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Capítulo

3EL SISTEMA PRINCIPAL DE

HISTOCOMPATIBILIDAD HUMANO

(HLA) Y EL TRASPLANTE HEPÁTICOEduardo Gómez-Casado

Jorge Martínez-LasoAntonio Arnaiz-Villena

EL SISTEMA HLA: GENERALIDADES

El Sistema Principal de Histocompatibilidad(MHC, del inglés Major Histocompatibility Com-plex) es un conjunto de genes en su mayoría alta-mente polimórficos, cuyos productos se expresanen la superficie de gran variedad de células y queson responsables de la respuesta inmune “adapta-tiva”. Se considera que estos genes están presen-tes en todos los vertebrados 1, 2 y en el hombrerecibe el nombre de sistema HLA (del inglés, Hu-man Leukocyte Antigen). Fue descubierto en losaños 50 en una situación artificial de trasplante detejidos de un individuo a otro. Las proteínas quecodifican estos genes se denominan “moléculasHLA” o “antígenos HLA” que son los que determi-nan el rechazo o aceptación de un injerto. Así, dosindividuos que expresen en sus células el mismoHLA aceptan tejidos trasplantados uno del otro, eindividuos que difieran en estos loci lo rechazaránvigorosamente. Aunque el papel de estas molécu-las en el rechazo de trasplantes tiene un conside-rable interés, la función primordial de las proteínascodificadas por este complejo genético es la pre-sentación antigénica (respuesta inmunológica es-pecífica mediada por linfocitos T).

El papel principal de los genes HLA en la res-puesta inmune frente a antígenos fue postuladaen 1970 cuando se demostró que los linfocitos Tantígeno-específicos no reconocían antígenos li-bres o en forma soluble, sino que reconocían por-ciones de proteínas antigénicas unidas nocovalentemente a las moléculas HLA. Puesto queestas moléculas son proteínas asociadas a mem-

brana, los linfocitos T pueden reconocer antígenosextraños solamente si están unidos a la superficiede otras células. Esta limitación en la activación delos linfocitos T es debida a que interaccionan me-jor con otras células que muestran antígenos aso-ciados a moléculas HLA que en forma soluble.

El modelo de asociación del antígeno con lamolécula HLA determina el tipo de linfocito T quees estimulado. Así, los antígenos unidos a molécu-las HLA de clase I estimulan principalmente linfo-citos T CD8+ y los unidos a moléculas HLA de claseII estimulan principalmente linfocitos T CD4+.

La forma en que estos genes influyen en la res-puesta inmune frente a diferentes antígenos vienedeterminada por la modulación del repertorio decélulas T maduras realizada por el MHC. De estamanera, el sistema inmunológico es capaz de dife-renciar lo “propio” de lo “no propio” (patógenos)e incluso de lo “propio alterado” (transformacióntumoral).

El sistema HLA es dialélico y codominante.Presenta tres características principales:

• es poligénico; está constituido por varios ge-nes clasificados en tres regiones.

• es muy polimórfico; existen múltiples alelospara cada locus. Los distintos alelos difierenentre sí en la habilidad para unir y presentarcon mayor eficacia diferentes antígenos pro-teicos. Cada individuo puede tener dos ale-los diferentes para cada gen, y la mayor partede los individuos de una población son hete-rocigotos para cada gen de este sistema.

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• presenta desequilibrio de ligamiento, es de-cir, diferentes alelos de distintos genes se en-cuentran en el mismo cromosoma con unafrecuencia mayor a la teóricamente esperadaen una combinación al azar.

Todas estas propiedades hacen que el MHC seauno de los sistemas genéticos más complejos y a lavez fascinantes descritos en la naturaleza.

LOCALIZACIÓN Y ESTRUCTURA DEL SISTEMA HLA

El sistema HLA se localiza físicamente en elbrazo corto del cromosoma 6, en la parte distal dela banda 6p21.3 y ocupa una longitud de 4 centi-morgan (CM), aproximadamente 4 millones depares de bases 3 y contiene al menos 200 genes,pseudogenes y fragmentos génicos 4.

Dependiendo del origen genético y/o funcio-nalidad biológica de sus productos, el conjuntode genes de esta región tradicionalmente se hadividido en 2-4 grandes grupos 4, 5. En la actuali-dad se admiten tres regiones, aunque la identifi-cación y caracterización constante de nuevosgenes no excluye una revisión futura de esta cla-sificación (ver Fig. 3.1).

Región de clase I

Es la región más telomérica y abarca un seg-mento cromosómico de unas 1600 Kb. Compren-de seis subgrupos de genes cuya nomenclatura está

relacionada con el orden cronológico de su des-cripción, estructura, funcionalidad y patrón deexpresión celular. En la Fig. 3.2 (ver Fig. 3.2) se es-quematiza la localización de estos genes en la re-gión de clase I.

Genes HLA de clase I “clásicos” o Ia:

A este grupo pertenecen los genes HLA-A, -By -C. Son los primeros descritos dentro del siste-ma HLA. Codifican para glicoproteínas de mem-brana que se expresan en prácticamente todas lascélulas del organismo si bien su nivel de expresiónvaría desde un máximo en células pertenecientesal sistema inmune (linfocitos T, B y macrófagos)hasta un mínimo en células musculares, del siste-ma nervioso y fibroblastos. Son moléculas impli-cadas en la restricción del reconocimientoantigénico mediada por linfocitos T citotóxicos.

Genes HLA de clase I “no clásicos” o Ib:

Son HLA-E, -F y -G. Codifican para proteínasestructuralmente similares a las de los genes clási-cos. Se diferencian básicamente de los anteriorespor su limitada expresión tisular, su bajo polimor-fismo y por su función aún poco conocida.

Además, en la región de clase I se han descubi-erto toda una serie de secuencias de DNA que se-gún su mayor o menor grado de similitud congenes funcionales se han clasificado en:

Fig. 3.1 – Vista de la localización del sistema HLA en el brazo corto del cromosoma 6.

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Pseudogenes

Hasta la fecha se han descrito cuatro pseudo-genes nombrados como HLA-H, -J, -K y -L 6. Sesitúan en las proximidades de HLA-A, teloméricoso centroméricos a éste. Todos ellos tienen en comúnla presencia de deleciones que rinden codones determinación prematuros. Se desconoce si tienenalguna función biológica.

Genes truncados

Son los denominados HLA-16, -75, -80 y -90.Presentan homología con los genes de clase I enzonas extensas 7. HLA-75 es el único que tiene ho-mología con la región 5’UT (del inglés, UnTransla-ted) de los genes de clase I; los demás la presentancon la región 3’UT.

Segmentos génicos

Son las secuencias más pequeñas y con unmenor grado de homología con clase I, el cual seobserva en cortas regiones exón/intrón. Aquí seincluyen HLA-17, -21, -30 y -81. HLA-81 solamen-te presenta homología con el exón 8 y región 3’UT,lo cual sugiere que podría ser un pseudogen pro-cesado. Además, mapea fuera del sistema HLA.

Genes no HLA que se encuentran dentro de laregión de clase I:

Existe un grupo de genes que mapean dentrode la denominada región de clase I pero que notienen ninguna función conocida que los relacio-ne con la presentación antigénica, si bien muchos

de ellos podrían ser genes reguladores 8. A esteapartado pertenecen los genes OTF3, gen MOG,genes S, gen de la cadena ? de la tubulina, genes dela familia P5, genes HSR1, exón B30-2, gen de la pro-lactina, genes MIC y gen de la hemocromatosis.

Dentro de este grupo quizás el más interesan-te sea el gen de la hemocromatosis (HFE). La pro-teína para la que codifica parece estar implicadaen el metabolismo del hierro. Se ha postulado, me-diante un análisis de homología de secuencia, quepodría tener estructura de molécula de clase I 9.

Región de clase II

Es la más centromérica y comprende unas 900kilobases (Kb). Se divide a su vez en tres subregio-nes de centrómero a telómero: HLA-DP, -DQ y -DR. Los genes de clase II se definen con la letra D,seguida de la inicial de la subregión (P, Q o R). Cadasubregión se compone a su vez de varios genes.

Las proteínas para las que codifican estos ge-nes están implicadas en fenómenos de restriccióndel reconocimiento antigénico mediado por linfo-citos T cooperadores CD4+. Su distribución tisu-lar está prácticamente limitada a células del sistemainmune: linfocitos B, macrófagos, linfocitos T acti-vados, etc.

Entre las subregiones -DP y -DQ aparecen otraserie de genes poco conocidos, éstos son -DN, -DO, -DMA y -DMB10-12. Además, en esta mismazona también se han descrito los genes TAP (TAP1y TAP2) que codifican para proteínas transporta-doras de péptidos13, 14 y LMP que intervienen enel procesamiento antigénico15, 16.

Región de clase III

Al menos 36 genes han sido identificados en elfragmento cromosómico que corresponde a estaregión. Estos genes, fuertemente ligados, abarcanun segmento de DNA de unas 100 Kb.

No todos sus genes presentan función inmu-nológica. Así, esta región incluye factores del com-plemento de la vía clásica (C4A, C4B, C2) y de lavía alternativa (Bf). También mapean en esta zonalos genes A y B de factores de necrosis tumoral(TNF-A y TNF-B), genes para las proteínas induci-das por estrés (HSP70-1 y HSP70-2) y muchos otros,algunos de ellos de función desconocida.

Fig. 3.2 – Genes de la región HLA de classe I.

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La presencia en esta región de genes sin re-lación funcional o evolutiva con los antígenosHLA hace que muchos autores no la considerencomo perteneciente al Sistema Principal de His-tocompatibilidad17.

