y de RE, además con inducción de senescencia
y resistencia a la terapia [60, 74, 97].
Varias clases de autofagia han sido descritas en respuesta a la terapia en cáncer, entre
ellas se encuentran la autofagia protectora y la autofagia citotóxica. La primera, recibe el
nombre de protectora por su papel homeostático que disminuye la muerte provocada por la
quimioterapia o la radioterapia. En estos casos el uso de inhibidores del flujo autofágico
como la cloroquina (CQ) aumentan la muerte celular [108]. Por el contrario, la autofagia
23
citotóxica contribuye con la muerte celular en algunas terapias, lo cual se asocia con un
aumento exagerado de la formación de los autofagosomas o con un bloqueo del flujo
autofágico que lleva a la acumulación de proteínas y organelos dañados [109]. Teniendo
en cuenta esto, se debe evaluar muy bien el papel de la autofagia en cada tipo de tumor y
terapia, para determinar si es una ventaja inhibir la autofagia o promoverla [108, 110].
Figura 2. Fases durante la inducción de autofagia y proteínas involucradas.
Se observan las cuatro fases de la autofagia, A. Inducción. B. Nucleación (formación del complejo de iniciación)
C. Formación del fagoforo D. Autofagosoma E. Fusión del autofagosoma con el lisosoma. Imagen creada en
Biorender.com
4.4 Melanoma: Papel del estrés de retículo endoplasmático y de la autofagia
El melanoma es un tipo de cáncer de piel que afecta a los melanocitos, células
especializadas en formar la melanina, pigmento que da color a la piel y la protege contra
los rayos ultravioleta (UV). La mayoría de los melanomas se forman en la piel, pero también
pueden presentarse en otros tejidos pigmentados, tales como el ojo. Aunque el melanoma
solo representa el 1% de todos los tumores malignos de piel es responsable del 80% de las
muertes [111]. En las últimas décadas su incidencia ha aumentado a nivel mundial. Según
el fondo colombiano de enfermedades de alto costo en el país el número de casos de
24
melanoma reportados en 2016 fue de 2685 y aumento significativamente a 3326 casos en
2017 [41].
La exposición a los rayos UV es la principal causa para el desarrollo de melanoma debido
a la generación de productos mutagénicos y a la alteración del ADN. Durante la progresión
y generación de melanoma el estrés celular juega un papel clave; normalmente la célula
responde a la agresión usando mecanismos de protección como son la síntesis de melanina
y la activación de mecanismos de respuesta a daños en el ADN y cuando estos mecanismos
no son adecuados la célula muere [112]. Durante la transformación de los melanocitos y la
formación del melanoma se ha observado que las células dañadas no mueren, por el
contrario ellas inician la sobreexpresión de mecanismos de reparación y la alteración de los
puntos de chequeo del ciclo celular, provocando que se desarrolle la enfermedad, e
inclusive la metástasis, en lugar de activar vías proapoptóticas que lleven a la eliminación
de la célula [113, 114]. Por otra parte, la exposición a rayos UV también está asociada con
la producción de ROS y la disminución de la actividad de enzimas antioxidantes como la
catalasa; este efecto es menor en personas de piel oscura que tienen mayores niveles de
melanina la cual puede actuar como antioxidante, adicionalmente, varios oncogenes
también pueden incrementar la producción de ROS en células transformadas de melanoma
[115].
Estos procesos de generación de ROS, así como los daños en el ADN en melanoma
incrementan el estrés de RE y autofagia. Se ha observado que las células de melanoma en
comparación con los melanocitos tienen una mayor expresión de proteínas de RE como
BiP, además de las proteínas de la UPR asociadas a las vías de PERK e IRE-1α [73, 74,
116]. El incremento de estas vías es asociado con resistencia a la terapia, un ejemplo es la
resistencia de células de melanoma a drogas que tienen como blanco los microtúbulos tales
como vincristina o docetaxel, a través de la activación de XBP-1 [117].
Por otra parte, en melanoma también ha sido descrita la relación entre el estrés de retículo
y la inducción de autofagia a través de la inhibición de mTOR, la activación de beclina-1 o
la liberación de calcio en condiciones de estrés, lo cual lleva a pensar que el estrés de RE
puede ser responsable en parte de las alteraciones de la autofagia observadas en
melanoma [118]. Adicionalmente, la autofagia en melanoma tiene un rol controversial, el
25
uso de modelos animales ha permitido mostrar que en tumores avanzados la autofagia es
usada por el tumor para resistir a la muerte, mientras que en estadios tempranos la perdida
de autofagia es asociada con el desarrollo del tumor [40]. Además, la autofagia también
puede regular el infiltrado tumoral, aunque no son muchos los trabajos relacionados con
este tema se ha encontrado que en modelos murinos de melanoma generados con células
B16-F10 con alteración genética en beclina-1, inducen tumores más pequeños por un
incremento en el infiltrado de células asesinas naturales (NK) [119].
Además del papel que tienen el estrés de RE y la autofagia en la promoción o inhibición del
crecimiento tumoral, también han sido ampliamente asociadas con la generación de
señales de MCI [4]. Estos mecanismos de estrés en melanoma modulados de la forma
adecuada pueden ser aprovechados para mejorar el tratamiento con drogas inductoras de
muerte celular inmunogénica.
4.4.1 PERK y su papel en melanoma
Como se mencionó anteriormente PERK es una molécula muy importante en el control del
destino celular, ya que puede responder a la mayoría de las señales de estrés. Durante la
evaluación del papel tumorigénico de PERK se encontró que la ablación de esta molécula
puede llevar a un aumento del estrés oxidativo que contribuye al daño del ADN y a la
muerte, lo que disminuye la regeneración del tumor y genera tumores menos agresivos [78].
El uso de inhibidores de PERK ha sido propuesto como una alternativa terapéutica, sin
embargo las funciones asociadas con supresión de tumor y apoptosis en las células
normales, hacen que el uso de estas moléculas tenga muchos efectos adversos, por ello,
se ha propuesto modularlo para incrementar las señales apoptóticas en tumores [120]. Su
importancia en melanoma se debe principalmente a su asociación con la supervivencia de
células que poseen la mutación V600E (sustitución de Acido Glutámico por Valina en el
codón 600) en BRAF, esta mutación es uno de los oncogenes más comunes en melanoma
y se estima que está presente en aproximadamente el 50% de los melanomas de pacientes
estadounidenses y europeos [121]. El uso de modelos de melanoma con esta mutación ha
permitido observar que en tumores PERK haploinsuficientes se aumenta el potencial de
BRAFV600E generando un incremento en el volumen tumoral y una disminución de la
26
viabilidad, efecto que se pierde cuando hay ausencia de PERK o cuando PERK se
encuentra en condiciones normales, sugiriendo que la progresión de melanoma puede ser
dependiente de la dosis de PERK [122]. Aunque en Colombia se ha estimado que la
frecuencia de esta mutación es menor al 35% [123], se debe tener en cuenta que parte de
la función de PERK en la progresión de melanoma también puede estar asociada a la
inducción de autofagia a través de la ISR principalmente [25], lo cual ha sido importante
para la protección de la muerte en melanoma y no solamente en presencia de la mutación
en BRAF [40]. Como hemos visto hasta ahora la autofagia y la inhibición del estrés oxidativo
pueden estar asociados con la activación de las vías de señalización de PERK,
principalmente a través de ATF-4 y NRF-2 respectivamente [74]. Si a esto le sumamos el
hecho de que las metástasis de melanoma tienen una mayor expresión de ATF-4 y CHOP
[73], se puede asociar el papel protumorigénico de PERK más a la activación de la ISR,
por lo tanto la modulación de PERK para activar otras rutas como la liberación de Ca2+
pueden ser una mejor estrategia en la terapia en cáncer.
4.5 Tipos de muerte celular asociados a la terapia en cáncer
La programación de la muerte celular es la forma natural de la célula para la regular el
funcionamiento de los tejidos, está se puede estimular por señales de muerte en la
membrana plasmática (vía extrínseca) o por alteración intracelular (vía intrínseca) [124]. A
la fecha han sido descritos aproximadamente 22 tipos de muerte celular, entre los cuales
se encuentran la apoptosis, la necrosis, necroptosis, anoikys, muerte celular dependiente
de autofagia y catástrofe mitótica entre otros. La muerte celular se presenta en los tejidos
constantemente como parte del proceso natural del organismo y en condiciones normales
se caracteriza por ser una muerte limpia, es decir que induce un proceso en el que las
células finalmente son fagocitadas sin activar la respuesta inmune [1, 125]. Aunque
cualquiera de estos tipos de muerte celular se puede presentar, la apoptosis es la principal
forma de muerte celular programada que se activa en cáncer, esta implica la activación de
un sistema de proteínas denominadas caspasas, la condensación de la cromatina,
fragmentación nuclear, encogimiento del citoplasma, "ampollamiento" de la membrana
plasmática y desintegración final conduciendo a la formación de cuerpos apoptóticos; por
27
lo tanto, algunos consideran a la apoptosis como una subrutina de muerte celular asociada
con una serie de procesos característicos [126]. La familia de genes Bcl-2 (del inglés:
antiapoptotic B cell lymphoma 2) es la principal implicada en la regulación de este
mecanismo de muerte celular, en ella se encuentran una serie de proteínas proapoptóticas
como BAX y BAK y antiapoptóticas como PUMA y NOXA entre otras [127]. Otras formas
frecuentes de muerte celular en cáncer son la necrosis que se caracteriza por hinchazón
de la célula y de organelos citoplasmáticos, antes que la membrana plasmática se rompa y
libere el contenido citoplásmico y la muerte por autofagia que consiste en el secuestro de
una gran parte del citoplasma en vacuolas autofágicas, previo a la apoptosis [126, 128]. La
muerte celular puede depender de señales generadas en distintos compartimentos de la
célula, por ejemplo, el estrés de RE se asocia con la regulación de proteínas proapoptóticas
de la familia Bcl-2 y la activación de la caspasa 12 a través de CHOP [129]. Por otra parte,
alteraciones en la mitocondria como la pérdida del potencial de la membrana mitocondrial
juegan un papel importante en diversos tipos de muerte celular [17]. El conocimiento
molecular de cada tipo de muerte celular y los mecanismos que la regulan pueden ayudar
a dirigir las terapias antitumorales, inhibiendo genes o proteínas que puedan proteger a las
células de la muerte o promoviendo la activación de señales que aumenten estos procesos
[126, 130].
4.5.1 Muerte celular inmunogénica en la terapia antitumoral.
Uno de los tipos de muerte celular que se ha identificado en cáncer, es la muerte
acompañada de la generación de señales de peligro conocidas como patrones moleculares
asociados a daño (DAMPs, del inglés damage-associated molecular patterns), estas
señales de peligro son reconocidas por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs,
del inglés PAMP/DAMP-Patterns Recognition receptors); los cuales activan diferentes vías
de señalización que promuevan la activación de células dendríticas, la presentación de
antígenos tumorales y una respuesta inmune efectora especifica de tumor. A este tipo de
muerte celular se le ha denominado muerte celular inmunogénica (MCI) [2]. Durante la
evaluación de la MCI tres clásicas señales de peligro han sido descritas: la exposición pre-
apoptótica de calreticulina (CRT) sobre la superficie celular, la liberación pos-apoptótica de
28
la proteína de unión a la cromatina del grupo de proteínas de alta movilidad de la caja 1
(HMGB1, del inglés: High mobility group box protein 1) y la liberación de adenosina trifosfato
(ATP) por distintos mecanismos [2, 4]. Aunque estas tres señales son las principalmente
evaluadas en MCI, a la fecha se conocen una gran variedad de señales que pueden
contribuir con la activación de la respuesta antitumoral, entre ellas se encuentran la
exposición en la membrana de HSP70 y HSP90, y la liberación de anexina A1 y de ácidos
nucleicos (ADN y ADN mitocondrial) y la producción de interferones (IFN) de tipo I [2, 27].
Las señales de peligro generadas durante la MCI dependen en gran parte del tipo de estrés
que se induce en la célula tumoral, se ha demostrado claramente que el estrés de RE y la
autofagia tienen un papel importante en la exposición de CRT y en la liberación de ATP [25,
26, 131].
Varios inductores de MCI han sido descritos entre los cuales se encuentran
quimioterapéuticos como las antraciclinas y el oxaliplatino, y otros tipos de terapias como
la fototerapia y la radioterapia [2, 27]. Estos han sido clasificados en dos grandes grupos,
los inductores tipo I como las antraciclinas, que inducen muerte celular teniendo como
blanco lugares de la célula diferentes al RE, como el núcleo, donde generan daño en el
ADN y como consecuencia una alta cantidad de ROS que de forma indirecta inducen estrés
de RE y finalmente MCI [5]. Por otra parte, están los inductores tipo II, los cuales tienen
como blanco específicamente la alteración de la homeostasis en el RE y esto lleva a la
inducción de una MCI en la cual, al parecer, se genera una mayor cantidad de señales de
peligro y se puede generar una respuesta inmune más eficiente. En este grupo se ha
descrito a la fototerapia en combinación con hipericina (un componente activo obtenido de
la planta Hypericum perforatum) la cual induce la producción de ROS específicamente en
el RE y esto favorece la generación de señales inmunogénicas [132]. Teniendo en cuenta
esto, se puede ver que el estrés oxidativo también juega un papel importante en la
generación de estas señales inmunogénicas en las terapias descritas a la fecha [6, 133].
29
4.5.2 Autofagia y estrés de retículo endoplásmico en la muerte celular
inmunogénica
Dentro del rol controversial que tienen estos dos mecanismos homeostáticos, uno de los
puntos más importantes de estudio es su papel en la inducción de la respuesta inmune
frente al tumor. Los trabajos del grupo de Kroemer y colaboradores han ligado fuertemente
la inducción de estrés de RE con la exposición de calreticulina y a la autofagia con la
liberación de ATP [26, 134].
La CRT es una chaperona que se encuentra normalmente en el RE, el tratamiento con
antraciclinas induce su translocación preapoptótica a la membrana citoplasmática a través
de vesículas, proceso que es necesario para la inducción de MCI, ya que el knockdown de
CRT inhibe la fagocitosis por las células dendríticas y en ratones genera la pérdida de la
inmunogenicidad. Además, se ha observado que en inductores tipo I y tipo II es necesaria
la producción de ROS, la depleción de calcio en el lumen del retículo y la inducción de UPR,
principalmente la fosforilación de eIF2α dependiente de PERK para que se lleve a cabo la
translocación de CRT [24, 29, 131, 135]. Por otra parte, la liberación de ATP de las células
que están muriendo constituye una señal de peligro que recluta células dendríticas y sus
precursores, y representa un estímulo proinflamatorio, a través de la unión a receptores
purinérgicos como el P2RX7 que activan el inflamosoma NLRP3. El knockdown de los
genes relacionados con la formación del autofagosoma ha demostrado que la autofagia es
esencial para la liberación de ATP cuando se usan antraciclinas o radiación (inductores tipo
I), estos trabajos también demostraron que la inhibición de autofagia no altera la exposición
de CRT [5, 26]. Sin embargo, en el modelo de fototerapia con hipericina se observó a través
del knockdown de Atg5 que la autofagia no era necesaria para la liberación de ATP y
además que al inhibir la autofagia aumentó la exposición de CRT, en este modelo la
liberación de ATP y CRT fue dependiente de fosfoinositol 3-quinasa (PI3K) la cual está
involucrada con el tráfico de vesículas hacia la membrana plasmática mostrando una vía
alterna de MCI [25]. Las investigaciones de los dos grupos el de Kroemer (inductores tipo
I) y el de Agostinis (inductores tipo II) han mostrado que es necesaria la inducción de ROS
y la depleción de Ca2+ del lumen del RE para la inducción de estrés de RE y la exposición
30
de CRT [133, 135, 136]. Es importante resaltar que ninguno de estos mecanismos ha sido
asociado directamente con la liberación de HMGB-1.
4.6 Respuesta inmune en cáncer
Cada vez toma más fuerza el papel del microambiente en el desarrollo del tumor y se ha
considerado que la inflamación y la evasión de la respuesta inmune son sellos
característicos en cáncer que promueven el desarrollo del tumor, la proliferación, invasión
y las metástasis [52]. Cuando se producen alteraciones genéticas que pueden dar lugar al
crecimiento de tumores la respuesta inmune juega un papel muy importante, y en
condiciones normales este proceso de transformación se puede presentar, sin embargo, el
sistema inmune constantemente reconoce y rechaza las células transformadas (vigilancia
inmune). Estas células transformadas adquieren una alta antigenicidad y son reconocidas
como no propias principalmente por células asesinas naturales (NK) y LT CD8+, lo cual da
lugar a la producción de diferentes citoquinas y quimioquinas que promueven la activación
de la respuesta inmune especifica con aumento de la proliferación y movilización de LT
antígeno específicos inhibiendo el crecimiento del tumor [137]. Sin embargo, algunas
células sobreviven a la fase de eliminación y cuando esto sucede se da lo que se conoce
como equilibrio en el cual los linfocitos y el interferón gamma (IFN-) ejercen una presión
de selección lo suficientemente buena para mantener controladas, pero no eliminar las
células que están en el nicho tumoral. Se ha propuesto que, debido a la presión del sistema
inmune, las células tumorales sobrevivientes generan nuevas variantes genéticas, lo cual
las hace menos inmunogénicas y más resistentes a las funciones citotóxicas del sistema
inmune durante lo que se conoce como la fase de escape. Esta fase se puede generar por
la producción de citoquinas inmunosupresoras, la activación de las funciones reguladoras
del sistema inmune (proliferación de LT reguladores), y también por la modulación de
marcadores en la célula tumoral que inhiben la fagocitosis (aumento de CD47) o inhiben la
función efectora de los LT (aumento de PD-L1 y disminución de la expresión del complejo
mayor de histocompatibilidad clase I). Es así como, las células tumorales que no son
reconocidas ni controladas por el sistema inmune promueven el crecimiento y desarrollo
del tumor [138].
31
Por otra parte, la inflamación es otro de los sellos característicos del cáncer relacionado
con el sistema inmune, esta puede ser un factor predisponente para el desarrollo de
tumores y además ayuda al mantenimiento de la enfermedad [52]. Durante el proceso de
desarrollo del cáncer y como consecuencia del daño tisular producido, se aumenta la
migración de células inmunes al microambiente del tumor entre las que se encuentran
macrófagos, neutrófilos, mastocitos, células mieloides supresoras, células dendríticas y NK;
además, células del sistema inmune adaptativo como LT y LB [139]. Estas células en
conjunto con otras células del microambiente inician la liberación de citoquinas y
quimioquinas proinflamatorias que van a contribuir con el reclutamiento y activación de la
respuesta efectora. En tumores establecidos se ha observado que la inflamación crónica
que se presenta contribuye con el suministro de moléculas como factores de crecimiento
del tumor, factores que contribuyen con la supervivencia celular, factores proangiogénicos
y diferentes enzimas que modifican la matriz extracelular y facilitan la angiogénesis,
invasión y metástasis. Adicionalmente, durante la activación de la respuesta inflamatoria
también se producen grandes cantidades de ROS y especies reactivas de nitrógeno (RNS)
que aumentan el daño del ADN y la inestabilidad genómica, lo cual acelera la evolución
genética y aumenta su malignidad [52, 140, 141].
4.6.1 Activación de la respuesta inmune en el contexto de la muerte inmunogénica
La inducción de MCI es una estrategia con la que se puede aprovechar la respuesta inmune
a favor de la eliminación del tumor. Cada una de las señales inmunogénicas tiene
mecanismos de acción alternos que permiten potenciar la respuesta antitumoral. La
exposición de CRT en la membrana plasmática es una señal que se genera antes de la
inducción de apoptosis y transmite un mensaje a la célula presentadora de antígeno (CPA)
para inducir la fagocitosis. CRT al igual que las proteínas de choque térmico interactúa con
el receptor de membrana CD91 también conocido como LRP1 (del inglés: low density
lipoprotein receptor-related 1), la interacción le permite a la célula dendrítica fagocitar partes
de la célula tumoral, madurar y posteriormente presentar antígenos tumorales a LT CD4+ y
CD8+ [142]. Los trabajos del grupo de Kroemer han demostrado que en ausencia de CRT
32
la inmunogenicidad de células tratadas con antraciclinas se pierde, sin embargo, también
han mostrado que son necesarias las demás señales para activar efectivamente la
respuesta antitumoral [143].
Por otra parte, está la liberación de ATP, el cual se une a los receptores purinérgicos
ionotrópico (P2RX7) y metabotrópico (P2Y2) en la célula dendrítica estimulando la
maduración y la quimiotaxis respectivamente. A través de P2RX7 el ATP estimula la
agregación del inflamosoma NLRP3-ASC-Casp1 y subsecuente maduración proteolítica de
la caspasa 1, el clivaje de la pro-IL-1β y la liberación IL-1β, la cual es requerida para la
eficiente activación de los LT CD8+ [144, 145]. Finalmente, la liberación de HMGB-1 tiene
un potente efecto sobre varios PRRs (del inglés Pattern Recognition Receptors o receptores
de reconocimiento de patrones) presentes sobre las células dendríticas, entre los cuales se
encuentran los receptores tipo Toll (TLR, del inglés Toll-like receptors) 2 y 4, y el receptor
para compuestos de glicosilación avanzada (RAGE). La señalización de HMGB-1 mediada
a través del TLR-4-MyD88 facilita la activación de las células dendríticas, la presentación y
el procesamiento antigénico [132, 146]. Adicionalmente, los ácidos nucleicos derivados del
tumor también pueden activar las células dendríticas [147].
El reconocimiento de estas señales en la CPA, en tumores tratados con inductores de MCI,
aumenta la expresión de marcadores de activación en células dendríticas como CD80,
CD83, CD86 y CMH-II, así como la generación de citoquinas proinflamatorias tales como
IL-1β, IL-12 y factor de necrosis tumoral (TNF-) a través de la activación del factor de
transcripción NF-B [147]. De esta forma se activa la respuesta inmune frente al tumor y se
aumenta el priming o iniciación de LT CD8+ antígeno específicos, así como la producción
de IFN- [25, 148].
