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Tesis de Posgrado

Caracterización de la regiónCaracterización de la regiónpromotora-reguladora del gen de lapromotora-reguladora del gen de lafibronectina humana : estudio de lafibronectina humana : estudio de la

interacción entre los factores queinteracción entre los factores quese unen a los elementos CRE yse unen a los elementos CRE y

CCAATCCAAT

Muro, Andrés Fernando

1992

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Muro, Andrés Fernando. (1992). Caracterización de la región promotora-reguladora del gen de lafibronectina humana : estudio de la interacción entre los factores que se unen a los elementosCRE y CCAAT. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2481_Muro.pdf

Cita tipo Chicago:Muro, Andrés Fernando. "Caracterización de la región promotora-reguladora del gen de lafibronectina humana : estudio de la interacción entre los factores que se unen a los elementosCRE y CCAAT". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad deBuenos Aires. 1992. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2481_Muro.pdf

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

CARACTERIZACION DE LA REGION PROMOTORA-REGULADORA DEL GEN DE

LA FIBRONECTINA HUMANA.

ESTUDIO DE LA INTERACCION ENTRE LOS FACTORE QUE SE UNEN A LOS

ELEMENTOS CRE Y CCAAT.

Autor. Andrés F. Muro

Director de Tesis: Dr. Alberto R. Komblihtt

Lugar de trabajo: Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular

(INGEBI), Buenos Aires.

Tesis presentadaparaoptaral títqu de ‘78 g j

DoctorenCienciasBiológicas #07 //

7 ,Z1992

AGRADECIMIENTOS.

A Alberto Komblihtt, por haberme dirijido y acompañado en este trabajo, y por haberme

enseñado y compartido durante todo este tiempo cosas que van mas allá de la ciencia, que

considero más importantes.

A Patricia, y te invito a un café y lo hablamos.

A Omar Coso y a Gustavo Pesce, por su amistad en los buenos y malos momentos, dentro yfuera del lNGEBl.

AI Dr. Héctor Torres, por permitirme realizar esta Tesis en el lNGEBl.

A todos los jefes de grupo que, con su esfuerzo, hicieron que hubiera en el lNGEBl la

infraestructura necesaria para hacer experimentos.

A Viviana Bemath, por todos los cafés y por la cálida amistad que me bn'ndó desde que llegué,

y a Anabella Srebrow por el compañerismo, dedicación y empeño que pone cotidianamente.

A Fernando Bravo, Ale Schijman, Mercedes Goin de Nardone, Pablo Nardone, Pablo

Rabinowicz, Rosana Celnick y Norberto Malarini por todo el afecto y camaradería que

compartimos desde el laboratorio.

A Gerardo Glikin, por todas las bromas compartidas, además de la ciencia intercambiada, y

disculpas por algún olvido, inmerecido, de mi parte.

A Silvia Cereghini, Marta Blumenfeld. Alberto Ochoa y Daniel Mendelzon, quienes me

introdujeron en el campo de la transcripción.

A los ex-211, ahora en el exterior. Danny, Ricky, Guillermo, Erich, y los extra-21] Javier y

Leo, por todos los buenos momentos, experimentos, apoyo y consejos compartidos.

Al resto de mis compañeros y ex-compañeros del INGEBI, Betina, Malala. Horacio, Alberto,

Jorge M., Rita, Ximena. Pablito. Gabriela C., Silvia, Dan, Martín. Alfredo. Sonia, Claudia,

Diego. Facundo, Jorge C., Florencia. Graciela, Gabriela L., Sandra y Marisa. por todos los

momentos compartidos, día a día.

A los integrantes del Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Exactas,

con quienes compartí mis primeras pipeteadas, y mucho cariño.

A Jorge Tezón y a Alberto Baldi, por haberme permitido usar parte de sus laboratorios para

hacer experimentos.

A Adriana Urman, lrma Gelmi, Mariano Rodríguez, Tito Contreras, Luis Acosta, María Julia

Alvarez, Nené Parodi, Gabriel Paissán, Marta Garibaldi y Leonor Acevedo, sin quienes esto nofuncionaría.

Y por último, pero en primer lugar, a mis padres. que me apoyaron y estimularon en todo

momento de manera totalmente incondicional, gracias.

INDICE.

INTRODUCCION. l

REGULACION de la TRANSCRIPCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

TIPOS DE PROMOTORES Y RNA POLIMERASAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

ESTADO DE LA CROMATINA Y TRANSCRIPCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

PROMOTORES DE RNA POLIMERASA II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

PROMOTOR DEL GEN DE LA FIBRONECTINA HUMANA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

MECANISMO DE INICIACION DE LA TRANSCRIPCION

POR LA RNA POLIMERASA II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

A- En promotores con elemento TATA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

B- En promotores sin elemento TATA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

FACTORES REGULADORES DE LA TRANSCRIPCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Dominios de dimerización y de unión al DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

"Zinc finger" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

"Leucíne-zipper" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I7

"Helix-tum-helix" (hélice-vuelta-he’lice) y "Helix-loop-helix"

(hélice-bucle-hélice) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Dominios de transactivación de los factores de transcripción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

Interacción entre factores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

DESCRIPCION DE ALGUNAS FAMILIAS DE FACTORES REGULATORIOS. . . 23

Factor de transcripción AP-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

Factor de transcripción SPI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

Familia ATF/CREB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

Familia de las proteínas que reconocen el sitio CCAAT (factores CCAAT o CTF). . . . . . 28

OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

RESULTADOS Y DISCUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

ANALISIS DE LA UNION DE FACTORES REGULADORES DE LA

TRANSCRIPCION AL PROMOTOR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

COMPETICIONES CON OLIGONUCLEOTIDOS SINTETICOS

DOBLE CADENA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

GELES DE RETARDO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

a) Complejos con la secuencia CRE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

b) Complejos con la secuencia CCAAT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

ENSAYOS DE FOSFORILACION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

CARACTERIZACION DE LA PROTEINA QUE RECONOCE

AL SITIO CCAAT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

EFECTO DEL ESPACIAMIENTO ENTRE LOS ELEMENTOS

CCAAT Y CRE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

TRANSCRIPCION IN VITRO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

CARACTERIZACION PARCIAL DE LA PROTEINA QUE

RECONOCE EL CRE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

SEPARACION DE LAS ACTIVIDADES CREB Y FACTOR CCAAT . . . . . . . . . . . . . 55

IDENTIFICACION DE LA ACTIVIDAD QUE RECONOCE EL

ELEMENTO CCAAT EN LA COLUMNA MONO Q . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

COMBINACION DE LAS FRACCIONES DE LA COLUMNA . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

IDENTIFICACION DE LA PROTEINA DE 73 kDa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

GELES DE RETARDO EN CELULAS HeLa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

PLASMIDOS UTILIZADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

MUTANTES DE INSERCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

PREPARACION DE SONDAS A PARTIR DE PLASMIDOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

OLIGONUCLEOTIDOS UTILIZADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

PREPARACION Y MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS . . . . . . . . . . . . . . . . 75

"Annealing" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

Marcación por fill-in de oligonucleótidos de cadena doble . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

PREPARACION DE EXTRACT OS NUCLEARES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

Purificación de núcleos a partir de hígado de rata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

Extracción de proteínas nucleares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

Diálisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

Preparación de extractos nucleares a partir de células en cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

FOOTPRINTING . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

GELES DE RET ARDO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

FOSFORILACION IN VITRO DE EXTRACTOS CRUDOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

DESNATURALIZACION TERMICA DE EXTRACTOS CRUDOS . . . . . . . . . . . . . 86

GELES DE PROTEINAS CON EXTRACT OS FOSFORILADOS IN VITRO . . . . . . 83

TRANSCRIPCION IN VITRO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

SEPARACION DE LOS FACTORES NUCLEARES POR CORRIDA

EN CROMATOGRAFIA LIQIDA DE ALTA PERFORMANCE . . . . . . . . . . . . . . . . 85

CUANTIFICACION DE LAS AUTORRADIOGRAFIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

SOUTHWESTERN BLOT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

ENTRECRUZAMIENTO COVALENTE PROTEINA-DNA

MEDIANTE LUZ UV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

COMPETICION CON ANTICUERPOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

TRANSCRIPCION IN VITRO CON T7 RNA POLIMERASA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

TRADUCCION IN VITRO CON LISADOS DE RETICULOCITOS . . . . . . . . . . . . . 88

BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

INTROD CI N

Introducción

INTRODUCQION.

La matriz extracelular está compuesta por un conjunto de proteínas con dominios

múltiples, que tienen la propiedad de unirse a un amplio espectro de ligandos diferentes. Este

material extracelular contribuye a mantener las células unidas entre sí, y permite así su

organización en tejidos. Sin embargo, las matrices extracelulares no son sólo armazones

rígidos o semirígidos donde se ubican las células, sino que intervienen, dinámicamente, en la

regulación de la migración y diferenciación celulares, favoreciendo la cicatrización de heridas

y participando en la transformación oncogénica y la metástasis. La matriz extracelular está

formada por colágeno, proteoglicanos y un conjunto de proteínas adhesivas. En el último

grupo se encuentra la fibronectina. Esta se dispone en fibrillas alrededor de las células, de

manera paralela a la trama de actina intracelular, unidas a la célula a través de receptores

específicos (integrinas). La fibronectina también se encuentra en el plasma sanguíneo, y actúa

en el proceso de coagulación, formando parte del coágulo y facilitando la adhesión de las

plaquetas a los bordes de la pared dañada, colaborando así en la formación del tapón.

La fibronectina está codificada por un único gen de aproximadamente 70 kb, que

posee al menos 48 exones, varios de los cuales son eliminados en ciertos tipos de RNA

mensajeros, de manera tejido específica, por un complicado mecanismo de "splicing

alternativo" (Gutman y Komblihtt, 1987; Mosher, 1989; Hynes, 1990). La proteína tiene un

tamaño aproximado de 250 kD. La forma plasmática es soluble, y forma heterodímeros,

mientras que la forma tisular forma dímeros y multimeros, los que son altamente insolubles.

