Butll. Inst . Cat. Hist. Nat., 49 (Sec. Zool., 5): 49-56. 1983

CARACTERiSTIQUES ULTRASTRUCTURALS DEL TEGUMENTDE LERNANTHROPUS KROYERI VAN BENEDEN(CRUSTACEA: COPEPODA) *

Montserrat Poquet ** Rebut: juliol 1981

SUMMARYUltrastructural features of the integument of Lernanthropus kroyeri Van Beneden(Crustacea : Copepoda)

Lernanthropus kroyeri Van Beneden is an ectoparasite of Dicentrarchus labrax whichis found attached to the gill filaments. Due to this fact, it shows morphological modifica-tions at different levels, which are studied through Electronic Transmission and ScanningMicroscopy.

On the dorsal surface, the body shows two types of epicuticular formations: veryabundant ones with a tubular or filamentous aspect, which provides the copepod with aconsiderable increase of cuticular surface in order to a better oxygen utilization, and soimproving respiratory processes through the integument ; the other type of cuticular for-mation consists of longer and more ramified expansions less abundant than the otherones , and they have mainly a sensory function.

The cuticle, 13 Im thick, shows three markedly different zones : epicuticle, exo-cuticle, and endocuticle. It is crossed by a great number of canalicles, wich allow the pass-age of substances from the underlying epithelium.

Epithelial cells have the typical morphology of this integumentary tissue, and thetwo main features are: a great number of septate junctions and mitochondria with verydevelopped and abundant cristae, which means an intense respiratory and metabolic acti-vity, due to their oxygen-poor habitat as well as to the immobility showed by L. kroyeri.

INTRODUCCI6 Els estudis mes exhaustius sobre el temavaren comencar a realitzar-se en el grup

En linies generals, la composicio quimi- dels insectes (LoCKE, 1964; RUDALL, 1965;ca i l'estructura fonamental del tegument HACKMANN, 1971). Posteriorment l'aporta-dels artrbpodes presenta grans similituds. cio de noves dades de tipus ultrastructural

* Aquest treball va esser exposat a la sessid ordinaria de la ICHN del maig de 1981.** Departament de Morfologia Microscopica. Facultat de Biologia. Universitat de Barcelona.

Avgda. Diagonal, 645. Barcelona, 28.

49

i histoquimic ha posat de manifest les va-riacions que l'estructura tegumentaria pre-senta en d'altres grups d'artropodes. Par-ticularment dins de la classe dels crusta-cis, aquestes diferencies es manifesten deforma mes palesa entre els deferents or-dres, essent un dels mes estudiats el delsdecapodes (DRAC H , 1976, 1979).

Les caracteristiques ultrastructurals deltegument dels copepodes han estat estu-diades exhaustivament per BOULIGAND(1966, 1973) a nivell de les diferents re-gions que formen la cuticula, i s'ha esta-blert la teoria de 1'estructura trenada coma forma d'ordenacio dels components queformen els estrats.

L'observacio ultrastructural de l'epitelitegumentari ha estat tambe objecte d'es-tudi en els treballs esmentats de BouLI-GAND sobre copepodes Mures i per DURFORT(1976) en un copepode endoparasit delmusclo, Mytilicola intestinalis; s'han ob-servat aixi, diferencies en l'organitzaciocellular motivades pets respectius regimsde Vida, donat que l'existencia de formeslliures i parasites dins l'ordre dels cope-podes comporta unes caracteristiques mor-fologiques i ultrastructurals ben peculiars,segons quin sigui l'habitat de les especiesestudiades.

L'objectiu del present treball consisteixen l'estudi morfologic de les diferents ca-pes que formen -la cuticula de Lernanthro-pus kroyeri i, especialment, de les estruc-tures que es localitzen a nivell de Ia. capames externa o epicuticula. Aixi mateix, ^sposaran de manifest les caracteristiquesultrastructurals de 1'epiteli tegumentari,per tal de veure les possibles implicacionsque pot tenir el regim parasitari del co-pepode en les seves c0-lules.

MATERIAL I METODES

Lernanthropus kroyeri Van Beneden, dela familia Lernanthropidae, es troba coma ectoparasit de Dicentrarchus labrax, ad-herit als filaments branquials i presentauna marcada cripsi cromatica. Els llobar-ros parasitats provenen, en la major part,del litoral catala, i el grau d'infestacio perL. kroyeri es d'un 65 %.