GENES SIMILARES A CLASE I CODIFICADOS FUERADEL SISTEMA HLA

Se han descrito recientemente toda una seriede genes con estructura similar, en mayor o me-nor medida, a los genes de clase I. Los más reseña-bles son CD1, FcRn, MR1 y ?2 glicoproteínaunidora de Zinc. Todos ellos se consideran genesrelacionados evolutivamente con los genes HLA.

CD1 y MR1 mapean en el cromosoma 1, al igualque muchos otros genes pertenecientes a la super-familia de las inmunoglobulinas18-20.

La proteína codificada por el gen FcRn (recep-tor Fc neonatal) se encarga de unir IgG (inmuno-globulina G) procedente de la leche maternaingerida por el recién nacido y transportarla a tra-vés del intestino21, 22. Juega un papel importanteen la adquisición pasiva de inmunidad humoralen el neonato. También se ha encontrado en laplacenta humana donde se encargaría de trans-portar IgG.

Se ha demostrado hace poco que CD1 es ca-paz de presentar lípidos y glicolípidos a los linfo-citos T a/b23-25.

Varios científicos han postulado que este gru-po de genes podría representar una línea impor-tante de defensa frente a diferentes agentesinfecciosos uniendo ligandos no polimórficos delos microorganismos tales como péptidos, carbo-hidratos, derivados de nucleótidos, lípidos, etc26.

MAPA GENÉTICO DEL SISTEMA HLA

La aplicación de técnicas de genética molecu-lar ha permitido determinar la organización físi-ca de los loci del complejo HLA. El mapa máscompleto y reciente se ha publicado en 19974. Enél se observa la localización y caracterización deal menos 209 loci que corresponden a genes, pseu-dogenes y fragmentos génicos. La función demuchos de ellos permanece todavía desconocida(ver Fig. 3.3)

ESTRUCTURA DE LOS ANTÍGENOS HLA DE CLASE I

Estructura proteica de los antígenos HLA declase I clásicos

Los antígenos HLA de clase I clásicos (HLA-A, -B y -C) son glicoproteínas de membrana com-puestas por dos cadenas polipeptídicas, unacadena pesada ??de unos 44 Kilodalton (Kd) co-dificada en el sistema HLA y una cadena ligerade 12 Kd, la ?2 microglobulina (?2-m) cuyo gen seencuentra fuera del sistema HLA, concretamenteen el cromosoma 1527. La cadena pesada es elúnico miembro del heterodímero que atraviesala membrana celular y cuyo extremo aminoter-minal está orientado hacia el exterior de la célula.Ambas cadenas se unen no covalentemente en suporción extracelular (ver Fig. 3.4).

La cadena ? está formada por 338 aminoácidos(aas) (HLA-B) o 341 aas (HLA-A y -C). La porciónextracelular de esta cadena se divide en tres domi-nios globulares bien diferenciados de unos 90 aascada uno, que pueden escindirse de la superficiecelular bajo la acción proteolítica de la enzimapapaína, denominados: dominio ?1 (aas 1-90,porción N-terminal de la cadena ?), dominio ?2 (aas91-182) y dominio ?3 (aas 183-247), codificados cadauno por un exón 28. La porción transmembrana,con estructura de ?-hélice, de unos 25 aas, se con-tinúa con un pequeño tallo citoplasmático de 30aas aproximadamente, rico en tirosinas y serinas.

Los dominios ?1 y ?2 de las cadenas pesadasde las moléculas de clase I son altamente polimór-ficos a diferencia de ?3 que está más conservado.El dominio ?3 y la cadena ligera ?2-m presentanalta homología de secuencia y estructura con lasregiones constantes de las inmunoglobulinas 29. Lasmoléculas de clase I se consideran miembros de lasuperfamilia de las inmunoglobulinas por tener unorigen evolutivo común y por similitudes estruc-turales, más evidentes en el dominio ?3. Esta su-perfamilia también incluye a las moléculas de claseII, al TcR, CD4 y CD8.

En 1987, Bjorkman y colaboradores definieronla primera estructura tridimensional de una pro-teína HLA, concretamente el antígeno HLA-A2 30,

31. Posteriormente, se ha conseguido cristalizarvarios antígenos más como HLA-Aw68, HLA-B27,HLA-B35 y HLA-B53 32-35. Todos los cristales obte-nidos presentaban una región distal formada porlos dominios ?1 y ?2 de la cadena pesada, y unaregión proximal a la que pertenecen los dominios

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Fig 3.3 – Mapa del Sistema Principal de Histocompatibilidad humano (HLA).

?3 y ?2-m. En la Fig. 3.5 (ver Fig. 3.5) se puede veruna representación extrapolada del cristal de cla-se I: la valva, el heterodímero ?/?2-m con el pépti-do unido, y la interacción con el receptor de lacélula T (TcR).

Los dominios distales (?1 y ?2) presentan unaestructura compuesta por dos láminas ?, forma-das cada una por cuatro hebras antiparalelas, y unaregión de ?-hélice localizada carboxi-terminal delas láminas ? (v er Fig. 3.5). Además, el dominio ?2

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Fig. 3.4 – Estructura proteica de la molécula HLA de clase I.

Fig. 3.5 – Representación tridimensional de la molécula de clase I HLA-A*0201: a) dominios moleculares de unión a antígeno; b) estructura completade HLA-A*0201 con un péptido asociado y la ?2-m; c) la misma estructura anterior interaccionando con el TcR 30, 42).

contiene una hélice corta adicional en posicióncarboxi-terminal que une los dominios ?2 y ?3. Lasláminas ? de ambos dominios forman la base deuna valva flanqueada por las ?-hélices orientadashacia el exterior. Esta valva formada por los domi-nios ?1 y ?2 de las moléculas de clase I constituyela estructura para la unión de los péptidos proce-sados 30, 36.

El gran polimorfismo que muestran estas mo-léculas se encuentra concentrado en esta valva.Estos residuos polimórficos sirven para interacci-onar con los distintos péptidos y/o con el TcR. Delos 20 residuos aminoacídicos de alta variabilidadidentificados en las moléculas de HLA 37, 14 cons-

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tituyen residuos de posible contacto con el pépti-do (posiciones 9, 24, 45, 66, 67, 70, 74, 77, 80, 95, 97,114, 116 y 156), uno contacta con el TcR (posición65) y cuatro más contactan con el péptido y con elTcR (residuos 62, 69, 76 y 163).

Se establecen toda una serie de contactos intrae interdominios entre ?1 y ?2. Aparece un puentesalino entre las posiciones 55 de ?1 y 170 del domi-nio ?2. Dos puentes disulfuro unen las cisteínas delas posiciones 101 y 164 de ?2 y las posiciones 203 y259 de ?3, además de varias interacciones de pu-entes salinos interdominios 30, 31, 38. Todas estas re-laciones entre aas contribuyen a la estabilidad dela molécula de clase I en su parte distal.

La asparagina en la posición 86 aparece N-gli-cosilada, si bien esta ramificación no es esencialpara el ensamblaje de la molécula ni para su ex-presión en superficie.

La región proximal a la membrana está forma-da por el dominio ?3 y la ?2-m y cada uno de ellos,al igual que los dominios constantes de la inmu-noglobulinas, consisten en dos láminas ? antipa-ralelas, una formada por 4 hebras y la otra por tres.Las hebras de cada lámina se conectan entre sí porpuentes disulfuro internos formando una estruc-tura similar a un “sandwich”. La ?2-m se sitúa porla parte de abajo de la valva formada por los do-minios ?1 y ?2, de tal manera que existe un míni-mo contacto entre estos dos dominios y el ?3.

Si los dominios ?1/?2 interaccionan con el pép-tido y con el TcR reconociendo residuos polimórfi-cos, el dominio ?3 lo hace con el correceptor de lacélula T (CD8), reconociendo determinantes mo-nomórficos en ?3. La interacción con CD8 requie-re la presencia de aas ácidos en las moléculas declase I, en posiciones 223, 227 y 229, que ocupanuna zona localizada en un lazo del dominio ?3, enuna cavidad justo debajo de la valva 39, 40.

Recientemente se ha demostrado que el do-minio ?3 no es imprescindible para el manteni-miento de la conformación nativa de la valva, almenos en lo que se refiere a su unión al péptido apresentar 41.

La variabilidad que presentan las moléculas declase I se traduce en cambios topológicos en lossitios de unión a péptido. Las características quí-micas y la exclusiva configuración de la estructurade cada valva (o Peptide-Binding Groove) explicacómo pueden unir gran variedad de péptidos 32, 38.Saper y colaboradores 31 identificaron una serie de

depresiones a lo largo de la valva, son las llamadas“Peptide-binding Pockets” o bolsillos. Los péptidosunidos a la valva pueden acomodar una o más desus cadenas laterales aminoacídicas en estos bolsi-llos. Se han identificado seis pockets denomina-dos con letras de la A a la F, localizados en lasuniones de las láminas ? con las ?-hélices (pocketsB, C, D y E) o en los extremos de las dos ?-hélices(pockets A y F) (ver Fig. 3.6). Estos dos últimos con-tienen aas más conservados que los otros cuatro43. De las 18 posiciones de alta variabilidad identi-ficadas en las proteínas de clase I que interaccio-nan con el péptido y/o con el TcR, 16 están situadasen la valva

Fig. 3.6 — Disposición de los bolsillos de unión al péptido en la moléculaHLA de clase I. El color de cada círculo (residuos variables) representa lacontribución a cada bolsillo.

