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QUiMICA CLiNICA 1989; 8 (2): 67-70
ARTicULOS ORIGINALES
Capacidad sintetizadora de prostanoides de la mucosa gastrica.Desarrollo de una metodologia de analisis
E. Poca, R.M. Perez", E. Sapcras, 1M. Bordas, J. Gaya, J.M. Pique
Resumen
Se fill eSllldiado el patrOil de silltes;!) de prosUlf/oidesell 11I11cosa gtistrica IlIImamt pOl' incubaciOfl cie homogeneizadQS de hiopsias ell prestncia de acido araquido"icQ·/- lie J' /JOslerior cromutograjia de liquidos ell' alta resollle;oll, ohserwilldo.\"e Will producci()11 muyoritaria deproslaglulICfil/us E! y Flu murclU/as rad;actillumellie.
Se /UI clelermilltuJo fa ClIpacitiad !,il11et;Zlulora de losproslUflOic!es 6-oxo-prostaglum/illa Fin (como metaboli·10 eSUlble cle fa proslagJumUlla 111. /romboxollo II](como mewholifo estable del fro",boxtIJlO A.J. y laspro.\'ulglmufiru/:!; F1". E! y Ih. de fa f11l1CO!UI gtl.\'Irica (/fI
lral Y f(im!iCll 11II/1/(lIIa (I parlir de precursores endogeII0S medianle radi(Jilllllllll(}(",dli~1sespec/ficos ell Ius fracciolles oblellic/as pOl' cromalogmjla de 1I'quidos de alIaresolucioll de /m JlOllIogelleiuu/o de biopsills (Jespues deIIna illctlbm:i6" ell c/lfsencia de ticido araqllidollico ex6gello. Las prostagltllldilltu' genenulas IIltl)'oriltll'ial/le"teell tll1/btls regiol1es tie la II/t1CMa gtlJlrictl jlleroll la £1 yla 1':\.. siemlo Sll sflltesis mayor en mllcostl alllmi respecto Sll sfmesis ell mucosa jlilldica CIllI/que sill llIostrar diferellcias siglli/ictl/il'as. £1 reslO de prostaglalltlillas 110If/ostraro" diferem.'itt.\' ell Sll ~'lillesis ell Itt.\' regiolles eSIl/·dicltlas.
InlrodlU.'cion
Los prostanoidcs dc la scric 2 dcrivan dc la oxidacioncllzim;itica del acido araquidonico, Estc .icido graso poliinsalurado sc libcm dc los fosfolipidos de membrana poraccion de las fosfolipasas C y A~ Yde una digliccrido lipasa en respucsla a dClcrlninados cSlimulos mcc:inicos
~ s.,·nicio d,' G:"lro""nl,'rologi:l, Ho)pil:ll Clinic i PIl)\'indalVillarrocl 17(}.OSOJ6 B:m:c1olla. Accpmuu cI 26·1-119
Summar)'
The proslalloid ~J'lIthesispattei'll ill anfral gastric 11111cosa has beell Sllldied by il1cubtl/ion of biop~J's hOlf/oget/ates lI'ith fllCf arachidollic acid and high performance liquid chrollllllography. A major prO(IUCliofl oflabelledIJrostaglwuUlls E] and fi.. has beell observed.
!»'fIfhesizillg capacity of prosrc/lloids 6-oxo-prostagill/it/iII F,~ (prostaglandin 11Slable metabolile), throm·boxalle III (thromboxalle A] stable meltlbolite), alltlprostaglalldills fi,·.. E] alld Ih ill ml1ral alltl jllll(lic gastric hUIIIt", mucosa from ellC/ogellotls precursors has bee"(Ietermilletl. ,SiJecijic radioitlll"'lIloCls~'ays in high JJerfor.II1l1llCe liquid £'Ilrol/l(l(ograplly fracliom' of if/(.'ubed bjop.~'les IlOmogellates ill aIJseflce of exogenOlI~' aradlldollicacid are used. Proslaglal/dill El tlml prostaglamlill Fla
were the prostaglalldills mai"ly syllthesized i" both gas·tdc mucosal regiolls. Although the ~'J''''hesisof these IWOpro.\'1tlglt/fleJil/s was higher ill the al/tral 'hall ill the fll'"tlic 1m/com, fhe differellces were 1/ot statistically .ligl1ifi·ca"'. 11,e ammmt of the Ofher pmstagllllulifls sYl/fhesi·:ecl was similar ifl the alltral and the fllmlic areas.