Els exemplars estudiats eren tots adults,predominant les femelles. Una vegada se-parats del filament branquial al qual estrobaven adherits per mitja del segon pa-rell d'antenes i del tercer parell de potes,

s'ha procedit a ]a fixacio de cada un d'ells,essent en alguns casos, previament aneste-siats i fragmentats.

Els exemplars destinats a esser obser-vats amb microscopia fotbnica han estatfixats amb liquid de Bouin, Zenker i liquidde Pampel, aquest darrer molt adient pera la preservacio de la cuticula. Posterior-ment, han estat inclosos en parafina i s'hanobtingut tails de 7µm. Les tecniques detincio aplicades han estat les classiques dela hematoxilina-eosina, la tricromica deMallory i la tincio amb solucio alcoholicade negre de clorazol, especifica per a laquitina. Estem duent a terme diferents tec-niques histoquimiques que aportin novesdades sobre la naturalesa d'aquesta cuti-cula.

El material a observar amb microsco-pia electrbnica ha estat fixat amb parafor-maldehid-glutaraldehid (3 oio) tamponatamb tampo Sorensen o be tampo cacodi-lat 0,1 N, ajustant el pH a 7,3. Despresd'una segona fixacio amb tetroxid d'osmi(1,5 %) s'ha procedit a la deshidratacio delmaterial utilitzant etanol o be acetona degradacions creixents. Posteriorment, s'haefectuat la inclusio amb Araldita-Epon is'han obtingut tails mitjancant un ultra-microtom Reichert, model OmU-2. El con-trastat dels tails ha estat fet amb acetatd'uranil i citrat de plom segons la tecnica

FIG. 1. Visio latero-ventral dc L. kroyeri. Pot ob-servar-se 1'atr6fla dels darrers parells de poles,aixi corn la carcassa que recobreix tot el cos(28 X).Ventral lateral view of L. kroyeri. Note the atrophy ofthe last pairs of legs, as well as the framework whichcovers the whole body (28x).

Fic. 2. Detail de la regio cefalica amb les ante-nes (a) molt desenvolupades. A la base de lesantenules s'observa el tlagell parabasal (f). Lacuticula presenta 1'aspecte filamentos caracterfs-tic (fletxes) (30X).Cephalic region detail, with very developed antenna (a).On the basis of the antennules the parabasal flagellum (f)can be observed. The cuticle shows the typical filamen-tous aspect (arrows) (30x).

Fic. 3. Detail de la regio ventral. A 1'extrem delprimer i segon parell de potes (lp, 2p) podenobservar-se espines (57X).Ventral region detail. On the tip of the first and secondpair of legs (lp, 2p) some thorns can be seen (57 x).

50

51

Fits. 4, 5, 6, 7. Formacions epicuticulars. A les figs. 6 i 7 poden observar-se els filaments ramificatsi la base d'implantacio en forma de crater.Epicuticular formations . In figures 6 and 7 ramified filaments and the implantation base in the shape of a cratercan be observed.

de Reynolds, i l'observacio s'ha realitzatamb un microscopi electronic de transmis-sio Phillips 200, del Servei de MicroscopiaElectronica de la Universitat de Barcelona.

El proces initial per al material a obser-var amb microscopia d'escombratge (scan-ning) ha estat el mateix, procedint-se a unadessecacio del material mitjancant la tec-

nica del punt critic. Finalment les mostreshan estat metallitzades amb vapors d'orpel metode de l'sputtering. El microscopiutilitzat per a l'observacio d'aquestes mos-tres ha estat un microscopi d'escombratgeCambridge, model Stereoscan S-4, del Ser-vei de Microscopia Electronica anterior-ment esmentat.

52

OBSERVACIONS

Cuticula

Les caracteristiques morfologiques ex-ternes de Lernanthropus kroyeri han estatja descrites en els darrers treballs de sis-tematica de RAIBAUT (1900) i de KABATA(1979). Les observacions realitzades ambmicroscopia d'escombratge no fan mes queconfirmar els details d'aquesta morfologia(POQUET, 1979).

Cal assenyalar 1'existencia de formacionscuticulars filamentoses (figures 2, 3) querecobreixen la superficie dorsal del cos iels apendixs de L. kroyeri, i constitueixen,amb fregiiencia, l'habitat de diverses colo-nies de bacteris, aixi com de ciliats sessils.La regio ventral presenta una menor den-sitat de distribucio d'aquests filaments, acausa, possiblement, del continu fregamentd'aquesta regio del cos amb el filamentbranquial al qual es troba adherit.