Estructura de los antígenos HLA de clase I noclásicos

Se han caracterizado tres genes consideradoscomo no clásicos (Ib) llamados HLA-E 44, 45, HLA-F 46

y HLA-G 47 (ver Fig. 3.2). En líneas generales sepuede decir que no existen grandes diferencias encuanto a la organización exón/intrón de estos ge-nes con respecto a los clásicos, aunque poseen unaserie de características peculiares que los diferen-cian de los genes Ia; estas son:

• Restringida distribución tisular (-G y -F).• Bajo polimorfismo.• Ausencia, de momento, de una función defi-

nida. Aunque este punto cada vez se va acla-rando más, sobre todo para -E y -G.

La determinación y análisis del polimorfismode Mhc-E y -G en diferentes especies de primates

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ha esclarecido el modo de evolución de estos ge-nes y de sus posibles funciones 48-51.

HLA-E

Sus RNA mensajeros (mRNA) se han visto entodo tipo de tejidos incluyendo tejidos fetales yplacentarios 52-54; sin embargo, en muchos años nopudo confirmarse la presencia de la proteína en lasuperficie celular, lo que sugería un mecanismo deregulación postranscripcional que impide su lle-gada a la membrana. Recientemente, se ha conse-guido cristalizar la molécula de HLA-E formandocomplejo con un péptido (VMAPRTVLL) que pro-cede de los residuos altamente conservados 3-11de la secuencia líder del alelo HLA-B8, y que tam-bién comparten HLA-B7, -B14, -B39, -B42 y -B48 55.El análisis cristalográfico de HLA-E muestra quetiene estructura similar a las moléculas Ia. La hi-pótesis funcional sugerida para HLA-E es muysugerente porque se ha propuesto que se encarga-ría de inhibir la lisis producida por las NKs en cé-lulas normales (sanas) a través del reconocimientopor parte de los receptores NK (de tipo lectinaCD94/NKG2A,B y C 56-58) de la molécula HLA-E conel péptido unido. Las células NK lisan las célulasinfectadas por virus que impiden la expresión nor-mal de las moléculas HLA. HLA-E funcionaríacomo un “negociador-intermediario”: si la célulaestá sana, se sintetizan proteínas HLA, con lo queHLA-E tiene a su disposición péptidos líder paraunirlos y poder expresarse en la superficie celular,interaccionar con las NKs y producir su inhibici-ón. Si la célula está infectada se interrumpe esteproceso mediador ya que HLA-E, al igual que lasotra proteínas HLA, es inestable si no tiene un pép-tido unido, y se produce la lisis celular.

HLA-F

Al igual que los otros genes no clásicos, HLA-Fpresenta una organización exón/intrón y tamañosimilar a los clásicos. Sin embargo, posee dos ca-racterísticas que lo diferencian claramente: la pri-mera de ellas es que elimina por splicing(maduración del mRNA) el exón 7 debido a unamutación puntual en la señal de splicing en 3' delintrón 6, ésta cambia AG (señal normal en el 100%de los casos) por AA no reconocida por la maqui-naria de maduración del mRNA. La segunda esque presenta una inusual región 3’UT, exclusiva

entre los genes de clase I, que se caracteriza por lainserción de una secuencia altamente conservadadurante la evolución y semejante a la de una pro-teína ribosomal 59.

HLA-G

HLA-G ha centrado su atención en su posiblepapel tolerogénico entre la madre y el feto ya queHLA-G se expresa en citotrofoblasto 60. Aunque sumRNA se ha detectado por técnicas molecularesde DNA (PCR) en tejidos adultos y fetales, unasubpoblación de células epiteliales tímicas son lasúnicas conocidas que expresan la proteína HLA-G61. Posee la particularidad de que el segundo tri-plete del exón 6 es un codón stop, que daría lugara una proteína con un dominio citoplásmico cortode 6 aas, 5 codificados por el exón 5 y 1 por el exón6. Se ha propuesto un splicing alternativo delmRNA de HLA-G 62, al haberse detectado no so-lamente el mRNA de tamaño completo (1200 bp)que codificaría para una proteína (HLA-G1) conun dominio transmembranal intacto y una colacorta (1 aa), sino también otras formas más cor-tas: un mRNA de 900 bp en el que estaría exclui-do el exón 3, dando lugar a una proteína(HLA-G2) sin el dominio ?2. En esta isoforma losdominios ?? y ?? se encontrarían unidos, y unmRNA de 600 bp que carecería de los exones 2 y 3dando lugar a una proteína (HLA-G3) en el queel dominio ?? estaría directamente conectado a laporción transmembranal.

Se propuso, a partir de estos hallazgos, queHLA-G podría funcionar como forma soluble trasser escindida de la membrana plasmática por acci-ón proteolítica enzimática, de manera similar a loque se supone ocurre para las formas solubles deHLA. Con este modelo se sugiere que las proteí-nas de HLA-G son en unos casos estructuralmen-te parecidas a las de clase Ia (HLA-G1), mientrasque en el caso de HLA-G2 y -G3 lo serían a las declase II, al postular la existencia de dímeros, en losque la estructura de “valva” de la molécula se ori-gina por la interacción de 2 dominios ?1 proceden-tes de dos moléculas de HLA-G diferentes; demanera análoga a lo que ocurre en las moléculasHLA de clase II, en las que interaccionan dos do-minios ??y ?? de dos cadenas polipeptídicas dife-rentes para originar la estructura de “valva”. Unacuarta forma de splicing alternativo formaría unaproteína sin dominio ?3, codificado éste por el exón

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4 (HLA-G4) 63. Otros estudios 64 detectaron la exis-tencia de 2 transcritos alternativos adicionales enlos que la pauta de lectura se extiende desde elpéptido líder hasta parte del intrón 4, en el que uncodón stop eliminaría la porción transmembranal,originando un extremo carboxi-terminal de 21 aasdiferente al encontrado en las proteínas de mem-brana. Esto apoyaría, según estos investigadores,la existencia de 2 formas solubles: HLA-G1 solu-ble, constituida por los dominios ??, ?2, ?? y la colade 21 aas codificada en el intrón 4, y HLA-G2 solu-ble, idéntica a la anterior pero sin dominio ???

ESTRUCTURA DE LOS ANTÍGENOS HLA DE CLASE II

Estructura proteica de los antígenos HLA declase II

Las moléculas de clase II (HLA-DP, -DQ y -DR)son heterodímeros transmembrana formados pordos cadenas, una cadena ? de 33-35 (Kd) y otra ?de 26-28 Kd asociadas no covalentemente. Se ori-entan de tal manera que sus extremos amino-ter-minal aparecen fuera de la célula (ver Fig. 3.7).

Las cadenas ? poseen dos puntos de N-glicosi-lación, uno en cada dominio extracelular, y unpuente disulfuro intradominio en ?2. A diferenciade ésta, la cadena ? posee un único sitio de N-gli-cosilación en ?1 y dos puentes disulfuro intrado-minio, uno en ?1, que genera un asa de 64 aas, yotro en ?2. Estas modificaciones post-traducciónno influyen en el reconocimiento por aloantisue-ros de estas moléculas de clase II 66.

Intracelularmente las proteínas de clase II seasocian con un tercer elemento proteico no poli-mórfico, de 31 Kd, denominado Cadena Invarian-te (Ii) y codificado fuera del sistema HLA. Elcomplejo Cadena Invariante-dímero ??? se formadurante la biosíntesis y transporte de las molécu-las de clase II; sin embargo, se disocian antes de suexpresión en la superficie celular 67. Se ha postula-do que la Cadena Invariante podría jugar un pa-pel importante en el transporte intracelular de lasmoléculas de clase II y en la unión del péptido.

Brown y colaboradores 68, usando técnicas dedifracción de rayos X consiguieron determinar laestructura tridimensional de los antígenos de cla-se II, concretamente de HLA-DR1. Descubrieronque ésta era muy similar a la de clase I, descritaunos años antes, y eran casi superponibles. Losdominios ?1 y ?2 de HLA-DR1 se asemejaban aldominio ?1 y ?2-m de las moléculas de clase I y losdominios ?1 y ?2 de HLA-DR1 eran superponiblesrespectivamente a los dominios ?2 y ?3. Los crista-les obtenidos de la molécula HLA-DR1 tambiénevidenciaron la tendencia que presentan a formardímeros (??)2, lo que parece tener importancia enla cascada fisiológica de transducción de señales alinterior celular. El punto de interacción con CD4 seubica en el dominio ?2 de la molécula de clase II 69.

Los dominios distales de la proteína (?1/?1) for-man la valva de unión del péptido que consiste enuna lámina ? formada ocho hebras antiparalelas yflanqueada por dos regiones en ?-hélice. La regiónhelicoidal del dominio ?1 presenta un extremo ami-no-terminal en cadena extendida y su extremo car-boxi-terminal se pliega hacia la base de la valva. Estapeculiaridad hace que la zona de unión a péptidomuestre los extremos abiertos. En esta valva abiertapor los extremos se puede acomodar un péptidogrande, de entre 12 y 24 aas. Este péptido puedepermanecer en la valva en conformación extendi-da y sus extremos amino y carboxi-terminales so-bresalen fuera de la molécula 70-74.

Fig. 3.7 — Estructura proteica de la molécula HLA de clase II.

Ambas cadenas presentan dos dominios extra-celulares de 90 a 100 aas designados como ?1, ?2 y?1, ?2. Los dominios ?1 son todos polimórficos yen algún caso los ?1 también (-DQ?, -DP?). Losdominios ?2 y ?2 son homólogos a las regionesconstantes de las inmunoglobulinas. Un péptidoconector hidrofóbico (10 a 12 aas) une los domini-os extracelulares de ambas cadenas a las respecti-vas porciones transmembrana (20 a 25 aas) y a lossegmentos citoplasmáticos (8 a 15 aas) 65.

