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ESTIMACION DEL CALOR METABOLICO GENERADO EN UNFERMENTADOR DE 3000L POR LA LEVADURA PICHIA

PASTORIS-rec HBsAg

Denis Alvarez Betancourt, Miladys Limonta, Ral E. Daz Betancourt.Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa.

P.O. Box 6162, C.P 10600, Habana, Cuba. e. mail: denis.alvarez@cigb.edu.cu

RESUMEN

En los procesos fermentativos uno de los parmetros acontrolar la temperatura del proceso. En los equipos de

fermentacin estndares la recirculacin de agentesrefrigerantes es el mtodo ms utilizado para la extraccindel calor que se genera en el proceso metablico de

crecimiento de microorganismos y de otras fuentes degeneracin de calor aunque esta es la ms importante. Es

por ello que la determinacin de la generacin de estecalor es un parmetro a ser determinado. En este trabajose expone la determinacin de este calor realizado en el

proceso de Fermentacin de la levadura Pichia pastorisutilizada en la produccin del ingrediente activo de la

vacuna antihepatitis B.Este proceso de fermentacin utiliza una etapa inicial

utilizando glicerol como fuente de carbono yposteriormente se realiza una induccin con el uso de

metanol para la produccin del antgeno.A partir de este procedimiento fue posible estimar el valorde generacin de calor del cultivo industrial en el tiempo

con un valor mximo de 37700 kcal/hora a las 100 horas deFermentacin y este valor permiti ajustar lascarctersticas del sistema de bombeo del agente

refrigerante.

Palabras claves:Fermentacin, calor metablico,Pichia

pastoris.

1. INTRODUCCION

Dentro de los llamados sistemas de segundageneracin para la expresin de genes heterlogos

tenemos la Pichia pastoris . Esta levadura tiene comocaracterstica fundamental que es capaz de utilizar elmetanol como nica fuente de carbono y energa. En 1987,

Cregg y col. [1] lograron expresar el HBsAg,desarrollndose entonces procedimientos de produccin

de este antgeno que se utiliza como materia prima activa

de la vacuna anti-hepatitis B [3].En general se conoce que los microorganismos

metilotrficos generan una gran cantidad de calor

metablico creciendo en metanol. La generacin de calormetablico no es ms que el resultado dede una parte de laenerga que se produce durante el proceso de crecimiento

y biosntesis de las clulas por lo que es razonable esperaruna relacin directa entre el calor generado y la energa del

sustrato utilizado [2].El valor de esta generacin de calor metablico se

debe considerar al disear los sistemas tecnolgicos parael enfriamiento de los bioreactores. Es posible

calcular el valor aproximado de este calor generado a partir

de un balance estequiomtrico de calor que utiliza losvalores de entalpa generados en la oxidacin completa del

sustrato unido al valor del entalpa de la oxidacincompleta de la biomasa generada afectada por elrendimiento biomasa/sustrato, reportado por Bailey, J;

Ollis, D.F [2]..

En nuestro proceso de produccin industrial delHBsAg-rec a partir de la levadura Pichia pastoris seobtienen altos valores de concentracin celular lo que

deriv en dificultades para mantener la temperatura detrabajo de 30 C, en el Bioreactor. Como parte de una

investigacin nos propusimos, utilizando la metodologa

reportada por Bailey, J; Ollis, D.F [2]determinar el calormetablico que se genera en nuestro proceso de

Fermentacin. Para ello se tomaron las cinticas decrecimiento de procesos industriales as como losconsumos promedio de metanol.

2. METODOLOGIA

MATERIALES: CepaPichia Pastoris MP36 Muts, His

+

modificada genticamente para producir el HBsAg. (Clon226)

Medio Salino: (NH4)2SO4(22 g/L), K2HPO4(18.2 g/L),MgSO4x5H2O (7.50 g/L), CaCl2 x 2H20(0.5 g/L), Extracto deLevadura(5 g/L), H3PO4 (16.40 g/L), Vitaminas 400X, 2.50

ml/L, Sales basales1000X, 1ml/L, NH3 (20 %) para ajustede pH y adiciones seriadas de vitaminas y sales basales.

Fermentadores CHEMAP de 75 y 300 y 3000 L decapacidad total.

Bomba peristltica WATSON-MARLOW 503U.