4.7 Productos naturales y polifenoles: una alternativa terapéutica en cáncer.
Dentro de las estrategias de terapias antitumorales, se está promoviendo en la actualidad
el uso de tratamientos combinados que tienen diferentes mecanismos de acción. A pesar
de esto, la multiresistencia, los efectos adversos y las metástasis siguen siendo un tema de
33
interés en la terapia contra el cáncer. En la búsqueda de nuevas estrategias, se han
empezado a aplicar los conocimientos de la medicina tradicional China, que utiliza entre
otros, plantas medicinales en el control del cáncer [149]. De hecho, aproximadamente la
mitad de las drogas antitumorales aprobadas desde 1940 hasta el 2014 son productos
naturales o han sido derivadas de ellos. A partir de las investigaciones con estos productos
se han obtenido moléculas antitumorales, las cuales han sido clasificadas en 4 grandes
grupos: vinca alcaloides como la vincristina y vinblastina utilizadas, apipodofilotoxinas,
taxanos (tamoxifen) y camptotecinas [150].
Además de la obtención de moléculas antitumorales aisladas, también se han venido
utilizando extractos derivados de plantas, cuya principal ventaja es que tienen múltiples
componentes y por lo tanto actúan sobre diferentes blancos terapéuticos simultáneamente
[151]. Además se ha considerado su uso como adyuvantes de la medicina convencional
(quimioterapia y radioterapia) lo cual podría proporcionar grandes ventajas entre ellas el
aumento de la sensibilidad a la apoptosis, la activación de la respuesta inmune frente al
tumor, la disminución de la proliferación y las metástasis, y la reducción de los efectos
secundarios y las complicaciones asociadas, lo que conlleva a una mejora de la calidad de
vida del paciente y del tiempo de supervivencia [152]. Un ejemplo es la raíz del Astrágalo
(Astragalus propinquus, comúnmente conocida como huang qí), la cual ha sido usada por
tradición para mejorar la función pulmonar y digestiva. Recientemente se ha demostrado
que es un potente inmunomodulador que, usado como coadyuvante en cáncer, disminuye
los efectos inmunosupresores de la quimioterapia, al mismo tiempo que estimula a los
macrófagos para la producción citoquinas que contribuyen a la activación de la respuesta
inmune adaptativa [149, 153].
Una de las mayores evidencias del potencial de los fitomedicamentos en cáncer, es el uso
de formulaciones herbales tradicionales (medicinas herbales populares en China, Japón y
Corea) en las cuales se combinan diferentes plantas. Algunas de estas formulaciones
tienen actividad citotóxica frente al tumor y las metástasis, una de ellas es el Juzen-taiho-
to que consiste en la combinación de 10 plantas medicinales con actividad antitumoral
en cáncer de ovario y melanoma por incremento de la función inmune sistémica,
34
observándose en modelos animales inducción de la respuesta inmune mediada por células
T [151, 154].
Entre los componentes activos que se encuentran en los extractos de plantas encontramos
los polifenoles, un grupo de compuestos naturales con actividades antimicrobianas,
antiinflamatorias, antitumorales e inmunomoduladoras [155]. Estos pueden ser clasificados
según su estructura química en flavonoides y no flavonoides (Tabla 1), estos se encuentran
en una gran variedad de frutas, en el té verde y en el vino. El estudio de los polifenoles
como el resveratrol, el epigalocatequin galato (EGCG) y la curcumina han mostrado que
pueden inducir varios mecanismos de estrés celular para inducir apoptosis, además inhiben
la carcinogénesis y pueden modular la resistencia a la terapia por acción sobre bombas de
multiresistencia en diferentes tipos de cáncer [37, 156-158]. Por ello en la actualidad se han
incrementado los esfuerzos por conocer los mecanismos de acción de los fitomedicamentos
y sus polifenoles, teniendo en cuenta su potencial como adyuvantes de la terapia contra el
tumor.
Tabla 1. Clasificación de polifenoles naturales
Clasificación
Miembros representativos
Fuentes principales en la dieta
Flavonoides
Antocianidinas Cianidina, malvidina Frutos rojos, ciruelas, uvas
Flavanoles Epicatequina, epigalocatequin,
EGCG
Uvas, peras, legumbres, te, cocoa
Flavanonas Esperidina, naringenina Frutos ácidos
Flavonas Apigenina, crisina, luteolina Perejil, apio, naranja, cebolla, te,
miel
Flavonoles Quercetina, kaempferol Frutos rojos, manzana, brócoli
Isoflavonoides Genisteína, daidzeina soya
Ácidos
fenólicos
Ácidos
hidroxicinámicos
Ácido ferúlico, ácido cafeico Café, cereales
Ácidos
hidroxibenzoicos
Acido gálico, ácido elágico Uvas, frutos rojos, nueces,
chocolate, vino, té verde
Lignanos Sesamina Sésamo
Estilbenos Resveratrol, piceatanol Uvas, frutos rojos, vino
Adaptada de: Yue Zhou y colaboradores, 2016 [159]
35
4.7.1 Polifenoles e inducción de estrés celular
La generación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno en la célula se produce en
condiciones normales para mantener el equilibrio de óxido reducción de la célula; estos
sirven como segundos mensajeros, que modulan diferentes vías de señalización y en dosis
bajas son esenciales para la regulación de funciones normales como proliferación y
diferenciación [160]. En cáncer el incremento de estrés oxidativo se presenta en respuesta
a cambios en el microambiente, disminución en el suministro sanguíneo, a la activación de
oncogenes y a otras variaciones haciendo que las células tumorales se transformen y se
adapten a este incremento en el estrés oxidativo. En general los fitomedicamentos y
específicamente los polifenoles han demostrado que pueden tener un potencial antioxidante
importante usado para la prevención y el tratamiento del cáncer [161].
Recientemente, se ha encontrado que además de su actividad antioxidante que puede ser
utilizada en la prevención del cáncer, estos componentes naturales también pueden tener
efectos deletéreos, dependiendo de su concentración y de la presencia de iones pesados
como hierro y cobre, dado que su presencia permite la oxidación de los polifenoles los
cuales presentan entonces una alta capacidad pro-oxidante que les permite activar el estrés
oxidativo en la célula e inducir la muerte por daño al ADN, proteínas y lípidos [161]. De
hecho, muchas terapias en cáncer tienen como blanco el incremento del estrés oxidativo
ya que esto contribuye a la activación de mecanismos de muerte celular. Según algunos
autores esto puede deberse a una variación en el umbral entre el estrés oxidativo que
soporta la célula y el que puede llevarla a la muerte [162]. En cáncer de seno por ejemplo
se ha encontrado que el microambiente de estos tumores es rico en cobre, que al unirse a
polifenoles puede generar peróxido de hidrogeno iniciando el proceso de oxidación [163].
Como se espera, la inducción de muerte por esta vía, parece estar relacionada con la
inducción estrés de RE y autofagia, por ejemplo, el tratamiento de células tumorales con
polifenoles como el resveratrol, se caracteriza por la inducción de estrés de RE y autofagia,
mecanismos que son usados para la inducción de apoptosis en diferentes modelos
tumorales [158, 164].
36
4.7.2 Polifenoles y modulación de la respuesta inmune
Los polifenoles además de tener la capacidad de inducir muerte celular en cáncer, también
son inmunomoduladores, pueden unirse a uno o más receptores en las células del sistema
inmune y llevar a la activación o la atenuación de la actividad de las mismas [12]. Por
ejemplo, el EGCG se une a tres receptores diferentes entre ellos al receptor de laminina de
67kDa (67LR), el cual está presente en macrófagos, neutrófilos, monocitos, mastocitos y
LT, la unión a este receptor le permite regular procesos de adhesión y de inflamación. De
esta forma, los polifenoles han sido involucrados en funciones antiinflamatorias, control de
las alergias, regulación de la respuesta inmune intestinal y activación de la respuesta
inmune en cáncer como se ha demostrado con un extracto obtenido de la planta Caesalpinia
spinosa, llamado P2Et [12, 155].
Los polifenoles pueden inhibir la activación de las principales vías de señalización celular
que desencadenan la inflamación sistémica, y la regulación de la inmunidad innata y
adaptativa a través de la inducción de citoquinas. Además, pueden proteger a las células
inmunes del estrés oxidativo eliminando los ROS, que como se describió previamente
aumentan la inflamación y la actividad supresora de las células del sistema inmune [155].
Algunos polifenoles como antocianidinas y EGCG inhiben el factor nuclear kappa B (NFB)
que es el principal mediador inflamatorio, y otras enzimas que promueven la producción de
ROS y aumentan la inflamación como la COX-2 [165]. En general los diferentes trabajos
con polifenoles sobre distintas células del sistema inmune han mostrado el gran potencial
que tienen para el manejo de enfermedades en las que la inflamación juega un papel
importante como las alergias o las enfermedades autoinmunes. Adicionalmente, se ha
propuesto que por su potencial antiinflamatorio podrían contribuir a mejorar la respuesta a
la inmunoterapia en cáncer [155, 165].
37
4.8 Actividad antitumoral de la planta Caesalpinia spinosa
4.8.1 Descripción general y distribución geográfica de Caesalpinia spinosa
La Caesalpinia spinosa Molina Kuntze es una leguminosa arbustiva nativa de los andes,
que se encuentra principalmente en la parte norte de Sudamérica (Perú, Colombia,
Venezuela, Ecuador, Bolivia y Chile). Es un árbol siempre verde con espinas en tallo y
ramas, mide de 3-5(-8) metros (m) y pertenece a la familia Caesalpiniaceae (Leguminosae:
Caisalpinoideae). El fruto tiene forma de vainas encorvadas que miden aproximadamente
10 centímetros (cm) de largo por 3 cm de ancho, y poseen un color naranja rojizo cuando
están maduros y se caracterizan por ser una gran fuente de taninos. Los frutos contienen
de 4 a 7 semillas ovoides, ligeramente aplanadas, membranosas, de color pardo oscuro o
negruzco cuando están maduras (Figura 3). Es conocida comúnmente como tara, dividivi,
quebrancho, guarango, guasango y guaranga. En Colombia está presente en climas fríos
(18-24°C) y bosque seco pre montañoso [166, 167]
Figura 3. Fotografías Caesalpinia spinosa. Fotos tomadas de cultivos de Caesalpinia spinosa por el agrónomo del grupo de investigación para la
identificación y caracterización de la planta A. Árbol, B. Vainas, C. Ilustración de semillas y vainas.
4.8.2 Actividades biológicas de Caesalpinia spinosa
Diferentes actividades biológicas han sido reportadas para los extractos obtenidos de
Caesalpinia spinosa. Estos presentan actividades antimicrobianas tanto en bacterias Gram
positivas como Gram negativas [168, 169], y también poseen actividad antifúngica frente a
38
Fusarium solani y Phoma tarda [170]; aunque uno de sus mayores usos comerciales se
enfoca en el curtido de cueros debido al alto contenido de taninos hidrolizables, siendo
considerada la segunda planta con mayor contenido de este tipo de compuestos [171].
Adicionalmente, otros compuestos han sido aislados de la planta con actividades
antitumorales [172]. Por otra parte, al ácido gálico y sus derivados (etil galato, metil galato,
propil, octil y lauril esteres) presentes en los extractos de Caesalpinia spinosa se les han
atribuido un gran número de propiedades, entre las que se incluyen: antioxidantes,
antialérgicos, antimutagénicos, anticarcinogénicos y antiinflamatorios [173].
Adicionalmente, se ha encontrado que inducen apoptosis en diversas líneas celulares
tumorales dentro de las cuales se mencionan diferentes tipos de leucemias, linfomas y
mielomas [174].
4.8.3 Antecedentes del extracto P2Et obtenido de Caesalpinia spinosa
Apoyados en el uso de Caesalpinia spinosa en la medicina tradicional, en el grupo de
Inmunobiología y Biología Celular se inició un trabajo extensivo, a través del cual se logró
obtener un extracto etanólico que se denominó P2Et. La caracterización del P2Et demostró
que es un extracto complejo con un alto potencial antioxidante ya que contiene taninos
hidrolizables de los cuales los más abundantes son el etil galato, metil galato y el ácido
gálico. Para determinar la estructura de otros componentes del extracto P2Et previamente
se obtuvo un perfil de HPLC/MS y se realizó un análisis de fragmentación de los diferentes
picos. Se identificaron 13 compuestos de acuerdo con su patrón de fragmentación (Figura
4 y Tabla 2). Todos los compuestos identificados fueron taninos hidrolizables derivados del
ácido gálico [39].
39
Figura 4. Huella cromatográfica del extracto P2Et y compuestos asociados. A. Identificación de picos en la huella cromatográfica del extracto P2Et en el equipo Agilent 1200: (2) ácido gálico; (8) etil galato. Los demás compuestos se encuentran en detalle en la tabla 2. Tomado de Sandoval, 2016 [175]. Estructura química de los dos polifenoles principales presentes en el extracto P2Et: B. Ácido gálico. C. Etil galato.
La actividad antitumoral del P2Et se observó inicialmente en la línea celular hematopoyética
K562 en la que el extracto indujo despolarización de la membrana mitocondrial, activación
de caspasa 3, condensación de la cromatina y disminución de la capacidad clonogénica,
adicionalmente redujo la concentración mínima inhibitoria (CI50) de la doxorrubicina (DOXO)
[176]. Los diferentes trabajos realizados en el grupo han mostrado que el extracto P2Et
tiene actividad citotóxica en múltiples líneas tumorales entre las que se encuentran 4T1,
B16-F10, A375, MES-SA/Dx5 sMDR-, MES-SA/Dx5 MDR+, K562 Wild type, K562 Pgp+
(entre otras) [14, 39, 176, 177]. Es importante resaltar que el P2Et no tiene efecto en células
no tumorales como células mononucleares de sangre periférica (CMSP) o fibroblastos
humanos obtenidos de la mucosa gingival [176].
40
Tabla 2. Resumen del análisis de fragmentación de los compuestos obtenidos del P2Et.
Número Compuesto tR (min)
1 Ácido n-O-galoilquinico 1.406
2 Ácido gálico 2.183
3 Acido di-O-galoilquinico 4.261
4 Éster etílico del ácido n-galoilquinico 5.223
5 Ácido tri-O-galoilquinico 6.296
6 Acido tetra-O-galoilquinico 7.073
7 Ácido tri-O-galoilquinico 7.354
8 Etil galato 8.101
9 * tetra-GCQ desconocido 10.099
10 Éster etílico del ácido tri-O-galoilquinico 13.583
11 * Éster etil galato del ácido di-O-galoilquinico 13.901
12 Éster etílico del ácido tri-O-galoilquinico 14.168
13 *Éster etil galato del ácido tri-O-galoilquinico acid 16.306
Columna 1: Número de compuesto en el cromatograma. Columna 2: nombre común del compuesto. Columna 3: tiempo de retención en minutos: tR (min). Adaptada de Sandoval, 2016 [175].
Adicionalmente, se ha observado que el tratamiento de células 4T1 y de melanoma murino
B16-F10 con P2Et induce señales de MCI: exposición en la membrana de CRT, liberación
de HMGB1 y de ATP [14, 15]. Con el modelo in vivo de cáncer de seno murino altamente
metastásico 4T1 se observó que el extracto P2Et disminuye el tamaño del tumor y el número
de metástasis, concomitante con la disminución de factores relacionados con la baja
sobrevida de los pacientes como la IL-6, así como la generación de una respuesta inmune
efectora en el tumor [15, 177]. Estos resultados fueron confirmados en el modelo de
melanoma murino con el cual se observó que la vacunación de ratones con células
pretratadas con P2Et, incrementó la inmunogenicidad del tumor permitiendo la activación
de la respuesta inmune caracterizada por un incremento de LT CD8+ específicos de
antígeno y productores de IFN-. Además, con el uso de ratones inmunodeficientes en este
mismo modelo se demostró que la disminución del volumen tumoral que induce P2Et es
dependiente de la respuesta inmune y que la depleción de LT CD8+ y CD4+ disminuye el
efecto del P2Et sobre el tumor, sugiriendo que la actividad antitumoral es altamente
dependiente del sistema inmune y por lo menos en parte de los LT. Adicionalmente, tanto
en cáncer de seno como en melanoma se mostró que el P2Et disminuye las MDSCs en el
41
infiltrado tumoral [14, 16]. Por otra parte, en ratones C57BL/6 con tumores de melanoma,
el tratamiento simultáneo de P2Et y anti PD-L1, aumentó la respuesta inmune para
disminuir el crecimiento del tumor [178]. Resultados similares fueron observados en las
líneas celulares MDR resistentes a la doxorubicina en las que se observó un efecto
sinérgico con P2Et en modelos in vivo e in vitro, con incremento en la exposición de CRT
[39]. Estos trabajos sugieren que el P2Et podría ser un buen coadyuvante tanto de la
quimioterapia como de la inmunoterapia actual. Sin embargo, aún surgen muchas
preguntas acerca de la actividad del P2Et y de su acción en el microambiente tumoral que
aún se encuentran en estudio.
El trabajo más reciente de nuestro grupo, en el cual se generó a partir de células 4T1 un
modelo altamente metastásico y enriquecido en células con características de célula madre
tumoral (CSC, del inglés cancer stem cells) denominado 4T1-H17, mostró que el P2Et
potencialmente tiene actividad sobre estas células in vitro, pero a nivel in vivo el efecto del
P2Et y la Doxorubicina (DOXO) sobre este modelo se perdió, encontrándose que el tamaño
tumoral y la supervivencia de los ratones era similar al control. Sin embargo, cuando los
ratones fueron vacunados con células tratadas con DOXO que tenían una alta expresión
de CRT, se incrementó la respuesta inmune frente al tumor y disminuyó el volumen tumoral
[179]. Probablemente, la modulación de los mecanismos de estrés en estas células es
diferente a nivel in vivo, por los cual se disminuye la generación de señales inmunogénicas
y por tanto la respuesta inmune. Sin embargo, en este trabajo se sugiere fuertemente que
la mejor estrategia para eliminar estas células tumorales enriquecidas en CSC es a través
de la participación de la respuesta inmune, por lo tanto, la adecuada inducción de MCI por
el P2Et podría ser crucial.
Todos los trabajos en el grupo han contribuido a conocer cómo actúa el P2Et sobre el tumor,
pero simultáneamente han generado nuevas preguntas de investigación, entre las cuales
se encuentran las que nos llevan a profundizar en los mecanismos celulares que participan
en la inducción de muerte y de señales inmunogénicas, tales como el estrés de RE y la
autofagia.
42
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo General
Estudiar el papel del estrés de retículo endoplásmico y la autofagia en la muerte celular y
la generación de señales inmunogénicas inducidas por el extracto P2Et y sus polifenoles
asociados sobre células de melanoma murino B16-F10.
5.2 Objetivos específicos
• Determinar el efecto del extracto P2Et y sus polifenoles asociados en la inducción
de estrés de retículo endoplasmático y su participación en la muerte celular sobre
células de melanoma B16-F10
• Establecer el efecto del extracto P2Et y sus polifenoles asociados en la inducción
de autofagia y su participación en la muerte celular sobre células de melanoma B16-
F10
• Evaluar la contribución del estrés de retículo endoplasmático y la autofagia en la
generación de señales inmunogénicas inducidas por P2Et y sus polifenoles
asociados sobre células de melanoma B16-F10
43
6 METODOLOGÍA
6.1 Reactivos y Anticuerpos
La solución de Ioduro de propidio (Sigma-Aldrich St. Louis, MO-USA), el MitoSOX™ rojo,
el MitoTracker® rojo DiOC2(3) (3,3´-Dietiloxacarbocianina ioduro), el Fluo-4/AM, Fluo-3/AM
y el Mag-Fluo-4/AM fueron adquiridos de Invitrogen, Molecular Probes (Chelmsford, MA,
USA). El quelante de calcio acido 1,2-bis-(2-aminofenoxi) etano-N,N,N′,N−'tetra acetico
tetra (acetoximetil) ester (BAPTA/AM), el inhibidor de PERK (GSK2606414), el ácido
salubrinal tauroursodeoxicolico (TUDCA), el N-Acetil-L-cisteina (NAC), el L-sulforafano, el
MitoTEMPO, la cloroquina, la monodansilcadaverina, el oleato, el terfenadine y la
quinacrina fueron adquiridas de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). La doxorubicina
hidrochlorida, mitoxantrona y metformina fueron adquirida de MP biomedicals (Solon, OH,
USA). Anticuerpos contra PERK total y fosforilado (PERK 3192, p-PERK 3179), IRE-1α total
(3294), ATF-4 (11815), caspasa 3 y 7 (9662 and 9494), XBP-1s (12782), LC3 (2775),
galectina-1(12936), fueron obtenidos de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).
Anticuerpos contra Calreticulina (2907), IRE-1α fosforilado (p-IRE-1, 48187) y eIF2α
fosforilado (p-eIF2α, 32157) fueron obtenidos de Abcam (Cambridge, MA, USA). El
anticuerpo contra ATF-6 (40256SS) fue adquirido de Novus biologicals (Centennial, CO,
USA). Anticuerpos contra β-actina (AC-74) y vinculina (V284) fueron adquiridos de Sigma-
Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anticuerpos contra Chop (sc-193) y HMGB1 (sc-74085) fueron
obtenidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). El anticuerpo contra EIF2α
(eIF2α) fue obtenido de Life Technologies (Chelmsford, MA, USA). Los lentivectores para
CRISPR/Cas9 fueron adquiridos de Applied Biological Materials (Richmond, BC, Canada).
La Lipofectamina 2000® fue usada para todas las transfecciones y fue adquirida de
(Invitrogen). La puromicina para la selección de los clones fue adquirida de Gibco (Gibco,
life technologies, NY, USA).