Está formada por tres tipos de dominios globulares diferentes, que se repiten a lo largo de la

secuencia, los que pueden unir independientemente distintas moléculas como heparina,

colágeno, actina, DNA, fibrina, e integrinas.

La expresión de la fibronectina es inhibida por transformación neoplásica, evento que

sería responsable parcialmente del cambio de morfología y adhesión de las células

transformadas. Además, su sintesis es regulada por hormonas glucocorticoideas y por

hormonas que tienen como transductor de su señal al CAMP.

Es por lo tanto de interés determinar los factores involucrados en la regulación de la

expresión del gen de la fibronectina.

REGULACION DE LA TMNSCRIPCION.

La iniciación de la síntesis de los RNA mensajeros es un punto de control primario en

la regulación diferencial de la expresión genética. Las células responden a señales intra y

extracelulares que encienden y apagan determinados genes, y modulan el nivel de

Introducción

transcripción de genes activos. En eucariotas superiores, los cambios transcripcionales en el

contexto de un programa de desarrollo pueden tener consecuencias a largo plazo. A pesar de

que los mecanismos y caminos bioquímicos por los cuales las células integran señales

fisiológicas para producir cambios transcripcionales adecuados son aún desconocidos en

profundidad, es claro que la frecuencia de iniciación de la síntesis del RNA mensajero

depende finalmente de factores que interactúan con elementos específicos en el promotor de

los genes y en sus enhancers (Mitchell y Tjian, 1989).

TIPOS DE PROMOTORES Y RNA POLlMERASAS.

Existen tres clases de genes en las células eucarióticas , definidos por el tipo de

promotor que poseen (Young, 1991; Lewin, 1990). Cada clase es transcripta por una RNA

polimerasa diferente: los genes que codifican para el RNA ribosomal son transcriptos por la

RNA polimerasa l, los que producen RNA mensajeros por la RNA polimerasa Il, junto a

algunos para RNAs pequeños nucleares y, los que codifican para tRNAs, RNAs SS y otros

RNA pequeños son transcriptos por la RNA polimerasa llI. De la misma forma que para la

RNA polimerasa bacteriana, son necesarios factores auxiliares para la iniciación.

En el caso de la transcripción en procariotes, la enzima básica lleva a cabo la

transcripción, asistida por ciertos factores, mientras que en el caso de los eucariotas, son los

factores, más que las enzimas mismas, los responsables de reconocer las secuencias

componentes del promotor.

Los promotores de cada clase de genes son diferentes. Los promotores reconocidos

por la RNA pol I y II están ubicados en la zona "upstream" del sitio de iniciación de la

transcripción, pero el promotor para la RNA pol Ill está ubicado "downstream" del sitio deiniciación.

Las RNA polimerasas eucarióticas tienen distinta ubicación dentro del núcleo, en

relación a sus funciones. La principal actividad sintetizadora de RNA es llevada a cabo por la

RNA pol l, que es efectuada en el nucleolo. La otra enzima principal es la RNA pol II, ubicada

en el nucleoplasma, la cual representa la mayor parte del resto de la actividad celular, y

sintetiza a los precursores de los RNA mensajeros, los hnRNA (RNA heterogéneos

nucleares) o transcriptos primarios. La menor actividad enzimática es la de la RNA pol III,

también nucleoplásmica, encargada de transcribir el rRNA SS y los tRNA.

Todas las RNA polimerasas eucarióticas son proteínas grandes, que aparecen como

agregados de 500.000 Daltons o más, y la composición de subunidades es compleja (Young,

1991). Cada enzima tiene dos subunidades grandes, generalmente una de N220 kDa y otra de

N140 kDa. La subunidad grande de la RNA pol II posee un dominio carboxi terminal

repetido, inusualmente largo, que estaría involucrado en la regulación de la iniciación de la

transcripción. El motivo repetido (17 veces en Plasmodium hasta 56 veces en ratón) es Tyr

Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Este dominio, llamado CTD ("carboxi terminal domain"), está

altamente fosforilado en una gran proporción de las RNA pol de las células. Aunque el rol del

Cl D en transcripción aún no está firmemente establecido, el modelo general más simple

establece que el CI‘D seria uno de los varios componentes del aparato de transcripción que

contribuye a la respuesta de señales activadoras de factores asociados a elementos del

promotor. La fosforilación de este dominio tendria un rol en la iniciación de la transcripción,

proveyendo un "switch" entre pasos durante la iniciación.

ESTADO DE LA CROMATINA Y TRANSCRIPCION.

El estado de la cromatina también tiene un rol en la regulación de la actividad génica.

ln vivo, la conversión de genes de un estado reprimido a uno transcripcionalmente activo o

competente, es frecuentemente acompañada por alteraciones en la estructura de la cromatina

(Layboum y Kadonaga, l99l). La reconstitución de la cromatina da como resultado la

represión de la transcripción in vitro. El factor TFllD, que reconoce al elemento TATA, u

otros factores específicos que se unen al DNA, pueden, cuando se unen antes de la

reconstitución de la cromatina, contrarrestar la represión de la transcripción mediada por la

cromatinización. La transcripción con moldes de DNA cromatinizados es altamente sensible a

los niveles de la histona H1. La histona Hl es un potente represor de la transcripción mediada

por la RNA pol ll, y ciertos factores de transcripción específicos de secuencia son capaces de

impedir la represión mediada por l-ll (antirepresión). Es posible que algunos factores de

transcripción puedan unirse al DNA solamente durante la replicación y posterior ensamblaje

de la cromatina, mientras que una subclase específica sea capaz de desplazar o causar una

reconfiguración de los nucleosomas (ver figura A y H). Es probable que algunas regiones

regulatorias en células que no se dividen estén empaquetadas en estructuras de la cromatina

que son resistentes al desplazamiento directo por factores trans-activantes.

La inhibición de la transcripción por nucleosomas aumenta progresivamente con el

grado de reconstitución de la cromatina y una densidad fisiológica de nucleosomas da como

resultado una inhibición de la transcripción de 4 veces respecto del DNA desnudo, comoconsecuencia de la ubicación de los "core" de los nucleosomas ubicados en los sitios de

iniciación de la transcripción. Hay modelos que sugieren que en la región promotora de

genes transcripcionalmente activos hay una disminución del número de "cores"

nucleosomales y de moléculas de histona l-ll. El paso limitante en la iniciación de la

transcripción in vivo podría ser el desplazamiento de los "cores" nucleosomales y de la histona

Introducción

H1 de la región promotora de los genes (Sharp, 1991). Esto explicaría el motivo de los bajos

niveles de activación observados en experimentos realizados ¡n vitro respecto de similares

realizados in vivo, ya que la cromatinización del DNA en los primeros es incompleta.

FIGURA A. Roles sibles de factores ue actúan en (ramInactive (arriba): un nucleosoma no perturbado con el "core" y la histona H l; (l) el factor Fse une al DNA "linker" y desplaza la histona H1 del "core" adyacente; (2) el factor F se une alDNA donde comienza el nucleosoma; (3) el factor F se une en el eje de simetría; (4) el factorG de5estabi|iza al nucleosoma, permitiendo la unión del factor F.

Existen también zonas del DNA denominadas regiones de control de locus (LCR),

que jugarian un rol en la estabilización de la cromatina abierta (Felsenfeld, 1992). Estas

regiones son elementos que actúan en cís y hacen que la expresión de genes o grupos de

genes asociados sea independiente de su posición dentro del genoma. En el caso del gen de la

beta globina, un LCR está ubicado en una zona a 10-20 kb "upstream" del gen. Aunque tienen

un efecto similar al de los enhancers, en la mayoría de los casos son distinguibles de esas

actividades, ya que la gran parte de ellos no funciona como enhancers en experimentos de

expresión transitorias, pero los mismos aumentan la transcripción cuando están establemente

integrados al genoma. Se sugiere que el rol priman'o de los LCR sería establecer interacciones

cooperativas que mantengan al promotor libre de histonas.

Introducción

PROMOTORES DE RNA POLIMERASA ll.

Los promotores y enhancers que controlan la transcripción de genes que codifican

para proteínas están compuestos de elementos genéticos múltiples, o módulos (Dynan, 1989).

El término promotor describe a un grupo de módulos de control de transcripción que

están agrupados alrededor del sitio de iniciación de la transcripción. Los promotores están

compuestos por módulos funcionales discretos, cada uno de ellos consiste e n

aproximadamente 7-20 bp de DNA, y contiene uno o más sitios de reconocimiento para

proteínas reguladoras de la transcripción. Al menos un módulo por promotor funciona para

posicionar el sitio de iniciación de la transcripción. El ejemplo más conocido es el elemento

TATA, pero en promotores que no lo poseen, hay un elemento discreto superpuesto al sitio de

iniciación, que ayuda a fijar el sitio de iniciación. Otros módulos adicionales, regulan la

frecuencia de iniciación. Estos son habitualmente llamados URE. por "upstream regulatory

elements". Típicamente, están ubicados entre 30 a 150 bases "upstream" del sitio de iniciación,

aunque en muchos promotores también se encuntran ubicados "downstream" del sitio de

iniciación. El espaciamiento entre los módulos es flexible, y la función del promotor es

preservada cuando los elementos están invertidos, o desplazados en su posición relativa unos

de otros. Dependiendo del promotor, los módulos individuales pueden funcionar tanto

cooperativamente como independientemente para regular la transcripción.