y qufmicos. EI acido araquidonico se convierle. por accion de la proslaglandina sinlasa (EC 1.14.99.1), en losendopcroxidos prostaglandina G2 y proslaglandina H2•
iIllcrmcdios inestablcs quc postcriormclllc sc transformanpor acci6n dc divcrsas isolllcrasas en las prostaglandinasEl , F1<.. D2• prostaciclina y Iromboxano A2•
La aetividad prostaglandina simasa csta presclllc pniclicamclllc cn lodos los Icjidos dc los mamifcros. incluidala mucosa gastrointcslinal. Posiblcrncntc los dislintos lipos dc cclulas POSCCIl difcrclllcs isolllcrasas, quc dan lugar a dislilllos pcrfilcs dc metabolilos del addo araquidOnico. Estas diferencias se encuentran enlre diSlintasespccies. lejidos, e incluso enlre regiones dc un mismoIcjido l •
Quimic<t Clinic:! 1989; 8 (2) 67
Enne los difcre[l(es efeclos en la lllucosa gaslroduodenal de las dislillWS proswglandinas, principalmellle laE: y la I:, se indllyen cilOproleccion, cSlililulaci6n 0 inhibicion do: funeiones secrelOras y carnbios en la microcircula(ion y la 11l0lilidad1 • la prirnera evidencia de laimporlancia de las proslaglandinas endogenas de la mu(osa g,is1rica ell elll1anlenimiellio de su resislencia frenIe a faelQres nocivos fue demoSlrada indirectame1l\e porRoben-' al observar que la eSlimulacion de su sinlcsisjuega lIll papel proleClOr de la mucosa. Divcrsos eSlUdioshan Illostrado que 1,1 adminislracion de prostaglandinaso sus derivados SilllClicos ejerce un IJ<lPcl cilOproleclOrde la mucosa frenle a ,ieidos, alcalis, elanol, olros sol\'CIlles organicos y dana lcrmico~, y wmbicn evila laaparicion de lJlceras gaslroduodenales causada por inhibicion de la sintesis de proslaglandinas medianle anliinf1amalorios no eSleroideos'.
La ll1edida del conlenido de proslaglandinas de un lejido no rtlkja la naturaleza din,imica del melabolismode 1,IS mismas dcbido a la sinlesis provocada por la misma oblenci6n dc la biopsia y por los procedimienlos dehomogeneizacion. Adem,is, las prostagl,llIdinas son quimica y lllelabolicamenle ineslables, no siendo almacenadas por e11ejido, y su liberacion y Sll aClividad resullande la sin1csis de 1/01'0. ESlas caracleriSlicas suponell problemas llletodologicos que podrian explicar la disparidaden los resultados aparecidos en la bibliografia. Por estarazon cs mas adccuada la rnedida de la aelividad sill1etiZ<lClora de proslaglandinas que la delerminacion del conIcnido de tllewbolitos pr('SenlCS cn el lejido en un momenlO dado, y,l que puedc rd'lcjar I1lcjor la funcion dela mucosa.
En eSle trabajo se expone Ull procedimiel11o para la determinacion de la capacidad de sinlesis de proslaglandi!las cn mucosa antral y flltldica humana.
Malcrial y mclodos
Paciellies
EI cSludio se htl rcalizado en un grupo de diez sujelosquc fuerOli sOlllclidos a una gaslroendoscopia con prop6silOS diagn6slicos, y quc lIO mOStrO ningllillipo dc lesion, siendo pOl' dlo considerados como sujclOs sanos.La ausencia de cambios palOlogicos cn Ii.! mucosa g,islriea fue confinllada hislologicamenle.