44
6.2 Líneas celulares y condiciones de cultivo
Para todos los experimentos, se utilizó la línea celular de melanoma murino B16-F10
(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA). Esta fue cultivada en medio
RPMI1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% (SFB), 2 mmol/L de L-glutamina,
100 U/mL de penicilina y 100g/ml de estreptomicina y 25 mmol/L de Hepes (Gibco, Life
Technologies, NY, USA). Las células fueron cultivadas a 37ºC en atmosfera húmeda con
5% de CO2 y subcultivadas cuando estaban al 75% de confluencia. Alcanzada la
confluencia, las células se lavaron con buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2, fueron recogidas
con tripsina/EDTA 0.25% (Gibco, Life Technologies, NY, USA) y se resuspendieron en
medio RPMI-1640 suplementado. Para los diferentes experimentos y tratamientos, 3x105
células fueron cultivadas en placas de 6 pozos, incubadas por 12h y posteriormente
tratadas. Los tratamientos con el extracto P2Et obtenido a escala de laboratorio como se
explica más adelante o con ácido gálico y etil galato (obtenidos de Sigma-Aldrich St. Louis,
MO-USA) fueron realizados por diferentes periodos de tiempo dependiendo del ensayo a
las concentraciones inhibitorias 50 (CI50) calculadas para cada uno 74.7µg/ml, 83.5µg/ml y
23.6µg/ml, respectivamente.
6.3 Obtención del Material vegetal y del extracto P2Et
Para la obtención de la fracción P2Et, se recolectaron vainas y frutos de Caesalpinia
spinosa (Molina) Kuntze en estado silvestre, en el municipio de Villa de Leyva, Boyacá,
Colombia en el polígono delimitado por las siguientes coordenadas geográficas: entre los
5°37´95´´ Norte y los 5°39´17´´ Norte; y entre los 73°32´19´´ Oeste y los 73°34´63. Fueron
identificados por Luis Carlos Jimenez del Herbario Nacional Colombiano bajo el número
COL 523714. La colección del material fue autorizada por el Ministerio del Medio Ambiente
número de acceso a recursos genéticos y sus productos derivados 220/2018. El extracto
P2Et fue producido bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura (GMP) y
caracterizado químicamente [39]. La obtención del P2Et a escala de laboratorio se realizó
como describe Sandoval en su tesis de doctorado: “se usaron 3 Kg de material vegetal
45
fresco, el cual se secó en un horno solar a 35ºC hasta alcanzar una humedad cercana al
5%. Posteriormente, luego fue molido hasta obtener un polvo fino (1.8Kg). Posteriormente,
se adiciono etanol absoluto (proporción 1:5 p/v) en un cilindro de acero a temperatura
ambiente, agitando dos veces al día durante 10 días. El sobrenadante se recuperó y se
secó bajo presión reducida hasta obtener un extracto solido (80g). Posteriormente, el
extracto fue atrapado en oxido de sílice y se realizó un fraccionamiento de polaridad
creciente con solventes orgánicos hasta agotamiento así: 1) éter de petróleo (1.5 L), 2)
cloroformo (2 L), 3) acetato de etilo (2 L) y finalmente, con este último solvente se obtuvo
un precipitado abundante denominado P2Et, el cual se secó a presión reducida, el
rendimiento total de este proceso fue de 0.07%” (Figura 5) [175]. Para los ensayos, el
extracto P2Et fue diluido en etanol al 95% grado HPLC a una concentración de 25mg/ml y
protegido de la luz.
Figura 5. Procedimiento para la obtención de P2Et a grado laboratorio. Imagen tomada de la tesis de doctorado de Sandoval 2016, se describe el procedimiento de obtención del P2Et grado laboratorio en el texto [175].
46
6.4 Ensayos de edición genómica utilizando CRISPR/Cas9
El sistema CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), en
español “Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente interespaciadas.”
es una herramienta de edición genómica, caracterizada por ser un método sencillo, rápido,
económico y más preciso que otras técnicas de edición genómica. Este sistema
CRISPR/Cas9 permite remover, adicionar o alterar secuencias de ADN a través de dos
componentes principales: (1) la enzima Cas9 (que corta el ADN) y (2) una secuencia de
ARN guía (sgARN) que dirige a la enzima al lugar específico del genoma donde se quiere
realizar el corte. La maquinaria de la célula se encarga de reparar el daño que se produce
por los cortes en el ADN, pero en este proceso las enzimas de reparación pueden cometer
errores y cambiar la secuencia de la proteína codificada o detener su producción por
completo [180].
Para la generación de las líneas celulares con knock-out de los genes asociados con estrés
de RE (PERK y XBP-1) y de autofagia (beclina-1), las células B16-F10 fueron cultivadas en
cajas de 6 pozos y transfectadas con el sistema CRISPR/Cas9 en medio Opti-MEM®
usando Lipofectamina® 2000 (Invitrogen) y siguiendo los protocolos del fabricante. La
transfección fue realizada utilizando secuencias guías de sgARN específicas para cada uno
de los genes o una secuencia scramble que no se une al genoma de ratón, las cuales
estaban cargadas en lentivectores all-in-one CRISPR/Cas9 de Applied Biological Materials
(ABM) (Richmond, BC, Canada). Las características del lentivector y las secuencias guía
utilizadas se encuentran en el Anexo 1. Después de incubar toda la noche en el medio de
transfección, las células se dejaron recuperar en medio RPMI 1640 completo durante 48h
y después se inició la selección con puromicina a 2.5µg/ml (Gibco, life technologies, NY,
USA). Después de 72h las células resistentes a puromicina, fueron cultivadas en placas de
96 pozos en dilución limitante a una concentración de 0.5 células por pozo, se generaron
clones a partir de los pozos con una sola célula y estos fueron expandidos.
El estuche de reactivos de la marca ABM K010 (Scrambled sgRNA CRISPR/Cas9
Lentivector all-in-one) fue utilizado para generar los clones control (SCR), siguiendo los
mismos pasos mencionados previamente para los genes blanco. La expresión de las
proteínas asociadas a los genes blanco fue evaluada como se describe a continuación.
47
6.4.1 Generación de líneas celulares con knock-out de genes involucrados en la UPR.
Para la generación de los clones knock-out para proteínas de estrés de RE se utilizaron
tres secuencias guía para Eif2ak3 (eIF2 quinasa 3 conocida como PERK) de ratón
contenidas en el estuche de reactivos con referencia K4522205 de ABM. Para generar el
knock-out de XBP-1 se utilizó el estuche K4387407 de ABM que contiene una secuencia
guía para Xbp1 (Anexo 1). Una vez se hizo la expansión y selección de los 9 clones
obtenidos después de la transfección con los sgARN de PERK, se analizó la expresión
relativa de PERK por q-PCR y se chequearon los dos clones con menor expresión por
western blot (Figura 6A-B). Para XBP-1 se obtuvieron 14 clones e igualmente se evaluó la
expresión relativa de XBP-1 y se chequeo la expresión de XBP-1s por western blot de los
dos clones con menor expresión (Figura 6C-D). Para todos los análisis de q-PCR se utilizó
-actina como gen control y se comparó la expresión de cada clon contra las células B16-
F10wt. Por otra parte, se obtuvieron 7 clones de la transfección con el SCR y ninguno mostró
menor expresión relativa de PERK o XBP-1 (resultados no mostrados); y de estos, el clon
con una expresión más similar a la de las células B16-F10wt fue el utilizado en todos los
experimentos de estrés de RE (Figura 6). Para los experimentos de muerte celular se
utilizaron los clones identificados en la figura 6 como P7 y X3, ya que tuvieron una viabilidad
similar a las células B16-F10wt.
48
Figura 6. Evaluación de la expresión de XBP-1 y PERK en los clones generados con el sistema CRISPR/Cas9. Los clones CRISPR/Cas9 obtenidos como se explica en el texto o las células B16-F10 salvajes (B16-F10wt)
fueron tratadas por 12h con el vehículo o con Taps (5g/ml). A. Evaluación por q-PCR de los niveles de expresión relativa del ARNm de PERK respecto al control GAPDH, se utilizó como control para determinar baja expresión las células B16-F10wt B. Imágenes representativas del análisis de western blot de células B16-F10wt, scramble (SCR) y de dos clones seleccionados con baja expresión de PERK. C. Evaluación por q-PCR de los niveles de expresión relativa del ARNm de XBP-1 respecto al control GAPDH. Se utilizó como control para determinar baja expresión las células B16-F10wt B. Imágenes representativas del análisis de western blot de células B16-F10wt, scramble (SCR) y de dos clones seleccionados con baja expresión de PERK
6.4.2 Generación de líneas celulares con knock-out de beclina-1 para inhibición de autofagia.
Para la generación de los clones knock-out para proteínas de autofagia, tres plásmidos con
secuencias guía diferentes para beclina-1 fueron utilizados (Anexo 1: ABM K446040). Se
realizó evaluación de la expresión de beclina-1 por western blot de los 22 clones obtenidos
a partir de la transfección con los plásmidos de beclina-1 y 12 obtenidos con el SCR, los
cuales fueron sometidos a deprivación de nutrientes por 12h para la evaluación de beclina-
1 (RPMI suplementado con 0.5% de SFB). No se observó alteraciones en la expresión de
49
beclina-1 en ninguno de los 12 clones SCR, y el clon 7.1 fue utilizado como control para
todos los ensayos de autofagia. De los clones evaluados para beclina-1 se obtuvieron 2
clones que no expresaban beclina-1 sugiriendo una deleción en ambos alelos (bialélica),
también se encontraron clones con una proteína de menor peso molecular que la proteína
original (proteína truncada) y algunos clones que no fueron modificados (Figura 7). Para los
experimentos de muerte celular y autofagia se utilizó el clon 3.1, ya que tuvo una viabilidad
similar a las células B16-F10wt
Figura 7. Evaluación de la expresión de beclina-1 en los clones generados con el sistema CRISPR/Cas9. A. Imágenes del análisis de western blot utilizando anticuerpos contra la proteína beclina-1 en los clones obtenidos de la transfección con el scramble y con los sgARN de beclina-1. Se utilizó como control de carga la
proteína -tubulina. Se observan los dos clones que no expresaron beclina-1 (cuadros rojos) y los SCR que presentaron expresión normal de beclina-1 (cuadros azules). Además, con flechas se señalan ejemplos de otros fenotipos obtenidos: heterocigoto (flecha verde), proteína truncada (flecha naranja), sin modificar (flecha morada)
6.5 Evaluación de la actividad citotóxica del extracto P2Et, AG y EG sobre las células B16-F10 salvajes y modificadas.
6.5.1 Ensayos de citotoxicidad por MTT
El efecto citotóxico del extracto P2Et, AG y EG y de la DOXO, una droga antitumoral
convencional usada como control en gran parte de los experimentos, fue evaluado en las
células B16-F10 usando la sal de tetrazolium MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue, Sigma-
50
Aldrich, Saint Louis MO) [181]. Para este y los demás ensayos, el extracto P2Et, el AG y el
EG fueron diluidos en etanol al 95% a una concentración de 25mg/ml y protegidos de la luz.
Las células fueron cultivadas a 5x103 células/pozo y tratadas por 48 h, en placas de 96
pozos haciendo diluciones seriadas del extracto P2Et, AG y EG empezando en 250 hasta
15.625µg/ml, etanol (control negativo, 0.02%) o DOXO usando concentraciones desde 5M
hasta 0.078 M. Después de los tratamientos, las placas se centrifugaron a 200xg durante
5 minutos y las células fueron lavadas con PBS 1X antes de adicionar el MTT, el medio se
descartó y se adicionaron 100μL de medio RPMI 1640 sin rojo de fenol y 50 µl de MTT en
PBS 1X a cada pozo. Posteriormente las placas fueron incubadas por 4h a 37°C para
permitir la formación de los cristales de formazán, los cuales fueron disueltos con DMSO
incubando las placas por 20 minutos a temperatura ambiente. Los resultados del MTT
fueron leídos a 540nm en un Multiskan MCC/340 (Labsystems, Thermo Fisher Scientific,
Waltham). El porcentaje de viabilidad fue calculado como la absorbancia del
vehículo/Absorbancia del tratamiento por 100. Los valores de CI50 fueron calculados con
curvas de regresión no lineal de tres o cuatro parámetros usando el software GraphPad
Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., CA, USA). Los valores de CI50 obtenidos se detallan
en la tabla 3 en la sección de resultados.
6.5.2 Ensayos de anexina V y Ioduro de propidio
Para diferenciar si el tratamiento de las células tumorales con P2Et y los polifenoles AG y
EG inducían muerte celular por apoptosis o por necrosis, la externalización de la
fosfatidilserina (FS) fue evaluada usando Anexina V-FITC y Ioduro de Propidio (IP). La
Anexina V es una proteína recombinante que se une específicamente a residuos de
fosfatidilserina los cuales se exponen en la membrana celular durante las fases iniciales de
la apoptosis, esta fue combinada con el marcador de ADN Ioduro de propidio (IP) es cual
no es permeable a la membrana a menos que esta se vea comprometida (fases más tardías
de la apoptosis), con el fin de distinguir células apoptóticas de necróticas. Un total de 3 x105
células B16-F10wt o modificadas con el sistema CRISPR/Cas9, fueron tratadas con el
vehículo (ETOH o DMSO), DOXO (100nM), TERF (5M) o con la CI50 del extracto P2Et,
51
AG y EG durante diferentes tiempos. En los ensayos en los que se utilizaron antioxidantes
o inhibidores de estrés de RE o autofagia, las células fueron incubadas durante 2h previas
al tratamiento y posteriormente se adicionó a cada pozo la CI50 del extracto P2Et, AG o EG
y se incubaron por 24 o 48h. Después del tratamiento, las células fueron recolectadas y
resuspendidas en Buffer anexina 1X (Hepes 100 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 2.5 mM) e
incubadas con Anexina V-FITC y con IP por 15 minutos a temperatura ambiente.
Inmediatamente fueron adquiridas en un FACSAria II (Becton Dickinson) o Cytoflex
(Beckman Coulter, Waltham, MA, USA) y analizadas con el software FlowJo (Tree Star Inc).
Cada ensayo se realizó por duplicado y los resultados son expresados como la media ±
ESM para 3 experimentos independientes.
6.5.3 Ensayos de clonogenicidad
Los ensayos de clonogenicidad de las células tumorales se realizaron sobre el SCR y las
células beclina-1 KO. Para esto, las células fueron cultivadas en placas de 6 pozos y
tratadas durante 24h con la CI50 de P2Et, AG y EG o etanol (control negativo, 0.02%).
Después del tratamiento, las células fueron recolectadas y plaqueadas en placas de 6
pozos con RPMI-agar al 0.5% (3.000 células/caja), incubadas por 14 d (37°C y 5% CO2) y
teñidas con cristal violeta (0.4% en etanol) [182]. Las colonias con más de 50 células fueron
contadas. Los tratamientos fueron realizados por triplicado y los resultados expresados
como la media ± ESM de tres experimentos independientes.
6.6 Evaluación del estrés del retículo endoplásmico
6.6.1 Ensayos para evaluación del volumen del RE
Durante el estrés del retículo endoplásmico, el tamaño del RE debe ajustarse a las
necesidades de la célula por ello inicia la expansión de su membrana, lo cual es necesario
52
para incrementar la producción y procesamiento de proteínas y chaperonas, por ello la
expansión de la membrana del RE fue evaluada como una medida de estrés del RE. Para
esto, las células B16-F10 fueron tratadas durante 6 y 12h con la CI50 de P2Et, AG y EG o
etanol (control negativo, 0.02%). Después del tratamiento las células fueron colectadas y
marcadas con 0.1M de ER-Tracker™ verde disuelto en HBSS por 30 min a 37°C y
analizadas inmediatamente por citometría de flujo.
6.6.2 Ensayos de Western Blot para estrés de RE
Para los ensayos de Western Blot, las células B16-F10wt o modificadas con el sistema
CRISPR/Cas9 fueron tratadas durante 6, 12 y 24h con la CI50 de P2Et, AG y EG. Las células
fueron recolectadas y lisadas. La concentración de proteínas de los lisados celulares fue
cuantificada usando el ensayo de MicroBCATM (Thermo Scientific, Chelmsford, MA, USA).
Para la electroforesis de proteínas se cargaron 15-20g de proteína en geles Tris-Glicina
10% (Life technologies), posteriormente se realizó la transferencia a membranas de PVDF
usando técnicas estándar. Para el Western Blot, las membranas fueron incubadas con los
anticuerpos primarios que se detallan en la sección de reactivos en las siguientes
diluciones: anti-PERK (1/1000), anti-p-PERK (1/500), anti-IRE 1 (1/1000), anti-p-IRE 1
(1/500), anti-eIF2α (1/2000), anti-p-eIF2α (1/2000), anti-ATF-4 (1/1000) , anti-CHOP (1/500)
o anti-ATF-6 (1/1000). Los anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo o ratón (según
corresponda) acoplados a la enzima peroxidasa se utilizaron diluidos 1:5000. Los
inmunocomplejos en la membrana fueron visualizados usando el kit ECL (Thermo Scientific,
Chelmsford, MA, USA) y las imágenes fueron adquiridas en el sistema de imagen Chemi-
Doc (Bio-Rad). La densitometría de cada proteína fue normalizada con la expresión de la
vinculina o -actina, usando el software Bio-Rad Image-Lab.
6.6.3 Ensayos de extracción de ARN y análisis mediante q-PCR
La extracción de ARN total se realizó usando el reactivo TRIzol LS de acuerdo a las
instrucciones del fabricante (Life technologies Corporation, Invitrogen, NY, USA). La calidad
y la cantidad de ARN fue medida con un espectrómetro NanoDrop (Thermo scientific,
53
Wilmington, DE, USA). Posteriormente, se sintetizo el cDNA usando transcriptasa reversa
SuperScripts III, siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Thermo scientific,
Wilmington, DE, USA). Para llevar a cabo la RT-PCR se tomaron 30 ng de cADN, DNA
Master Plus SYBRGreenI (Roche Applied Science, IN, USA) y 250 ng de iniciadores forward
y reverse en un volumen total de 20 μL. Las reacciones fueron llevadas a cabo en dos
experimentos independientes con duplicados cada uno utilizando un termociclador
Spectrum 48 Real Time Thermal Cyclers (ESCO, Singapore). Las condiciones fueron: una
denaturación inicial a 95ºC por 10 min, 40 ciclos a 95ºC por 10s, 60ºC por 10s, 72ºC por
10s, seguido por una etapa de disociación. La especificidad de los productos de
amplificación fue verificada por un análisis de curva melt post-amplificación. Los niveles de
expresión relativa de cada transcripto fueron normalizados respecto al gen de control
GAPDH y la expresión relativa fue calculada usando el método 2-ΔΔCT.
6.6.4 Ensayos para evaluación de niveles de Calcio
Para la detección del calcio citoplasmático, las células B16-F10wt o modificadas con el
sistema CRISPR/Cas9 fueron tratadas durante 24h con la CI50 de P2Et y colectadas para
su tinción como se describió previamente [183]. Brevemente, las células fueron lavadas con
solución salina fisiológica (PSS, 140mM NaCl, 5 mM KCl, 1mM MgCL2, 10 mM glucosa, 10
mM Hepes a pH 7.4) sin calcio. Las células fueron marcadas con esteres de calcio AM
permeables a la membrana como Fluo-3 (1.5 M) o Fluo-4 (1.5 M), diluidos en PSS
suplementado con 70 M CaCl2 y 0.05% (v/v) Pluronic F-127 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
USA) e incubadas por 30 min a 37°C. Después de esto, las células fueron centrifugadas y
estabilizadas en PSS suplementado con una alta concentración de CaCl2 (1.7mM) a
temperatura ambiente por 30 min Inmediatamente fueron adquiridas en un FACSAria II
(Becton Dickinson) o Cytoflex (Beckman Coulter, Waltham, MA, USA) y analizadas con el
software FlowJo (Tree Star Inc). Cada ensayo se realizó por duplicado y los resultados son
expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes.
54
6.6.5 Ensayos para detección de ROS
Para evaluar la generación de ROS, las células B16-F10wt fueron tratadas durante 24h con
la CI50 de P2Et y colectadas. Posteriormente, fueron marcadas en RPMI 1640 sin rojo de
fenol a 37°C durante 40min con una solución de CellROX® (0.5µM), 15 minutos antes de
finalizar el marcaje, se agregó SYTOX® a una concentración final de 1µM. Las células
fueron analizadas inmediatamente por citometría de flujo y se determinó la IMF del CellROX
sobre las células SYTOX negativas. Cada ensayo se realizó por duplicado y los resultados
son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes.
6.7 Evaluación de disfunción mitocondrial
6.7.1 Ensayos de integridad mitocondrial
Para evaluar la integridad de la membrana mitocondrial, las células B16-F10wt fueron
tratadas durante 24h con la CI50 de P2Et y colectadas. Posteriormente, fueron marcadas en
RPMI 1640 sin rojo de fenol a 37°C con soluciones de MitoTracker (0.5µM) para evaluar la
masa mitocondrial o MitoSOX (5 µM) para evaluar los ROS específicos de la mitocondria,
terminado el marcaje las células fueron analizadas inmediatamente por citometría de flujo
en Cytoflex (Beckman Coulter, Waltham, MA, USA) y analizadas con el software FlowJo
(Tree Star Inc). Cada ensayo se realizó por duplicado y los resultados son expresados como
la media ± ESM para 3 experimentos independientes.
6.7.2 Medición del potencial de la membrana mitocondrial
La pérdida en el potencial de la membrana mitocondrial fue evaluada por citometría de flujo
en las células B16-F10, SCR o PERK KO usando las sondas DIOC2(3) y JC-1. Para esto,
las células tratadas durante 24h con la CI50 de P2Et fueron marcadas con DIOC2(3) a una
concentración final de 50nM en PBS por 30 min a 37°C. Sobre estas células se hizo el
55
análisis del porcentaje de células DIOC2(3)low. Para determinar esta población se realizó la
ventana de análisis sobre las células tratadas por 5 min previos a la adquisición con 1M
de carbonilcianuro-m-clorofenilhidrazona (CCCP), este es un control de desacomplamiento
mitocondrial, el cual altera la membrana y disminuye la retención de DIOC2(3).