Hi ha dos tipus diferents de filaments:els mes nombrosos corresponen a unesformacions de 1'epicuticula, d'estructuratubular, que tenen uns 10 µm de llargadai un diametre d'uns 0,5 1,m (figs. 4, 5, 6, 7).Donada la seva magnitud poden visualit-zar-se amb el microscopi optic, un cop te-nyits amb la tecnica del Mallory de colorblau, caracteristic d'estructures de natura-lesa mucopolisacaroidea. Un segon tipusde formacions, tambe filamentoses, tenenuns 50 µm de Ilarg i uns 3,5 µm de diame-tre, i son mes escasses que les anteriors.Llur regio apical es troba ramificada i labase del filament es troba dins d'una pro-tuberancia de la cuticula en forma de cra-ter (fig. 7). Sembla que el sistema d'im-plantacio d'aquests filaments possibilitauna certa flexibilitat i mobilitat. Aquestesestructures son en vies d'observacio ambmicroscopia electronica de transmissio.

Ja en l'observacio dels tails amb el mi-croscope optic es visualitzen clarament tresde les quatre capes que constitueixen lacuticula dels artropodes: una capa mesexterna o epicuticula d'uns 0,2 µm de gruixamb una elevada densitat als electrons,deguda possiblement a la seva naturalesalipoproteica, una exocuticula de 8 tm degruix i una endocuticula d'uns 5µm quepresenta mes densitat electronica que 1'an-terior, a la vegada que les diferents capesque la formen es troben mes compactades.En les seccions obliques, les diferents ca-pes quitinoproteiques presenten la tipica

ordenacio ,en arcades)), caracteristica dela cuticula dels crustacis (fig. 10). L'endo-cuticula presenta, a la vegada, gran nom-bre de canalicles que la travessen perpen-dicularment amb un contingut d'una ele-vada densitat electronica. Pot observar-sela comunicacio entre algunes cellules de1'epiteli subjacent a la cuticula i algunsd'aquests canalicles (fig. 8). Aquests cana-licles son visibles tambe en els tails ob-servats amb microscopia fotonica.

Epiteli

En contacte amb la regio mes interna del'endocuticula pot observar-se l'epiteli te-gumentari format per una cola filera decellules allargades, d'uns 3 um d'algadaper uns 11 o,m de llargada, disposades ambl'eix mes llarg parallel a la cuticula.

Entre les membranes de cellules adja-cents es troben un considerable nombred'unions septades d'uns 230 nm de llarg,essent l'espai intercellular a nivell d'aques-tes unions d'uns 200 A. Tambe s'observengran nombre d'interdigitacions entre mem-branes, la qual cosa implica un incrementimportant de I'adherencia entre les dife-rents cellules de 1'epiteli (fig. 9).

El citoplasma presenta escasses vesicu-les de reticle endoplasmatic rugos i algundictiosoma, i la caracteristica mes desta-cable es la gran abundancia de mitocon-dris, principalment a la regio cellular mespropera a 1'endocuticula. Si be Ilur morfo-logia i mida no presenten alteracions, caldestacar la densitat electronica de la ma-triu mitocondrial, aixi com les nombrosescrestes que presenten (fig. 10).

El nucli to uns 2,4 dam de diametre i estasituat a la regio central. Posseeix un solnucleol i una densificacio bastant intensade la cromatina.Aquest epiteli monoestratificat esta se-

parat dels feixos musculars, dels teixitsglandulars o de les cavitats, segons els di-ferents nivells del cos, per una lamina ba-sal de 0,13 t,m de gruix.

DISCUSSIO

Els apendixs i les expansions caudalsdels copepodes presenten les formacionscuticulars que son comunes als altres or-dres de crustacis (sedes, sedules, espines).Llur importancia sistematica es ben evi-

53

dent, tant per als individus adults com perals diferents estadis larvaris (RAIBAUT,1900; KABATA, 1979). Existeixen, tambe, al-tres estructures (denticles, espines i es-pinules) que constitueixen l'ornamentaciode diferents organs i presenten importantsvariacions quantitatives entre les especiesIliures i parasites.Quant a les formations epicuticulars, cal

destacar las microvellositats que to el co-pepode lliure Aleutha depressa, les qualsrepresenten un considerable increment dela superficie cuticular per a la retenciod'aigua en perlodes de baixamar (G H ARA-GOZLOU, 1976).Encara que els filaments cuticulars mes

prims que posseeix L. kroyeri difereixenrespecte d'aquestes vellositats pel que faa nombre i mida, el fet de tractar-se deformacions epicuticulars distribuldes re-gularment per tota la superficie del cos,impliquen, tambe en aquest cas, un aug-ment de la superficie del tegument, la qualcosa comportaria un millor aprofitamentde l'oxigen que, es troba de forma escassa-ment disponible a la zona on esta ubicatL. kroyeri. Aquest factor es ben important,donat el sistema de respiracio a traves deltegument que presenten els copepodes(FAHRENBACH, 1948). Aixf mateix, 1'exis-tencia d'una coberta de mucopolisacaridsen aquests filaments implica una possiblefuncio de defensa enfront de l'accio liticad'alguns enzims de l'hoste (KANNUPANDI,1976).