Los enhancers fueron originalmente detectados como elementos genéticos que

incrementaban la transcripción de un promotor ubicado en una posición distante en la misma

molécula de DNA. Los enhancers están organizados de manera similar a los promotores, es

decir, compuestos de varios módulos individuales, los cuales unen una o más proteínas

reguladoras de la transcripción. El enhancer más estudiado es el del virus SV40, en el cual,

mutaciones en los módulos reducen la actividad de la región. En los virus con un módulo

mutado, se generan espontáneamente revertantes fenotípicas que poseen duplicaciones de los

módulos no mutados. Se necesita un mínimo de dos módulos de enhancer para que éste tenga

actividad, y la duplicación de uno de los módulos compensa totalmente la pérdida de actividad

de los otros. Los módulos discretos pueden ser divididos en secuencias de DNA aún más

pequeñas que parecen ser la estructura básica de la estructura de los enhancers. Estas

secuencias se denominan "enhansons", y probablemente corresponden a sitios de unión

individuales para proteínas reguladoras de la transcripción. Un enhancer puede estar formado

por uno solo enhanson, o por varios, ya sean iguales o diferentes. Los enhancers actuarían

mediante una interacción de los factores unidos con los factores generales del aparato de

transcripción, en una reacción en la cual el DNA interviniente forma un rulo ("loop") (Su et

al.,l990).

Introducción

Los promotores se diferencian de los enhancers de manera operacional. Los

promotores tienen módulos que dirigen la iniciación de la transcripción en sitio y orientación

particular, mientras que los enhancers carecen de estos módulos.

PROMOTOR DEL GEN DE LA FlBRONEQI INA HUMANA.

La expresión del gen de la fibronectina está regulada por distintas señales

extracelulares. Es altamente inhibida por transformación neoplásica, y esto ha sido

correlacionado con un incremento en la metástasis de las Células tumorales (Hynes et al.,

1979; Raz et al., 1986; Schalken et al., 1988; Muro et al., 1991). La síntesis de FN es inducida

por glucocorticoides y por el factor TGF-B (Oliver et al., 1983; lgnotz et al., 1987). Los

glucocorticoides tienen un rol bien conocido en respuesta a "stress", sugiriendo que podrían

proveer un mecanismo temprano de inducción de FN en procesos tales como cicatrización de

heridas. El efecto del TFG-B en la diferenciación celular podría ocurrir mediado a través de la

regulación de los componentes de la matriz extracelular, dado que éstajuega un rol importante

en la determinación de la morfología y comportamiento celulares. La transcripción del gen de

la FN está también regulada por los niveles de CAMP intracelulares. En la mayoría de los

casos, la transcripción del gen es estimulada por CAMP(Dean et al., 1988,1989), sin embargo

en Célulasde la granulosa su efecto es inhibitorio (Bemath et al., 1990).

La estimulación transcripcional causada por incrementos en los niveles de CAMPo

por agentes que elevan sus niveles intracelulares puede ocurrir por dos mecanismos: el

primero no requiere síntesis de proteínas, es decir, se produce activación de factores de

transcripción ya pre-existentes (FN en CélulasJEG-3, somatostatina, proencefalina, fosfoenol

piruvato carboxi quinasa, péptido intestinal vasoactivo y subunidad alfa de la gonadotrofma

coriónica). El efecto en estos genes es rápido e insensible a Cicloheximida. En el caso de la

FN en Células HT-IOSO,la inducción ocurre a través de un mecanismo diferente, que requiere

de la síntesis de proteínas, y el tiempo de respuesta es mayor a 24 horas. La respuesta a CAMP

es conferida por el elemento CRE ("cyclic AMP respense element") ubicado en la posición

170 del promotor (Dean et al., 1989).

El promotor de la fibronectina humana fue Clonado por el grupo de S. Bourgeois en el

año 1987 (Dean et al., 1987). Posee la secuencia ATA'ITA en la posición -25, y la secuencia

CCAAT en la posición -lSO (fig. B). Las secuencias GGGGCGGG, ubicadas en las

posiciones -104 y -98, corresponden a sitios de unión del factor SP1. La secuencia

TGACGTCA en la posición -l73 corresponde al elemento que confiere respuesta a CAMP

(CRE). Hay varias regiones que muestran una homología limitada con el elemento regulatorio

Introducción

de glucocorticoides (posición —206y en las posiciones +218 y +302). Existen dos sitios de

unión del factor AP-2 en las posiciones -120 (3'CCGCCCGCC5') y -70 (3TCCCCCGCG5').

-500 —130 460I | '

num-um Illfllbbbl l I lCl

-440 —420 -100| I I

HEHTTPPPPPPPTPIKII __flflfififlflTGTCCTCHRHCHCTRCCHCCRCCCHE?

-380 -360 -340I | I

PPP "¡PTTGCHHLLLLIÏCÜLllLHLHLHHUILCCHHÏ

-320 -3UO —280

| | I

CHGCCHCTCCCÏTTCCTCCCRGCCGCTÏCCCHTCCCTTCCCCCRTCCCCÏHHHRHGTTTG

-260 —210 —220I

RTRRPPnPflRflflfiR-n-I IUILI¡uLLLLHUILL¡UDLuuuLLnILHuLn

-200 -IBO -160I l l

TCTCTTTTGTTCGCTGCGHHCCCHCRGTCCCCCGIQflQfilfiflCCCGGHGCCCGGüfififlfllCHE CCRBÏ

-110 —lZÜI l __SL-_L

CGGGCGCGGTCGGCTGCGGCGGCCGGCfififififififififififiïüüüüïGGGGCfiQfifiQfififififltHP-2 SP-l

—80 -60 —10

| | |

HGCCCGGCGGGTCTCTCCIEEQEQEEEECCCBGGCCTCCHGHGGGGCGGGRGGGCCGTCCHP-Z

-20 ‘20l I

mÏBThH'I | l ¡un Il l I nl nl ll l IIH| nl l I nl Ill llllII ll|ll|l IIII I'llIBTR

FIGURA B. Secuencia del promotor del a.en de la fibronectina humana.El sitio de inicio de la transcripción es indicado con una flecha en la posición +1. Lassecuencias que son similares a elementos regulatorios conocidos se encuentran subrayados.

También fue demostrado que el elemento CRE de la posición - l70 es responsable de

la estimulación por suero (Dean et aL, 1990). El incremento de la transcripción parece resultar

de una rápida unión de proteínas al sitio CRE, inducida por suero , que no requiere de latraducción.

En el caso de las células de la granulosa, la inhibición de la síntesis de mRNA de FN

requiere la presencia de la región ubicada entre las posiciónes —221y —500,es enteramente

dependiente de la síntesis de proteínas inducidas por CAMP,y enmascara el efecto activador

CRE dependiente (Bemath et al., 1990).

MECANISMO DE INICIACION DE LA TRANSCRIPCÍON POR LA RNAPOLIMERASA ll.

A- En promotores con elemento TATA.

La iniciación de la transcripción en sistemas eucarióticos es una reacción complicada,

en la que intervienen numerosos factores, además de la RNA pol ll, formando distintos

complejos de manera secuencial. Algunos de los factores involucrados en el proceso son:

TFIIA, TFllB, TFIID ,TFlIE , RAP30/74, TFIlI-l, y TFIIF.

Como se mencionó anteriormente, dos clases de elementos de DNA actuantes en ci:

están encargados de modular la trascripción dirigida por el elemento TATA. Los elementos

situados en la región "upstream" del promotor a una distancia corta, y los elementos enhancer

que pueden estar ubicados hasta a varios miles de bases del sitio de iniciación de la

transcripción. La iniciación específica por la RNA pol Il requiere de la acción coordinada de

múltiples factores proteicos. Estos pueden ser clasificados en dos categorias: a-. factores

generales de transcripción; y b-. proteínas que se unen a elementos "upstream" del promotor,

también llamadas reguladoras de la transcripción.

La velocidad de iniciación de la transcripción está determinada finalmente por los

factores que reconocen secuencias en elementos enhancers. sitios "upstream" del elemento

TATA, y el elemento TATA mismo.

El gen de la RNA pol II ha sido clonado en diversos organismos, así como los de

algunos de los factores generales de transcripción y numerosos factores reguladores

específicos de secuencia.

Originalmente se utilizaban para el estudio de la iniciación de la transcripción

fracciones medianamente purificadas que poseían "actividad" con las que era posible

reconstituir un sistema que transcribiera en forma específica al promotor tardío principal de

Adenovirus. Para poder ver sólo una ronda de iniciaciones, el grupo de Roeder utilizó el

detergente aniónico Sarkosyl, que en concentraciones de 0.015% era capaz de impedir una

nueva ronda de iniciaciones, pero no la elongación (Hawley y Roeder, 1985). De esta forma,

utilizando fracciones medianamente purificadas, se caracterizaron tres pasos en la iniciación de

la transcripción en base a diferente sensibilidad al Sarkosyl (figura C).

0.0|5°/o 0.25%

Sorkosyl Sork05yll l

DNA Templo” i Rapid i lnilioled ElongolingRNAPoll] —- Commilled—> Slarl Comme! ComplexFactors Complex Complex

2 NTP's 4 NTP‘s

HGUM C. Pasos ro uestos en la iniciación de la transcri ión orla RNA limerasa II.

El primer paso es lento e involucra el "commitment" o compromiso del molde a la

transcripción, que requiere la presencia de los factores TFIIA y TFIID. Luego, sigue la

formación de un complejo transcripcionalmente activo o complejo de comienzo rápido o

complejo de preiniciación, por analogía con el mecanismo de transcripción en Ecolí . Este

paso requiere los factores THIB, TFIIE y la RNA pol II. El tercer paso es la utilización de

energía (dada por la hidrólisis de la unión fosfato beta-gama de ATP o dATP), seguido de la

iniciación de la transcripción (formación de la pn'mera unión fosfodiester), y por último, la

elongación , con algunos componentes de transcripción aún asociados al molde.

Una característica de las RNA polimerasas eucarióticas es que están primariamente

gobernadas por interacciones específicas proteína-proteína, más que a través de unión a una

secuencia específica de DNA, como ocurre en procariotas.

Estos pasos fueron conociéndose más en detalle a medida que fue posible obtener

fracciones cada vez más purificadas de los distintos factores.

El grupo de P. Sharp (Buratowski et aL, 1989) describió cinco complejos en la

iniciación de la transcripción por la RNA pol Il, haciendo uso de geles de alta resolución con

ensayos de unión de factores a DNA y footprinting con DNasa I de los complejo formados .