Toma de los especimenes
Durante 1'1 gaslrocndoscopia se tOl11arOlllres biopsiasdc la mucosa anlral y Ires dc la fll11dica de lin peso cnSCCO entre 12 y 20 mg cada especimen lllcdianle una pinza Olympus CB IJ U. Eltejido rue lavado con lamponKrebs-Henseleil pH 7,46 en frio y congelado inmediatamcn1e despul's de su oblcncion en N~ liquido, conserv<lndose a -70 "C hasta el lllomcnto de Sit anillisis.
ProcedimielllO analitico
Los espcdmellcs congdados sc homogcneizaron en 1,1mL de lampon Krebs-Henscleil pH 7,4 a 4 °C previamenIe salurado de dioxigeno (pOl' gaseo duranle 5 rninulos(on «carbogenoll: 95 % de O~ y 5 070 de CO;) usando
(,S (Juimic" Clinic;! 1%':1: 8 (11
un homogeneil.ador IYlanual de vidrio esmcrilado. Dosalicuolas de 600 ~L del hOlllogcncizado sc incubaron a37 "C duranle 30 minulOS con agilacion conlinua, conel fin de proeeder a ta medicion de la sinlesis cndogemlde proslaglandinas. Ell otra alicuola de 600 IlL se aiiadieron 10 ~g de indomelacina, inhibidor de la proslaglandina siulasa7 y se incubo a 4 °C con c1 objelO de medirel contenido basal de proslaglandinas.
Con la finalidad de disponer del perfil de sinlesis deproslagJandinas en la mucosa annal, se incubaron tambien lllucstras procedenles de biopsias de tres sujelOs nOl"males ('n prcs(,ll(ia de 91,5 tvll3q/l de acido araquidonicol_I·C (aclividad especifica: 1,9 TBq/mol).
Finalizada la reacdon la mel.e1a se diluyo con 9,5 rnLde eWllol 1,75 mol/L, y se anadieron 0,23 13q/L de proslaglandinas E" F!" Y 0 1 , Iromboxano B~ y 6-oxoproslaglandina F1" triliadas (Amcrsham, lnglmerra) parael calculo de la recuperacion en la medicion de sinlesisendogena. Se ajuslo c1 pH a 3,5 con acido acclico 91ll01/L, Y los proslanoides se eXlt'ajeron medianle una minicolumna de oCladedl silica (ODS) (Sep Pak CIS. Walers, Mildford, Ma) previamenle aClivada~. Se lav6 la columna con agua y cler dc pelroleo, eluycndose lasproslaglandinas con formialO de melilo. EI extraclO seevaporo a sequcdad bajo COrriellle de N, a 40 0c.
CromalOgrafia de Hquidos de aha resolucion
EI eX\raclo seco se rediluyo en 100 III de fase rnoviLSe Ulilizo un siSlema cromalOgrafico compueslO por dosbombas Walers 510, un inyeclor Walers U6K, una columna de ODS (Radial-Pak CIS. Walers) coneclada alternalivamell1e a un coleclOr de fracciones (Frac-lOO, Phanllacia, Upsala, Sueda) 0 a un deleclor de radiacliv;dad {3en f1ujo conlinuo (RlC-40, KOJllron, Zurich, Suiza). Lafase l1lovil fuc una lllczc1a de aeido formico 0,01 mol/L,pH 3,0 (solvcnle A) y acclonilrilo (solvenle 13) a un caudal dc 0,01 mL/sY. Las rnueSlras para la rnedkion de lasinlcsis cndogena de proslaglandinas se e1uyeron isocralicamentc (on una proporcion AID de 67:33, recogicndosc las fracciollcS correspondientes a [os melabolilOS6-oxo-proslaglandina 171", lromboxano 13", y proslaglandinas Fe'" E.: yO.:, cuyas posiciones se idemificaron l\lCdiaIl\e una mel.c1a de palrones lriliados, medianle el eo1cClOr de fra(ciones. EI perfil de sintesis oblenido COil lasllluestras in(ubadas con acido araquidonico-I-"'C se obluVO por elucion isocralica AlB 67:33 durall1e 20 minulOS, seguido dc un gradielllc lineal haSla alcamar el 100 %dc 13 en 5 minlllOS y mtlnlcnimienlo del 100 0,'0 de B duorallle 15 minulOS. En eSle caso, la dele(cion dc los picosse realizo medianle d deleclOr radioquimico. La convcrsian cle ,icido araquidonico-l-I.lC en produclOs se expresa como porcenlaje de radiaClividad en los picos respec10 radiaclividad 101,11 en el cromtllOgrama.