La solución de JC-1 fue preparada a 2.5g/ml en medio RPMI1640 sin rojo de fenol a
temperatura ambiente y adicionado a las células por 10 min a 37°C. Un total de 20.000
células marcadas (eventos) fueron analizados por citometría de flujo y los agregados JC-1
fueron evaluados en FL-2 (485nm Ex/530nm Em), los cuales representaban potencial de la
membrana mitocondrial normal, mientras que un incremento en la fluorescencia roja en FL-
1 (530 nm Ex/590 nm Em.) está asociado con monómeros, como consecuencia de la
pérdida del potencial de la membrana mitocondrial. Inmediatamente después del marcaje
las células fueron adquiridas en un FACSAria II (Becton Dickinson) o Cytoflex (Beckman
Coulter, Waltham, MA, USA) y analizadas con el software FlowJo (Tree Star Inc). Cada
ensayo se realizó por duplicado y los resultados son expresados como la media ± ESM para
3 experimentos independientes.
6.7.3 Ensayos de Seahorse
Las células SCR o PERK KO tratadas durante 24h con la CI50 de P2Et o con el vehículo, se
sometieron a análisis de Seahorse utilizando medio base XF no tamponado que contenía
glucosa 25mM (Sigma), 1mM l-glutamina y piruvato sódico 1mM sin suero. Las microplacas
de cultivo celular XF96 se recubrieron con CellTak (Corning) antes del análisis de acuerdo
con las instrucciones del fabricante y se lavaron dos veces con agua destilada. Se colocaron
en las placas 1.2 x 105 células tratadas y se analizó la tasa de consumo de oxígeno (OCR,
del inglés oxygen consumption rate) en un equipo de flujo extracelular XFe96 (Agilent).
Después de obtener las mediciones basales de OCR utilizando el Kit de prueba de estrés
XF Cell Mito Stress (Agilent). Posteriormente, se registró el OCR en respuesta a oligomicina
(1 μM), carbonil cianuro-p- (trifluorometoxi) fenilhidracona (FCCP, 1 μM), y rotenona y
antimicina (0,5 μM cada una). Los parámetros metabólicos se calcularon de la siguiente
manera: OCR basal fue igual a la última medición de la tasa antes de la inyección de
56
oligomicina menos la medición de la tasa mínima después de la inyección de rotenona y
antimicina. OCR máximo como la medición de la tasa máxima después de la inyección de
FCCP menos la medición de la tasa mínima después de la inyección de rotenona y
antimicina. Se examinaron 3-5 repeticiones técnicas para cada muestra. Después del
análisis, se cuantifico la cantidad de proteína contenida en cada pozo usando el ensayo de
MicroBCATM (Thermo Scientific, Chelmsford, MA, USA) y los valores de OCR se
normalizaron en consecuencia.
6.8 Evaluación de la inducción de autofagia
6.8.1 Ensayos de monodansilcadaverina y LC3 I/II por microscopia confocal
Para la evaluación de autofagia se uilizan varios métodos entre ellos se encuentra el uso
de la monodansilcadaverina (MDC) una sonda autofluorescente que se utiliza
principalmente para marcar vacuolas autofágicas, la presencia de fluorescencia representa
que la célula ha entrado en autofagia [184]. Por otra parte, está la proteína LC3, la cual se
encuentra uniformemente distribuida en el citoplasma, durante la activación de la autofagia,
esta es reclutada a la membrana del autofagosoma generando puntos de LC3 los cuales
pueden ser contados y comparados con controles para determinar los cambios en la tasa
de autofagia. La evaluación de LC3 se realizó por microscopia confocal utilizando anti-LC3
o células transfectadas con el plásmido ptf-LC3 (Addgene plasmido #21074, donado por
Gonzalo Arboleda, Universidad Nacional de Colombia). Para todos los experimentos
láminas cubreobjetos fueron pre-tratadas con fibronectina (Fisher-Brand Microscope Cover
Glass) y dispuestas en placas de 12 pozos. Un total de 1.2x104 células B16-F10wt, B16-
F10tfLC3 o modificadas con el sistema CRISPR/Cas9 fueron cultivadas y tratadas con los
vehículos (etanol y DMSO), los controles positivos metformina (50nM), oleato (100nM) y
terfenadina (5M) o con la CI50 del extracto P2Et y de los polifenoles AG y EG por 12h,
según como se indica en cada figura de la sección de resultados. Las imágenes fueron
adquiridas a una resolución de 640x640 pixeles en un microscopio confocal FV1000
57
(Olympus, Tokyo, Japan) usando el objetivo de aceite de inmersión UPLSAPO 60x 1.35
NA.
Para los ensayos de MDC después del tratamiento las células fueron lavadas dos veces
con PBS 1X y a cada pozo se le agrego 1ml de una solución de MDC 50M en RPMI
completo, las células fueron incubadas por 1h a 37ºC en atmosfera de CO2 al 5%. Luego
las células fueron fijadas con paraformaldehído (PFA) al 4% por 20 min, lavadas y
permeabilizadas con triton X-100 0.1% por 5 min. Finalmente, las células fueron lavadas y
marcadas con faloidina-Alexa fluor 647 (dilución 1/1000) por 20min y la fluorescencia fue
preservada con el reactivo Prolong Antifade (Life Technologies, Woburn, MA, USA). Las
imágenes fueron analizadas utilizando el software del microscopio confocal y se determinó
el número de células MDC positivas/el total de células por campo microscópico. El análisis
se realizó en 6 campos microscópicos por tratamiento en 3 experimentos independientes.
Para la evaluación de la inducción de autofagia con anti-LC3 las células fueron fijadas y
permeabilizadas con metanol frio por 20min/-20ºC. Posteriormente, lavadas y se realizó un
bloqueo con SFB al 10% por 1h y se incubo con el anticuerpo anti-LC3 toda la noche a 4ºC,
seguido del anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 por 1h a temperatura
ambiente. Finalmente, las células fueron marcadas con DAPI (300 nM) por 5 min y la
fluorescencia fue preservada con el reactivo Prolong Antifade (Life Technologies, Woburn,
MA, USA). Las imágenes fueron analizadas utilizando el software del microscopio confocal
y se contaron el número de puntos de LC3 por célula, en 25 células por tratamiento y se
realizaron 3 experimentos independientes.
Con el fin de caracterizar el flujo autofágico inducido por los tratamientos las células B16-
F10, fueron transfectadas con el plásmido ptfLC3 que induce la expresión de una proteína
de fusión denominada mRFP-GFP-LC3 (Red Fluorescent Protein-Green Fluorescent
Protein-LC3). Con este sistema los autofagosomas se observan como puntos de GFP-RFP-
LC3, de color amarillo como consecuencia de la colocalización de la fluorescencia verde y
roja, mientras que los autofagolisosomas solo son fluorescentes en rojo, debido a que la
proteína GFP es sensible al pH ácido del lisosoma. El exceso de autofagolisosomas
respecto a los autofagosomas refleja un flujo autofágico completo, mientras que un exceso
58
o un número equivalente de autofagosomas respecto a los autofagolisosomas, es un
indicativo de un bloqueo en el flujo autofágico normal [185]. Para esto las células B16-F10
fueron cultivadas en cajas de 6 pozos y transfectadas durante 6h con el plásmido ptfLC3
en medio Opti-MEM® usando Lipofectamina® 2000 (Invitrogen) y siguiendo los protocolos
del fabricante. Posteriormente las células se dejaron recuperar en RPMI 1640 completo
durante 48 horas y se recolectaron. Posteriormente, se sembraron en láminas cubreobjetos
como se indica previamente, fueron tratadas y marcadas con DAPI (300 nM) por 5 min. La
fluorescencia fue preservada con el reactivo Prolong Antifade (Life Technologies, Woburn,
MA, USA). Las imágenes fueron analizadas utilizando el software del microscopio confocal
y se contaron el número de puntos de LC3 amarillos y rojos por célula, en 15 células por
experimento en 3 experimentos independientes.
6.8.2 Ensayos de Western Blot para proteínas de autofagia
Para los ensayos de Western Blot, las células B16-F10wt o modificadas con el sistema
CRISPR/Cas9 fueron tratadas durante 12, recolectadas y lisadas con buffer RIPA (Tris 20
mM [pH 8,0], NaCl 150 mM, SDS 0,1%, DOC 0,5%, y Tritón X-100 0,5%). La concentración
de proteínas de los lisados celulares fue cuantificada usando el ensayo de Bradford (Bio-
Rad). Para la electroforesis de proteínas se cargaron 15-20g de proteína en geles Tris-
Glicina 4-12% (Mini-PROTEAN® TGX™ Gels, Bio-RAD), posteriormente se realizó la
transferencia a membranas de PVDF usando técnicas estándar. Para el Western Blot, las
membranas fueron incubadas con los anticuerpos primarios que se detallan en la sección
de reactivos en las siguientes diluciones: anti-LC3 (1/1000), anti-p62 (1/2000), anti-Beclina-
1 (1/1000). Los anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo o ratón (según corresponda)
acoplados a la enzima peroxidasa se utilizaron diluidos 1:5000. Los inmunocomplejos en la
membrana fueron visualizados usando el kit ECL (Thermo Scientific, Chelmsford, MA, USA)
y las imágenes fueron adquiridas en el sistema de imagen Chemi-Doc (Bio-Rad). La
densitometría de cada proteína fue normalizada con la expresión -tubulina, usando el
software ImageJ del NIH (National Institutes of Health).
59
6.9 Evaluación de muerte celular inmunogénica
6.9.1 Ensayos de evaluación de Ecto-calreticulina
Las células B16-F10wt o modificadas con el sistema CRISPR/Cas9 fueron cultivadas a una
densidad de 3 x105 en placas de 6 pozos y tratadas con el vehículo (etanol), DOXO (control
positivo) o con la CI50 del extracto P2Et y los polifenoles AG y EG por 12h. Las células
fueron colectadas, lavadas con PBS y fijadas con PAF al 0.25% en PBS por 5 min. Después
de esto, las células fueron lavadas con PBS frio e incubadas con el anticuerpo primario
(anti-CRT, ab2907, abcam) diluido en buffer de bloqueo frio (SFB al 2% en PBS) por 30
min. Finalizada la incubación, las células fueron lavadas e incubadas con el anticuerpo
secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) en buffer de bloqueo por 30
min. Las células fueron adquiridas en un citómetro de flujo FACSAria II (Becton Dickinson)
para identificar la CRT en la membrana de las células. La intensidad de fluorescencia de
las células teñidas fue evaluada sobre una población Aqua negativa (células vivas) [186].
Los análisis fueron realizados utilizando el software FlowJo (Tree Star Inc). Los resultados
son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes.
6.9.2 Evaluación de ATP vesicular
Las células B16-F10wt o modificadas con el sistema CRISPR/Cas9 fueron cultivadas a una
densidad de 3 x105 en placas de 6 pozos y tratadas con el vehículo (etanol), DOXO (control
positivo) o con la CI50 del extracto P2Et y los polifenoles AG y EG por 48h. Las células
fueron recolectadas y marcadas como se describió previamente [26]. Brevemente, la
quinacrina fue preparada a una concentración final de 1M en solución de Krebs-Ringer
(125mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgSO4, 2mM CaCl2, 6mM glucosa y 25mM HEPES, pH 7.4).
Las células fueron marcadas con la solución de quinacrina por 30 min a 37ºC, lavadas y
resuspendidas en una solución con PI (1mg/ml). Las células fueron adquiridas en un
citómetro de flujo FACSAria II (Becton Dickinson) y los datos fueron analizados utilizando
60
el software FlowJo (Ashland, OR, USA). Los resultados son expresados como la media ±
ESM para 3 experimentos independientes.
6.9.3 Evaluación de HMGB-1
Para la evaluación de HMGB-1 las células fueron cultivadas en láminas pre-tratadas con
fibronectina en placas de 12 pozos (Fisher-Brand Microscope Cover Glass). Un total de
1.5x104 células B16-F10wt o modificadas con el sistema CRISPR/Cas9 fueron cultivadas y
tratadas con el vehículo (etanol), DOXO (control positivo) o con la CI50 del extracto P2Et y
los polifenoles AG y EG por 48h. Finalizado el tratamiento las células fueron lavadas 2
veces con PBS. Las células fueron fijadas con paraformaldehido al 4% por 20 min, lavadas
y permeabilizadas con triton X-100 0.1% por 5 min. Posteriormente, se realizó un bloqueo
con SFB al 10% por 1h y se incubo con el anticuerpo anti-HMGB1 por 30 min a temperatura
ambiente, seguido del anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 por 30 min.
Finalmente, las células fueron marcadas con DAPI (300 nM) por 5 min y la fluorescencia
fue preservada con el reactivo Prolong Antifade (Life Technologies, Woburn, MA, USA). Las
imágenes fueron adquiridas a una resolución de 640x640 pixeles en un microscopio
confocal FV1000 (Olympus, Tokyo, Japan) usando el objetivo de aceite de inmersión
UPLSAPO 60x 1.35 NA.
Análisis Estadísticos
Para evaluar la significancia entre dos grupos, en algunos experimentos se realizó una t-
student pareada o no pareada a dos colas. Se consideró un valor de p <0.05 como
estadísticamente significativo. Test estadísticos específicos son indicados en los resultados
de cada figura, teniendo en cuenta: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.001. Los
análisis estadísticos se realizaron usando el software GraphPad Prism versión 8.0
61
7 RESULTADOS
7.1 Papel del estrés de retículo endoplasmático en la inducción de muerte celular mediada por el extracto P2Et y sus polifenoles asociados
La actividad citotóxica del extracto etanólico P2Et obtenido de la planta Caesalpinia spinosa
ha sido previamente evaluado sobre diferentes líneas celulares tumorales incluyendo las
células B16-F10 [14, 15, 39, 177, 187]. Sin embargo, los mecanismos involucrados en esta
inducción de muerte celular y en la generación de señales para la activación de la respuesta
inmune mediada por P2Et no son claros. Teniendo en cuenta que uno de los principales
mecanismos de acción de los productos naturales es la inducción de estrés de RE [36] y
que este mecanismo ha sido ampliamente asociado con la generación de señales de peligro
[4], los siguientes resultados muestran el papel del estrés de RE en la inducción de
apoptosis mediada por P2Et y por los dos principales polifenoles presentes en el extracto:
ácido gálico (AG) y etil galato (EG).
7.1.1 El extracto P2Et y los polifenoles ácido gálico y etil galato presentan actividad citotóxica e inducen apoptosis en células B16-F10.
La actividad citotóxica e inhibidora de la proliferación del extracto P2Et, acido gálico y etil
galato sobre la línea celular de melanoma murino B16-F10, fue determinada utilizando la
técnica de MTT. Los resultados obtenidos mostraron que el etil galato tiene una mayor
actividad citotóxica en estas células presentando una CI50 de 23.6g/ml, en comparación
con el ácido gálico que presento una CI50 de 83.5g/ml. Mientras que con el P2Et, se
encontró una CI50 intermedia la cual fue de 72.1g/ml (Figura 8 y Tabla 3), más cercana a
los valores de citotoxicidad encontrados con AG lo cual puede ser justificado debido a que
el extracto presenta una mayor concentración de ácido gálico (4.88%) que de etil galato
(1.88%) [175].
Posteriormente las células B16-F10 fueron tratadas con la concentración CI50 por 24 y 48h
con cada uno de los polifenoles y con P2Et. En la figura 9 se pueden observar como el
62
tratamiento con P2Et, AG y EG induce cambios morfológicos en las células B16-F10.
Durante la evaluación microscópica, se encontró que la mayoría de las células tenían
cambios morfológicos a las 24h de tratamiento, observándose con P2Et perdida de la
adherencia, detritos celulares y una alta formación de vesículas. Con AG y EG además de
encontrarse vesículas citoplasmáticas como con P2Et, se observó un alargamiento de las
células en comparación con el control.
Figura 8. Actividad citotóxica de P2Et y los polifenoles AG y EG sobre la línea celular B16-F10. Las células B16-F10 fueron tratadas por 48 horas con cada uno de los tratamientos y se utilizó como control positivo DOXO. La citotoxicidad fue evaluada por MTT, la densidad óptica a 540nm es directamente proporcional a la viabilidad celular. Los cálculos fueron realizados sobre los vehículos ETOH y DMSO.
Tabla 3. Actividad citotóxica (CI50) de P2Et, ácido gálico y etil galato sobre células B16-F10
Para la evaluación de la inducción de apoptosis en las células B16-F10, estas fueron
tratadas con la CI50 de P2Et, AG y EG, además, se utilizó la DOXO un inductor de MCI que
induce apoptosis. Las células apoptóticas fueron evidenciadas a través de un marcaje con
Anexina V/Ioduro de propidio (Anexina V/IP) con el cual se identificaron las células en
Tratamientos CI50
P2Et 72,1µg/mL
AG 83,5µg/mL
EG 23,6µg/mL
DOXO 100nM
63
apoptosis temprana (Anexina V+/IP-), apoptóticas tardías (Anexina V+/IP+) y necróticas
(Anexina V-/IP+). Como se observa en la figura 10A, el tratamiento con los polifenoles AG y
EG muestra una inducción de muerte similar a la observada con la fracción P2Et. En los
polifenoles al igual que con el P2Et la mayoría de las células muertas fueron Anexina V+,
sugiriendo que la muerte con los tres tratamientos es dirigida principalmente por apoptosis
[126]. Un pequeño porcentaje de células fueron Anexina V-/PI+, teniendo en cuenta que hay
una gran cantidad de células apoptóticas estos resultados sugieren que la necrosis es más
un proceso secundario a la inducción de apoptosis (necrosis secundaria), por lo tanto, los
análisis se hicieron sobre la población Anexina V+. Por otra parte, este análisis permitió
identificar que a las 24h de tratamiento se observa una mayor cantidad de células
apoptóticas con P2Et, lo cual sugiere que puede tener un efecto más temprano sobre las
células tumorales en comparación con los polifenoles. Para determinar si la muerte con
P2Et iniciaba antes de las 24h se realizó una cinética desde las 6h y hasta las 48h (Figura
10B), con lo cual se pudo evidenciar que la muerte mediada por P2Et se presenta entre las
12 y las 24h.
Figura 9. Alteraciones morfológicas presentadas en las células B16-F10 tratadas con P2Et y los polifenoles AG y EG. Las células fueron tratadas por 24 horas con (A) ETOH, (B) P2Et, (C) AG y (D) EG. Se muestran las imágenes representativas obtenidas utilizando el objetivo 40X en el microscopio de luz invertido.
64
Figura 10. El extracto P2Et y los polifenoles AG y EG inducen muerte por apoptosis de células B16-F10. A. Se muestran los diagramas de contornos representativos de células B16-F10 marcadas con Anexina V/IP que habían sido previamente tratadas por 24h con P2Et, AG, EG y con el control negativo ETOH o con el control positivo DOXO (100nM) B. Análisis estadístico del porcentaje de células apoptóticas C. Se muestra los diagramas de contornos representativos de células tratadas con P2Et y recolectadas a las 0, 6, 12, 24 y 48h de tratamiento. D. Análisis estadístico del porcentaje de células apoptóticas. En ambos casos los resultados estadísticos son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
7.1.2 P2Et induce estrés de RE y este es necesario para la inducción de apoptosis en células B16-F10
El interés creciente en el uso de productos naturales como una posibilidad terapéutica en
cáncer ha llevado a la evaluación de los mecanismos involucrados en la muerte celular
mediada por estos compuestos. Se ha observado que muchos derivados de productos
naturales inducen apoptosis a través de la inducción de estrés de RE [36, 188]. Teniendo
en cuenta esto, se evaluó el papel del estrés de RE en la inducción de apoptosis mediada
por P2Et, AG y EG. Para esto, inicialmente se estudió si el P2Et y los polifenoles AG y EG
65
podrían inducir estrés en el RE. Se determinó de forma indirecta la inducción de estrés de
RE, utilizando la sonda fluorescente ER-Tracker™, la cual nos permite evidenciar el
incremento en la masa del RE que se produce como consecuencia de la activación de la
UPR. Con este marcador se observó que P2Et induce estrés de RE desde las 6h de
tratamiento, con un aumento significativo a las 12h (Figura 11A-B). Sin embargo, aunque
AG y EG inducen muerte celular por apoptosis no se observó aumento de la masa del RE
con ninguno de estos polifenoles a las 6 o 12h de tratamiento (Figura 11C-D). De forma
complementaria, se analizó la expresión relativa de BiP, una de las principales chaperonas
que se aumenta durante la inducción de estrés de RE y de CHOP, que ha sido ampliamente
involucrado con la inducción de apoptosis mediada por UPR; para estos experimentos se
utilizó como control positivo la tunicamicina que inhibe la glicosilación de proteínas e induce
UPR [189]. Con este análisis se pudo observar que mientras el P2Et aumenta de forma
relativa la expresión a nivel del ARNm de BiP y CHOP, el AG y EG no lo modifican,
sugiriendo que estos polifenoles no inducen estrés en el RE (Figura 11E). Por lo tanto, los
siguientes experimentos se hicieron únicamente con el P2Et.
Posteriormente, para evaluar el papel del estrés de RE en la inducción de apoptosis
mediada por P2Et, las células B16-F10 fueron tratadas con la CI50 del extracto por 6, 12 y
24h y se realizó un análisis por western blot de la activación de las tres vías de la UPR.
Este análisis permitió evidenciar la activación principalmente de las ramas PERK e IRE-1α
en las células B16-F10 expuestas a P2Et en comparación con el vehículo. El tratamiento
con P2Et, incremento la señalización vía PERK aumentando la fosforilación de eIF2α y la
producción de CHOP. No se encontró un aumento significativo de ATF-4 o ATF-6 en las
células tratadas con P2Et (Figura 12A-B). Teniendo en cuenta que la inducción de la UPR
se inicia a las 12h de tratamiento y se aumenta significativamente hacia las 24h que es el
momento en el que inicia la muerte celular, estos resultados sugieren que el incremento de
la apoptosis puede ser una consecuencia del estrés de RE en células de melanoma
después del tratamiento con P2Et.