El factor TFIID reconoce en forma específica la región TATA de los promotores.

formando así el primer complejo en la iniciación (Cl) (figura D) (Greenblatt,l991;

Buratowski et al., 1989). Este complejo de preiniciación "committed" (Cl) es resistente a

incubación con dedC o Sarkosyl. El complejo TFIID-Promotor dirige el ensamblaje

ordenado del resto de los factores generales de transcripción y la pol II para crear un complejo

multiproteico capaz de iniciar la transcripción. Posiblemente este factor se una al DNA,

junto con TFIIA, formando el complejo 2 (C2) (fig. D), aunque el requerimiento de IIA es

discutido por distintos grupos. Las observaciones varían desde su total dispensabílidad

(Sawadogo y Roeder,l985), a ser fuertemente estimulatorio (Buratowski et aL, 1988; Sarnuels

IO

y Sharp, 1986; Egly et al., 1984), hasta ser absolutamente necesario (Reinberg et al., 1987).

Este factor estabiliza la unión del TFllD a la secuencia TATA del promotor de MLP2 ("major

late promoter 2") de Adenovirus (Buratowski et al., 1989). Es posible que diferentes TATA de

distintos promotores tengan requerimientos diferenciales del TFIIA. El factor TFIIA no se

une directamente al DNA, pero induce cambios en el patrón de footprinting de TFIlD. El

primero de ellos es cuantitativo: reduce aproximadamente dos veces la cantidad de TFIID

necesaria para saturar la secuencia TATA del promotor "ML " de Adenovirus; y el segundo es

cualitativo: extiende la región protegida a la DNasa l y genera una banda hipersensible.

Ambos fenómenos ocurren en la zona "upstream" de la región protegida. El TFlIA es un

atractivo blanco para la regulación de la transcripción en virtud de su potencial de incrementar

la afinidad del TFlID por el DNA, de servir de puente entre factores reguladores y el TFlID, y

por servir como un sitio de interacción para el factor general TFIIB, el que se asocia con el

complejo de preiniciación despues de formarse el complejo TFIID-TFllA-promotor (

Meisterenst y Roeder, 1991).

La fracción normalmente denominada TFIID, con capacidad de reconocer el elemento

TATA de los promotores, es resuelta en dos complejos macromoleculares de diferentes

tamaños: uno de 300 kDa, y otro de más de 700 kDa (Timmers y Sharp, 1991). Ambos

complejos contienen la proteína de 38 kDa TBP (TATA binding protein), responsable delreconocimiento del elemento TATA. La TBP interactúa con numerosos factores asociados,

que se denominan TAFs (TATA-binding protein-associated factors), los cuales intervendn'an

en el reconocimiento específico de los promotores. Recientemente se demostró que los

aparatos transcripcionales de las RNA polimerasas l y Ill eucarióticas también poseen la

proteína TBP, asociada con diferentes TAFs según sea el tipo de promotor. Los TAFs no

participarían solamente en el reconocimiento de la secuencia para la especificidad del

promotor, sino que estarían probablemente involucrados en seleccionar la RNA polimerasa

apropiada (Sharp, 1992).

El gen que codifica para el factor TBP fue clonado en varios organismos (levaduras,

Drosophila, humanos) por diversos grupos. Al comparar las secuencias de los factores

clonados, se observo que la parte C-terminal de la proteína está altamente conservada entre las

distintas especies. Los N180 aminoácidos C-terminales de la TBP formarían un core"" de

secuencia conservada que es requerida para su nivel de actividad basal (Lewin, 1990). No seencontró similitud de secuencia en los dominios N-terminales de la TBP analizados.

Experimentos realizados con TBP clonados de distintas especies, y con sus mutantes de

deleción de la región N-terminal sugieren que habrían evolucionado para satisfacer las

funciones específicas de las especies (Lewin, 1990).

El factor TFIIB ha sido purificado de células HeLa, y permite la asociación de la

polimerasa al complejo THID-TFllA-promotor, actuando como un puente entre la polimerasa,

el TFllA y el TFIID, formando el C3 (fig. D). Ninguno de los factores de transcripción

generales. con excepción de la TBP, es capaz de unirse por sí solo al DNA y dar complejos

específicos. La polimerasa agregada a la mezcla de reacción no genera complejos de mayor

orden (complejos 4 y 5) a menos que al TFIIB este presente, sugiriendo que en ausencia de

TFIIB la polimerasa no se une en forma estable. El TFIIB es capaz de unirse a la polimerasa

aún en solución. Por lo tanto, es muy probable que el factor TFIIB actúe como puente entre el

complejo TFIlA-TFllD-Elemento TATA y la Polimerasa. Se ha observado recientemente que

el factor TFIIB es capaz de unirse a proteínas activadoras como VP16 (Lin y Green, 1991).

Dos dominios de activación de proteínas reguladoras de la transcripción, como por ejemplo

VP16, unidos al DNA, aceleran el paso lento en en ensamblado del complejo de iniciación con

la RNA polimerasa Il poniendojuntos al factor TBP y al TFIIB, posibilitando así la unión de

los restantes factores generales al complejo de iniciación (Greenblatt, 1991). TFIIB estaría

también involucrado en "medir" la distancia al sitio de iniciación de la transcripción. La

polimerasa no se une eficientemente al TFIID, a menos que el TFIIB esté presente. Una vez

agregada la RNA pol II al complejo 3 o el complejo TFIIB-pol II al complejo 2, se forma el

C4 (fig. D). Luego se une al complejo 4 el factor TFIIE formando el C5 junto con las

proteínas RAP30/74; Algunos autores afirman que las proteínas RAP30/74 se unen

previamente al factor TFIIE (Aso et al., 1992). Estos complejos de mayor orden no se forman

en ausencia de la RNA pol ll. RAP30/74, o proteínas asociadas, serían requeridas para

"desenrrollar" el DNA en la zona del promotor para formar un complejo abierto (Greenblatt,

1991). Las proteínas RAP30/74 impiden que la polimerasa se una al DNA en forma

inespecífica de secuencia, y puede disociar los complejos DNA-polimerasa inespecíficos. La

subunidad pequeña RAP30 se une directamente a la pol II y parece estar estructuralmente

relacionada al factor sigma bacteriano en su región de unión a la RNA polimerasa.

Los cDNAs de las proteínas RAPBOy RAP74. y el factor TFllE fueron recientemente

clonados (Sopta et al., 1989; Aso et al., 1992; Finkelstein et al.,l992; Peterson et al., 1991).

TFlIE un heterotetrámero con estructura alfa2 beta2, que estaría involucrado en interacciones

proteína-proteína con la polimerasa ll y con el factor TFlll-l. No posee capacidad de unir el

DNA por sí mismo.

La formación del quinto complejo es inhibida por la presencia de alfa-amanitina, y por

lo tanto este complejo representa el de transcripción mediada por la RNA pol ll.

FIGURA D. Modelo es uemático de la estructura molecular de los com le'os.La flecha indica el sitio de iniciación de la transcripción, y los números las posiciones ennucleótidos relativas al mismo.

Es posible que in vivo la pol ll y el TFTIE, y quizás el TFIIB se asocien previamente a

agregarse al complejo TFllD-TFllA-elemento TATA. preparaciones que contenienen TFllE

poseen actividad de ATPasa dependiente de DNA. Este requerimiento de energía puede ser

satisfecho por ATP o dATP, para generar un complejo de transcripción activado.

El factor TFlIE se disocia del complejo al agregar ATP/dATP, perdiéndose la

protección a la DNasa en la zona "downstream" a la polimerasa.

B- En promotores sin elemento TATA.

Existe otra clase de promotores de la RNA pol ll, los cuales se caracterizan por no

poseer elemento TATA. La principal diferencia entre estos dos tipos de molde es el

mecanismo por el cual unen al TFIID al promotor (Pugh y Tjian, 1991). En promotoresconteniendo elemento TATA, la TBP se une directamente al DNA mediante interacciones

específicas de secuencia. En los promotores sin elemento TATA, el molde no tiene

especificidad intrínseca por la TBP, y ciertos activadores unidos a otras secuencias distintas

del elemento TATA son capaces de reclutar el complejo TFIID asociado al TBP vía enlazado

del factor ("factor tethering") (figura E). Dado que ambos tipos de promotores aparentemente

requieren las mismas funciones basales iniciales, es muy probable que el complejo TFIID

unido forme un complejo de preiniciación similar en ambos tipos de promotores.

RNA ml IlTFllA,-B,-E.-F

FIGURA E. Modelo de activación or "tetherino" enlazado del factor SPl.El modelo muestra al factor de enlazado interactuando con el factor TFIID, reemplazando elelemento TATA de los promotores.

El complejo de preiniciación básico permanece inalterado tanto para promotores que

contienen elemento TATA como para los que no contienen, pero la especificidad del promotor

por la unión del TFIID es llevada a cabo a través de interacciones específicas proteína-proteína

mediante "factor tethering" y factores específicos unidos al DNA en vez de interacción directa

del TFIID con el DNA del elemento TATA. Es posible que la TBP pueda interactuar

directamente con el DNA una vez producida la interacción proteína-proteína. Fue descripto un

elemento iniciador ,que se encuentra en algunos promotores sin elemento TATA, así como en

algunos que poseen elemento TATA. Se trata de la secuencia iniciadora ("INR") (Roeder,

1991). A este elemento se une el factor designado TFIl-I, que es capaz de sustituir al TFllA

en presencia de otros factores generales, indicando la existencia de caminos alternativos para

la formación del complejo de preiniciación. La presencia de TFIID es requerida para la

activación del promotor en los complejos análogos en que el TFIID participa para promotores

que poseen elemento TATA. Estos complejos son : TF'llD-TFlI-I y TFIID-TFII-I-TFIIB.