Rad ioi 11111 Ul1oensayo
las fracciones relalivas a las proslaglandinas E, y F!"se analizaron pOI' radioinmunoensayo (RIA) usando anlicuerpos allamenle especificos (lnslilule Pasleur, Paris,Francia), proslaglandina E1• 'H Y proslaglandina F:,,-"Hcomo lrazadores y separacion median Ie carbon aClivodcxlrano. las fracciones relalivas a la 6-oxo-proslaglandina 17 1" y lromboxano 13, sc delcnninaron por RIA
(Amersham) lIsando trazadores mareados COli ':~I y separadon mediante antic-lIerpo Iigado a paniculas magnClicas. La proslaglandina D: sc determin6 por RIA(Amersham) t:on lrazador triliado y separad6n mediantC carbon aCli\o·dexlrano. L..1S concentraciones obien idas fucron corrcgidas segun la l\.'CulX'racion de cada mucsIra y eI factor de dilllciOn. Los resultados fin,lles scexpres'lll en moles/kg de lejido,
Amilisis estadistico
Los resultados se e\aluaron usando la prueba de la I
de Siudeni pre\'hl comprobal'ion de la hipotesis dl' gaussianidad mediante la prueba de Kolmogoro\. ·Iodos losresullados se expresan (,-omo Illedia ±error eSlandar.
Rcsultados
[1 peso medio de las IIlllCSUaS analiz<ldas fue de42,7 ±4,2 mg par<llas de lllucosa anlral y 58,7 ± 10,0 mgpara las de jUl/rllIS,
Las medias de los porcenlajes de rccuperacion conjunlade eXlraedon y cromawgrafia de Iiquidos de alia eficacia fueron de un 60 0'0, 32 0.0 , 65 11"0, 65 It'o y 30 0.0 , para6·oxo·proslaglandina F,,,, Iromboxano B~ y proslaglandinas F:,,, E~ y D~ respectivamcllte.
EI limile de deleccion de los procedimienlos radioinmunologicos rue de 4,0 pmolcs/L 4,0 pmoles/L, 4.8pmoles/L. ].4 pmolcs/L y 5,7 pmolcs/L los coeridellle~ de variaeion illlrascriales rlleron 8 %.7 %,7 6,'0.9 6/0Y S %, Y los codicieilles de \'uriaciOIl illler~eriaics ruerOil 17 %, 16 %. 20 %. 19 % y 19 Ufo. respeclival1lClllepam 6-oxo-proslaglandina F1", ll"Omboxano 13: Y proslaglandinas F~". E: y D;.
En 1a labia I se llllleSlran los resultados oblenidos dela silllesis end6gena ill I'ilro de los distintos prostanoidesen las dos rcgione~de la Illucosa gastrica analil.adas (anI ro y ju"dlls).
EI produclo Illayoritario del ~i:.tellla de sinle:.is end6gl'no de proslanoidl's en ambas regiones rue proslaglandina E1 (753 ± 108 moles/kg y 5]0 ± 66 moles/kg en an·tro y fill/rillS respeclivlllllellle) (dircrencia 110 sigllifie:Hiva),prodllci('l1dose llllllbicn call1id<ldes impOrl,lllle~ de prosl:t~landin.. F:" (417±71 Illoles/k~ y 23]±91 moles/kgcn amro y jl/lltllIS respeelhamellle) (diferenda no sign ifieali\'a). Lo~ rc~"lIltes produclos analizados, 6-oxo-prostaglandina F,.. , prostaglandina D: y trombo:\ano B: mos·traron \'alores infcriorcs ,I los \';Ilores hallados para laspro~lagl,llldinas E: y F,:." sin mOSlrar direreTlcias sigl1ificalivas en su ~intesis ClI las dos re~iones dc la mucosac~ludiadas.