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Región de genes HLA de clase II

Los genes de clase II se localizan en la regiónmás centromérica del Sistema HLA denominadaregión D. Como ya se había comentado, se dividea su vez en tres subregiones, de centrómero a teló-mero: -DP, -DQ y -DR (ver Fig. 3.8). Los genes declase II se definen con la letra D, seguida de la ini-cial de la subregión (P, Q o R) y de la letra A paralos genes que codifican cadenas ?, o B para los ge-nes que codifican cadenas ?. Además, se le añadeun número para designar cuantos genes A o B es-tán presentes en cada subregión. En esta mismaregión se localizan otra serie de genes de clase II:HLA-DNA, HLA-DOB y HLA-DM (-A y -B), ade-más de los genes TAP y LMP implicados en el pro-cesamiento antigénico de las moléculas de clase I.

De la subregión DR cabe destacar que su estruc-tura ha sido estudiada en diferentes grupos de talmanera que el número de genes presentes en cadauno de ellos define haplotipos (genes o alelos quese heredan conjuntamente). Dependiendo del ha-plotipo, aparecen un gen DRA que codifica para lascadenas ? y uno o dos genes DRB que lo hacen paralas cadenas ? (ver Fig. 3.9). El resto de genes DRB decada haplotipo son pseudogenes:

• Haplotipos con un gen DRB funcional. Pre-sentan sólo el gen DRB1, altamente polimór-fico, y el gen DRA. A éste pertenecen lossubtipos DR1, DR8 y DR10.

• Haplotipos con dos genes DRB funcionales.Poseen el gen DRB1 y otro, menos polimórfi-co, DRB3, DRB4 o DRB5, en función del sub-tipo codificado DRB1 (DR1, DR2, DR3, etc).

Los genes DMA y DMB codifican para un he-terodímero ?/? integral de membrana de 261-263aas, no detectado en la superficie celular. La es-tructura proteica de este dímero sería ligeramentediferente a la del resto de los antígenos de clase II;los dominios proximales a la membrana pertene-cen a la superfamilia de las inmunoglobulinas ylos dos dominios más externos contienen aas quepueden formar múltiples puentes disulfuro quedarían lugar a una conformación muy rígida yprobablemente cerrada. Estos genes poseen unafunción relacionada con la presentación antigéni-ca mediante moléculas HLA de clase II. Los genesTAP1 y TAP2 se encuentran presentes en la regiónde genes de clase II pero participan en el procesa-miento antigénico de moléculas HLA de clase I, aligual que los genes LMP2/7

FUNCIÓN DE LAS MOLÉCULAS HLA

Presentación antigénica de las moléculas HLA declase I

Las moléculas de clase I actúan como recep-tores de péptidos endógenos, propios normalesy alterados (tumorales), y virales, para hacerlosaccesibles a la detección por las células T que lle-van en su superficie celular el marcador CD8+(mayoritariamente linfocitos citotóxicos); las cé-lulas presentadoras de antígeno también puedenpresentar péptidos procedentes de proteínas exó-genas para ser reconocidas por el mismo tipo delinfocitos T 75, 76.

Las funciones de unión de péptidos y presen-tación implican que cada molécula de clase I pue-

Fig. 3.8 – Estructura génica de las subregiones DP, DQ y DR.

47

de formar complejos con un amplio espectro depéptidos, sin embargo, cada una de ellas une ungrupo determinado, lo cual indica que estas molé-culas presentan selectividad alelo-específica 77. Laestructura cristalina de la molécula HLA con elpéptido unido ha revelado cómo un único produc-to alélico puede unir un extenso panel de pépti-dos con alta afinidad 78.

El tamaño adecuado de estos péptidos es de 8a 11 aas 77, 79 y sus extremos carboxilo y aminoter-minales están fuertemente fijados al borde de lahendidura 78, a diferencia de los péptidos para cla-se II en los que son los aas centrales los que inte-raccionan con la valva. Prácticamente, el únicorequerimiento imprescindible para que el péptidose adapte bien a la valva es que el aminoácido car-boxiterminal sea hidrofóbico o cargado 79, permi-tiéndose casi cualquier aminoácido excepto prolinay probablemente glicina 80. Las cadenas lateralesde los residuos aminoacídicos P1, P2, P3, P6, P7 yP9 interactúan con los pockets A, B, D, C, E y Frespectivamente (ver Fig. 6) 38, 77. Para péptidos máslargos de 9 aas, los extremos se adaptan a los po-ckets A y F, y los demás se curvan hacia fuera de lavalva. Las interacciones entre los pockets y los aasancla están mediadas por puentes de hidrógeno81. La arquitectura de la valva permite que sus resi-duos interaccionen con el péptido y puedan adop-

tar conformaciones opcionales para mejorar estaunión 81. Además, la mayor parte de estas interac-ciones confieren estabilidad a la molécula y al pép-tido, y los hacen más accesibles al contacto con elTcR de la célula T 82. La inmensa mayoría de lospéptidos presentados por las moléculas de clase Ison generados a partir de proteínas localizadas enel interior celular, las cuales son degradadas en unorgánulo especial formado por un complejo pro-teásico ATP dependiente llamado Proteasoma 83,

84. El único requerimiento específico para que unaproteína entre en el proteasoma de forma eficaz esque posea una cola de ubiquitina unida de formacovalente 85. La implicación de este complejo pro-teásico específico en la presentación antigénica fuesugerido tras el hallazgo de dos subunidades,LMP2 y LMP7, cuyos genes mapean en el MHC 15.Se ha demostrado que ambos, tras ser inducidospor INF-?, reemplazan a dos subunidades consti-tutivas del proteasoma 86, de manera que orientanel procesamiento hacia un patrón distinto, y pro-bablemente específico, de los requerimientos de lasmoléculas HLA de clase I 87. El descubrimiento deotro activador inducible por INF-? y que tambiénmodifica la especificidad del proteasoma, el 11S-regulador o PA28 (subunidad que forma parte delproteasoma), ha sugerido la posibilidad de queestos tres componentes -LMP2, LMP7 y PA28- sean

Fig. 3.9 — Diferentes haplotipos de la subregión DR.

48

los responsables de los cambios específicos quesufre el proteasoma 88.

Los péptidos generados en el citosol han de sertraslocados a través de la membrana del retículoendoplasmático por los transportadores de pépti-dos TAP1 y TAP2, traslocación dependiente de ATP.No está claro si los péptidos, una vez en el lumendel retículo, sufren un procesamiento proteolíticoañadido 84. La molécula HLA de clase I maduraconsta de tres componentes: las dos cadenas poli-peptídicas (cadena pesada ? y la ?2-m) y el pépti-do. Al igual que todas las proteínas, en la mayoríade los orgánulos, sufre plegamientos y ensambla-jes facilitados, y en parte controlados, por las de-nominadas chaperonas. Las chaperonas secaracterizan por la falta de especificidad de sus-trato, el bajo número de recambio (turnover) y porno catalizar reacciones de plegamiento específicas.Básicamente parecen unir y estabilizar la confor-mación “no nativa” de las proteínas impidiendosu agregación 89. Entre ellas los miembros de lasfamilias de las “heat shock proteins”, hsp60 yhsp70, que pertenecen a las llamadas “proteínasinducibles por estrés” (stress-induced proteins),

El modelo de ensamblaje propuesto para lasmoléculas HLA de clase I 84 implica toda una seriede interacciones sucesivas (ver Fig. 3.10):

1. La cadena pesada naciente se asocia princi-palmente a la proteína BiP (Binding Protein) o a lacalnexina 90.

2. La unión de la ?2-m promueve la liberaciónde la calnexina, probablemente por un cambio con-formacional de la cadena ? 91.

3. Más tarde se forma un nuevo complejo cons-tituido por la cadena ???2-m al que se unen dosnuevas chaperonas, la calreticulina y la tapasina,y posteriormente el heterodímero TAP1/TAP2 92.

4. Una vez formado este complejo, la moléculade clase I es cargada con el péptido proporciona-do por TAP1/TAP2, adquiere la conformación ma-dura, se libera y es transportado hacia la membranacelular a través del cis y trans-Golgi siguiendo laruta secretora 93.

Presentación antigénica de las moléculas HLA declase II

Las moléculas de clase II unen un grupo hete-rogéneo de péptidos procedentes en su mayorparte del exterior celular y se encargan de “expo-nerlos” en la superficie de las células presentado-ras de antígenos (linfocitos B, células dendríticas ymacrófagos) para ser “inspeccionados” por el TcR

Fig. 3.10 – Vía de procesamiento y presentación antigénica para moléculas HLA de clase I.

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de los linfocitos T CD4+ (generalmente coopera-dores). La mayor parte de los péptidos presenta-dos por las moléculas de clase II provienen de ladegradación endocítica de proteínas exógenas obien, en menor medida, de proteínas endógenasque acceden a los endosomas (ver Fig. 3.11). Elensamblaje de la molécula de clase II con el pépti-do ocurre en unos compartimentos acídicos espe-ciales llamados MIIC (del inglés, MHC Class IICompartment) 94. La estructura física del antígenode clase II, así como la ruta proteolítica seguida porlas proteínas cuyos péptidos van a ser presenta-dos, hacen que el tamaño final de éstos varíe de 12a 25 aas 73, 74.