La adición de otros factores a estos complejos presumiblemente procede de manera similar a

14

lo que ocurre en promotores con elemento TATA. La unión del factor TFll-l al promotor

probablemente estabilice la unión subsiguiente del TFllD. También ha sido descripto un

complejo similar para promotores que no poseen elemento TATA, pero que poseen elementos

ricos en GC que unen al factor SP1 (Pugh y Tjian, 1991). El factor SP1, cuando se encuentra

unido al DNA, actuaría reclutando al TFllD via "factor tethering" (fig. E) (Pugh y Tjian,

1990).

Muchos de los promotores que no poseen elemento TATA poseen un muy alto

contenido de secuencias ricas en GC. Entre estos genes se encuentran los genes de

hipoxantina fosforibosil transferasa, dihidrofolao reductasa, adenina fosforibosil transferasa,

adenosina deamínasa, fofoglicerato kinasa y hidroximetilglutan'l CoA reductasa (Dynan,

1986). Otros promotores que llevan el sitio de unión del factor SP1 poseen también el

elemento TATA como en el caso de los genes para la triosa fosfato isomerasa y la

fibronectina. Todos estos promotores dirigen, en general, la expresión de enzimas que

participan en caminos metabólicos esenciales y están ampliamente distribuidas. Sus genes son

llamados "housekeeping genes" porque son expresados durante todo el ciclo celular con unnivel basal.

FACTORES REGULADORES DE LA TRANSCRIPCION.

Dominios de dimerización y de unión al DNA.

Además de los factores generales de transcripción (TFIID, lIA, llB, llE, etc) existen

otros factores denominados regulatorios. Los factores generales de transcripción son capaces

de interactuar productivamente con elementos "core" de los promotores en estudios in vitro,

aunque estas interacciones no son fácilmente observadas in vivo (Roeder, 1991). El rol de los

factores regulatorios es el de estimular las interacciones entre los factores generales que deotra manera sen'an limitantes.

Las actividades de unión al DNA de muchos factores han sido localizadas en

subregiones relativamente pequeñas consistentes en 60 a 100 aminoácidos. Estos dominios de

unión al DNA son necesarios pero no suficientes para que los factores sean

transcripcionalmente activos (Mitchell y Tjian, 1989). Las proteínas reconocen al DNA en

esencialmente la misma forma que reconocen otras proteínas. Esto es, tienen una estructura

tercian'a o forma que es compatible con la superficie con la que debe interactuar. Entonces es

posible que se ubiquen suficientemente cerca en una amplia superficie como para establecer

interacciones atómicas. Así como entre proteínas, los contactos atómicos entre el DNA y

proteínas también son variados, incluyendo puentes de hidrógeno, interacciones iónicas e

IQ

Introducción

interacciones hidrofóbicas (Johnson y McKnight, 1989). Sin embargo, parece no haber un

código general que especifique el aminoácido necesario para interactuar establemente con una

dada región del DNA (Landschulz et al., 1988). Un número limitado de motivos estructurales

"dirige" a las cadenas laterales de los aminoácidos apropiados de una proteína hacia el surco

mayor de la doble hélice del DNA, donde interactúan directamente con las bases. Estos

motivos estructurales están compuestos primariamente de residuos que no hacen contacto

directo con el DNA. Estos forman un "esqueleto" tridimensional que dirige el

posicionamiento apropiado de la superficie de la proteína, permitiendo la interacción atómica

entre las cadenas laterales de los aminoácidos y los pares de bases, la cual determina la unión

específica al sitio de DNA. Es en estos "esqueletos", más que en las secuencias de la

superficie de contacto, donde se observa conservación de secuencias entre factores. Hasta la

fecha, distintos tipos de dominios de unión al DNA han sido descriptos : dedos de zinc ("Zinc

fingers“), hélice-vuelta-hélice ("helix-tum-helix"), hélice-horquilla-hélice ("helix-loop-helix"),

cierre de leucina-región básica ("leucine zipper-basic region"), y otros dominios que no hansido clasificados.

"Zinc finoer": Este motivo fue descubierto como consecuencia de estudios de

expresión de los genes ribosomales SS de Xenopus leavís (Miller et al., 1985). La

transcripción de los genes SS está regulada por un promotor interno, al que se une el factor de

transcripción TFIIIA, el cual,junto a al menos otros dos factores (TFIIIB y TFlIlC) forma un

complejo estable que es blanco de la RNA polimerasa III. Se observó en el factor TFlllIA

una distribución secuencial y ordenada de residuos cisteína e histidina repetida nueve veces en

la estructura primaria (Cys-N34-Cys-N3-Phe-N5-Leu-N3-His-N3-His). Estas observaciones,

asociadas a resultados previos que mostraban que el factor TFIIIA estaba acomplejado a Zn,

llevó al grupo de Klug a postular que cada repetición secuestraba un solo ión de Zn vía

coordinación tetrahédrica con los residuos de His y Cys conservados . Los doce aminoácidos

que están entre las Cys y las His podrían hacer "loop out" facilitando así la interacción directacon el DNA.

La característica distribución espacial de His y Cys dentro del factor TFllIA pen'nitió

la rápida identificación de otras proteínas que posean "zinc finger". Se encontraron estos

dominios en proteínas regulatorias de la transcripción desde levaduras, pasando por insectos,hasta humanos.

Una secuencia altamente relacionada con los "Zinc fingers" ha sido observada en una

gran cantidad de proteínas que unen DNA, desde receptores de hormonas en mamíferos hasta

proteínas regulatorias en levaduras. Este motivo está formado por grupos de 4 a 6 residuos de

cisteína, agrupados de a pares, separados por 2 o 4 aminoácidos. Estos dominios son llamados

"Cysszysz f'mgers" y también requieren Zn para unir DNA. Han sido encontrados en

16

proteínas que unen DNA, como los receptores de glucocorticoides, estrógenos, progesterona,

vitamina D, mineralocorticoides, y en los productos de los genes GAIA, PPRl y ARGRII de

levadura. Poseen la misma estructura Cys-Ng-Cys-N13-Cys-Ng-Cys.

El grupo de Klug identificó una periodicidad de guaninas, en promedio cada 51/3

bases en el sitio de unión de TFlllA, que se extiende por 50 bp, y basado en esto postuló que

cada motivo de "finger" se une a media vuelta del DNA y que la periodicidad de Sl/g pb se

correlaciona con la interacción de estructuras de finger contiguas con el DNA (Rhodes y

Klug, 1986).

"Leucine-zipmr": Este modelo fue descripto por primera vez con el clonado del factor

C/EBP por el grupo de Steven McKnight (Landschulz et al.,l988). La secuencia de

aminoácidos de la región de unión al DNA de C/EBPen la región de unión al DNA tiene

similitud con la de los factores ya clonados JUN, FOS y MYC. El motivo consiste en una

repetición periódica de residuos de leucina, separados por 7 u 8 aminoácidos, formando parte

de una inusualmente larga alfa hélice, donde el lado de leucinas de una cadena se interdigita

con la misma estructura de un segundo polipéptido formando así un dímero unido no

covalentemente. Estas hélices apareadas juegan un rol fundamental en dar forma a la

superficie de contacto para la interacción secuencia específica con el DNA.La secuencia de aminoácidos del dominio de unión al DNA de C/EBP contiene una

abundancia de residuos con cadenas laterales cargadas, especialmente Lys y Arg. Al

posicionar los residuos de ese dominio como pertenecientes a una alfa hélice, un lado de la

hélice queda compuesta predominantemente de aminoácidos hidrofóbicos (leucina), mientras

que el otro lado queda compuesto de residuos con la cadena lateral cargada y cadenas laterales

sin carga, pero polares (ver figura). La hélice, en posiciones vecinas a la "espina" de leucinas,

es rica en aminoácidos hidrofóbicos, creando así un lado hidrofóbico de la molécula por seis a

ocho vueltas de hélice. Esta estructura hidrofóbica de la hélice requiere una estructura

"complementaria", la cual es donada por la misma hélice de un segundo monomero. La cadena

lateral de la leucina posee dos grupos metilos en su carbono gamma. y ninguno en el beta.

Como tal, su cadena lateral es larga, simétrica y voluminosa en su extremo. Estas propiedades

permitirían a los residuos de leucina de una alfa hélice interdigitarse con aquellos de una

segunda alfa hélice, formando un "cierre" molecular entre los dos polipéptidos (ver figura F).

El "cierre" de leucinas yuxtapone así las regiones básicas de los dos polipéptidos en

una manera apropiada para el reconocimiento específico del DNA.

Introducción

FIGURA F. Modelo de la estructura de "zi er" de leucinas.

Las proteínas que poseen cierres de leucina no son capaces de dimerizar al azar. Por

ejemplo GCN4 y C/EBP forman homodímeros, mientras que FOS y JUN forman

heterodímeros. La formación de heterodr’merospodría resultar en nuevas propiedades de

reconocimiento de DNA, o en diferentes actividades regulatorias, expandiendo así el repertorio

de un número determinado de factores de transcripción. La posibilidad de que diferentes

complejos de proteínas posean actividades reguladoras de la transcripción diferentes proviene

de la observación de que FOS puede actuar como una proteína regulatoria positiva o negativa

en diferentes contextos de secuencia de DNA. En efecto, FOS es capaz de estimular la

transcripción cuando se une al sitio AP- 1/TRE, pero actúa negativamente cuando está unido al

elemento regulatorio específico de adipocitos (Currran y Franza, 1988; Vogt y Bos, 1989). El

sitio AP-l/F RE es reconocido por el factor heterodimérico JUN/POS (ver más adelante).Helix-tum-helix hélice-vuelta-hélice Helix-loo -helix hélice-bucle-hélice : Esta

estructutra (HTH) fue primero estudiada en procariotas. Las estructuras de tres proteínas

regulatorias de la transcripción CRO, CI (ambas del bacteriófago lambda) y la proteína CAP

de E.colí (catabolite activator protein) fueron determinadas. Se sabía que las tres proteínas

unían DNA como dimeros, y que sus sitios de unión en el DNA tenían un eje de simetría.