El segon tipus de filaments que hem lo-calitzat a la cuticula de L. kroyeri tenenunes caracteristiques morfolbgiques i dis-tribucionals comparables a les del sistemamicrosedal descrit per DRAQH (1979) endiferents especies de crustacis decapodes.A diferencia de les macrosedes que actuencom a efectors mecanics les microsedestenen una funcio mecano-quimio-recepto-ra. Aquesta funcio sensorial dels filamentsramificats de L. kroyeri vindra confirmadaper les observations que estem duent aterme actualment amb microscopia elec-tronica de transmissio.

Pel que fa referencia al gruix de la cu-ticula dels diferents generes de copepodes,sembla ser que el medi on habiten influen-

cia en gran manera aquesta caracteristicamorfologica. El copepode lliure Calanusfinmarchicus to una cuticula d'uns 5µmde gruix (RAYMOND et al., 1974), mentre que

la de Mytilicola intestinalis no sobrepassaels 2 l_Lm (DURFORT, 1976). Caligus savala,

copepode ectoparasit d'alguns gadids, pre-senta una cuticula que, en determinadesregions del cos, arriba a fer els 30 µm(KANNUPANDI, 1976). Sembla logic, doncs,que el grau de parasitisme, i les modifica-tions que aixo comporta en l'estructuraexterna i la immobilitat de L. kroyeri in-fluenciln tambe en els 13 ltm de gruix queto la seva cuticula.

L'existencia dels canalicles transversalsque travessen 1'endocuticula, han estat des-crits en crustacis superiors (pore canals).En copepodes, en canvi, han estat obser-vats mes rarament. Nomes hem trobat re-ferencies d'aquestes estructures en Aleurtha depressa i en dos copepodes parasits,Pennella elegans (KANNUPANDI, 1976) i Lirn-naressia mamillifera (BOULIGAND, 1966), elqual manca d'aparell digestiu, i l'absorciode nodriments, la realitza per mitja d'a-quests canalicles. Aquest no es el cas deL. kroyeri que posseeix un aparell diges-tiu ben desenvolupat, la ultrastructura delqual estem estudiant. Pel gruix de la sevacuticula i l'aspecte d'aquests canalicles,obliterats per quitina i altres substancies,es probable que tinguin, com en la majorpart dels crustacis, una funcio de conduc-ci6 de diferents components procedents deles cellules epitelials que intervenen en laformacio d'aquesta regi6 del tegument(DENNELL, 1960).

FIG. 8. En aquesta seccio ]leugerament obliquade ]a cuticula poden observar-se les tres capes:epicuticula (ep), exocuticula (ex) i endocuticula(end). S'observen alguns canalicles (c) transver-sals. A la cellula epitelial s'observen gran nombrede mitocondris (m). N: nucli; M: membrana cel-lular; ]b: lamina basal (14.500X).In this slightly oblique section three layers can be ob-served: epicuticle (ep), exocuticle (ex) and endocuticle(end). Note some cross canalicles (c). A great number ofmitochondria (m) can be observed in the epithelial cell.N: nucleus; M: cellular membrane; lb: basal plasmamembrane (14.500 x).

FIG. 9. Interdigitacions de la membrana cellu-lar. Les fletxes indiquen dues unions septades(59.000 X).Cellular membrane interdigitations. The arrows show twoseptate junctions (59.000 x).

FIG. 10. S'observa la disposicio yen arcades- dellestrats de la cuticula. Er: ergastoplasma; m: mi-tocondris (39.000 X).Cuticle layers placed in arc. Er: ergastoplasm; m: mi-tochondria (39.000 x).

54

55

La presencia en les cellules epitelials d'u-nions septades es un fet coma en aquestacategoria cellular de la majoria d'inverte-brats (NOIROT-TIMOTHEE, 1980). Aquest ti-pus de contactes, aixi com el gran nombred'interdigitacions comporta una gran cohe-sio cellular, caracteristica dels epitelis te-gumentaris de tota 1'escala animal.