Mientras los péptidos se están formando, lascadenas ? y ? de los antígenos HLA de clase II sonsintetizados en el retículo endoplasmático e inme-diatamente el heterodímero naciente se asocia a lacadena invariante, Ii (proteína de membrana detipo II invertida). La cadena invariante, además deayudar al ensamblaje de las cadenas ??? tambiénbloquea la hendidura del heterodímero impidien-do la unión de péptidos en el retículo endoplás-mico. La unión está mediada por la proteína BiP yla calnexina además de otras chaperonas que ayu-dan a la estabilización y ensamblaje correcto decomplejos nonaméricos (???)3Ii3 95. Estos comple-

jos son rápidamente exportados hacia los compar-timentos endocíticos a través del aparato de Golgiguiados por las señales de la cola citoplasmáticade la cadena invariante 96. Cuando el complejononamérico entra en el endosoma la cadena inva-riante sufre una proteolisis secuencial, mediada porproteasas, catepsinas entre ellas, que la reducirá aun pequeño péptido de unos 20 aas denominadoCLIP (del inglés, Class II Associated Ii Peptide) yque ocupará la hendidura 97. En este proceso escuando los complejos nonaméricos se disocian endímeros a/b y es cuando entra en juego otro hete-rodímero, DMA/DMB, que actúa como catalizadorque promueve la separación del CLIP y la unióndel péptido antigénico, reacción favorecida por elpH ácido del compartimento MIIC 98. Sin embar-go, el mecanismo exacto de este intercambio, asícomo el sustrato sobre el que actúa la moléculaHLA-DM permanecen todavía poco claros.

Selección del repertorio de linfocitos T

La presentación de péptidos en el contexto delas moléculas HLA de clase I y II es esencial du-rante la selección del repertorio útil de los linfoci-tos T en el timo. Cada timocito genera porreordenamiento un TcR?? (o ??) único y proba-

Fig. 3.11 – Vía de procesamiento y presentación antigénica para moléculas HLA de clase II.

50

blemente irrepetible. Inicialmente, se produce unaselección positiva rescatando aquellos timocitoscon reordenamientos funcionales de los TcR, queson capaces de reconocer a las moléculas HLA conun péptido. Posteriormente, puesto que la especi-ficidad de cada TcR ya no cambiará mediante ma-duración de su afinidad, se desarrolla unaselección negativa para eliminar aquellos timoci-tos que pudieran convertirse en linfocitos autor-reactivos, y lo hace según la afinidad de estos TcRspor las moléculas HLA de clase I y II con péptidospropios unidos. Los timocitos cuyo TcR posean unaafinidad muy elevada o muy baja serán seleccio-nados negativamente (apoptosis), quedando aque-llos timocitos con afinidad media-baja por lospéptidos propios. La existencia de mutaciones enlos genes que codifican para las proteínas del com-plejo CD3 asociado al TcR da lugar a inmunodefi-ciencias de tipo primario 99.

POLIMORFISMO DEL SISTEMA HLA

El sistema HLA presenta un enorme polimor-fismo en los genes cuyas proteínas participan enla presentación antigénica; HLA de clase I clásicos(A, B y C) y de clase II (DR, DQ y DP). Esta carac-terística implica que dos individuos, sin ser pari-entes, tengan muy pocas probabilidades de serHLA idénticos.

Polimorfismo serológico

El polimorfismo del sistema HLA se detectóinicialmente mediante técnicas serológicas 100, 101 queconsisten en ensayos de linfocitotoxicidad por an-ticuerpos mediada por complemento. Por tanto, esnecesario disponer de anticuerpos monoclonaleso policlonales (menos frecuentes actualmente)para reconocer un antígeno HLA en diferentes la-boratorios. Las nuevas especificidades son revisa-das cada cuatro años, de forma oficial, en losTalleres Internacionales de Histocompatibilidadpor el Comité de Nomenclatura de la Organiza-ción Mundial de las Salud (OMS). En el últimoTaller Internacional de Histocompatibilidad (Pa-ris, 1996) se reconocieron oficialmente 28 especi-ficidades de la serie A, 61 para la serie B, 10 de laserie C, 24 de la serie DR, 9 de la serie DQ y 6 paraHLA-DP 102 (ver Tabla 3.1).

Polimorfismo genético

Este se ha incrementado notablemente, respec-to al detectado por técnicas serológicas, con el des-cubrimiento y aplicación de la reacción en cadenade la polimerasa 103 (PCR, del inglés PolymeraseChain Reaction), lo que ha permitido desarrollarnuevas técnicas moleculares de caracterización delpolimorfismo genético de los alelos HLA de clase Iy clase II: amplificación e hibridación con oligo-sondas específicas de alelo o grupos de alelos (oli-gotipaje directo y reverso), y la secuenciación deDNA genómico y cDNA. En el último Taller Inter-nacional de Histocompatibilidad 102 (Paris, 1996) sereconocieron oficialmente 98 alelos para el locusA, 212 para el locus B, 195 para el locus DRB1, 19para el locus DQA1, 35 para el locus DQB1, 10para el locus DPA1 y 77 para el locus DPB1. Des-de entonces y hasta Enero de 2000 se han reco-nocido oficialmente los siguientes alelos (http://www.anthonynolan.com/HIG) (ver Tabla 3.2).

Debido a la gran cantidad de polimorfismosdiferentes encontrados, el Comité de Nomencla-tura revisa y publica mensualmente los nuevos ale-los, así como los alelos que confirman los yaexistentes. Este elevado polimorfismo muestra unadistribución poblacional, en ocasiones, limitada ocon diferentes patrones de frecuencias. Es el casode las poblaciones nativas americanas (Amerindi-os) que poseen un restringido espectro de antíge-nos HLA (por ejemplo: B15, B35, B39, B40) respectoa los caucasoides, y cuyos subtipos alélicos sólo sehan encontrado en estas poblaciones 104-106. Asimis-mo, las poblaciones orientales, caucasoides y ne-groides muestran alelos HLA y diferencias en susfrecuencias que sirven como marcadores genéti-cos poblacionales.

Nomenclatura

Siguiendo la nomenclatura establecida por laOMS, los alelos de clase I se definen por la letra A,B o C (en función de su loci genético HLA) segui-do de una serie de números, y en ocasiones de unaletra (ver Tabla 3.3). Los dos primeros númerosdefinen la especificidad serológica cuando ha sidoidentificado con un anticuerpo, o en su defecto,definen la familia con la que posee mayor homo-logía de secuencia de DNA. Los dos números si-guientes indican el alelo dentro de esa familia y seasigna por orden cronológico consecutivo. Existe

51

Tabla 3.1Nomenclatura de las variantes polimórficas determinadas por técnicas serológicas de los antígenos HLA de clase I y II 102

HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DR HLA-DQ HLA-DP HLA-D

A1 A28 B5 B40 B59 Cw1 DR1 DR13(6) DQ1 DPw1 Dw1 Dw14

A2 A29(19) B7 B4005 B60(40) Cw2 DR103 DR14(6) DQ2 DPw2 Dw2 Dw15

A0203 A30(19) B703 B41 B61(40) Cw3 DR2 DR1403 DQ3 DPw3 Dw3 Dw16

A210 A31(19) B8 B42 B62(15) Cw4 DR3 DR1404 DQ4 DPw4 Dw4 Dw17(w7)

A3 A32(19) B12 B44(12) B63(15) Cw5 DR4 DR15(2) DQ5(1) DPw5 Dw5 Dw18(w6)

A9 A33(19) B13 B45(12) B64(14) Cw6 DR5 DR16(2) DQ6(1) DPw6 Dw6 Dw19(w6)

A10 A34(10) B14 B46 B65(14) Cw7 DR6 DR17(3) DQ7(3) Dw7 Dw20

A11 A36 B15 B47 B67 Cw8 DR7 DR18(3) DQ8(3) Dw8 Dw21

A19 A43 B16 B48 B70 Cw9(w3) DR8 DQ9(3) Dw9 Dw22

A23(9) A66(10) B17 B49(21) B71(70) Cw10(w3) DR9 DR51 Dw10 Dw23

A24(9) A68(28) B18 B50(21) B72(70) DR10 DR52 Dw11(w7) Dw24

A2403 A69(28) B21 B51(5) B73 DR11(5) DR53 Dw12 Dw25

A25(10) A74(19) B22 B5102 B75(15) DR12(5) Dw13 Dw26

A26(10) A80 B27 B5103 B76(15)

B2708 B52(5) B77(15)

B35 B53 B78

B37 B54(22) B81

B38(16) B55(22)

B39 B56(22) Bw4

B3901 B57(17) Bw6

B3902 B58(17)

Los antígenos que llevan a continuación otro número entre parétesis son un subtipo del antígeno entre paréntesis.

Tabla 3.2Variantes alélicas polimórficas admitidas por la OMS

(Enero de 2000) HLA de clase I HLA de clase II

Loci Nº de alelos Loci Nº de alelos

A 165 DRB 298

B 327 DQA1 20

C 88 DQB1 44

E 5 DPA1 19

G 14 DPB1 86

DMA 4

DMB 6

DOA 8

DOB 3

un quinto dígito para aquellos alelos con cambiosen la secuencia primaria de DNA (normalmenteen la tercera base de uno o más codones) que noproducen cambio en la proteína codificada (porejemplo, B*39061 y B*39062). También se han iden-tificado alelos que no se expresan (nulos o en in-glés “Null”) y que se nombran incluyendo la letraN como último carácter en el nombre del alelo (porejemplo, A*0215N).

Los alelos de clase II siguen las mismas reglasde nomenclatura genética, se definen por la letrasde la subregión (DR, DQ, DP) seguidos de A o Bpara indicar que codifican respectivamente para

52

Tabla 3.3Nomenclatura de las variantes alélicas determinadas por técnicas de secuenciación del exón 2 y 3 del

gen que codifica la cadena ? de los antígenos HLA de clase I 102.