Luego de obtenerse la estructura tridimensional de los factores, resultó evidente que

compartían una sucesión de dos alfa hélices separadas por un giro beta. A esta estructura se la

denominó hélice-vuelta-hélice. Combinando los datos estructurales y bioquímicos de la

proteína Cro, surgió un modelo en el cual el dímero Cro se encuentra anclado a la forma B del

DNA, en el que el eje de simetría del dímero coincide con el del DNA operador. De esta

IR

Introducción

manera, las dos hélices alfa 3 del dímero Cro están ubicadas en surcos mayores sucesivos, y

pueden utilizar las cadenas laterales de los aminoácidos para reconocimiento sitio específico y

unión al DNA (figura G). Las hélices alfa 2 están ubicadas cerca del DNA de manera tal que

su región N-terminal es capaz de hacer contactos no específicos con el DNA. La secuencia de

aminoácidos de cada proteína exhibe regularidad distintiva en ciertas posiciones (Johnson y

McKnight,l989; Brennan y Matthews, 1989).

‘ ‘ DNA-bind¡ngdomains

2- fold axis

FIGURA G. Modelo de la interacción de la estructura "Helix-tum-helix" con el DNA.(a) es la vista lateral, con el eje de simetría señalado con una flecha; y (b) es la vista de frentedel complejo. Los círculos en líneas de puntos indican la región que ocupa el dominio deunión al DNA.

Teniendo en cuenta estas posiciones conservadas, se buscaron proteínas reguladoras

en eucariotas. Se encontró similitud de secuencias con los productos del locus de tipo de

aparcamiento de Saccharomyces cerevísiae, MATal y MAT alfa2. Esta similitud de

secuencias pudo ser extendida a productos de los genes homeóticos de Drosoóphila,

antennapedía, filS/‘lirara:u y ultrabíthórax.

También se encontró un motivo similar , denominado "helix-"loop"-helix", en otras

proteínas involucradas en el control de la expresión génica durante el desarrollo, como las

proteínas que se unen a secuencias específicas en los enhancers de inmunoglobulinas E12 y

E47, las proteínas MyoD, Myf-S y miogenina, que juegan roles críticos en la determinación

muscular, genes del complejo achaete-scute (involucrados en la neurogénesis de Drosóphila),

rwist (involucrado en el establecimiento de capas germinales de Drosophila) y daughterless,

también de Drosophila. Consiste en 2 hélices anfipáticas separadas por una secuencia

"linker", con una o más vueltas beta , precedidas por una región básica, la cual está involucrada

en la unión al DNA y en la dimerización (Murre et al., 1989). Algunas de las proteínas de esta

familia pueden formar heterodímeros.

Dominios de transactivación de los factores de transcrimión.

Los factores activadores de la transcripción ejercen su efecto interactuando con una o

más proteínas del aparato de transcripción basal. Hay dos clases de activadores (Ptashne y

Gann, 1990) : la pn'mera clase posee una superficie de unión al DNA y una región activadora

acídica que interactúa con la proteína blanco del aparato basal (ej.: GALA), mientras que cada

miembro de la segunda clase posee sólo una de las funciones anteriores, y por lo tanto solo

puede actuar en células que le provean la función faltante (ej.: Octl y VP16) (ver figura H).

Los dominios acídicos interactúan directamente con el TFlID. Es necesario que otro(s)

componente(s), como por ejemplo los TAFs, interactúen con el complejo TFlID-activador

para lograr una respuesta completa al activador.

Los factores que no poseen el dominio de activación acídico como CTF/NFl o SPl ,

funcionarían a través de una clase de coactivadores que servirían como adaptadores

moleculares que conectarían funcionalmente a los primeros con el aparato de transcripción

basal (Mitchell y Tjian, 1989; Pugh y Tjian, 1990). El factor. unido a su sitio en el DNA,

interactuan’a con coactivadores específicos, los cuales a su vez interactuan’an con el TFlID

activando la transcripción. Dentro de este grupo de factores están las proteínas con dominios

activadores ricos en glutamina (25% de glutamina), presentes en los factores SP1;

Antennapedia, Zeste y Ultrabíthorax (estos tres últimos de Drosophila); HPAl, HPAZ y

GALll en levaduras; y en mamíferos OCT-l, OCT-2, Jun, AP-2 y SRF. Otros tienen

/dominios ricos en prolina (20 a 30%) como los factores AP-2, Jun, OCT-2 y SRF.

7.0

(a) . .antirepreSSIon

uchvaiondcn‘a‘n

DNAb {Y} ".7domain

achvalorprotein

TATAAA=

repression

achvnhon

fi

FIGURA H. Modelos de activación transcrimional.(a) Interacciones de proteínas activadoras podrían evitar la represión por histonas; (b) elactivador (en negro) lleva un dominio de unión al DNA, y una región activadora acídica. Elactivador unido a su sitio se "acerca" al sitio "blanco", produciéndose un "looping out" delDNA intercalado; (c) las actividades de unión al DNA y activadora acídica están en moléculasdiferentes. y ambas son requeridas para la activación.

7|

Introducción

Interacción entre factores.

Para llevar a cabo sus funciones, las proteínas que se unen a los enhancers y

promotores deben ser capaces de interactuar entre sí o con componentes de la maquinaria de

transcripción. Estas interacciones permiten a la maquinaria "sensar" el número de elementos

activos en una región enhancer o promotora. La capacidad de algunos factores reguladores de

la transcripción de interactuar entre sí puede ser infen'da por la habilidad de las proteínas de

unirse en forma cooperativa a sitios adyacentes (Dynan, 1989).

Es improbable que sólo la interacción directa proteína-proteína sea suficiente para

explicar la amplia gama de interacciones entre módulos de promotores y enhancers

eucarióticos. Hay ejemplos de módulos que son capaces de interactuar entre sí, a pesar de

estar separados por distancias que son demasiado grandes y variables como para permitir el

contacto directo entre las proteínas. Un ejemplo de esto son los módulos distales del promotor

del gen de la timidina kinasa del virus Herpes Simplex (HSV tk), los que en forma

independiente no contribuyen apreciablemente a la actividad transcripcional, mientras que la

transcripción se activa fuertemente si ambos están presentes, aún separados por 50 bp

(McKnight, 1982).

Dos tipos de modelos explican estas interacciones:

A - Los factores que están relativamente separados, son puestos en contacto por

plegamiento del DNA (ver figuras H e l). Este plegamiento sería inducido por las proteínas

unidas, ya que la distancia entre módulos es muy pequeña para permitir un plegamiento

espontáneo del DNA. Hay también ejemplos de factores que reconocen sitios contiguos en el

DNA que se unen de una manera cooperativa, es decir que la ocupación de uno de los sitios

aumenta la afinidad del factor por el otro sitio (Martínez y Wahli, 1989). En el caso del

promotor del gen de la proencefalina (Comb et al., 1988), los factores unidos a elementos del

DNA adyacentes actuarían sinergísticamente para regular la transcripción inducible por CAMP

del gen. Otro ejemplo es el del factor USF, que reconoce la secuencia ubicada entre las bases

63 y -52 del promotor principal tardío de Adenovirus, e interactúa cooperativamente con el

TFllD cuando ambos están unidos simultáneamente al DNA del promotor (Jackson y Tjian,

1988).

B - Un modelo diferente está ilustrado en la figura I: los factores unidos al DNA

interactuan indirectamente via una molécula integradora separada. Este tipo de modelo predice

la existencia de componentes celulares que ayudan a integrar la señal de los factores de

transcripción. Este sería el caso descripto por los grupos de Ptashne y Green (Carey et al.,

1990). En este ejemplo, el activador transcripcional de levaduras GAL4 se une a sitios

múltiples en el DNA para activar la transcripción en forma sinergística, interactuando

7.7.

simultáneamente con componentes de la maquinaria transcripcional, en vez de interactuar entre

sí directamente. En este caso la "molécula integradora" sería directamente el aparato de

transcripción basal.

RNA

V

FIGURA l. Modelos de interacción entre factores.

Los modelos A y B detallados en el texto se esquematizan en la figura, arriba y abajo

respectivamente.

DESCRIPCION DE ALGUNAS FAMILlAS DE FACTORES REGULATORIOS.

Factor de transcripción AP-Z.

El factor de transcripción AP-2 fue caracterizado originalmente en células HeLa. Es

una proteína de 50-52 kD que se une como dímero a múltiples sitios en promotores de SV40,

hGH (hormona de crecimiento humana), hc-myc, BPV (virus del papiloma bovino), H-2Kb

(gen Kb del complejo mayor de histocompatibilidad de ratón) y el promotor de la

metalotioneina llA humana estimulando su transcripción in vitro (Mitchell et al., 1987;

lmagawa et al., 1987). La secuencia de DNA que reconoce es T/cc/gC/gCCA/CNG/CC/GG/c_

En todos estos genes, la expresión es estimulada en respuesta a TPA, y se sabe que algunos

de ellos son inducidos por agentes que elevan los niveles de cAMP intracelular. La actividad

de AP-2 es incrementada en respuesta a tratamientos de las células con ésteres de forbol vía

activación de la proteína kinasa C, y con agentes que elevan los niveles de cAMP, por medio

de la proteína kinasa A. AP-2 contiene una región C-terminal de unos 200 aminoácidos que es

responsable de la dimerización y de la unión al DNA. La región de unión al DNA está

organizada de una manera similar a la región básica del "leucine zipper" y de las proteínas

HLH, con una zona de carga neta básica adyacente al area que tiene una estructura de alfa

hélice. Esta última contiene dos alfa hélices separadas por 80 aminoácidos los que no serían

73

Introducción

esenciales para la formación del dímero. Esta estructura fue denominada HSH (helix span

helix). El motivo HSH de AP-2 no contiene similitud de secuencia con las repeticiones de

leucina de los "zipper de leucina" ni con los motivos de dimerización de HLH. Estos últimos

poseen entre lO y 25 aminoácidos entre las dos hélices .

Factor de transcripción SP1.