L'escassesa d'organuls citoplasmatics fapensar en una fase de les cellules de pocaactivitat, si be 1'existeneia de petites zonesde reticle endoplasmatic, aixi com d'algundictiosoma, indiquen estadis cellulars an-teriors en els quals pot haver existit unimportant increment d'organuls implicatsen la secrecio de determinats componentsde la cuticula. Cal assenyalar que els exem-plars estudiats son en fase postexuvial i,per tant, la propera muda es mes o menysllunyana i la cuticula estudiada es de for-macio relativament recent. Aquest fet veconfirmat amb les dades obtingudes del'estudi de l'intesti de L. kroyeri, en el quales pot observar l'inici de formacio de con-crecions calcaries que posteriorment in-tervindran en el proces de consolidacio dela cuticula, despres de 1'exuviaci6.

L'elevat nombre de mitocondris en lescellules de 1'epiteli tegumentari va esserja assenyalat per DURFORT (1976) en Myti-licola intestinalis. En el cas de L. kroyeri,l'increment de crestes mitocondrials indicauna activitat respiratoria molt intensa, pertal de compensar la relativa escassesa d'o-xigen que pot absorbir pel tegument, acausa del gruix que presenta aquest i dela pobresa en oxigen del medi on habitael copepode.

BIBLIOGRAFIA

BOULIGAND, Y. 1966. Le tegument de quelques co-pepodes et ses dependances musculaires et sen-sorielles. Mem. Museum Natl. Hist. Nat. (Pa-ris), A, XL (4): 189-206.

DENNELL, R. 1960. Integument and exoskeleton. In:The Physiology of Crustacea, Vol. 1. Metabo-lism and Growth. Academic Press. London.

DRACH, P. 1976. Systeme setifere des CrustacesDecapodes. Insertion des soies sur 1'exosque-lette et donnees generales sur leur structurecuticulaire. C. R. Acad. Sc. Paris, 282 (D): 1869-1871.

DRACH, P. & JACQUES, F. 1979. Systeme setifere desCrustaces Decapodes. Le systeme microsetal.C. R. Acad. Sc. Paris, 288 (D): 1103.

DURFORT, M. 1976. Estructura y ultraestructuradel tegumento de Mytilicola intestinalis SteuerCrustacea, Copepoda). Misceldnea Zoologica,III (5): 69-77.

FAHRENBACH, M. 1962. The biology of a harpacti-coid copepod. La Cellule, LXII: 303-376.

GHARAGOZLOU-VAN GINNEKEN, I. D. & BOULIGAND, Y.1973. Ultrastructures tegumentaires chez uncrustace copepode Cletocaptus retrogressus. Tis-sue & Cell, 5 (3): 413-439.

GHARAGOZIOU-VAN GINNEKEN, I. D. 1976. Particula-rites morphologiques du tegument des peltidii-dae (Crustaces Copepodes). Arch. Zool. exp.gen., 117: 411-422.

HACKMANN, R. H. 1971. The integument of Arthro-poda. In: Chemical Zoology, VI (B). AcademicPress. London.

KABATA, T. 1979. Parasitic Copepoda of British Fis-hes. The Ray Society. London.

KANNUPANDI, T. 1976. Cuticular adaptations in twoparasitic copepods in relation to their modes oflife. J. exp. mar. Biol. Ecol., 22: 235-248.

LOCKE, M. 1964. The structure and formation ofthe integument in insects. In: Physiology ofInsecta. Rockstein, ed., Academic Press.

NOIROT-TIMOTHEE, C. 1980. Septate and scalari-form junctions in Arthropods. Int. Rev. of Cy-tology, 63: 97-140.

POOUET, M. 1979. Aportaciones al estudio morfo-logico de algunas especies de copepodos para-sitos de peces del litoral mediterraneo. Misce-ldnea Zoologica, 5: 161-171.

RAIBAUT, J. 1977. Les copepodes parasites des Mu-ges en Mediterranee. Bull. Mus. natn. Hist. nat.,3e. ser., 472 (329): 848-933.

RAYMOND, J. E. G., KRISIINASWAMY, S. WOODHOU-SE, M. A. & GRIFFIN, R. L. 1974. Studies on thefine structure of Copepoda. Observations onCalanus finmarchicus Gunnerus. Proc. R. Soc.Lond., B. 185: 409-424.

RUDALL, K. M. 1965. Skeletal Structure in Insects.In: Aspects of Insect Biochemistry. Ed. T. W.Goodwin, pp. 83-92. Academic Press. London.

56