HLA-A HLA-B HLA-CA*0101 A*2414 B*07021 B*1529 B*3519 B*4406 B*67011 Cw*0102A*0102 A*2501 B*07022 B*1530 B*3520 B*4407 B*67012 Cw*0103A*0103 A*2502 B*07023 B*1531 B*3701 B*4408 B*7301 Cw*02021A*0104N A*2601 B*0703 B*1532 B*3702 B*4409 B*7801 Cw*02022A*02011 A*2602 B*0704 B*1533 B*3801 B*4410 B*78021 Cw*02023A*0202 A*2603 B*0705 B*1534 B*38021 B*4501 B*78022 Cw*02024A*0203 A*2604 B*0706 B*1535 B*38022 B*4601 B*8101 Cw*0302A*0204 A*2605 B*0707 B*1536 B*39011 B*4701 B*8102 Cw*03031A*0205 A*2606 B*0708 B*1537 B*39013 B*4702 Cw*03041A*0206 A*2607 B*0801 B*1538 B*39021 B*4703 Cw*03042A*0207 A*2608 B*0802 B*1539 B*39022 B*4801 Cw*04011A*0208 A*2609 B*0803 B*1540 B*3903 B*4802 Cw*04012A*0209 A*2610 B*0804 B*1541 B*3904 B*4803 Cw*0402A*0210 A*2611N B*0805 B*1801 B*3905 B*4901 Cw*0403A*0211 A*2901 B*1301 B*1802 B*39061 B*5001 Cw*0404A*0212 A*2902 B*1302 B*1803 B*39062 B*5002 Cw*0501A*0213 A*2903 B*1303 B*1804 B*3907 B*51011 Cw*0602A*0214 A*3001 B*1304 B*1805 B*3908 B*51012 Cw*0701A*0215N A*3002 B*1401 B*2701 B*3909 B*51021 Cw*0702A*0216 A*3003 B*1402 B*2701 B*3910 B*51022 Cw*0703A*02171 A*3004 B*1403 B*2702 B*3911 B*5103 Cw*0704A*02172 A*3006 B*1404 B*2703 B*3912 B*5104 Cw*0705A*0218 A*31012 B*1405 B*2704 B*40011 B*5105 Cw*0706A*0219 A*3201 B*1501 B*27052 B*40012 B*5106 Cw*0707A*0220 A*3202 B*1502 B*27053 B*4002 B*5107 Cw*0708A*0221 A*3301 B*1503 B*2706 B*4003 B*5108 Cw*0801A*0222 A*3303 B*1504 B*2707 B*4004 B*5109 Cw*0802A*0224 A*3401 B*1505 B*2708 B*4005 B*5110 Cw*0803A*0225 A*3402 B*1506 B*2709 B*4006 B*5111N Cw*0804A*0226 A*3601 B*1507 B*2710 B*4007 B*52011 Cw*12021A*0301 A*4301 B*1508 B*2711 B*4008 B*52012 Cw*12022A*0302 A*6601 B*1509 B*2712 B*4009 B*5301 Cw*1203A*0303N A*6602 B*1510 B*3501 B*4010 B*5302 Cw*12041A*0304 A*6603 B*1511 B*3502 B*4011 B*5401 Cw*12042A*1101 A*68011 B*1512 B*3503 B*4012 B*5501 Cw*1205A*1102 A*68012 B*1513 B*3504 B*4013 B*5502 Cw*1301A*1103 A*6802 B*1514 B*3505 B*4014 B*5503 Cw*14021A*1104 A*68031 B*1515 B*3506 B*4015 B*5504 Cw*1403A*2301 A*68032 B*1516 B*3507 B*4016 B*5505 Cw*1502A*240210 A*6804 B*1517 B*3508 B*4017 B*5506 Cw*1503A*240210L A*6805 B*1518 B*35091 B*4018 B*5601 Cw*1504A*2403 A*6806 B*1519 B*35092 B*4101 B*5602 Cw*15051A*2404 A*6901 B*1520 B*3510 B*4102 B*5603 Cw*15052A*2405 A*7401 B*1521 B*3511 B*4103 B*5604 Cw*1506A*2406 A*7402 B*1522 B*3512 B*4201 B*5701 Cw*1601A*2407 A*7403 B*1523 B*3513 B*4202 B*5702 Cw*1602A*2408 A*8001 B*1524 B*3514 B*4402 B*5703 Cw*16041A*2409 B*1525 B*3515 B*44031 B*5704 Cw*1701A*2410 B*1526N B*3516 B*44032 B*5801 Cw*1702A*2411N B*1527 B*3517 B*4404 B*5802 Cw*1801A*2413 B*1528 B*3518 B*4405 B*5901 Cw*1802

53

la cadena ??o ???Después un número que indica laversión del gen, y por último los caracteres alfa-numéricos, por ejemplo, DRA1*0101-DRB1*03011(ver Tabla 3.4). A diferencia de clase I, para clase IIno existe una correlación lógica entre la nomen-clatura genética y la serológica, puesto que ambosgenes A (alfa) y B (beta) son polimórficos (exceptoDR). Así, el antígeno DQ5 (variante de DQ1) está

codificado a nivel genético por los loci DQA1*0102y DQB1*0602.

La OMS ha decidido asignar solamente nom-bre oficial a aquellos patrones de reacción seroló-gicos que correlacionen con secuencias de DNA,ya que puede haber patrones de reacción cruzadaentre diferentes antígenos por compartir determi-nados epitopos.

Tabla 3.4Nomenclatura de las variantes alélicas determinadas por técnicas de secuenciación del exón 2 de los genes

que codifican para las cadenas ? y ? de los antígenos HLA de clase II 102

HLA-DRA HLA-DRB1

DRA*0101 DRB1*0101 DRB1*0414 DRB1*0815 DRB1*1125 DRB1*1320 DRB1*1420

DRA*0102 DRB1*01021 DRB1*0415 DRB1*0816 DRB1*1126 DRB1*1321 DRB1*1421

DRB1*01022 DRB1*0416 DRB1*0817 DRB1*1127 DRB1*1322 DRB1*1422




























DRB1*0411 DRB1*0812 DRB1*1122 DRB1*1317 DRB1*1417



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APLICACIONES AL ESTUDIO DEL SISTEMA HLA

El conocimiento cada vez más preciso adquiri-do en los últimos años respecto a la evolución yfunción de genes y moléculas HLA (MHC en ge-neral) ha permitido su estudio aplicado a múlti-ples disciplinas 107:

• Legales: el polimorfismo del sistema HLA per-mite realizar estudios de paternidad, ya quees muy improbable que dos personas no re-lacionadas genéticamente posean los mismosantígenos HLA. Su poder de discriminaciónsupera el de otros sistemas de proteínas.

• Evolutivas: el polimorfismo y el desequilibriode ligamiento del sistema HLA sirven comoherramienta para relacionar filogenéticamen-te grupos poblacionales humanos, alelos y locigenéticos entre intra e interespecies 108-111.

• Clínicas: por una parte intentar establecer larelación entre la compatibilidad HLA y la su-pervivencia de los trasplantes de órganos. Porotra parte, existen muchos estudios que rela-cionan ciertas moléculas HLA, e incluso de-terminadas secuencias de DNA, como factoresde protección y susceptibilidad a padecer en-fermedades 112, 113. Se ha postulado que el mi-metismo molecular entre ciertos patógenos ypéptidos autólogos podría desencadenar unarespuesta específica autoinmune.

TRASPLANTE HEPÁTICO

Introducción

En las últimas dos décadas, la supervivenciadel trasplante hepático ha mejorado de forma con-comitante con los avances en la preservación delos órganos, técnicas quirúrgicas, cuidados posto-peratorios, regímenes inmunosupresores, los di-agnósticos de rechazo y, quizá por encima de todo,a unos criterios más fundamentados de selecciónde enfermos y de fijación del momento del tras-plante 114, 115. A pesar de la relativa alta mortalidadinicial, la supervivencia a un año es comparableahora a la de los trasplantes de corazón y riñón.Aunque el rechazo agudo es sin duda problemáti-co, la tasa de mortalidad después de un año debi-do al rechazo crónico es comparativamente baja.Aún más, existen evidencias de que el trasplantehepático confiere protección específica para otrosórganos trasplantados.

El trasplante hepático difiere al de otros órga-nos vascularizados en el marcado poder de recu-peración del rechazo hiperagudo y unasusceptibilidad reducida al rechazo crónico. El hí-gado es el órgano de mayor fuente de moléculassolubles HLA de clase I (sHLA-I) que podrían ejer-cer, según diversos estudios, potentes efectos in-munomoduladores. Además, al contrario que elcorazón y el riñón, el hígado tiene capacidad re-generativa y las células de Kuppfer del donanteson remplazadas por células retículo-endontelia-les del receptor en 6 semanas.

Compatibilidad ABO

Aunque la compatibilidad de grupos sanguí-neos no es un requisito indispensable en el tras-plante hepático, el beneficio de la identidad ABOsobre la compatibilidad se encuentra actualmentebien establecido. El registro de trasplante hepáticoUNOS muestra un 67%, 61% y 57% de supervi-vencia a los cinco años en pacientes trasplantadoscon identidad, compatibilidad e incompatibilidadde combinaciones de grupos sanguíneos, respecti-vamente 116. De estos trasplantes, todos menos el2.3% fueron ABO idénticos o compatibles. El pro-nóstico adverso en la incompatibilidad ABO esigualmente aparente en receptores infantiles con un72%, 70% y 64% de supervivencia a los cinco años,respectivamente. Actualmente, pocos centros reali-zan trasplantes ABO incompatibles, a menos quelas circunstancias clínicas obliguen a lo contrario.