El factor de transcripción SP1 es una proteína presente en células de mamíferos que se

une a los elementos ricos en GC de los promotores y selectivamente activa la síntesis de

mRNA de genes que contienen sitios de reconocimiento funcionales (Kagadonga et al., 1987).

SP1 fue originalmente identificado en células HeLa como una proteína de 105 kDa que se une

a las secuencias múltiples GGGCGG en los elementos repetidos de 21 bp presentes en SV40

y activando la transcripción del promotor temprano de SV40. Numerosos genes celulares

también son activados por SP1, hecho que se correlaciona con la presencia en sus promotores

múltiples sitios de reconocimiento ricos en GC . La secuencia GC más cercana al sitio de

iniciación de la transcripción está típicamente ubicada entre 40 y 70 nucleótidos del mismo, y

es funcional en cualquier orientación.

A Ser/Thr-n'chZn(|l) Fingers/\ /\

NH2[WI-IP: COZHGln-rich

DNA Bindíng

1100200300460560660696

FIGURAJ. Quema de la estructura del factor SPl.

A- Estructura de los 696 aminoácidos C-terminales de SP1. Las regiones ricas en Ser/Treo

son indicadas como rectángulos rayados, las regiones ricas en glutamina sen indicadas como

rectángulos sombreados, y los motivos de zinc "finger" se muestran como rectángulos llenos;

B- Secuencia y estructura de los tres motivos de Zn "finger" en SPl.

74

El factor SP1 contiene tres estructuras "Zn finger" contiguas ubicadas en los 168

aminoácidos C-tenninales, semejantes a las descn'ptas para el factor TFlllA, que requieren Zn

para su actividad de unión al DNA (ver figura J). Una de las características más sobresalientes

de la proteína es su alto contenido en glutamina (11.9%), serina (11.2%), y treonina (9.2%).

Estos aminoácidos están distribuidos en grupos ricos en glutamina que se alternan con grupos

n'cos en serina/treonina. Este factor se encuentra O-glicosilado, y el grado de glicosilación

sen'a importante en la regulación de la activación de la RNA pol ll (Jackson y Tjian, 19%).

El factor SP1 posee cuatro regiones, diferentes a los Zn fingers, que son importantes

para la activación transcripcional (Courey y Tjian, 1988). Hay dos segmentos ricos en

glutamina, ubicados en la porción N-terminal de la molécula, que sen'an requeridos para una

actividad normal. Este dominio constituye una nueva clase de motivo de activación de la

transcripción (fig. J).

Familia ATF/CREB.

La expresión de numerosos genes en eucariotas superiores está controlada por

hormonas. El nivel de regulación de la transcripción de los genes está mediado por

interacciones DNA-proteínas con elementos específicos en el DNA del promotor. En el caso

de las hormonas esteroideas y tiroideas, que son capaces de atravesar libremente la membrana,

las proteínas que se unen al DNA son también sus receptores. En el caso de hormonas

peptídicas incapaces de difundir a través de la membrana, la activación de los genes ocurre más

indirectamente a través de de la unión de la hormona a su receptor en Ia membrana plasmática,

un proceso que activa la formación de importantes segundos mensajeros intracelulares tales

como CAMP,diacil glicerol (DAG), inositol fosfato, calcio ionizado (Habener, 1990). Estos

mensajeros activan a su vez enzimas específicas, proteínas kinasas, que llevan a la fosfon'lación

y activación de proteínas que se unen al DNA. De esta forma, la información portada por

hormonas peptídicas lleva a la regulación de la transcripción. Dos de los caminos de

transducción de señales son los que llevan a la activación de la proteína kinasa A dependiente

de CAMP y a la proteína kinasa C dependiente de DAG. Todos los genes regulados por

CAMPaislados y caracterizados hasta la fecha comparten varias características (Roesler et al.,

1988). Son expresados en tejidos que responden a regulación por hormonas o factores

regulatorios, y la velocidad de transcripción es rapidamente alterada por CAMP. Las regiones

promotoras de estos genes han sido aisladas y se ha caracterizado a una región que confiere

regulación por cAMP a promotores neutros. Este elemento fue denominado CRE (cyclic

AMP responsive element), y posee eje de simetría (5' TGACGTCA 3'). La especificidad del

75

sitio de unión aparentemente requiere 5 bases en las regiones flanqueantes a esta secuenciaconservada.

El clonado de los cDNAs de distintos factores que se unen al DNA posibilitó

identificar a una compleja familia de proteínas transactivadoras transcripcionales que

comparten la propiedad de proveer interacciones transcripcionalmente productivas al estar

unidas al elemento CRE de los promotores. A estas proteínas se las denomino CREB (cyclic

AMP responsive element binding proteins)/ ATF (activating transcription factor). Al menos

10 cDNAs que codifican CREBs/ATFs estructuralmente diferentes han sido aislados y

estudiados (Habener, 1990).

El grupo de Roeder demostró en 1988 (Hai et al., 1988) que el factor ATP/CREB sería

requerido para el establecimiento, pero no para el mantenimiento y la subsiguiente función del

complejo de iniciación. El factor ATP/CREB estaría involucrado en la formación del primer

complejo ("commitment" del molde) pero no en los subsiguientes.

El miembro de esta familia más estudiado es el CREB-327841, cuyo cDNA fue

clonado por el grupo de Montminy a partir de corteza de cerebro de rata (González et al.,

1989), y por el de Habener, a partir de placenta humana ( Hoeffler et al., 1988). El dominio de

unión al DNA se puede dividir en dos subdominios: el "zipper " de leucina en posición C

terminal, involucrado en la dimerización, y una región básica ubicada "upstream" consistente

en dos hélices anfipaticas que forman el motivo HLH, que poseen el 50% de los aminoácidos

cargados positivamente (lisina y arginina) . Es una fosfoproteína, pudiendo ser fosforilada por

las proteínas quinasas A y C. La región amino terminal es el dominio de activación de la

transcripción, y posee entre los aminoácidos 82 y 150 (CREB 327) u 82 y 164 (CREB 341)

un dominio llamado P el cual posee sitios múltiples de fosforilación. Se demostró que las

serinas ubicadas en la posiciones l 19 (CREB 327) y 133 (CREB 341) son fosforiladas por la

subunidad catalítica de la proteína quinasa A (Lee et al., 1990; González y Montminy, 1989).

El reemplazo de esta serina (Ser l 19-133) por otros aminoácidos atenúa severamente la

transcripción inducida por CAMPo por proteína quinasa A y el grado de fosforilación de la

proteína. La fosforilación en esta posición (Ser l l9-l33) podría catalizar la fosforilación en

sitios más distantes ubicados en el dominio P y como consecuencia se podn’an producir

cambios conformacionales que le permitirían interactuar con el aparato transcripcional. El

dominio P podría ser fosforilado por proteínas quinasas diferentes de la PKA como la caseina

quinasa ll y la proteína quinasa C. El CREB 327 y 341 son productos del mismo gen por

"splicing" alternativo. La diferencia entre ambos consiste en un segmento de 14 aminoácidos

entre los residuos 88 a lOl. Esta región fue denominada región alfa (Yamamoto et al., 1990),

y define un motivo estructural y funcional dentro de la molécula CREB. El ACREB (CREB

327), que no posee la región alfa, es 5 veces más abundante que el CREB (CREB 341) y lO

7.6

Introducción

veces menos activo en cuanto a la transactivación de la transcripción. El ACREB servin'a para

regular negativamente la respuesta a CAMP,sirviendo quizás como inhibidor competitivo del

CREB (Yamamoto et al., 1990).

Otro factor clonado que se une al CRE es el CRE-BPl/ATF2 (Maekawa et al., 1989;

Hai et al., 1989). Posee un PM de 54.5 kDa, y es de mayor tamaño que el CREE-341

(PM=3840 kDa). La organización de sus dominios es básicamente similar al CREE-341, con

el dominio de activación de la transcripción en la región N-terminal, que poseeria el dominio

de fosforilación P, y luego, más hacia el extremo carboxilo de la molécula, el dominio de

unión al DNA dividido en la región básica y en el cierre de leucinas. En el extremo amino de

la molécula, contiene un "zinc finger" (CgHz), sugiriendo que esta región podría interactuar

con otras proteínas como Ela, que también posee secuencia de unión a metal. Es transcripto a

partir de un único gen, cuyo transcripto primario sufre splicing alternativo, y además hace uso

alternativo de promotores, generando al menos tres variantes denominadas CRE-BP] , CRE

BPZ y CRE-BP3 (Georgopoulos et al., 1992).

El CRE-BPl/ATFZ es capaz de formar heterodimeros con ciertos miembros de la

familia CREB/ATF tal como con el factor ATF3. También es capaz de heterodimerizar con

Jun y con fra-l (Fos related antigen-l) (Benbrook y Jones, 1990; Hai y Curran, 1991), y

posiblemente también con Fos (Hoeffler et al., 1991). Jun se une cooperativamente al CRE en

asociación con CRE-BPl/ATFZ. Las proteínas codificadas por las familias c-Jun y c-Fos

están involucradas en complejas interacciones con el sitio AP-l. El sitio AP-l es similar al

CRE, salvo por la deleción de una base: CRE 5'TGACGTCA 3' ; AP] STGACTCA 3' . El

zipper de leucina de CRE-BPl/ATFZ posee más semejanza con el de Jun que con el de Fos, y

es capaz de formar heterodimeros con JunB y con JunD, y también posiblemente conmiembros de la familia Fos.

A partir de células HeLa fue identificado y caracterizado otro miembro de la familia

CREB, de 120 kDa (Andn'sani y Dixon, 1990). Este factor es fosforilado in vilro en forma

eficiente por la PKC, y no por la PKA. No es capaz de transactivar la transcripción in virro de

un gen neutro bajo el promotor del gen de la somatostatina, que posee un sitio CRE. Esto

puede ser debido a inactivación del factor, falta de fosforilación o a que el CRE del promotor

del gen de la somatostatina no sea el blanco adecuado del factor.