Para determinar el papel del estrés del RE en la inducción de la apoptosis por P2Et, las
células B16-F10 fueron pretratadas 2h con TUDCA, una chaperona química que bloquea la
activación de los mediadores de la UPR [190] y posteriormente tratadas por 24h adicionales
66
con P2Et. Las células pretratadas con TUDCA presentaron una disminución en el
porcentaje de células Anexina V+ en respuesta al P2Et (Figura 12C-D). En consecuencia,
observamos una disminución en la escisión de caspasa 3 y 7 después del pretratamiento
con TUDCA y el tratamiento con P2Et (Figura 12E). Estos resultados confirman que la
apoptosis inducida por P2Et está parcialmente mediada por el incremento del estrés de RE.
Figura 11. El P2Et a diferencia de AG y EG aumenta la masa del RE y la expresión relativa de BiP y CHOP en células B16-F10. Las células B16-F10 fueron tratadas con los controles ETOH y Tunicamicina (5ug/ml) o con la CI50 de P2Et, AG y EG por 6 y 12h, posteriormente fueron recolectadas y marcadas con ERTracker™ (100nm). A. Histogramas representativos de la fluorescencia asociada con ER-Tracker de células tratadas con P2Et. IMF de ERtracker para cada tratamiento: B. P2Et, C. AG, D. EG. E. Niveles de expresión relativa del ARNm de BiP y CHOP respecto al vehículo ETOH. Resultados se muestran como la media ± ESM (*p<0.05).
67
Figura 12. La inducción de estrés de RE es necesaria para la muerte celular mediada por P2Et. Las células B16-F10 fueron tratadas con la CI50 de P2Et por 6, 12 y 24h A. Imágenes representativas del análisis de western blot mostrando la expresión de las proteínas de las distintas ramas de la UPR. B. Análisis densitométrico de la expresión relativa de proteínas de la UPR respecto al control de carga actina. Para la siguiente serie de experimentos se analizaron las células no tratadas (NT) o pretratadas durante 2h con TUDCA
(0.5mM), posteriormente se agregó P2Et (72.1g/ml) y se incubaron por 24h adicionales. C. Gráfico de contornos representativo del análisis por citometría de flujo de las células marcadas con Anexina/IP. D. Porcentaje de células apoptóticas. E. Western blot de caspasas 3 y 7. Los resultados son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes (*p<0.05, **p<0.01).
68
7.1.3 Inducción de apoptosis por P2Et depende de la activación de PERK
A continuación, para evaluar específicamente el papel de PERK, se usó un inhibidor de la
fosforilación de PERK conocido como GSK2606414 [191]. El pretratamiento con
GSK2606414 antes del tratamiento con P2Et llevo a la disminución de los porcentajes de
células anexina V+ (Figura 13A-B). Para confirmar el papel de PERK en la apoptosis
mediada por P2Et, se generaron células B16-F10 deficientes de Perk mediante el uso de
construcciones CRISPR/Cas9 específicas de Perk (PERK KO), simultáneamente y en las
mismas condiciones se generaron clones con una secuencia Scramble (SCR). El análisis
por western blot confirmó la pérdida de la expresión de PERK en las células PERK KO y
adicionalmente se observó que la eliminación de PERK no alteró la fosforilación de IRE-1α
después del tratamiento con tapsigargina, la cual induce depleción de calcio en el RE y la
subsecuente activación de la UPR, estos resultados mostraron que el sistema de
eliminación de PERK permitió la inhibición selectiva solo de la vía PERK de la UPR, sin
alterar IRE-1 (Figura 13C). Notablemente, la eliminación de PERK bloqueó la inducción
de apoptosis en células tratadas con P2Et en comparación con los controles. Además,
como se esperaba se detectaron niveles de apoptosis similares en células deficientes de
PERK y en las SCR tratadas con DOXO (Figura 13D-E), debido a que ha sido descrito que
este fármaco induce apoptosis de forma independiente de PERK [25].
Por otra parte, para determinar si la vía de IRE-1 también está involucrada con la muerte
mediada por P2Et inicialmente se evalúo por q-PCR la generación del splicing alternativo
de XBP-1 (sXBP-1) y, de esta forma, se observó que corriente abajo de IRE-1 se activa
XBP-1 durante el tratamiento con el extracto. Por otro lado, se mostró que esta vía no se
activó con los polifenoles AG y EG; por lo tanto, estos resultados junto con los obtenidos
durante la evaluación de ER-Tracker y los niveles de expresión de BiP y CHOP, sugieren
que estos polifenoles aislados no inducen estrés en el RE. En seguida, para evaluar si la
activación de XBP-1 observada durante el tratamiento con P2Et estaba involucrada en la
generación de apoptosis, se utilizó el sistema CRISPR/Cas9 para obtener células B16-F10
knockout para Xbp-1 (XBP-1 KO). Inicialmente, se confirmó que estas células no expresan
sXBP-1 (Figura 13F). Posteriormente, se estudió el papel de la inhibición de la vía IRE-
1/XBP-1 de la UPR en la inducción de apoptosis por P2Et. En este ensayo se observó una
69
inducción similar de apoptosis en las células XBP-1 KO y en las células SCR tratadas con
P2Et o con DOXO durante 24 horas (Figura 13G-H). Tomados en conjunto, estos resultados
indican que la apoptosis inducida por P2Et depende de la inducción de estrés de RE y
específicamente de la fosforilación de PERK.
Figura 13. La apoptosis mediada por P2Et es dependiente de PERK e independiente de XBP-1.
Células B16-F10 fueron pretratadas durante 2h con GSK2606414, posteriormente se agregó P2Et (72.1g/ml) y se incubaron por 24h adicionales. Se utilizaron células no tratadas (NT) o tratadas con el vehículo ETOH. A. Gráfico de contorno representativo del análisis por citometría de flujo de las células marcadas con Anexina V/IP. B. Porcentaje de células anexina V+ C. Imágenes representativas del análisis de western blot de células B16-F10, scramble (SCR) y PERK knockout (PERK KO) tratadas por 12h con el vehículo DMSO o con tapsigargina
70
(1M) D. Gráfico de contorno representativo del análisis por citometría de flujo de las células SCR y PERK KO tratadas con la CI50 de P2Et por 24h, con el vehículo o con DOXO (100nM) y marcadas con Anexina/IP. E. Porcentaje de células anexina V+. F. Evaluación por q-PCR de los niveles de expresión relativa del ARNm de sXBP-1 respecto al control GAPDH de células B16-F10 tratadas durante 12h con ETOH, la CI50 de P2Et, AG y
EG o con Tapsigargina (Taps, 5g/ml) G. Imágenes representativas del análisis de western blot de células B16-F10, scramble (SCR) y XBP-1 knockout (XBP-1 KO) tratadas por 12h con el vehículo DMSO o con tapsigargina
(1M). G. Gráfico de contorno representativo del análisis por citometría de flujo de las células SCR y XBP-1 KO tratadas con la CI50 de P2Et, con el vehículo o con DOXO (100nM) por 24h y marcadas con Anexina/IP. H. Porcentaje de células anexina V+. Los resultados son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
7.1.4 La apoptosis inducida por P2Et es independiente de la respuesta integrada al estrés y de la producción de ROS
PERK ha sido ampliamente asociado con la inducción de apoptosis ya que contribuye con
la generación de la ISR a través de la fosforilación de eIF2α y la posterior inducción de ATF-
4 y CHOP, este último como se mencionó previamente es uno de los principales
conductores de la apoptosis dirigida por el RE [70, 192]. Para probar si la ISR contribuye a
la apoptosis inducida por P2Et, se utilizaron los inhibidores salubrinal (Sal) e ISRIB los
cuales bloquean la desfosforilación [193] y la fosforilación [194] de eIF2α, respectivamente
(Figura 14A-E). La apoptosis inducida por P2Et no se alteró después del pretratamiento con
Sal y disminuyo solo ligeramente con ISRIB, lo que sugiere que P2Et dirige la apoptosis en
células B16-F10 de una manera independiente de ISR. Para validar estos resultados, se
transfectaron de manera estable células B16-F10 con plásmidos de eIF2α que modifican la
fosforilación de esta molécula en la serina 51. Se utilizó el plásmido que codifica para la
forma salvaje de eIF2 (eIF2-S51S), una forma resistente dominante a la fosforilación de
eIF2 (eIF2-S51A) en la que se ha mutado la serina por una alanina, o una forma
fosfomimética de eIF2 (eIF2-S51D) en la que la serina se cambia por aspartato [195]. La
modulación genética de la actividad de eIF2 no afectó el porcentaje de células apoptóticas
tratadas con P2Et (Figura 14F-G). Posteriormente, se utilizó un oligonucleótido antisentido
dirigido contra CHOP (ASO-CHOP), el cual disminuyo la expresión de CHOP de manera
significativa en células B16-F10 tratadas con tapsigargina (Figura 14H). Una vez se
confirmó la efectividad del oligonucleótido y la mejor concentración, se pretrataron las
células B16-F10 antes del tratamiento con P2Et y se encontró que la inhibición en la
expresión de CHOP no afectó la apoptosis inducida por el tratamiento con P2Et (Figura 14I-
71
J). Estos hallazgos sugieren que la inducción de ISR juega poco o ningún papel en la
mediación de los efectos de P2Et y que una vía alternativa mediada por PERK es necesaria
para la inducción de la apoptosis en estas células de melanoma.
Figura 14. La inhibición de la respuesta integrada al estrés no afecta la actividad del P2Et. Las células B16-F10 fueron pretratadas durante 2h con Salubrinal (Sal) o con el inhibidor de la ISR (ISRIB),
posteriormente se agregó P2Et (72.1g/ml) y se incubaron por 24h adicionales. Como controles se usaron
72
células no tratadas (NT) o tratadas con el vehículo ETOH (control). A. Imágenes representativas del análisis de
western blot de células B16-F10, tratadas por 12h con Sal (10, 25, 50 y 75M). B. Gráfico de contorno representativo de las células pretratadas con Sal marcadas con Anexina/IP. C. Porcentaje de células anexina V+ D. Gráfico de contorno representativo del análisis por citometría de flujo de las células pretratadas con ISRIB
(1, 2 y 5M), tratadas con P2Et por 24h y marcadas con Anexina V/IP. E. Porcentaje de células anexina V+ F. Gráfico de contorno representativo del análisis por FACS de las células transfectadas establemente con
plásmidos codificantes para eIF2-S51S (S/S), eIF2-S51A (S/A) y eIF2-S51D (S/D) tratadas con la CI50 de P2Et o con el vehículo por 24h y marcadas con Anexina V/IP. G. Porcentaje de células anexina V+. Posteriormente, las células B16-F10 pretratadas por 2h con un oligonucleótido antisentido dirigido contra CHOP (ASO-CHOP) o con el oligonucleótido antisentido control (Mock) y posteriormente tratadas con tapsigargina
(1M) por 12h o con P2Et CI50 por 24h H. Evaluación por q-PCR de los niveles de expresión relativa del ARNm
de CHOP en células tratadas con taps (5, 10 y 20M) o con el vehículo (0M) respecto al control -actina. I. Gráfico de contorno representativo de las células marcadas con AnexinaV/IP, las cuales fueron tratadas con
20M de los oligonucleótidos antisentido y con P2Et J. Porcentaje de células anexina V+. Los resultados son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes excepto para ASO-CHOP donde se realizaron solo 2 experimentos independientes (**p<0.01, ***p<0.001).
Polifenoles como la curcumina o el resveratrol entre otros inducen muerte celular por
apoptosis a través de una acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y eso tiene
como consecuencia la inducción de estrés en el RE y activación de la UPR [158, 188]. Por
lo tanto, se evaluó si la apoptosis mediada por P2Et en las células B16-F10 podría ser una
consecuencia de la acumulación de ROS. Inesperadamente, el tratamiento de las células
B16-F10 con P2Et no alteró los niveles de ROS en las células B16-F10 de acuerdo a la IMF
de la sonda CellROX (Figura 15A-B); en consecuencia, cuando se pretrataron las células
con tres antioxidantes diferentes MitoTEMPO, sulforafano y NAC antes de la exposición a
P2Et no hubo cambios en los porcentajes de apoptosis (Figura 15C-D). Estos resultados
sugieren que el mecanismo de acción de P2Et es independiente de la regulación de los
niveles de ROS.
73
Figura 15. El tratamiento con P2Et en las células B16-F10 no modula la producción de ROS como mecanismo de inducción de apoptosis.
Las células B16-F10 fueron tratadas con P2Et (72.1g/ml) o con el vehículo ETOH (control) por 6, 12 o 24h. Se utilizó como control positivo Phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) A. Histogramas representativos de las células marcadas con CellROX (100nM) B. Porcentaje del cambio de la IMF sobre el control (100%). C. Gráfico de contorno representativo del análisis por citometría de flujo de las células pretratadas por 2h con MitoTEMPO
(2mM), sulforafano (2mM) o N-acetyl-cysteine-NAC (2.5mM), tratadas con P2Et por 24h adicionales y marcadas
con Anexina V/IP. E. Porcentaje de células anexina V+. Los resultados son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes (***p<0.001).
7.1.5 P2Et induce disfunción mitocondrial y apoptosis a través del incremento de
los niveles citoplasmáticos de Ca+2 vía PERK.
Estudios recientes muestran que PERK juega un papel muy importante en la formación de
MAMs y de esta manera regula el flujo de Ca+2 entre el RE y las mitocondrias, lo cual
contribuye con el mantenimiento de la homeostasis celular y de diferentes funciones
metabólicas [88, 196]. Teniendo en cuenta esto, se evalúo el papel del Ca+2 en la inducción
de la apoptosis por P2Et; para ello se utilizó BAPTA, un quelante de Ca+2, previo a la
exposición con P2Et. En las células pretratadas con BAPTA se observó una disminución de
la apoptosis de forma dosis dependiente (Figura 16A-B). Para confirmar que el P2Et
alteraba los niveles de Ca+2 a través de la inducción de estrés de RE y específicamente vía
74
PERK se evaluaron los niveles de calcio citoplasmático utilizando las sondas Fluo-3 y Fluo-
4 AM. Inicialmente se marcaron con Fluo-3 AM las células tratadas con P2Et y pretratadas
con TUDCA o GSK2606414. Las células tratadas con P2Et presentaron niveles de Ca+2
citoplasmático elevados con respecto a las células tratadas con el vehículo. Adicionalmente,
los niveles de Ca+2 inducidos por P2Et fueron similares a los niveles presentados con el
control cuando se usaron los dos inhibidores de estrés de RE (Figura 16C-D), sugiriendo
que la fosforilación de PERK aumenta los niveles de Ca+2 en el citoplasma. Estos resultados
fueron consistentes cuando se usaron las células SCR y PERK KO marcadas con Fluo-4
AM, donde se encontró que la eliminación de PERK inhibe la alteración de los niveles de
Ca+2 mediada por P2Et (Figura 16E-F).
Por otra parte, ha sido descrito que la liberación masiva de Ca+2 puede inducir disfunción
mitocondrial durante condiciones de estrés de RE sostenido [196]. Por lo tanto, la siguiente
serie de experimentos tuvo como objetivo determinar el papel de PERK y de Ca+2 en la
disfunción mitocondrial mediada por P2Et. Los experimentos iniciales permitieron confirmar
que el P2Et altera la homeostasis mitocondrial en células B16-F10, como lo mostró el
aumento de ROS a nivel mitocondrial evaluadas con MitoSOX y la disminución de la masa
mitocondrial evaluada con MitoTracker (Figura 17A-B). Adicionalmente se observó una
reducción del potencial de membrana mitocondrial en células B16-F10 tratadas con P2Et.
De forma interesante, la inhibición de PERK con GSK2606414 en células B16-F10 o el
knockout de PERK (PERK KO) previene la disfunción mitocondrial inducida por P2Et,
mientras que la Valinomicina usada como control positivo alteró la membrana mitocondrial
en ambas células PERK KO y SCR, ya que su acción es directa sobre la mitocondria (Figura
17C-E). Además, a través del análisis por Seahorse se detectó una disminución
mitocondrial en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) después del tratamiento con P2Et,
que se normalizó en las células PERK KO (Figura 17F). Por otra parte, el pretratamiento
con BAPTA de las células expuestas a P2Et redujo el porcentaje de células con pérdida del
potencial de membrana (Figura 17G-H), esos resultados apoyan la hipótesis del papel
principal de la acumulación de Ca+2 mitocondrial mediada por P2Et en la mediación de la
apoptosis inducida por el tratamiento en células B16-F10. En conjunto, nuestros resultados
sugieren que la activación de PERK inducida por P2Et impulsa la liberación de Ca+2 desde
el RE, esto lleva a disfunción mitocondrial y, finalmente, a la inducción de la apoptosis.
75
En resumen, estos resultados muestran que P2Et induce estrés de RE, alterando los niveles
de Ca+2 intracelular a través de la fosforilación de PERK y esto lleva a la disfunción
mitocondrial, a la inducción de apoptosis y la consecuente activación de caspasas con
liberación de citocromo c que había sido ya mostrado en trabajos previos [14].
Figura 16. P2Et incremento de los niveles citoplasmáticos de Ca+2 vía PERK para la inducción de apoptosis.
Las células B16-F10 fueron pretratadas durante 2h con BAPTA (5, 10 y 25M), posteriormente se agregó P2Et
(72.1g/ml) y se incubaron por 24h adicionales. Las células recolectadas en el momento de poner el tratamiento corresponden al tiempo cero (T0) o tratadas con el vehículo ETOH (control). A. Gráfico de contorno representativo de las células pretratadas con BAPTA marcadas con Anexina V/IP. C. Porcentaje de células anexina V+. Posteriormente las células B16-F10 fueron pretratadas durante 2h con GSK2606414 o con TUDCA,
76
y luego se trataron con la CI50 de P2Et y se incubaron por 24h adicionales D. Histogramas representativos de
las células marcadas con Fluo-3 AM (150M) E. Intensidad media de fluorescencia (IMF) en unidades arbitrarias (u.a.). F. Células SCR y PERK KO tratadas por 24h con P2Et CI50. Se muestran histogramas representativos
de las células marcadas con Fluo-4 AM (150M). G. Porcentaje del cambio de la IMF sobre el control (100%). Los resultados son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes (*p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001).
Figura 17. P2Et induce disfunción mitocondrial dependiente de Ca+2 y PERK.
Las células B16-F10 fueron tratadas con P2Et (72.1g/ml) o con el vehículo ETOH (control) por 24h. A. Histograma representativo de las células marcadas con MitoSOX (100mM) y porcentaje del cambio de la IMF sobre el control (considerado como 100%). B. Histograma representativo de las células marcadas con
77
MitoTracker (100mM) y porcentaje del cambio de la IMF sobre el control (considerado como 100%). Evaluación del potencial de membrana mitocondrial: C. Las células B16-F10 fueron pretratadas durante 2h con
GSK2606414 (5M) y entonces tratadas por 24h adicionales con el vehículo (control) o P2Et CI50. Se muestran histogramas representativos de las células marcadas con DioC2(3) (100mM) D. Porcentaje de células
DioC2(3)low; para determinar esta población se realizó la ventana de análisis sobre las células tratadas con 1M de carbonilcianuro-m-clorofenilhidrazona (CCCP) 5min antes de la evaluación por citometría. E. Las células
SCR y PERK KO fueron tratadas por 24h con P2Et CI50 y marcadas con JC-1 (0.5g/ml). Se muestra el porcentaje de agregados de JC-1 que representan las células con pérdida del potencial de membrana mitocondrial. F. Tasa de consumo de oxígeno (OCR, del inglés oxygen consumption rate) de las células SCR y PERK KO tratadas con P2Et CI50 o vehículo durante 12 h. G. Las células B16-F10 se trataron previamente con
BAPTA (10M) durante 2h y luego se trataron con P2Et IC50 o vehículo durante 24h adicionales y fueron marcadas con DioC2(3), se muestran histogramas representativos. H. Porcentaje de células DioC2(3)low,
determinadas sobre la ventana de análisis de células tratadas con 1M CCCP. Los resultados son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001****, p<0.0001).
7.2 Papel de la autofagia en la muerte celular mediada por el extracto P2Et y los polifenoles ácido gálico y etil galato.
Al igual que el estrés de retículo la autofagia ha sido descrita ampliamente en cáncer como
un mecanismo protector de las células tumorales en respuesta al estrés generado por
diferentes tratamientos incluidos algunos productos naturales [37, 60]. Sin embargo, en
otros casos se ha descrito que la autofagia también puede tener un efecto citotóxico, por
ejemplo, la autofagia en células de carcinoma oral tratadas con resveratrol ha sido asociada
con una mayor citotoxicidad [197]. Para determinar si la autofagia está involucrada con la
inducción de muerte celular o la protección de las células tratadas con P2Et y sus
polifenoles asociados se realizaron la siguiente serie de experimentos.
7.2.1 El P2Et y el EG inducen autofagia con flujo autofágico completo, mientras que el AG bloquea el flujo autofágico.
En primer lugar, se determinó si P2Et, AG y EG inducían autofagia, para estos experimentos
se usó como control positivo la terfenadina, una droga anfifílica catiónica la cual es capaz
de inducir apoptosis a través de la generación de autofagia en células de melanoma [198].