Compatibilidad HLA

En contraste con los trasplantes de corazón yriñón, no existen evidencias concluyentes de unbeneficio en la supervivencia del trasplante cuan-do hay compatibilidad HLA. Incluso, se ha obser-vado una correlación inversa en pacientes concirrosis biliar primaria (CBP) y virus de la hepatitisC (VHC). Esta influencia en trasplantes HLA com-patibles puede ser debida a mecanismos autoin-munes recurrentes facilitados por clones delinfocitos T autorreactivos.

Estudios realizados por el grupo de Dallas 117

mostraron evidencias de un efecto positivo de lacompatibilidad HLA-A, -B, y –DR, comparando 0-2 antígenos no compatibles (86%, 4 años de super-vivencia) con 6 antígenos no compatibles (62%, 4años de supervivencia). Además, se observó un

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efecto independiente de las incompatibilidadesHLA-DR con 84%, 73%, y 64% en pacientes con 4años de supervivencia para 0, 1 y 2 incompatibili-dades respectivamente. Este efecto para -DR serelacionó con la clínica, el aumento de la inmuno-supresión, sepsis y rechazo en el grupo que pre-sentaba incompatibilidades 118.

Una tendencia en la supervivencia de los tras-plantes hepáticos con compatibilidad HLA-B, aun-que no para HLA-A o -DR, fue obtenida de datosacumulados de cuatro centros en Eurotrasplante119, y con órganos compatibles HLA-DR, restringi-dos a pacientes con cirrosis alcohólicas o autoin-munes, en el estudio CTS 120. Posteriores análisiscon datos obtenidos de 1146 trasplantes ortotópi-cos desde 1988 a 1993 apoyaban un efecto benefi-cioso de la compatibilidad HLA-DR 121. Lasupervivencia a un año para 0 incompatibilidadesfue del 74%, comparado con 57% y 59% con 1 y 2incompatibilidades respectivamente, mostrándo-se estos resultados estadísticamente significativos(p£0.02). En contraste, la experiencia Madison indi-caba que las incompatibilidades de clase I (HLA-Ay -B) pero no –DR (clase II) era predictivo de pér-dida inmunológica del trasplante 122. Por otra par-te, Meyer y colaboradores 123 no encontrarondiferencias estadísticas de compatibilidad a pesarde una tendencia de la compatibilidad DR con 91%,69% y 63% a 5 años de supervivencia para 0, 1 y 2incompatibilidades DR, respectivamente.

Como ocurre a menudo con estudios de cen-tros individuales, los trabajos anteriormente menci-onados requieren mucho tiempo y diferentes tasasde supervivencia. El pequeño número de pacien-tes compatibles y las múltiples comparaciones es-tadísticas llevaron a Doyle a cuestionarse la validezde estos resultados sin considerar otros factores deriesgo 124.

Menor atención ha recibido el locus HLA-DQ,posiblemente porque su determinación serológi-ca es menos resolutiva y, además, posee un fuertedesequilibrio de ligamiento con HLA-DR. Sin em-bargo, estudios realizados en España sobre estosantígenos muestran que la presencia del aleloDQB*0302 correlaciona con el rechazo agudo 125.Respecto a la determinación del polimorfismo, unestudio comparativo realizado en Japón 126 sobrela determinación HLA por genética molecular res-pecto a la serología muestra un 16% de errores enésta última.

Por otra parte, excepto para el trasplante renalde vivo, no existe correlación entre la compatibili-dad HLA y el curso postoperatorio. Sin embargo,los autores advierten de un mayor uso del inmu-nosupresor tacrolimus (FK-506) en aquellos casoscon incompatibilidades respecto a los que erancompatibles. Se ha observado la tendencia de unbeneficio en el trasplante cuando existe compati-bilidad HLA-DRB1 (alta resolución) junto conHLA-A y -B 127.

En común con el trasplante de riñón, la necesi-dad de realizar más de un trasplante hepático cons-tituye un riesgo adicional, pudiendo aparecer unrechazo agudo y crónico en el re-trasplante, corre-lacionando este último con la clínica del trasplan-te primario. En los trasplantes de riñón lasincompatibilidades HLA repetidas de un donanteconstituye la principal contraindicación cuando elprimer trasplante finalizó en rechazo. Debido a quelos trasplantes hepáticos se realizan sin tener ini-cialmente en cuenta la compatibilidad HLA, la sen-sibilización por repetición de incompatibilidadespuede ser determinante en la supervivencia detrasplantes posteriores. Sin embargo, estudios re-alizados por diferentes grupos llegan a conclusio-nes contradictorias, es decir, la repetición deincompatibilidades HLA de clase I y II no tienenefecto. Estos datos sorprendentes indican que larelación de las incompatibilidades del primer ysegundo donante no conllevan la supervivenciade futuros trasplantes.

Los datos registrados del UNO muestran la ideade que los trasplantes hepáticos confieren efectosprotectores específicos del donante sobre otros ór-ganos trasplantados 128. Este análisis demuestra quelos riñones trasplantados en combinación con elhígado tenían mayores tasas de supervivencia quesolo el riñón contralateral. En este estudio, despuésde la corrección por la muerte de pacientes a cau-sa de la pérdida del trasplante, la supervivencia alos 3 años era del 78% para el riñón contralateralrespecto al 81% para aquellos riñones trasplanta-dos en combinación con el hígado.

Compatibilidad HLA, infección viral y rechazocrónico

El rechazo en el trasplante hepático, al igualque ocurre en otros órganos, se manifiesta por unestrechamiento de las pequeñas arterias dandolugar a un daño isquémico progresivo. En el híga-

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do, la patogénesis órgano-específica del rechazocrónico es el síndrome de los conductos biliaresevanescentes (SCBE)129. Los mecanismos de la pér-dida crónica del injerto son aún desconocidos ypuede manifestarse como una hepatitis autoinmu-ne “de novo”130, hepatitis crónica inducida por vi-rus y rechazo crónico131. Algunos estudios hanmostrado una posible relación existente entre lacompatibilidad HLA y las infecciones virales.Máñez y colaboradores132 mostraron que la inci-dencia de manifestaciones clínicas de CMV era del44% para hígados HLA-DR compatibles y del 14%para los que eran DR incompatibles, sugiriendo enesta situación que, la compatibilidad DR acelerabael rechazo crónico. El grupo de Donaldson133 en-contró que la compatibilidad en el locus HLA-Btenía un efecto beneficioso, pero que el SCBE eramás común en pacientes sin incompatibilidadespara el locus HLA-A. En contraste con otros estu-dios, estos autores no encontraron relación algu-na entre la compatibilidad HLA-DR o -DQ y elSCBE. Un estudio reciente ha identificado la in-fección prolongada activa por CMV como un fac-tor de riesgo asociado al rechazo crónico, lo queocurría aparentemente sólo en pacientes que norecibían propilaxis con ganciclovir. Sin embargo,Candinas y su grupo134 obtuvieron resultados con-tradictorios ya que no encontraron, mediante aná-lisis multivariable, asociación entre HLA y CMVen el rechazo crónico. El uso no rutinario en todoslos estudios de ganciclovir en la profilaxis del CMV,podría explicar las diferencias encontradas en laliteratura.

Las técnicas modernas de diagnóstico hanmostrado que la infección recurrente post-trasplan-te del virus de la hepatitis C (VHC) es casi univer-sal, pero sólo una proporción de pacientessucumbe a una cirrosis VHC o hepatitis colestáti-ca131. Este espectro de síntomas clínicos no se en-cuentra directamente relacionados a la carga viral,pero sí podría estar relacionado con el genotipoVHC y la compatibilidad HLA, lo que permitiríauna respuesta celular MHC restringida hacia lopéptidos virales. Diferentes estudios han mostra-do alguna relación con HLA-A, -B135, -DR136 o sinasociación a HLA131, 137. El genotipo VHC 1b seencontró asociado con un mayor rechazo sobretodos los supervivientes que no eran diferentes deaquellos sin VHC138. En este estudio, el pronósticono fue moderado por el régimen inmunosupresorprimario o exento de incompatibilidad HLA.

La carencia de una asociación entre la compa-tibilidad HLA y el rechazo crónico ha llevado a losinvestigadores a tener en cuenta otros factores noHLA. Candinas y colaboradores134 consideraroncompatibilidad de sexo (donante varón para unamujer receptora) y compatibilidad CMV. Estos fac-tores fueron identificados como factores de riesgoadicional para el rechazo crónico de trasplante dehígado, los cuales eran independientes de la com-patibilidad HLA. La hibridación “in-situ” ha loca-lizado el antígeno masculino H-Y expresado en lascélulas epiteliales biliares y en las células endoteli-ales hepáticas139 que son las principales dianas delrechazo crónico. Por otra parte, el registro UNOSmostró que la combinación de varones receptoresde mujeres donantes resultaba en la tasa de super-vivencia más pequeña a un año con un 68% desupervivencia sin rechazo frente a un 75% para elresto de combinaciones sexuales donante/receptor(p£0.001)116. En receptores infantiles tampoco se haobservado una relación entre estos factores.

El mecanismo de reconocimiento aloantigéni-co indirecto en el rechazo ha sido demostrado porrespuestas T-específicas a péptidos sintéticos deantígenos incompatibles HLA-DR del donante,presentes en pacientes con rechazo hepático140.Esto está en concordancia con el concepto de quelos aloantígenos del donante son procesados porlas células presentadoras de antígeno del receptorindicando que la vía indirecta juega un papel prin-cipal en la respuesta del rechazo. La compatibili-dad HLA para los trasplantes hepáticos pueden,por tanto, ser un arma de doble filo, con una dis-minución del rechazo agudo pero con un aumen-to de la respuesta a través de MHC a antígenosvirales, péptidos derivados de MHC o antígenosmenores de histocompatibilidad. Mientras el recha-zo agudo mediado por el alorreconocimiento di-recto, como demostró Arvieux y colaboradores141

en injertos HLA-DR incompatibles, es normalmen-te controlable por los inmunosupresores actuales,las respuestas indirectas a células T son resistentesa ciclosporina y son menos fácilmente controlables.El entendimiento de estos mecanismos inmunoló-gicos será importante para futuras estrategias quemejoren la supervivencia del trasplante hepático.