Recientemente fue descripto un factor modulador de la actividad del CREB,

denominado CREM (por CRE modulator), de 29 kDa (Foulkes et al, 1991 a y b). Este es

capaz de heterodimerizar con el CREB, unirse al CRE del promotor de c-fos y bloquear la

inducción por CAMP. Existen isoforrnas del CREM con diferentes dominios de unión al

DNA, los que tendrían diferentes afinidades por distintos sitios CRE.

7.7

Introducción

Como se ve, la célula posee una gran diversidad de factores de transcripción

ATF/CREB. Existe una distribución relativa de los diferentes CREB/ATF de manera tejido

específica. La diversidad se genera a partir de: la existencia de genes multiples (al menos 10

cDNAs aislados hasta el momento); procesamiento post-transcripcional del pre-mRNA

resultando en complicados patrones de splicing alternativo; restricciones en la formación de

dímeros, ya que la formación de heterodímeros no es promiscua; y mediante modificaciones

post-traduccionales, como fosforilaciones que afectan tanto la especificidad como la afinidad

de algunos factores de la familia CREB/ATF por la secuencia blanco (Habener, l990).

Familia de las proteínas gue reconocen el sitio CCAAT {factores CCAAT o CFE).

El motivo de reconocimiento GCCAAT, generalmente llamado elemento CCAAT, fue

originalmente identificado como un elemento importante de los promotores transcriptos por la

RNA Pol II en genes eucarióticos. La purificación de factores que se unen a la secuencia

GCCAAT mediante cromatografías de afinidad identificó a una serie de polipéptidos de masa

molecular relativa entre 52 y 66 kDa. Estas proteínas, colectivamente denominadas factores de

transcripción que se unen a la secuencia CCAAT (Cl' F), actúan como proteínas específicas de

secuencia, iniciadoras de la transcripción. Además de estar presentes en muchos promotores

transcriptos por la RNA pol ll, el elemento CCAAT sirve también como una secuencia cis de

control en origenes de replicación virales.

Varios laboratorios han caracterizado una multiplicidad de factores que se unen a la

secuencia CCAAT, que luego, en muchos casos resultaron ser la misma proteína.

Los factores que reconocen esta secuencia son heterodiméricos. El factor CBF

(CCAAT binding factor) fue descripto por el grupo de B. de Crombrugghe (Hatamochi et al.,

1986) como un heterodímero (CBF-A y CBF-B). cuyas subunidades poseen diferentes

tamaños moleculares y diferentes propiedades. Este factor es capaz de activar la transcripción

de diversos promotores (colágeno alfa2(l) y alfal(l), RSV-LTR, ML de Adenovirus). El

grupo de P.Sharp (Chodosh et al., 1988) caracterizó 3 proteínas diferentes presentes en

células HeLa: CPl, CP2 y NFl/CTF. Las tres son heterodiméricas, y reconocen diferentes

elementos transcripcionales, todos ellos conteniendo la secuencia CCAAT. CPl se une con

alta afinidad a los promotores de alfa globina humana, hsp70 humana, H-2Kb, ML de

Adenovirus, y MSV-LTR. CP2 se une con alta afinidad a elementos CCAAT presentes en

promotores de gama fibrinógeno, H-2Kb, y MOPC-4l Vk. El factor NFI/CTF, reconoce

elementos presentes en los promotores de alfa globina, hsp70, HSV-TK, MSV-LTR. y B

globina. Los mismos elementos a los que se une NFI/CTF son también reconocidos por CPl,

con excepción de MLP de Adenovirus. Sin embargo, el factor NFl/CTF no reconoce el grupo

78

de elementos reconocidos por CP]. El factor NFI tiene las mismas propiedades que el factor

CTF descripto por Jones et al. (1987) en cuanto a la composición polipeptídica, propiedades

de unión al DNA, reactividad crumda inmunológica, y estimulación in vitro de la replicación

del DNA y la iniciación de la transcripción. Diferentes especies de CTF/NFl son el resultado

de "splicing" alternativo del mRNA (Santoro et al., 1988). Un único gen en humanos origina

al menos tres especies diferentes de mRNA por "splicing" alternativo. Un factor con

características similares al CTF/NFl fue descripto en hígado de rata (Paonessa et al., 1988).

Los factores CBF (Hatamochi, A. et al., 1986), CPl (Chodosh et al., 1988), la proteína

que reconoce el elemento CCAAT del promotor del gen de la albumina (Raymondjean et al.,

1988), y NF-Y (descripto originalmente en el elemento Y de los genes de clase ll del

complejo mayor de histocompatibilidad), resultaron ser la misma entidad (Hooft van

Huijsduijnen et al., 1990), la cual es a su vez el homólogo en mamíferos del complejo

Hap2/Hap3 de levaduras.

El factor C/EBP, también descripto originalmente como dos factores diferentes (CBP

y EBP), funciona exclusivamente en células arrestadas, tenninalmente diferenciadas. En el

hígado adulto está restringido a hepatocitos adultos, y células hepáticas en rápida proliferación

expresan sólo una pequeña fracción respecto del tejido adulto.

En resumen, son numerosas las proteínas capaces de reconocer el elemento CCAAT

de los promotores eucarióticos. Estas se unen a distintos promotores con distintas afinidades,

y aumenta aún más la posibilidad de regulación si tenemos en cuenta que algunas de las

subunidades pueden ser generadas por "splicing" alternativo, y su actividad puede ser

regulada en forma independiente, por distintas señales. Por ejemplo, factores similares a CPl

A podrían afectar la actividad transcripcional confiriendo una especificidad particular en, o

incrementando la eficiencia transcripcional de factores similares a CPI-B.

79

QBJETIVQS

Objetivos

me;En los últimos años se ha avanzado notablemente en la comprensión de la iniciación

de la transcripción en sistemas eucarióticos (Buratowski et al., 1989; Roeder, 1991). La

caracterización y posterior clonado de numerosos factores de transcripción, tanto reguladores

de la misma como miembros del aparato de transcripción basal ha facilitado el estudio en

detalle de los mecanismos que llevan a la iniciación de la transcripción. Factores del aparato

de transcripción basal como TBP, TFIIE, RAP30/74, TFIIB y TFIIA, así como numerosos

factores que se unen al factor de reconocimiento del elemento TATA, TBP, han sido clonados.

Esto permitió la obtención de factores recombinantes puros, y su utilización en sistemas de

transcripción reconstituídos. Estos factores interactúan con los factores reguladores de la

transcripción, que se encuentran unidos, en general, a sitios ubicados en regiones río arriba del

sitio de iniciación de la transcripción. Estas interacciones son las que finalmente determinan

los niveles de transcripción de los genes, ya sea en sistemas inducidos como reprimidos.

Por esto, consideramos que es de gran importancia el entendimiento de las

interacciones que ocurren entre los factores unidos al promotor de la hFN, que como se dijo

anteriormente son responsables de la eficiencia transcripcional del promotor.

Dada la importancia de la regulación por CAMPen la expresión del gen de la hFN, y

la existencia de diferencias específicas de tejido en la ocupación de los elementos vecinos CRE

y CCAAT, nos propusimos caracterizar a los factores que intervienen en su regulación. En

esta tesis analizamos los factores que reconocen los elementos presentes en el promotor de la

fibronectina, en especial los elementos CRE y CCAAT ubicados entre las posiciones -l70 y

150 respectivamente, así como también estudiamos la cooperación que existe entre los

mismos, tanto en la unión al DNA como en su actividad transcripcional.

Parte de los resultados presentados en esta Tesis fueron publicados en:

- Bemath, V.A., Muro, A.F., Vitullo, A.D., Bley, M.A., Barañao, J.L. and Komblihtt, A.R.(1990). Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cellline by a mechanism that suppresses cAMP-responsive-element transcriptional activation.J.Biol.Chem. 265 18219-18226.

- Muro, A.F., Bemath, V.A. and Komblihtt, A.R. (1992). Interaction of the -l70 cyclic AMPresponse element with the adjacent CCAAT box in the human fibronectin gene promoter.J.Biol.Chem. en prensa.

"ll

RE LTAD YDI UIN

RESULTADOS Y DISCUSION.

Como se comentó en la introducción, el promotor del gen de la fibronectina humana

fue clonado y secuenciado con anterioridad al comienzo de este trabajo (Dean et al., 1987).

Este promotor posee una disposición característica de los promotores transcriptos por la RNA

pol ll (fig. 1): la secuencia ATATTA en la posición -?.5y la secuencia CCAAT en la posición

-150, además de otras secuencias regulatorias como el CRE (-173), AP-2 (- 120 y -70), SP1 (

104 y -98), y otras no totalmente conservadas como el elemento GRE (-206) (ver

introducción). La región del promotor hasta -200 es muy rica en GC y más hacia el 5' esrelativamente rica en AT.

-SDU 480 -160l I

llIHlbbbllllClILL HIÏPPÏRTÑÑFPÑG

-110 -120 -100. | I

HbHTTÍ‘Í‘PPPPPTPl‘Rf‘P-I “M l u ILLILHHHLHLl HLLHLLI’ILLCHE?

-300 -360 -34nl l l

un: "lllIULHHLLLLIILbLllLHLHLHHUILCCHRÏ

-320 -300 -280| l I

CHGCCRCTCCCTTTCCTCCCHGCCGCÏÏCUÏRÏCCCÏTCCCCCHÏCCCCÏRHHHHGÏTTG

-260 -210 -220| I I

nrnnrrnrnnnnnnun-u lblLl IULLLLHUILLIUULUUULLHILHULH

-200 -l 80 -|60| I l

ICTCÏTïTGTTCGCTGCGHRCCCHCRGÏCGÏCCWCCGGRGCCCGGWCRE CCM"

-l10 -120l __5"_-L.

CGGGCGCGGÏCGGCÏGCGGCGGCCGGWÏGGGGÏGGGGCMWC¡IP-2 SP-l

-80 -60 -1ÜI l l

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