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Tiempo (minUlos)
.'~ur.. I. ltadio.:rol1l:uogr.una dd e'lf";,h:lo de homogellcizado derlIl1\:= :amr.Jl ilH:lll):ado ':011 :lcido ar.Jqllid6nico-l-1-C.(Donde AA repre.ell1:a d :ieido a....quidOnico. 6lPG1'1. d mel:lbolilO,-_Iable de 1'1 pro_raglandin:a I:. rXlJ: llOmbo"'1no B~ > PGI':". 1'Gl:.~.
I'GO: r"sp.:\:!i\aIl1Clll" l;l' prO'lal!landinas 1':'.. E: > 01).Ell orden:uJ:l, cpm h:lce rcf.:rl'nda a la IC"l:lllr;1 de r:IlJial'li,idad pord dl'le<:lor y 0.0 ,\CN d por,'cntaje de :I<:l'lOnilrilo pre_ellle en cII!ladjcnl" d..· clu<."i(\n
L"1 figura I Illuestra un cromatograma reprCSenlali\'odel perril de productos sillletizados al al1adir acidoaraquidonico-I·'-C a un homogeneizado de mucosa anlraL E1 cromatograma, realizado seglin elucion en gradiellle permite separar lo~ prodliCtOS de la prostaglandina sillla~a mas polarcs del propio precursor (acidoaraqllid6nico) y de OIro~ metabolilos menos polares noidcnlifie<ldos. $e deleCI.HOII cuatro produclOS mareadosIlla~'orilariosell.' la prosla~lanelina sinlas,l: proslaglandin.. F:.. , prostaglandina E:. 6-oxo-proslaglundina F1" Yprostagl,llldina D;, siendo ellromboxano Il: apenns deteclable. L."1 abundancia relali\'a de cada produclO scIllucstra en la figum 2. dondc se reprcsen\;l c1 porcentajede l.:ol\\el),iOn del acido ar.lquidonico-I.I-C a proslaglandinas marcadas. c..'\presado como mdiaclh idad en el picorcspcclo mdiactividad tal'll ell cI cluato. Las proslaglandinas F:, y E; rueron los proslanoidcs mayoriwriossintetizados (2.47±0.17 0'0 y 2.07±41 0'0 del total, ~s
IlCCliv<lIl1ClltC), La 6-oxo-praslaglandina F1" y la prostaglandina D; mostrarOIl porcentajes dl.' conversion similares (0,67 ±0.27 % y 0,8] ±O.20 % rcspl.'clivamerHc).
Dis('usion
Los resuhados del preSCIIlC cSludio demueslran que lasproslaglandinas E; y F:, son las mayoritariamenle simetizadas en la lIlucosa gaslriea. tamo enla region rltndica
Tnbhl ICap:lcidad de sinlcsis de Ilroslaghllldinas dc la mucosa g~lslric~, anlml ~r h'lIldic~1 a Imrlir dc
Ilrccursorcs cmhlgcnos cXIJrcsado como moll's/kg Icjido (media ± l'rror cShindar; 11 = 10),(J-uxo-I'Gh,.. representa cl mctabolilo eSlable de la prostaglandina I:. TXB: cl lromboxano H;
y I'CF;..• PGE: ~r PGD l rcspccli\'amcntc las proslaglundinas F: ' E l Y Dl
I\m roFUI/dus
ll-m:o-PGI- l .,
1-12:1::2686:1::2-1
TXU:
137:1::,H156:1::-16
PGF:"
-117 ±71233 ::l:91
PGI:;
7S3 ± lOS530:1:: 66
PGD~
130:1::32SS± 19
Quimil"a CHnil·a 1989; 8121 69
'" Conversi6n(como cpm !olales)
3,0
2,0
1,0
f'I:Ur.l 2. COnlenido de 6kPGFI" (m...tabolito ....lable de laprostaglandina 11). trombo.\ano lJl. y de las proslaglandinas Fl<>.El l' 1)1 radiactivos gellerados por homogencizados de mucosag:i.trica antral humana incubados con acido ~lraquid6nil:o-I.I·C.Los resultados sc expreSllIl como JlQrcelllajc de mdiaclil'idad en clpico rcspcclO a la mdiaelil idad total en cI eromatogmma(media'::I:error cstandar. 11=3)
como en la anlTal. La sintesis de las proslaglandinas El
y F1" ell mucosa antral fue mayor que su sintesis cn mucosa f(lIldica, aunqllC la diferencia no fue estadisticamentcsignificativa, mientras que el rcslO de mctaboliloS estudiados no mostraron difercncias entre ambas regiones.