En todos los tratamientos se observó un aumento significativo en el número de puntos de
LC3, los cuales representan la formación de autofagosomas, con lo cual pudimos
determinar que el P2Et, el AG y el EG inducen autofagia (Figura 18A-B). En seguida, se
realizó una caracterización de la autofagia inducida, estudiando si esta era acompañada o
78
no con un flujo autofágico completo. Por lo tanto, se realizó la transfección de las células
B16-F10 con el plásmido tfLC3 para diferenciar entre la formación de autofagosomas y
autolisosomas; donde un exceso de autofagolisosomas respecto a los autofagosomas
refleja un flujo autofágico completo, mientras que un exceso o un número equivalente de
autofagosomas respecto a los autofagolisosomas, es un indicativo de un bloqueo en el flujo
autofágico completo. Interesantemente, el análisis del número de puntos de LC3 permitió
evidenciar que P2Et y EG inducen autofagia con un flujo autofágico completo, por el
contrario, el AG tiene un mecanismo más parecido a la terfenadina, donde ambos bloquean
el flujo autofágico (Figura 18C-D). En los análisis de western blot también se evidenció un
incremento de la proteína beclina-1 la cual se activa durante la autofagia y adicionalmente
se observó la acumulación de la proteína p62 en las células B16-F10 tratadas con AG y
terfenadina lo cual confirma el bloqueo del flujo autofágico (Figura 18E). Se ha mostrado
que la terfenadina puede actuar sobre células de melanoma a través de la liberación de
Ca+2 del RE, y la alteración de la permeabilidad de la membrana lisosomal (LMP, del inglés
lisosomal membrane permeabilization), induciendo un tipo de muerte celular conocida como
muerte lisosomal. Se postula que los lisosomas de las células tumorales son más frágiles
que los de las células normales, y por lo tanto, se ha propuesto que pueden ser blanco de
terapéuticos dirigidos a ellos como las drogas catiónicas anfifílica [199]. Por lo tanto, acá se
quiso evaluar si el P2Et o alguno de los polifenoles asociados podía inducir esta respuesta
de estrés lisosomal. Para ello se usó una técnica recientemente descrita que aprovecha el
hecho que la galectina, una proteína que habitualmente se encuentra en el citoplasma,
durante la inducción de LMP se acumula en los lisosomas dañados [200]. De esta forma se
cuentan por inmunofluorescencia los puntos de galectina positiva, que corresponden a los
lisosomas dañados. Usando este ensayo, se encontró que, a diferencia de la terfenadina,
el P2Et y los polifenoles EG y AG no inducen alteraciones en los lisosomas de las células
B16-F10. De igual forma, se sugiere que el bloqueo del flujo autofágico en células tratadas
con AG es mediado por un mecanismo diferente al daño lisosomal, como si parece ocurrir
con la terfenadina (Figura 18F-G)
79
Figura 18. P2Et y EG inducen autofagia con flujo autofágico completo. A. Células B16-F10 fueron cultivadas en láminas de vidrio pretratadas con fibronectina, posteriormente las
células fueron tratadas con P2Et, AG, EG o con los controles: ETOH (Negativo, control) o Terfenadine 5M
80
(TERF, positivo) por 12h. En seguida, las células se marcaron con un anticuerpo primario dirigido contra LC3 I/II, un anticuerpo secundario conjugado con Alexa-Fluor 488 (verde) y DAPI (azul). B. Puntos de LC3 por célula contados en 25 células por cada experimento independiente (n= 3). Los resultados son expresados como la media ± ESM (****p<0.0001) C. Células B16-F10 fueron transfectadas con el plásmido tfLC3 utilizando Lipofectamina® 2000 y posteriormente cultivadas en láminas de vidrio pretratadas con fibronectina, las células fueron tratadas con P2Et, AG, EG, TERF o el control (ETOH). D. Puntos de LC3 por célula contados en 10 células de 3 experimentos independientes. AF (autofagosomas observados de color amarillo) y AL (autolisosomas observados de color rojo). Se cálculo el número de AL menos AF para determinar si el flujo autofágico es completo. Los resultados son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes: comparación AL de tratamientos frente ***p<0.001****, p<0.0001; comparación AF de tratamientos frente al control $p<0.05, $$$$p<0.0001; comparación AF-AL de tratamientos frente al control # ##
p<0.001. E. Se muestra imagen del análisis de western blot de las proteínas de autofagia beclina-1 y p62 en células B16-F10 tratadas por 12h con P2Et, AG, EG, TERF o el control (ETOH), como control de carga de utilizó
-tubulina. F. Células B16-F10 fueron cultivadas en láminas de vidrio pretratadas con fibronectina, posteriormente las células fueron tratadas con P2Et, AG, EG, TERF o con ETOH (control) por 12h, posteriormente fueron marcadas con un anticuerpo primario dirigido contra galectina-1, el anticuerpo secundario Alexa-Fluor 647 (rojo) y DAPI (azul). G. Puntos de galectina-1 por célula contados en 10 células por cada experimento independiente (n=3). Los resultados son expresados como la media ± ESM (**p<0.01). Todas las imágenes 640x640 de resolución se adquirieron con el microscopio confocal Olympus FV1000 con un objetivo
de aceite 60 × PlanAPO. La barra blanca corresponde a 10m
7.2.2 La inhibición del flujo autofágico con cloroquina aumenta la muerte celular mediada por P2Et, AG y EG.
Para determinar cuál es el papel funcional de la autofagia en procesos de homeostasis o
muerte frente a la terapia se recomienda utilizar ensayos con bloqueadores farmacológicos,
acompañado de ensayos donde usando estrategias de modificación genética se inhiba o
elimine la expresión de genes involucrados en la autofagia [201]. Por lo tanto, acá
inicialmente se analizó el efecto del bloqueo con cloroquina (CQ) sobre la inducción de
apoptosis mediada por P2Et y los polifenoles EG y AG, y posteriormente utilizando el
sistema CRISPR/Cas9 se generaron clones de células B16-F10 que carecen del gen
beclina-1 y se trataron con el extracto P2Et, AG y EG para determinar el impacto sobre la
apoptosis.
Las células B16-F10 se pretrataron con CQ, que inhibe la fusión entre el autofagosoma y el
lisosoma [202], y posteriormente se trataron las células con P2Et, AG, EG y terfenadina. La
inhibición de la autofagia utilizando CQ, incremento la muerte celular aproximadamente en
20% en todos los tratamientos (Figura 19). Sin embargo, se debe tener en cuenta que la
CQ por si sola puede contribuir con el incremento de la autofagia, la acumulación de los
autofagosomas y el aumento de la citotoxicidad en células tumorales [202, 203].
81
Figura 19. La inhibición del flujo autofágico con cloroquina aumenta la muerte celular en células B16-F10 tratadas con P2Et, AG y EG.
Las células B16-F10 fueron pretratadas durante 2h con CQ (5, 10 y 25M), posteriormente se agregó P2Et, AG y EG a la CI50 o se trataron con el vehículo ETOH (control) y se incubaron por 24h adicionales. A. Gráfico de contorno representativo de las células pretratadas con CQ y marcadas con Anexina V/IP. B. Porcentaje de células anexina V+. C. Se muestra imagen del análisis de western blot de las proteínas de autofagia p62, LC3 I/II y beclina-1 en células B16-F10 tratadas por 12h con P2Et, AG, EG o el control (ETOH), como control de
carga de utilizó -tubulina. Los resultados son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes (*p<0.05).
7.2.3 En células B16F10 (knock-out para beclina-1) se observa un aumento en la
muerte celular mediada por P2Et y una disminución por AG.
Teniendo en cuenta los resultados con CQ y para confirmar que la autofagia mediada por
P2Et y por los polifenoles realmente protege a las células de la muerte, se utilizó el sistema
CRISPR/Cas9 en las células B16-F10 con el cual se generó el knock-out de la proteína
beclina-1, la cual se encuentra en el complejo de iniciación de la autofagia y está
82
relacionada con la lipidación de LC3; es por esto, que en células que no expresan beclina-
1 se ha observado una disminución en la autofagia y en el tamaño de los autofagosomas,
además de una pérdida de la función de los mismos [204]. A través del análisis de western
blot de las proteínas beclina-1 y LC3 se evalúo si el clon seleccionado como se indica en la
metodología no expresaba beclina-1 y además presentaba defectos en la inducción de
autofagia. Para ello se trataron las células SCR y beclina-1 knock-out (KO) con metformina
(la cual induce autofagia dependiente de beclina-1), P2Et y con oleato, el cual ha sido
descrito que induce autofagia en células con expresión de beclina-1 reducida, por lo cual
se considera que es un inductor de autofagia independiente de beclina-1 [205]. En el
análisis de western blot se confirmó que las células no expresaban beclina-1, y se observó
un incremento en LC3 II en las células SCR y beclina-1 KO tratadas con oleato. Por el
contrario, solo hubo un aumento en LC3 II en las células SCR tratadas con metformina, lo
cual confirma que no hay inducción de autofagia dependiente de beclina-1 en el clon
seleccionado y además sugiere que las otras proteínas relacionadas con la maquinaria de
autofagia se conservan, dada la inducción de autofagia en las células beclina-1 KO tratadas
con oleato. Adicionalmente, estos resultados preliminares fueron confirmados por
microscopia confocal utilizando monodansilcadaverina (MDC) (Figura 20A-C). Estos
ensayos permitieron mostrar que el P2Et al igual que la metformina induce una autofagia
dependiente de beclina-1. De forma interesante, en las células tratadas con P2Et se
observó una disminución en el número de células MDC positivas y en el tamaño de las
vacuolas marcadas con MDC en las células beclina-1 KO en comparación con las SCR
(Figura 20B-D). De igual forma, se encontró que el P2Et y los polifenoles inducen autofagia
dependiente de beclina-1, ya que se disminuyeron los puntos de LC3 en las células beclina-
1 KO. De forma interesante, se observó que en las células beclina-1 KO se mantuvo la
inducción de autofagia mediada por TERF, mostrando que el mecanismo de la TERF es
independiente de beclina-1 (Figura 21A-B). Cabe resaltar, que las células deficientes en
beclina-1 presentaron un patrón diferencial en la expresión de la proteína LC3, donde se
observan unos puntos fluorescentes vacíos, a diferencia de los puntos bien definidos,
rellenos y de menor tamaño que se presentan en las células SCR. Este patrón diferencial
en las células beclina-1 KO se asocian con la agregación de la proteína LC3 en estructuras
denominadas agregosomas, pero no constituyen por sí solos la asociación a
83
autofagosomas [206]. Por lo tanto, para los análisis únicamente se tuvieron en cuenta los
puntos que no presentan características de agregosomas.
Una vez confirmada la inhibición de la autofagia en las células tratadas con P2Et y los
polifenoles, se evalúo el papel de la autofagia en la inducción de apoptosis con el marcaje
de Anexina V/IP. Se observó que las células beclina-1 KO tratadas con P2Et y EG se
murieron más, similar a lo que se observó en el tratamiento con CQ, sugiriendo que para
estos dos tratamientos la autofagia protege parcialmente de la muerte celular. Por el
contrario, con AG se observó una disminución en la inducción de apoptosis cuando la
autofagia es inhibida en las primeras fases (células beclina-1 KO), lo cual sugiere que el
mecanismo de muerte mediado por AG es la inducción de autofagia y el posterior bloqueo
del flujo autofágico, generando citotoxicidad por acumulación de autofagosomas (Figura
21C-D). Para confirmar que la autofagia era citotóxica o protectora algunos autores han
descrito que el mejor método es el ensayo de clonogenicidad, que permite observar el
efecto real a largo plazo [108]. Con este ensayo se confirmó que la autofagia protege a las
células tratadas con P2Et de la muerte y ayuda a la citotoxicidad en células tratadas con
AG en las cuales se observaron más colonias en las células beclina-1 KO que en las células
SCR tratada con el vehículo. En el caso del EG no se pudo confirmar una disminución
significativa de las colonias solo se observó una ligera disminución a largo plazo. De forma
interesante, las células SCR tratadas con P2Et tienen menor número de colonias que las
tratadas con los polifenoles aislados, lo cual sugiere que el efecto citotóxico del P2Et a largo
plazo es mejor (Figura 21E-F).
84
Figura 20. La inducción de autofagia fue inhibida en células B16-F10 utilizando el sistema CRISPR/Cas9. Las células B16-F10 fueron transfectadas con el sistema CRISPR/Cas9, los clones seleccionados SCR y
beclina-1 KO fueron tratadas por 12h con el extracto P2Et, metformina 50M (METF), oleato (100nM) y los vehículos (ETOH y DMSO) A. Se muestra imagen del análisis de western blot de las proteínas de autofagia
p62, LC3 I/II y beclina-1 en células SCR y beclina-1 KO, como control de carga de utilizó -tubulina. Las líneas punteadas representan los cortes hechos al gel. B. Imágenes representativas de las células marcadas con faloidina (rojo) y con MDC (verde), Las imágenes se adquirieron con el microscopio confocal Olympus FV1000 con un objetivo de aceite 60 × PlanAPO. Se muestran imágenes representativas de tres experimentos
independientes. La barra blanca corresponde a 10m.C. Se muestra el porcentaje de células MDC positivas por campo de 6 campos microscópicos por tratamiento y 3 experimentos independientes. Los resultados son expresados como la media ± ESM (*p<0.05, ***p<0.001). D. Zoom tomado de la figura B, imágenes adquiridas de las células tratadas con P2Et. Las flechas amarillas señalan las vacuolas ácidas que representan autolisosomas marcados con MDC.
85
Figura 21. La autofagia inducida por P2Et y EG es protectora y es dependiente de Beclina-1. A. Las células SCR y Beclina-1 KO fueron cultivadas en láminas de vidrio pretratadas con fibronectina, posteriormente las células fueron tratadas con P2Et, AG, EG o con los controles: ETOH (control) o Terfenadine
5M (TERF, positivo) por 12h. En seguida, fueron marcadas con un anticuerpo primario dirigido contra LC3 I/II, el anticuerpo secundario conjugado Alexa-Fluor 488 (verde) y DAPI (azul). B. Puntos de LC3 por célula contados en 15 células por cada experimento independiente (n=3). Los resultados son expresados como la media ± ESM (****p<0.0001). Las imágenes se adquirieron con el microscopio confocal Olympus FV1000 con un objetivo de aceite 60 × PlanAPO. Se muestran imágenes representativas de tres experimentos independientes. Las flechas amarillas señalan lo que parecen ser agregosomas. C. Gráfico de contorno representativo de las células SCR y Beclina-1 KO fueron tratadas con P2Et, AG y EG a la CI50 o con el vehículo ETOH (control) y se incubaron por 48h y marcadas con Anexina/IP. D. Porcentaje de células anexina V+. E. Imágenes representativas del ensayo de clonogenicidad para el cual las células fueron tratadas con la CI50 de P2Et, AG, EG o con el control por 12h y luego cultivadas en agar por 14 días. F. Porcentaje de colonias para cada tratamiento sobre el control (100%). Los resultados son expresados como la media ± ESM para 3 experimentos independientes (*p<0.05, **p<0.01). El análisis de la comparación de células tratadas con ETOH (control) del SCR frente a los tratamientos $$p<0.01, $$$$p<0.0001; comparación de células tratadas con ETOH (control) de las células beclina-1 KO frente a los tratamientos ##p<0.01, ###p<0.001, ####p<0.0001.
86
7.3 Participación del estrés en el RE y la autofagia en la generación de señales inmunogénicas en células B16-F10 tratadas con el extracto P2Et y los polifenoles asociados
Como fue descrito previamente, los trabajos de nuestro grupo de investigación han
mostrado que el P2Et induce apoptosis acompañada de señales de peligro en modelos de
cáncer de seno y melanoma. Adicionalmente, se comprobó que la disminución en el
volumen tumoral depende de la presencia de una adecuada respuesta inmune [14, 15].
Debido a la importancia de la inducción de estrés de RE y autofagia en el proceso de
generación de señales inmunogénicas, y teniendo en cuenta los resultados previamente
descritos en la tesis en los cuales se observó que estos mecanismos están involucrados en
la muerte celular mediada por P2Et, AG y EG, el propósito del siguiente grupo de
experimentos fue determinar el rol de cada uno de estos mecanismos en la generación de
señales inmunogénicas.
7.3.1 Los polifenoles AG y EG tienen menor potencial inmunogénico que el extracto complejo P2Et
En nuestro trabajo previo demostramos que las células B16-F10 tratadas con P2Et
aumentan la expresión de las tres principales señales de peligro asociadas con MCI (Ecto-
CRT, ATP y HMGB1) [14]. Para determinar si los polifenoles asociados al P2Et contribuyen
con la generación de MCI se evalúo la inducción de Ecto-CRT, y la liberación de ATP y
HMGB-1 en células tratadas con P2Et, AG y EG; para estos experimentos se utilizaron
como controles dos inductores clásicos de MCI, DOXO y mitoxantrona (MTX). La Ecto-CRT
se presenta de forma temprana durante la apoptosis [131]. Como se puede observar en la
figura 22 y confirmando nuestros resultados previos, hay una mayor IMF en las células
después del tratamiento con el extracto P2Et, lo cual representa una mayor expresión de
CRT en la membrana de las células B16-F10 en comparación con el vehículo, de forma
similar a lo que se observa con la DOXO (figura 22A-B). Otra de las proteínas que ha sido
considerada importante en la MCI es la HMGB1. La liberación de la proteína HMGB1 en un
estado tardío del proceso apoptótico, favorece la activación de células dendríticas por ello
la evaluación de este marcador se hizo después de las 48h de tratamiento. La liberación de
la proteína HMGB1 se asocia con un incremento en la deslocalización de la proteína del
núcleo determinado por microscopia confocal [207]. Se observó que el tratamiento de las
87
células B16-F10 con P2Et genera una pérdida de la colocalización de HMGB-1 con el
núcleo, lo cual fue evidenciado con una disminución en el coeficiente de correlación de
Pearson en las células B16-F10 tratadas con el extracto (Figura 22C-D).
Finalmente se realizó la evaluación de la liberación de ATP, otra molécula involucrada con
la activación de la respuesta inmune. Para ello, se marcaron las células con quinacrina, la
cual es un compuesto fluorescente afín por el ATP. Se determinó el porcentaje de células
con menor fluorescencia asociada a la quinacrina, lo cual es directamente proporcional a
las células que han liberado ATP [26]. En las células tratadas con P2Et se observó un
incremento del 25% aproximadamente en el porcentaje de células con disminución en la
IMF de quinacrina con respecto a las células control, este incremento fue similar al control
MTX. Por lo tanto, tomando en conjunto estos resultados muestran que tal como habíamos
reportado previamente el P2Et induce la producción de los DAMPs asociados con MCI:
Ecto-CRT y liberación de HMGB1 y ATP [14].
Por otro lado, contrario a los resultados obtenidos con P2Et se puede observar en la figura
22 que el tratamiento con AG no induce ninguna de las 3 señales de MCI evaluadas; esto
podría explicarse por el mecanismo de muerte inducido con AG, el cual es independiente
de estrés en el RE y dependiente de la autofagia. Por otra parte, el EG induce las tres
señales de MCI, sin embargo, la Ecto-CRT y la liberación de HMGB-1 es menor cuando se
compara con el P2Et, probablemente debido que no induce estrés de RE e una forma
estadísticamente significativa e induce menor grado de apoptosis en comparación con el
extracto. Este conjunto de resultados permite sugerir que el P2Et, un extracto complejo, es
más eficiente en cuanto a la inducción de MCI, en comparación con los polifenoles aislados
AG y EG.
88
Figura 22. La inducción de señales de muerte inmunogénica es menor en las células tratadas con AG y EG en comparación con P2Et. A. Histogramas representativos del análisis por citometría de flujo, de las células B16-F10 tratadas con la CI50 de P2Et, AG, EG, DOXO o el vehículo durante 12 h. La Ecto-CRT se detectó con un anticuerpo primario anti-CRT y un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488. La evaluación de la IMF se determinó mediante citometría de flujo sobre las células vivas (Aqua negativas). B. Se muestra el porcentaje de cambio de la IMF de las células tratadas en relación con el vehículo (100%) expresado como la media ± SEM de 4 experimentos independientes. C. Las células B16-F10 tratadas con la CI50 de P2Et, AG, EG, DOXO o el vehículo por 48h. El anticuerpo primario anti-HMGB1 se detectó utilizando un anticuerpo secundario de conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (verde) y DAPI (azul) para los núcleos. Las imágenes 640x640 de resolución se adquirieron
89
con el microscopio confocal Olympus FV1000 con un objetivo de aceite 60 × PlanAPO. Se muestran imágenes representativas de tres experimentos independientes, en los cuadros rojos pequeños se muestra la misma
imagen solo en el canal de HMGB-1. La barra blanca corresponde a 5m. D. Gráfico de dispersión de los coeficientes de correlación de Pearson, se evaluaron 45 células de cada tratamiento en tres experimentos independientes, se muestran los resultados de un experimento representativo expresado como media ± S.E.M. E. Grafica de contorno representativo de las células B16-F10 tratadas con la CI50 de P2Et, AG, EG, de MTX (0,5μg/ml) o con el vehículo durante 48h. Las células fueron marcadas con quinacrina (1µM) y PI. Se determinaron el porcentaje de quinacrinalow sobre las células PI negativas. F. Porcentaje de células quinacrinalow se expresa como media ± SEM de tres experimentos independientes. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001, **** P <0.0001
7.3.2 El knock-out de PERK inhibe la generación de señales de peligro en células
B16-F10 tratadas con P2Et
La evaluación de los mecanismos de Ecto-CRT con diferentes inductores de MCI se ha
podido determinar que esto ocurre como consecuencia del estrés de RE a través de la vía
PERK [24, 25]. Adicionalmente, los trabajos con Hyp-PDT han mostrado que en este tipo
de tratamiento PERK también modula la liberación de ATP, a través de la activación de vías
de secreción [25]. Por lo tanto, teniendo en cuenta estos antecedentes se evalúo el papel
de PERK en la generación de señales de peligro en células tratadas con P2Et. Teniendo
en cuenta que el AG no induce señales de peligro, y adicionalmente, que ni el AG ni el EG
inducen estrés de RE los siguientes experimentos se realizaron principalmente con P2Et.