Sensibilización

Al contrario que los trasplantes de riñón y co-razón, los trasplantes hepáticos rara vez sucum-

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ben a un rechazo hiperagudo. La compatibilidadde los grupos sanguíneos y una prueba cruzadanegativa con los linfocitos del donante no son pa-rámetros esenciales y, por tanto, no están estrecha-mente relacionados con la sensibilización humoral.

Los estudios realizados con resultados enfren-tados sobre la sensibilización y pruebas cruzadasen trasplantes hepáticos pueden explicarse por lasdiferentes metodologías empleadas e interpreta-ción de los resultados. Por ejemplo, muchos estu-dios históricos no han considerado criterios talescomo las clases de inmunoglobulinas (Igs) y espe-cificidades de los anticuerpos, asumiendo de for-ma errónea que todas las pruebas cruzadaspositivas son potencialmente dañinas. Datos reci-entes muestran una proporción de anticuerposIgM linfocitotóxicos HLA no específicos en tras-plantados hepáticos, los cuales no presentabansignos clínicos relevantes en el trasplante renal142.Sin embargo, tales anticuerpos tienen baja afini-dad de unión a las células T y son fácilmente eli-minables por lavado en ensayos de unión143. Portanto, aunque estos anticuerpos puedan reaccio-nar fuertemente en ensayos estándar de microlin-focitotoxicidad, es menos probable detectarlos enensayos AHG (antiglobulina humana) y son nega-tivos cuando se utiliza citometría de flujo.

Prueba cruzada y citotoxicidad

Se ha observado que una prueba cruzada po-sitiva ejerce un efecto deletéreo significativo de-tectado en un mes144. Con una prueba cruzadapositiva la supervivencia en un año fue del 55%respecto al 79% con prueba cruzada negativa. Untítulo de anticuerpos >1/8 y la persistencia de an-ticuerpos detectables después del trasplante fue-ron considerados factores adversos en la viabilidaddel mismo. Evidencias similares de un efecto ad-verso en una prueba cruzada positiva fue descritapor el centro de Dallas, con un 18% de diferenciaen pacientes trasplantados a los 4 años, y el centrode Houston con un 24% de diferencia a 1 año145.En este último estudio, la diferencia fue mayorcuando se utilizó la técnica AHG con el 54% (AHGpositivo) frente al 89% (AHG negativo) de super-vivencia y sólo el 30% de supervivencia para pru-ebas cruzadas AHG-positivas (IgG) DTE resistente.Al contrario de lo expuesto, otro grupo no encon-tró efectos en 12 trasplantes hepáticos con prue-bas cruzadas IgG positivas, de los cuales 11

tuvieron valores normales de bilirrubina y enzi-mas hepáticas146.

Máñez y colaboradores135 demostraron la im-portancia de las clases de Igs y el título que pre-sentan, y la persistencia de la circulación deanticuerpos después del trasplante como un fac-tor determinante de la viabilidad. La persistenciade altos títulos de anticuerpos reactivos del donan-te después del trasplante fue asociado con una ac-tividad decreciente hemolítica del complemento,un incremento de inmunocomplejos circulantes ytrombocitopenia. En estos pacientes, el 50% de lostrasplantes fracasaron debido al rechazo.

Un incremento de la incidencia de fracaso tem-prano del trasplante fue confirmado por el grupode Hathaway147 con 5 de 24 (21%) trasplantes falli-dos con pruebas cruzadas positivas dentro de unmes, comparadas con el 4% para receptores depruebas cruzadas negativas en el mismo tiempo.Se ha descrito, en pacientes receptores con anticu-erpos IgG del donante, un rechazo severo y fraca-so final. En este estudio 8 de 20 trasplantes conpruebas cruzadas positivas fracasaron, y posterior-mente 5 más sufrieron rechazo agudo severo.

Inmunomodulación por moléculas solubles HLAde clase I y microquimerismo

La resistencia comparativa de los trasplanteshepáticos al rechazo y la observación de que unaproporción de receptores se muestran tolerantesa los órganos del donante sin una inmunosupre-sión mantenida, ha llevado a la hipótesis de quelas moléculas solubles MHC de clase I secretadaspor el hígado del donante podrían inducir unafalta de respuesta donante-específica a antígenosde clase I.

Niveles elevados en plasma de moléculassHLA-I se muestran como un indicador útil depatología hepática, siendo un marcador tanto deinfección como de rechazo agudo148. Puppo y co-laboradores149 han reportado un incremento dia-rio del 20% de sHLA-I hasta 6 días antes de lasmanifestaciones clínicas de rechazo, concentraci-ón que disminuye después del tratamiento con elanticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT3). Estosresultados indican el papel potencial de molécu-las sHLA-I en la monitorización inmunológica delcurso clínico y la respuesta a la terapia inmunosu-presiva. Niveles elevados de moléculas sHLA-I

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también se encuentran asociados con la enferme-dad de injerto contra huésped (GVHD), y en reca-ídas posteriores al trasplante de médula óseaalogénico. Además, los receptores de riñón, cora-zón e hígado con función estable en el tiempo pre-sentan niveles altos y estables de moléculas sHLA-Ide los donantes, indicando un posible papel tole-rogénico de estas moléculas.

Por el contrario, McMillan y colaboradores150

identificó dos grupos de receptores hepáticos alo-trasplantados: un grupo con alta y otro con bajaconcentración de moléculas sHLA-I. No encontródiferencias entre estos grupos en la incidencia derechazo o supervivencia del trasplante, indicandoque este factor no debe ser usado como un indica-dor para predecir un estado de tolerancia. La se-creción de altos y bajos niveles de moléculassHLA-I se han asociado con alotipos HLA concre-tos y diferentes grupos étnicos151. Los individuoscon antígenos HLA-A9 (A23 y A24), A29 (caucasoi-de) y A33 (afroamericano) tienen elevadas concen-traciones de sHLA-I en suero, mientras losindividuos HLA-A2 poseen baja concentración.Tales variaciones fenotípicas pueden ser importan-tes al considerar los estudios de supervivencia delos trasplantes y la tolerancia. Sin embargo, Chau-han y colaboradores152, utilizando un análisis cu-antitativo de moléculas sHLA-I en pacientesreceptores, no encontraron correlación con la fun-ción del injerto.

El uso de anticuerpos o el bloqueo celular sonalgunos de los mecanismos propuestos para lasmoléculas sHLA-I en la protección de alotrasplan-tes hepáticos frente a la respuesta inmune del re-ceptor. Se ha descrito la inhibición de CTLsHLA-específicos por moléculas sHLA y su habili-dad para formar inmunocomplejos153. Estos datosindicarían el importante papel de las moléculassHLA-I de los donantes en atenuar una respuestainmune adversa, y que daría cuenta de la relativabaja tasa de rechazo hepático crónico.

El paradigma (llamado en inglés “two way pa-radigm”) del microquimerismo hematopoyético,en el cual linfocitos del órgano donante inician unareacción contra células del receptor causando unaexpansión clonal recíproca y deleción, ha sido pro-puesto como un mecanismo de tolerancia al tras-plante hepático154. Esta hipótesis indicaría queGVHD y el rechazo son opuestos en el espectro delos mecanismos inmunológicos al trasplante, conun balance mantenido por la inmunsupresión. La

tolerancia inmunológica puede ser experimental-mente inducida con la transferencia de células he-matopoyéticas, produciendo un estado persistentede quimerismo, y un requerimiento particular delas células dendríticas podría inducir tolerancia155.Estas células pueden también ser importantes en laselección negativa de timocitos por deleción clonal.Starzl y colaboradores155 han argumentado que estoexplica por qué la compatibilidad HLA es inefecti-va para predecir la supervivencia del trasplante.

El microquimerismo puede ser establecido des-pués de una transfusión sanguínea y puede sermantenida después de la eliminación del órganorechazado156. Sin embargo, la detección del micro-quimerismo fluctúa y un resultado negativo en unmomento puntual puede ser engañoso. Técnicasinmunocitoquímicas y de la Reacción en Cadenade la Polimerasa (PCR) han demostrado la existen-cia de células quiméricas en la piel, ganglios linfá-ticos y sangre de riñones rechazados en pacientestrasplantados 29 años atrás157. En estos individu-os, el cultivo mixto de los linfocitos del donanteresultaron bajos frente a la tercera parte de los es-timulantes, indicando un estado de no respuestaespecífica del donante.

Sivasai y colaboradores mostraron que ni lasmedidas cuantitativas ni las cualitativas de las cé-lulas del donante a través de oligonucleótidos paraalelos HLA-DR incompatibles del donante, sonpredictivas de una función estable o rechazo158. Enun análisis secuencial análogo del DNA procedentede células del donante en órganos como el híga-do, corazón y riñón de receptores, Elwood y cola-boradores159 no encontraron asociación con lafrecuencia y severidad del rechazo dentro del pri-mer año del trasplante.

Los mecanismos de inmunomodulación, conla generación de altas dosis de tolerancia a travésde múltiples trasplantes, moléculas sHLA o la ino-culación de leucocitos de donantes para potenci-ar el microquimerismo, aún permanecen pococonocidos.

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