La aplicacion de la cromatografia de Iiquidos de altaresolution a un cXlracto de un homogeneizado de mucosa antml humana, pcrmitio conocer cI perfil dc los produclOs sintetizados al incubar cl lcjido cn presencia de.icido araquid6nico-I- '·'C. Los porcentajes de conversiona productos de la prostaglandina sintasa obtenidos fueron similares a [os cncontrados por Ahlquist l cnjImdlfsusando cromalOgrafia en eapa fina como tccniea de separacion. y por Redfern tO en antro y fUlldus usando cromatografia de Iiquidos de aha resolucion. Las pequetiasdiferencias elllrc los rcsultados obtenidos por distintos:lutorcs en las proporciones de los dislilllOs prostalloidesobtenidos, pucden ser debidas al uso de difercnlcs mcdios dc incubaciOn ll •
Green y cols. lz cn un estudio realizado COli mucosagastrica humana no encomraron correlacion entrc cl ami.lisis de la sintesis endogena y cI amilisis de la sintesis apartir del precursor cxogcno radiactivo. La sintesis en·dagena pareec ser un renejo mas ajustado dc la capacidad sintctica dcl tcjido, ya quc lHiliza la fuen,,· cndogcnn de precursor. sicndo la produccion dc proslanoidcsdependicntc de toda la cadcna cnzimatica de la via metabolica y, por tanto. es UII renejo de la situation real dcltejido ell una drCUlIstanda dada. Los lIlctodos basadoscn la convcrsion de prccursorcs exogcnos son indudablemcntc uliles para conocer cl cspectro de metabolitos sinIClizados por un 1cjido. pero no rcvclan la vcrdadera actividad cclular cn una circullstancia fisiopatologicadctcrminada.
l\'luchos trabajos sigucn rcfiricndose a contCllidos ba·salcs de prostanoides (cn especial prostaglandina Ez) entcjido gastroduodcnal. Sin cmbargo. durante los uhimosanos sc han publicado varios mctodoslM.c.1J1 que valoranla capacidad endagcna dc silllcsis de prostanoides. Lascondir.:iOllcs de incubadon. cxtracci6n y aisiamiclllo de
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los proslanoidcs simetizados varian considerablemente deun mctodo a otro, 10 que dificulta la comparacion de resultados. De hecho, los valorcs basalcs de proslanoidcsen un homogencizado de tejido se ven afcctados por variables imposiblcs de controlar, como la CSlimuladon desu sintesis por la propia obtencion y manipulacion de lamucstra. Nucstro Irabajo apona un metodo que cvita csteimponante inconvenientc al medir exelusivameme la capacidad de sintcsis deltejido, indcpendientcmente del valor basal, que puede cstar afectado difercntemente en cadamuestra. Los resultados finales de sintesis sc cxprcsancomo difcrencia entre los va[orcs tras la incubacion pasiva l\ 37 °C Ylos valorcs dc una alieuota mantcnida a 4 0c.Todas las muestras fueron analizadas por duplicado. Debide al pequeno tamano de las biopsias 110 fue posiblela e\'aluacion de la imprecision del procedimiento analilieo. EI riesgo dc reacciones cruzadas en la medida de lasdislilllas proslaglandinas fue dcsprcciablc puesto que elRIA se realizo despucs de [a separacion por cromatografia de liquidos dc alta resoluciOn.
Agradecimienlos
ESle lrabajo ha sido sub\'encionado por una beca dela C,I.R.I.T. (Ar 87/153) dc la Gcneralitat de Calalunya.
Hfbliullr:lfia
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