Para la evaluación de Ecto-CRT las células SCR y PERK KO fueron tratadas con el
vehículo, P2Et, EG o el control de MCI (DOXO). Los resultados en las células SCR fueron
comparables a los obtenidos en las células salvajes tratadas con P2Et, EG o DOXO,
observándose un aumento de Ecto-CRT en todos los tratamientos, en comparación con las
células tratadas con el vehículo. Como se esperaba, Ecto-CRT disminuyó en las células
PERK KO tratadas con P2Et, EG y DOXO (Figura 23A-B), lo que demuestra el papel de
PERK en la expresión de Ecto-CRT. Interesantemente, la ausencia de PERK disminuyó la
deslocalización nuclear de HMGB1 (reflejado por un aumento en el coeficiente de Pearson)
en las células tratadas con P2Et; esto no había sido previamente descrito con ninguno de
los inductores de muerte inmunogénica, y vimos que no hubo diferencias en las células
tratadas con DOXO sugiriendo que el P2Et podría inducir una vía diferente de MCI (Figura
23C-D). Por otra parte, similar a lo observado con la terapia con Hyp-PDT, la inhibición de
PERK disminuyó el porcentaje de células con bajo contenido de quinacrina después del
tratamiento con el extracto P2Et, sugiriendo que PERK es necesario para la liberación de
90
ATP (Figura 23E-F). Adicionalmente, como había sido descrito previamente no se
observaron diferencias en las células tratadas con MTX, ya que la liberación de ATP
mediada por antraciclinas está más asociada a la inducción de autofagia que al estrés de
RE [5, 26]. Estos resultados sugieren que P2Et induce la expresión de las 3 principales
señales de peligro asociadas a MCI: Ecto-CRT, y la liberación de ATP y HMGB1 de una
manera dependiente de PERK.
91
Figura 23. PERK es necesario para la generación de las 3 principales señales de peligro inducidas en el tratamiento con P2Et. A. Histogramas representativos del análisis por citometría de flujo, de los clones SCR o PERK KO tratados con la CI50 de P2Et, EG, DOXO o el vehículo durante 12 h. La Ecto-CRT se detectó con un anticuerpo primario anti-CRT y un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488. La evaluación de la IMF se determinó mediante citometría de flujo sobre las células vivas (Aqua negativas). B. Se muestra el porcentaje de cambio la IMF de las células tratadas en relación con el vehículo (100%) expresado como la media ± SEM de 3 experimentos independientes. C. Los clones SCR o PERK KO se cultivaron en láminas y se trataron con la CI50 de P2Et, DOXO y el vehículo por 48h. El anticuerpo primario anti-HMGB1 se detectó utilizando un anticuerpo secundario de conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (verde) y DAPI (azul) para los núcleos. Las imágenes se adquirieron con el microscopio confocal Olympus FV1000 con un objetivo de aceite 60 × PlanAPO. Se muestran
imágenes representativas de tres experimentos independientes. La barra blanca corresponde a 10m. D.
92
Gráfico de dispersión de los coeficientes de correlación de Pearson, se evaluaron 45 células de cada tratamiento en tres experimentos independientes, se muestran los resultados de un experimento representativo expresado como media ± S.E.M. E. Dot plot representativo de los clones SCR o PERK KO tratados con la CI50 de P2Et, 0,5μg/ml de MTX o con el vehículo durante 48h. Las células fueron marcadas con quinacrina (1µM) y PI. Se determinaron quinacrinalow sobre las células PI negativas. F. Porcentaje de células quinacrinalow se expresa como media ± SEM de tres experimentos independientes. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001, **** P <0.0001
7.3.3 La autofagia es necesaria para la liberación de ATP en células B16-F10 tratadas con EG y P2Et
Previamente ha sido descrito que la autofagia está relacionada con la liberación de CRT y
ATP [25, 26]. Teniendo en cuenta esto y que además la autofagia es inducida por P2Et y
por sus polifenoles asociados AG y EG, se evalúo el papel de la autofagia en la generación
de señales de MCI. En la figura 24 se puede observar el análisis de los resultados con AG,
con el cual no se observó inducción de señales de MCI a pesar de la inhibición de la
autofagia. La evaluación de Ecto-CRT en los clones beclina-1 KO sugiere que la autofagia
participa de forma parcial en la exposición de CRT mediada por P2Et y EG, ya que se
observó una disminución parcial de Ecto-CRT en estas células (Figura 24A-B). Como se
esperaba, la liberación de HMGB-1 no varía con ninguno de los tratamientos entre las
células SCR y beclina-1 KO (Figura 24C-D). Finalmente, se confirmó que la autofagia
también es necesaria para liberación de ATP mediada por P2Et, EG y MTX (Figura 24E-F).
93
Figura 24. La autofagia es necesaria para la exposición de CRT y la liberación de ATP durante el tratamiento con P2Et y EG. Histogramas representativos del análisis por citometría de flujo, de los clones SCR o Beclina-1 KO tratados con la CI50 de P2Et, AG, EG, DOXO o el vehículo durante 12 h. La Ecto-CRT se detectó con un anticuerpo primario anti-CRT y un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488. La evaluación de la IMF se determinó mediante citometría de flujo sobre las células vivas (Aqua negativas). B. Se muestra el porcentaje de cambio la IMF de las células tratadas en relación con el vehículo (100%) expresado como la media ± SEM de 3 experimentos independientes. C. Los clones SCR o Beclina-1 KO se cultivaron en láminas y se trataron con la CI50 de P2Et, AG, EG, DOXO o el vehículo por 48h. El anticuerpo primario anti-HMGB1 se detectó utilizando un anticuerpo secundario de conejo de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (verde) y DAPI (azul) para los núcleos. Las imágenes se adquirieron con el microscopio confocal Olympus FV1000 con un objetivo de aceite 60 ×
94
PlanAPO. Se muestran imágenes representativas de tres experimentos independientes. La barra blanca
corresponde a 10m. D. Gráfico de dispersión de los coeficientes de correlación de Pearson, se evaluaron 45 células de cada tratamiento en tres experimentos independientes, se muestran los resultados de un experimento representativo expresado como media ± S.E.M. E. Gráfico de contorno representativo de los clones SCR o Beclina-1 KO tratados con la CI50 de P2Et, AG, EG, MTX (0,5μg/ml) o el vehículo durante 48h. Las células fueron marcadas con quinacrina (1µM) y PI. Se determinaron quinacrina low sobre las células PI negativas. F. Porcentaje de células quinacrinalow se expresa como media ± SEM de tres experimentos independientes. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001, **** P <0.0001
95
8 DISCUSION
El uso de productos naturales como terapia en diferentes enfermedades ha tenido un amplio
crecimiento durante los últimos 30 años, al punto que para 2014 el 77% de los tratamientos
aprobados por la FDA en cáncer eran derivados de productos naturales [150]. Compuestos
activos aislados de extractos de plantas tales como el taxol proveniente de Taxus brevifolia
y la vincristina derivada de Vinca rosea Linne, son ejemplos clásicos de productos naturales
usados en el tratamiento del cáncer [208]. Sin embargo, al igual que se observa con el uso
de terapias combinadas en la medicina convencional, se ha visto que el uso de extractos
de plantas complejos puede tener grandes ventajas frente al uso de los compuestos
aislados, donde en algunos casos se ha observado que pueden perder su actividad. La
diversidad de componentes presentes en los extractos complejos de plantas puede
aumentar la actividad de los mismos, ya que la interacción de los componentes de una
fracción puede disminuir la degradación enzimática, aumentar la solubilidad y
permeabilidad a través de membranas y la biodisponibilidad de los diferentes componentes.
Adicionalmente, una gran ventaja de usar extractos complejos es que pueden tener
múltiples blancos moleculares lo cual podría también disminuir la multiresistencia en cáncer
[43].
Los resultados obtenidos en este trabajo aportan al conocimiento de los mecanismos
celulares por los cuales un extracto complejo como el P2Et obtenido de la planta
Caesalpinia spinosa induce MCI y tiene muchas ventajas frente al uso de dos de sus
principales componentes el AG y el EG. Como fue demostrado a lo largo de este trabajo, el
P2Et induce estrés del RE que es necesario para la muerte de las células B16-F10, a través
de la fosforilación de PERK y sin activación de marcadores que contribuyen a la
supervivencia, lo cual lleva al incremento en los niveles de Ca+2 citoplasmático y la
disfunción mitocondrial; mientras que los polifenoles AG y EG no inducen estrés de RE. Por
otra parte, la autofagia mediada por P2Et y EG tiene características similares, los dos
inducen autofagia con flujo autofágico completo que protege parcialmente a las células de
la muerte. Por el contrario, el AG induce autofagia que es citotóxica para las células.
Adicionalmente, el P2Et a través de la activación de PERK y la inducción de autofagia
aumenta significativamente la generación de señales de MCI en el tratamiento de células
96
B16-F10 con P2Et. Ambos procesos fueron necesarios para la exposición de CRT y la
liberación de ATP, pero fue interesante encontrar que PERK también está involucrado con
la liberación de HMGB-1 mediada por P2Et lo cual no había sido previamente reportado.
En la evaluación de las tres señales de muerte inmunogénica se encontró que el P2Et es
el mejor inductor en comparación con los polifenoles, el EG, aunque induce las tres señales
lo hace en menor proporción comparado con P2Et y el AG, no incremento ninguna de estas
señales en comparación con las células tratadas con el vehículo (Figura 25). A pesar de
que la autofagia disminuye la muerte mediada por P2Et, en el ensayo de clonogenicidad
pudimos ver que a largo plazo el P2Et disminuye la generación de colonias en mayor
proporción que los polifenoles aislados, en presencia o ausencia de autofagia. Estos
resultados muestran que, aunque la autofagia protege parcialmente a las células de la
apoptosis el efecto predominante es la inducción de estrés de RE y de apoptosis. Además,
esa protección parcial de la muerte es necesaria para una mejor generación de señales de
muerte inmunogénica.
Por otra parte, los resultados previos de nuestro grupo han mostrado el alto potencial
antitumoral que tiene el extracto P2Et, induciendo la muerte celular no solo en melanoma
sino también en diferentes modelos tumorales [15, 39, 179, 187]. Esta muerte celular, está
acompañada de Ecto-CRT y la liberación de HMGB1 y ATP en células 4T1 y B16-F10, las
cuales activan la respuesta inmune frente al tumor como se evidencio en ratones que fueron
vacunados con células tratadas con P2Et [14, 15]. Este efecto antitumoral del P2Et se
pierde en ratones inmunodeficientes [14], al parecer como se describió en el trabajo más
reciente de nuestro grupo el P2Et reduce las MDSCs y aumenta las células efectoras en el
infiltrado tumoral [16]. Sin embargo, los mecanismos intracelulares por los cuales P2Et
puede generar todas estas respuestas eran desconocidos hasta ahora, los resultados, de
este trabajo muestran el importante papel que tienen el estrés de RE y la autofagia en la
generación de está MCI.
97
Figura 25. Modelo de la inducción de muerte y la generación de señales inmunogénicas por P2Et, AG
y EG. Imagen creada en Biorender.com
98
Como fue demostrado en la primera serie de experimentos, el P2Et promueve una
apoptosis dependiente de la inducción de estrés de RE, mientras que los polifenoles por
separado no lo hacen. El EG parece incrementar ligeramente el estrés de RE, pero no de
manera significativa y el tratamiento con AG no incremento este mecanismo de respuesta
al estrés sino una ligera disminución frente a los niveles basales observados en las células
tratadas con el control. Muchos polifenoles han sido asociados con la inducción de muerte
a través del incremento en el estrés de RE, el resveratrol, por ejemplo, uno de los polifenoles
más conocidos por estar presente en una gran variedad de alimentos, incrementa el estrés
de RE en células humanas de melanoma A375 y de cáncer de colón HT29 en respuesta al
incremento en el estrés oxidativo; en estos trabajos, se sugiere que es un mecanismo
proapoptótico debido al incremento de BiP, de la fosforilación de eIF2 y de CHOP [209,
210]. La curcumina, es otro polifenol que incrementa la apoptosis en células tumorales de
una forma dependiente de CHOP [211]. Estos resultados han sido encontrados con un gran
número de compuestos naturales y en la mayoría de estos trabajos la inducción de estrés
de RE es una consecuencia del incremento en ROS [36]. Por otra parte, se ha visto que
algunos de estos polifenoles y otras moléculas antioxidantes pueden reducir el estrés de
RE en diferentes tipos de células [212, 213]. Teniendo en cuenta los antecedentes de la
literatura y que el AG tiene mayor capacidad antioxidante y disminuye la producción de ROS
(resultados no mostrados), en comparación con el P2Et y el EG, podemos sugerir que la
disminución en el estrés de RE que se observó en el tratamiento con AG puede deberse a
la actividad antioxidante de este compuesto, y además podría también explicar el que tenga
una CI50 mayor en comparación con EG y P2Et.
Adicionalmente, al tratar de dilucidar el mecanismo por el cuál P2Et induce estrés de RE y
muerte, pensamos inicialmente que esto podía deberse a la producción de ROS, similar a
lo que ha sido observado con otros polifenoles [214]; sin embargo, nuestros resultados
mostraron que el P2Et no incremento la cantidad de ROS en las células B16-F10, y se
confirmó que el uso de antioxidantes en combinación con P2Et no rescata de la apoptosis
a las células tratadas con P2Et, sugiriendo que la muerte celular inducida por el extracto es
independiente de la producción de ROS.
99
Por otra parte, la UPR tiene como objetivo principal favorecer la homeostasis celular
aliviando el estrés en el RE y de esta forma promoviendo la sobrevivencia de la célula, sin
embargo, durante el estrés prolongado y severo en el RE, la UPR se vuelve un mecanismo
más citotóxico que citoprotector [9, 215]. Diferentes trabajos en varias líneas celulares han
mostrado que durante un estrés sostenido o crónico las ramas ATF-6 e IRE-1 son
atenuadas y solo PERK se encarga de la inducción de señales de muerte. Además, si se
mantiene activa la vía IRE-1 con vectores genéticos durante el estrés crónico se promueve
la protección de las células frente a la muerte, sugiriendo que la duración y la fuerza de la
señalización de PERK son las que determinan que el destino de la célula sea la apoptosis
[76, 216]. Interesantemente, P2Et induce apoptosis dependiente de estrés de RE y de la
fosforilación de PERK, pero a través de una vía no canónica; comúnmente la apoptosis
mediada por PERK es una consecuencia de una prolongada activación de la ISR (p-
eIF2/ATF4/CHOP) [192]. Sin embargo, como lo muestran nuestros resultados, aunque el
tratamiento de células B16-F10 con P2Et aumenta la fosforilación de eIF2 (p-eIF2) e
incrementa CHOP, el P2Et no aumenta ATF-4 de forma significativa y no depende de
eIF2 o CHOP para la inducción de apoptosis como pudimos ver con la inhibición de estas
dos proteínas. Además, la apoptosis inducida por P2Et tampoco es dependiente de la vía
IRE-1α/XBP-1. Estos hallazgos sugieren que P2Et induce un estrés de RE severo que lleva
a la rápida y directa activación de señales proapoptóticas vía PERK. Este mecanismo de
estrés severo inducido por P2Et puede tener otras ventajas en células de melanoma, ya
que la expresión de moléculas de sobrevida como ATF-6 y ATF4 protegen las células de
melanoma y promueven las metástasis [73, 76]. Así mismo, es interesante ver que la ISR
no juega ningún papel importante en el tratamiento con P2Et, porque se ha visto que este
mecanismo por su papel homeostático puede aumentar la resistencia a la terapia en cáncer
[217].
Una vez se descartó que la acumulación de ROS o la activación de CHOP participaban en
la apoptosis, se evaluaron los niveles de Ca2+ intracelular. Como se describió previamente,
la liberación de Ca2+ desde el RE hacia el citoplasma y/o la mitocondria puede generar
señales de muerte principalmente a través de la alteración del metabolismo mitocondrial
[89, 90]. Con nuestros resultados se mostró el incremento de los niveles de Ca2+
citoplasmático en las células B16-F10 como consecuencia del tratamiento con P2Et,
100
además, vimos que este incremento es el responsable de la inducción de muerte celular
como se observó con el uso de BAPTA. Un hallazgo interesante, es el hecho que PERK fue
necesario para que el P2Et incrementará los niveles de Ca2+ citoplasmático y para la
disfunción mitocondrial; en ese sentido, se ha descrito que PERK regula el paso de Ca2+ a
través de la formación de MAMs [88], y nosotros hipotetizamos que el P2Et podría regular
el flujo de calcio hacia la mitocondria usando estas estructuras. Sin embargo, trabajos
adicionales son necesarios para confirmar este mecanismo. De forma similar, ha sido
descrito que productos naturales (entre ellos varios polifenoles) y algunos
quimioterapéuticos producen la liberación masiva de Ca2+ desde el RE y con esto la muerte
celular en células de cáncer, como consecuencia del incremento de Ca2+ en la mitocondria
[218, 219]. Por otra parte, se ha visto que las células tumorales pueden disminuir la
expresión de canales de Ca2+ o aumentar la distancia entre la mitocondria y el RE para
disminuir el número de MAMs como mecanismo de resistencia a la muerte celular y a la
quimioterapia [218]. Algunos oncogenes también tienen la capacidad de limitar la
transferencia de Ca2+ a través de las MAMs, para evitar la toxicidad y permitir así la
progresión y el desarrollo de tumores, mientras que algunos supresores de tumores
promueven la transferencia de Ca2+ [220]. En este sentido, la inducción de muerte con P2Et
a través de la modulación de Ca2+ y posiblemente con la participación de las MAMs tendría
muchas ventajas, entre ellas que podría volver a sensibilizar a las células tumorales
resistentes a la muerte celular y además podría ayudar a aumentar la muerte en
combinación con otras terapias.
Por otro lado, es interesante resaltar que en células iniciadoras del tumor también conocidas
como células madre tumorales, se ha reconocido que la modulación de los niveles de Ca2+
es uno de los principales mecanismos de resistencia que poseen y se considera que la
modulación Ca2+ puede ser un potencial blanco terapéutico, ya que el tratamiento con
drogas que alteran la homeostasis del Ca2+ intracelular como la tapsigargina aumentan la
muerte de estas células que son altamente resistentes a la terapia [221, 222]. Esta sería
otra ventaja de este mecanismo de muerte celular mediado por P2Et, y tal como ha sido
mostrado en resultados previos de nuestro grupo de investigación el P2Et disminuye el
crecimiento in vitro de células de cáncer de seno que presentan un enriquecimiento en
células con fenotipo de célula madre tumoral [39].
101
Además del estrés de RE, el P2Et también incrementó autofagia en células B16-F10, como
se describió en nuestro trabajo previo [14]. La autofagia como mecanismo de respuesta al
estrés ha sido ampliamente involucrada con el destino de la célula, como mencionamos
anteriormente la autofagia puede tener un papel dual, contribuyendo con la supervivencia
celular o con la muerte [107]. Algunas de las terapias más usadas en cáncer actúan sobre
diferentes blancos para inducir apoptosis y simultáneamente incrementan la autofagia
protegiendo parcialmente a las células de la muerte, este proceso es conocido como
autofagia protectora. En otros casos la inducción de autofagia no protege a las células sino
que puede contribuir a la muerte celular, a este proceso se le denomina autofagia citotóxica
[108]. Varios trabajos han mostrado que en células en las que la terapia aumenta la
autofagia protectora, el uso de cloroquina o de otros inhibidores del flujo autofágico puede
mejorar la inducción de muerte celular [201, 202]. Nuestros resultados mostraron que los
polifenoles al igual que el P2Et inducen autofagia en la línea celular B16-F10; pero es
importante resaltarla diferencia entre el P2Et y el EG que inducen una autofagia completa
(flujo autofágico completo), en comparación con el AG que bloquea el flujo autofágico. El
flujo autofágico completo permite a la célula degradar proteínas y otras macromoléculas
dañadas que pueden ser tóxicas para la célula por lo cual se ha asociado más con la
protección frente a la terapia; mientras que el bloqueo del flujo autofágico permite la
acumulación de estas proteínas como p62 y con esto aumenta la citotoxicidad [109].
Nuestros resultados mostraron que la inhibición de la autofagia en su fase tardía con
cloroquina (fusión autofagosoma-lisosoma) aumenta la muerte mediada por P2Et, AG y EG;
mientras que, la inhibición temprana (Beclina-1 KO) solo incrementa la apoptosis mediada
por P2Et y EG, demostrando que la inducción de autofagia con un flujo autofágico completo
disminuye parcialmente la muerte celular en estos dos tratamientos. Además, esta
inhibición temprana disminuyó la apoptosis mediada por AG a corto plazo (menor
porcentaje de células anexina V+) y también a largo plazo (mayor porcentaje de colonias),
sugiriendo que el mecanismo de muerte celular utilizado por este polifenol se asocia con la
inducción de autofagia citotóxica por inhibición del flujo autofágico.
102
Finalmente, uno de los objetivos de este trabajo era determinar cómo estos dos
mecanismos (estrés de RE y autofagia), que han sido asociados de forma independiente
con el tratamiento con polifenoles [36, 37] y con la generación de señales de MCI [5, 25],
contribuyen en la exposición de CRT en la membrana celular, y en la liberación de ATP y
HMGB-1 durante el tratamiento con P2Et y sus principales componentes AG y EG. La
generación de estas tres señales en las células B16-F10 durante el tratamiento con P2Et
fue confirmada de acuerdo a los resultados descritos previamente [14]. Adicionalmente, al
comparar la generación de las tres señales en las células tratadas con P2Et, AG y EG,
encontramos que el mejor inductor de señales de MCI es el extracto complejo. Aunque el
EG induce las tres señales, el efecto en la inducción de Ecto-CRT y la liberación de HMGB-
1 es menor comparado con P2Et, así mismo, el tratamiento con AG solamente incremento
la liberación de ATP y en menor proporción que el P2Et y el EG.
El estrés del RE se ha mostrado como un mecanismo determinante para la inducción de
MCI [4, 9]. En este sentido, los inductores de MCI pueden ser clasificados de acuerdo con
la contribución y la calidad del estrés de RE [4]. De esta forma, se consideran como
inductores tipo I a la radioterapia y la quimioterapia con antraciclinas, mitoxantrona u
oxaliplatino, los cuales inducen daños en el DNA, e incrementan la producción de ROS para
inducir apoptosis y aumentar el estrés en el RE llevando a la Ecto-CRT de una forma
dependiente de PERK; mientras que otros DAMPs como la liberación de ATP y HMGB1 se
generan a partir de otros mecanismos independientes de estrés de RE [4, 5]. Por otro lado,
los inductores tipo II entre los cuales se encuentra la hipericina en combinación con terapia
fotodinámica (Hyp-PTD), incrementan la producción de ROS directamente en el RE, lo cual
hace que el mecanismo completo sea dirigido por la inducción directa de estrés en el RE y
esto favorece la Ecto-CRT, la liberación de ATP y la apoptosis de una forma dependiente
de PERK. Similar a los inductores de tipo I, el tratamiento con Hyp-PDT favorece la
liberación de HMGB1 por un mecanismo pasivo que no depende directamente de PERK
después de la muerte celular [5, 25, 29]. En ambos tipos de inductores de MCI, la depleción
de Ca2+ en el RE se produce en respuesta al incremento de ROS y es necesario para el
incremento de Ecto-CRT [88, 135]. En contraste con ambos tipos de inductores de MCI, la
apoptosis mediada por P2Et es dependiente de estrés en el RE, lo cual incrementa los
niveles de Ca2+ pero como vimos es independiente de la producción de ROS.
103
Interesantemente, la fosforilación de PERK se requiere para la inducción de Ecto-CRT y la
liberación de ATP y HMGB1 (Figura 29). Aunque la liberación de HMGB1 en la MCI no se
ha asociado con PERK, algunos estudios han mostrado un papel en los niveles de Ca2+ en
este proceso [223, 224]. Por lo tanto, es plausible que la liberación de HMGB1 durante el
tratamiento con P2Et dependa del incremento en el Ca2+ citoplasmático después de la
generación de estrés en el RE y de la fosforilación de PERK.
De forma similar a otros inductores de MCI [24, 25], PERK fue necesario para el incremento
en Ecto-CRT en células tratadas con EG, en las cuales la inducción de estrés de RE no fue
significativa. Por lo tanto, se requieren de investigaciones posteriores para dilucidar de una
forma más precisa las vías involucradas en la inducción de MCI por el EG.
Con respecto al papel de la autofagia en la inducción de señales de MCI se encontró en las
células tratadas con EG y P2Et resultados similares en cuanto a la generación de estas
señales, la autofagia parece participar parcialmente en la Ecto-CRT ya que el knock-out de
Beclina-1 atenúo ligeramente la exposición de CRT en el tratamiento con P2Et y DOXO, y
elimino completamente la Ecto-CRT en células tratadas con EG, probablemente porque el
efecto inicial con este polifenol es mucho menor que el observado con P2Et. Estos
resultados van en contra de lo observado en los trabajos del grupo de Kroemer que
muestran que el knock-out de Atg5 no altera la exposición de CRT en los inductores tipo I
[5], sin embargo, nuestros datos son comparables con resultados obtenidos más
recientemente, que muestran que la inhibición temprana de la autofagia puede disminuir la
exposición de CRT en células tratadas con oxaliplatino [225]. No es claro cómo podría la
autofagia estar regulando la exposición de CRT, pero se ha descrito que existen algunos
mecanismos de secreción de proteínas hacia la membrana celular que pueden depender
de la autofagia principalmente durante condiciones de estrés [226, 227]. Adicionalmente,
se ha descrito que la inhibición de la autofagia en fases tardías puede incrementar la
exposición de CRT, siempre y cuando se genere estrés de RE, lo cual sugiere que la
autofagia regula de alguna manera la exposición de CRT en la membrana celular [225].
Nuestros resultados sugieren que la inducción de autofagia citotóxica y el bloqueo del flujo
autofágico induce una muerte que puede considerarse limpia, y que no llevaría a la
activación de la respuesta inmune como se observó con el tratamiento con AG.
104
Figura 26. Modelo comparativo entre P2Et y otros inductores de MCI. Se muestra en la figura la comparación con diferentes inductores de MCI, Tipo I como las antraciclinas. Tipo II como la terapia fotodinámica con hipericina (Hyp-PDT) y con P2Et. Mostrando el papel de la autofagia y del estrés de RE en la generación de señales inmunogénicas Imagen creada en Biorender.com
105
Por otra parte, la inhibición de beclina-1 no generó cambios en la liberación de HMGB-1 en
células tratadas con P2Et o con EG. Adicionalmente, aun cuando eliminamos la autofagia,
el AG incrementó la liberación de ATP con respecto al control, resultados similares se
observaron en células tratadas con P2Et y EG en las que se disminuyó significativamente
la liberación de ATP, pero no completamente. Esto puede ser debido a que la autofagia no
es el único mecanismo involucrado, se ha visto que algunos canales en la membrana como
los canales de panexina 1 también ayudan a la liberación de ATP en células apoptóticas y
la activación de estos canales puede darse como una consecuencia del aumento de Ca2+
citoplasmático, lo cual estaría potenciando la generación de señales inmunogénicas con
P2Et [26]. En conjunto estas observaciones, nos permiten concluir que la autofagia a pesar
de proteger las células parcialmente de la muerte es necesaria para una mejor generación
de señales inmunogénicas.
Este trabajo aporta al conocimiento de los mecanismos por los cuales estos extractos de
plantas pueden contribuir con la inducción de MCI, a la fecha la mayoría de productos
naturales que han sido involucrados con MCI son compuestos aislados y poco se conoce
de los extractos de plantas complejos [228]. Algunos estudios han mostrado que extractos
de plantas pueden modular la respuesta inmune en modelos de inflamación o que pueden
activar células dendríticas frente al tumor [12, 155, 229]. Sin embargo, no se conocía hasta
ahora que mecanismos podían estar involucrados en la generación de estas señales de
peligro en células tumorales tratadas con polifenoles o extractos de plantas. Además,
nuestros resultados muestran, que el P2Et podría ser ventajoso en comparación con otros
inductores de MCI, por varias razones relacionadas con en el mecanismo de inducción de
muerte celular. Una de ellas es que se ha descrito que el incremento en los niveles de ROS
en el microambiente tumoral puede inducir estrés en el RE en las células infiltrantes del
sistema inmune, favoreciendo mecanismos de inmunosupresión [31]. Además, se sabe que
las células tumorales estresadas pueden transferir factores solubles hacia células del
microambiente tumoral favoreciendo la UPR y las actividades de inmunosupresión en
MDSC y células dendríticas tolerogénicas [80, 82]. Por lo tanto, la inducción de UPR y
apoptosis por P2Et en las células tumorales, sin incremento de ROS, podría estar asociado
con la reducción de la inmunosupresión en el microambiente tumoral. De acuerdo con esto,
106
recientemente se mostró en nuestro grupo de investigación en el modelo trasplantable de
tumor B16-F10, que la reducción del crecimiento tumoral inducida por P2Et se acompañaba
con una reducción en las células MDSC infiltrantes del tumor [16]. En segundo lugar, la
alteración de la homeostasis del Ca2+ llevaría a una muerte celular más eficiente y además
podría contribuir a una mejor generación de señales de MCI. El papel del Ca2+en la MCI es
también relevante, estudios han mostrado que el tratamiento con antraciclinas e Hyp/PDT
modulan la disminución de Ca2+ en el lumen del RE y esta depleción de Ca2+ es necesaria
para inducir Ecto-CRT [29, 135]. Además, aunque no es del todo claro, se ha descrito que
la modulación de bombas de Ca2+ y la alteración de los niveles de este electrolito pueden
contribuir con la liberación de HMGB-1 [224, 230]. Sin embargo, deberán realizarse
experimentos adicionales usando P2Et como un inductor de MCI donde se evalúe el papel
de las MAMs y el Ca2+ en la inducción de Ecto-CRT y la liberación de ATP y HMGB1.
Finalmente, la señalización de PERK se ha convertido en un blanco atractivo para una
intervención terapéutica debido a su participación durante la carcinogénesis y metástasis
[120]. De hecho, PERK se ha asociado con radioresistencia de células hipóxicas del tumor
a través de la respuesta de estrés integrado (ISR) [73]. La modulación con P2Et podría ser
interesante en este punto, ya que se ha propuesto el uso de inhibidores químicos de la
actividad de PERK cinasa para disminuir la señalización protectora pero estos han
generado graves efectos colaterales [120]. Por lo tanto, P2Et podría ser una mejor opción
terapéutica para la activación de la vía PERK, ya que induciría señalización asociada más
con la muerte que con la homeostasis modulando los niveles de Ca2+, evitando las funciones
asociadas con el eje eIF2a/ATF-4 de la UPR que favorecen la sobrevivida, y aumentando
la respuesta inmune a través de la generación de DAMPs. Por otra parte, algunos estudios
han mostrado que las células tumorales presentan un incremento en los niveles basales de
estrés en el RE con respecto a las células normales, siendo más sensibles a la inducción
de muerte con tunicamicina [20]. Esto explicaría porque el P2Et presenta una baja
citotoxicidad en células normales. Sin embargo, estudios adicionales que evalúen el papel
de PERK en las actividades antitumorales deberían ser validadas en un futuro usando
modelos animales.
107
En conclusión, nuestros resultados sugieren que los extractos de plantas ricos en
polifenoles como el P2Et inducen estrés en el RE y señalización a través de la fosforilación
de PERK, modulando los niveles de Ca2+, induciendo apoptosis y la liberación de señales
inmunogénicas, que podría ser interesante en futuras direcciones para el desarrollo de
terapias más eficientes que incrementen la respuesta inmune frente al tumor.
108
9 CONCLUSIONES
• El P2Et induce estrés de RE en células B16-F10 a través de la activación de las vías
de la UPR PERK e IRE-1 Esta inducción de estrés de RE es necesaria para la
muerte celular mediada por P2Et a través de la fosforilación de PERK, incremento
en los niveles de Ca+2 citoplasmático y disfunción mitocondrial.
• PERK fue necesario para la exposición de CRT y la liberación de ATP y HMGB-1,
siendo necesario para la generación de señales de muerte celular inmunogénica en
el tratamiento de células B16-F10 con P2Et.
• El P2Et induce autofagia completa que protege parcialmente a las células de la
muerte. Sin embargo, la inhibición de la autofagia, aunque aumenta la muerte celular
mediada por P2Et, disminuye la Ecto-CRT y la liberación de ATP.
• El estrés de RE y la autofagia son dos mecanismos necesarios y complementarios
para la inducción de señales de MCI mediada por P2Et, por una parte, el efecto de
inducción de muerte celular a través de PERK predomina, pero lo que vimos es que
es necesaria una atenuación del efecto por medio de la autofagia para mejorar la
generación de las señales de MCI.
• Dos de los principales polifenoles presentes en el extracto P2Et: el ácido gálico y el
etil galato tienen mecanismos de acción diferentes a los encontrados con P2Et, el
EG, aunque es el que tiene mayor similitud con P2Et en cuanto a la inducción de
autofagia y presento mayor citotoxicidad, induce menor muerte celular a largo plazo,
un ligero incremento de estrés de RE que no fue significativo y menor proporción de
señales inmunogénicas. En cuanto al AG, encontramos que no induce estrés de RE,
Ecto-CRT o liberación de HMGB-1 y lleva a la muerte celular a través de la inducción
de autofagia con flujo autofágico incompleto.
109
• Nuestros resultados muestran que el uso de extractos complejos tiene un mayor
potencial antitumoral que polifenoles aislados.
110
10 PERSPECTIVAS
Los resultados obtenidos en este trabajo conducen al planteamiento de nuevas preguntas
de investigación para mejorar el entendimiento de la actividad del P2Et y de otros extractos
de plantas con propiedades antitumorales.
• Una de las principales preguntas que se generan de este trabajo, es si la inhibición
in vivo del estrés de RE y la autofagia disminuyen su efecto antitumoral y reducen
la respuesta inmune en el infiltrado tumoral. Para lo cual se hace necesario realizar
experimentos de vacunación en ratones, utilizando las células knock out generadas
en ese trabajo. De igual forma, sería interesante determinar el papel del calcio in
vivo utilizando un quelante de calcio como el BAPTA en cotratamiento con P2Et.
• Teniendo en cuenta el papel tan importante de la alteración en la homeostasis del
calcio durante el tratamiento con P2Et, y que fue una consecuencia de la activación
de PERK se hace necesario:
a. Evaluar si se incrementa el número de MAMs durante el tratamiento con
P2Et y si el efecto cambia en las líneas celulares PERK KO, para determinar
si las MAMs están realmente involucradas con la muerte celular.
b. Determinar la transferencia de calcio entre el RE y la mitocondria para
confirmar que el aumento de calcio mitocondrial es el que lleva a la muerte
celular.
c. Analizar otras bombas y canales de calcio que puedan ser alterados durante
el tratamiento con polifenoles, como la bomba SERCA que es modulada por
resveratrol.
d. Analizar si la inhibición de la formación de MAMs o de los canales asociados
a la actividad del P2Et disminuye la generación de señales inmunogénicas
en células con estrés de RE.
111
• Finalmente, si tenemos en cuenta los resultados de P2Et y de los polifenoles, en
donde encontramos que el AG tiene una actividad totalmente opuesta al EG, se
podría realizar una serie de experimentos en los que:
a. Se eliminen el AG del extracto y se determine si su papel en el extracto
contribuye a la muerte y a la reducción del volumen tumoral, o por el contrario
su eliminación potencia el efecto del P2Et.
b. Incrementar la concentración de EG en cotratamiento con P2Et, para determinar
si esto mejora los resultados obtenidos con el extracto.
c. Hacer combinación de los polifenoles AG y EG a diferentes concentraciones,
para ver los efectos de esta interacción.
112
11 FINANCIAMIENTO
Este trabajo fue financiado por el Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e
Innovación COLCIENCIAS a través del proyecto 120356934797 (número de contrato 701-
2013). Por la Vicerrectoría de Investigaciones de la Pontificia Universidad Javeriana, Sede
Bogotá, a través del proyecto 007682. Este proyecto también fue financiado por el Sistema
General de Regalías (BPIN: 2013000100196, número de contrato 1027-1-2015) y una parte
fue desarrollada en el laboratorio del doctor Paulo Rodríguez, en el Lee Moffitt Cancer
Center en el departamento de inmunología. Los estudios de doctorado fueron financiados
a través de la beca de doctorados nacionales del Departamento Administrativo de Ciencia,
Tecnología e Innovación COLCIENCIAS, convocatoria 647 de 2014.
113
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230. Ma, L., S.J. Kim, and K.I. Oh, Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase is Involved in the Release of High Mobility Group Box 1 Via the Interferon-beta Signaling Pathway. Immune Netw, 2012. 12(4): p. 148-54.
127
13 ANEXOS
13.1 Anexo 1. Lentivectores CRISPR/Cas9 utilizados para la generación de los clones knock-out
Referencia ABM del lentivector
Gen Blanco sgARN
K010
Ninguno (Scramble)
GCACTCACATCGCTACATCA
K4522205
PERK
Blanco 1: GGAAAGCACCTTTAAACC Blanco 2: ATGGAGACCTCTTCCAG Blanco 3: GAAAGCACCTTTAAACC
K4387407
XBP-1
CGCGGACCGGGTACCATGAG
K4460405
Beclina-1
Blanco 1: CACGAGCTTCAAGATCC Blanco 2: TGGGCTGTGGTAAGTAA Blanco 3: AGAGGCTAACTCAGGAG
128
13.2 Anexo 2. Productos relacionados con este trabajo
Artículos publicados:
Karol Prieto, Yu Cao, Eslam Mohamed, Jimena Trillo-Tinoco, Rosa Sierra, Claudia Urueña,
Tito Sandoval, Susana Fiorentino, Paulo Rodriguez, Alfonso Barreto. Polyphenol-rich
extract induces apoptosis with immunogenic markers in melanoma cells through the ER
stress-associated kinase PERK. Cell Death Discovery. Volume 5, Article number: 134
(2019). https://www.nature.com/articles/s41420-019-0214-2
Gomez-Cadena A, Urueña C, Prieto K, Martinez-Usatorre A, Donda A, Barreto A, Romero
P, Fiorentino S: Immune system dependent anti-tumor activity of a plant derived polyphenol
rich fraction in a melanoma mouse model. Cell Death and Disease 2016. 7(6): p. e2243.
129
13.3 Anexo 3. Premios y distinciones
Convocatoria nacional para estudios de doctorado en Colombia, Convocatoria 647,
Colciencias, 2014. Enero de 2015 – diciembre de 2018.
Premio de la asociación americana de inmunólogos: “The AAI Young Investigator Award”
octubre 13 de 2015.
130
13.4 Anexo 4. Participación en congresos y eventos
2015
Participación y asistencia en el 10°Congreso de la Asociación Colombiana de Alergia, Asma
e Inmunología". IMMUNOCOLOMBIA 2015, 11th Congress of the Latin American
Association of Immunology. Octubre 10-13 de 2015.
• Asistencia al curso precongreso denominado “Immune regulation in health and
disease” de 32 horas de duración, realizado en el marco del Congreso
• Poster:
Karol Prieto, Alejandra Gómez, Maria C. Tovar, Claudia P. Urueña, Susana
Fiorentino and Alfonso Barreto. The fraction P2Et from Caesalpinia spinosa induce
autophagy associated with stress signals on B16 melanoma cell line
Society for Immunotherapy of Cancer (SITC)’s 30th Anniversary Annual Meeting. 2015.
Maryland, United State.
• Poster:
Alejandra Gómez-Cadena, Claudia Urueña, Amaia Martínez, Karol Prieto, Alena
Donda, Alfonso Barreto, Pedro Romero, Susana Fiorentino. Immune system activation
through immunogenic cell death and tumor recruitment of dendritic cells is required for
anti-tumor activity of a plant-derived polyphenolic fraction
2016
Asistencia al IV Simposio de actualización en inmunología de la asociación colombiana de
inmunologia “antitumoral immunity” – ACOI Bogotá, abril 4 de 2016
Participacion en Second Latin America Chapter Conference of Cell Stress Society
International. Bogotá-Colombia. April de 6-8 de 2016
• Poster:
Prieto Karol, Alejandra Gomez, Fiorentino Susana, Barreto Alfonso. The fraction
P2Et from Caesalpinia spinosa induce autophagy associated with stress signals on
B16 melanoma cell line.
131
Co-Instructora programa Clubes de Ciencia Colombia (CdeC-Col). Edición 2016 del 18 al
25 de junio. Este programa educativo busca despertar en jóvenes colombianos su pasión
por la ciencia y la tecnología, y en el proceso crear una red internacional de colaboración
académica para beneficio del desarrollo social y económico del país.
Mini simposio de biología celular del cáncer. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, julio
18 y 19 de 2016.
• Presentación oral:
Uso del sistema CRISPR/Cas9 en la inhibición del gen relacionado con la autofagia beclina-
1 en una línea celular tumoral
Immunotherapy meeting. La Habana, Cuba, octubre 17 al 21 de 2016
• Poster:
Prieto Karol, Carlos Javier Almeciga, Fiorentino Susana, Barreto Alfonso. Antitumor
P2Et extract from Caesalpinia spinosa induces a partially pro-survival beclin 1-
dependent autophagy on melanoma cells
XVI Congreso Internacional del Colegio Nacional de Bacteriología. Bogotá, noviembre 4 al
7 de 2016. presentación en modalidad de poster del trabajo:
• Poster:
Prieto Karol, Carlos Javier Almeciga, Fiorentino Susana, Barreto Alfonso. Uso del
sistema CRISPR/Cas9 en el knockout de beclina 1 para evaluar la participación de
la autofagia en mecanismos antitumorales en la línea celular de melanoma murino
B16F10.
2017
Participación en el encuentro del anual de estudiantes del posgrado de Ciencias Biologicas,
Pontificia Universidad Javeriana 2017
• Presentación oral:
Papel de la autofagia inducida por P2Et y por polifenoles en la citotoxicidad y la generación
de señales inmunogénicas
132
Participación XIV Congreso de Investigación en la Pontificia Universidad Javeriana
• Presentación oral:
Karol Prieto, Susana Fiorentino, Alfonso Barreto. Contribución de la autofagia en la
citotoxicidad y generación de señales inmunogénicas en células tumorales tratadas con un
extracto rico en polifenoles y sus polifenoles asociados
2017
Pasantía internacional en Moffitt Cancer Center. Enero-Julio de 2018
5th anual Junior Scientist Retreat, April 30, 2018. University of South Florida. Tampa, Florida
Moffitt Cancer Center Scientific Symposium, May 9, 2018. Tampa, Florida
Participación en el encuentro del anual de estudiantes del posgrado de Ciencias Biológicas,
Pontificia Universidad Javeriana. Mayo de 2018
• Poster:
Karol Prieto, Paulo Rodriguez, Susana Fiorentino, Alfonso Barreto. El extracto P2Et de
Caesalpinia spinosa induce muerte celular dependiente de estrés de retículo en células de
melanoma B16-F10.
Participación Mini simposio de biología celular del cáncer. Pontificia Universidad Javeriana,
Bogotá, agosto 2018.
• Presentación oral:
Karol Prieto, Paulo Rodriguez, Susana Fiorentino, Alfonso Barreto. Papel del estrés de
retículo endoplásmico en la inducción de apoptosis mediada por el extracto P2Et obtenido
de la planta Caesalpinia spinosa
133
13.5 Anexo 5. Otros productos no relacionados
Artículos sometidos:
Ana Isabel Sánchez, Mary Alexandra García-Acero, Angela Paredes, Rossi Quero, Rita Iris
Ortega, Jorge Armando Rojas, Daniel Herrera, Miguel Parra, Karol Prieto, Andrés Camilo
Vásquez, Juana Ángel, Luz-Stella Rodríguez, Juan Carlos Prieto, Manuel Franco.
Immunodeficiency in a patient with 22q11.2 distal deletion syndrome is associated with a
p.Ala7dup variant in the MAPK1 gene. Human Immunology