Proceso Fermentativo.

El proceso de fermentacin del HBsAg, en la levaduraPichia pastorisse lleva a cabo en Fermentadores de 3000

L con 1000 L de volumen de Medio, inoculado con 200 Lde un cultivo de 8 horas previamente desarrollado en unfermentador de 300 L con el mismo medio y glicerol al 3

% como fuente de carbono.Se divide en tres etapas fundamentales. Crecimiento en

glicerol como fuente de carbono, Induccin del promotor

AOXI mediante la adicin de un flujo lento y continuo demetanol y Crecimiento y expresin del HBsAg por adicin

regulada segn un esquema preestablecido que mantienerelaciones especficas entre el flujo de metanol y labiomasa generada (gramos de MeOH a adicionar por

hora/gramos de biomasa generada (base hmeda)) avalores de 0.03, 0.025, 0.017, 0.015. Las condiciones de

Memorias V Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniera, Habana 2003, Junio 10 al 13 de 2003

959-212-095-1 2003, Sociedad Cubana de Bioingeniera, artculo T_0108

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trabajo son T= 30C, pH 4.75, 2 VVM de aireacin y 250r.p.m. de agitacin.

Calculo del calor metablico. Se calcul el calormetablico seccionando la fermentacin en varias etapas y

asumiendo la combustin completa de las fuentes de

carbono. Segn Bailey, J; Ollis, D.F [2]que plantea:

Y= Ys/(Hs - YsHc)

donde:

Ys: Rendimiento Biomasa-Substrato.

Hs(Variacin de la entalpa por combustin completa del

substrato) = #de moles x calor generado por la combustincompleta

Hc : Variacin de la entalpa debida a la combustincompleta de la biomasa.

= Hc x biomasa generada (gramos de d.w.)

Hc = 3 kcal/g cel. para levaduras creciendo en glicerol.

Hc = 8.33 kcal/g cel. para levaduras creciendo en metanol.Adems:

Qc (Calor asociado a la combustin de la levadura) =

Hc x Ys

: (Flujo de calor genera do por la unidad de t iempo)

Ys/Y= Qc-Hs

= x tiempo

3. RESULTADOS

Los resultados de los clculos a partir de lametodologa reportada se muestran en la Tabla I.

Tabla I

Resultados en la determinacin del flujo de calor total

generado (F ) durante el proceso fermentativo de lalevaduraPichia pastoris. HBsAg-rec .

t

(h)V. Glic. V. MeOH

Biom.

kg (d.w.)M. sust.

8 30 L - 19,2 361,57

15 - 51 L 8,53 1224,2

53 - 155 L 29,25 3759,7

75 - 121 L 18,98 2925,0

90 - 81 L 12 1967,4

100 - 96 L 13 2315,8

115 - 105 L 14 2535,5

Hskcal/ gsubst.

Hckcal/g cel.

YsQc

kcalF

kcal/hora

132694 57600 0,577 3,32E+04 1,24E+04209216 71054,9 0,218 1,55E+04 2,77E+04

642534 243652,5 0,243 5,92E+04 1,53E+04

499887 158103,4 0,203 3,21E+04 2,13E+04

336235 99960 0,191 1,91E+04 2,11E+04

395775 108290 0,175 1,90E+04 3,77E+04

433318 116620 0,173 2,01E+04 2,75E+04

Se pudo observar que existen dos mximos de flujo de

calor total. El primero es alrededor de las 15 horas de

Fermentacin en que se produce la mxima velocidad decrecimiento del cultivo. Despus existe una reduccin

asociada a la disminucin de la adicin de metanol comoestrategia para lograr la particulacin adecuada intracelulardel HBsAg. La acumulacin en el tiempo de biomasa en el

fermentador se incrementa paulatinamente hasta las 100horas en que se produce el mximo total de calor generado

observndose una reduccin en las horas finales del

proceso relacionado con la detencin del crecimiento

celular.El mximo de flujo total de calor generado se produce

para las 100 horas con un valor calculado de 37700kcal/hora que coincide en tiempo con el momento dondeno es controlable la temperatura del proceso industrial

donde adems la cantidad de biomasa en el cultivo escercana a 100 kg (base seca).

Este resultado mximo de calor es cercano a 0.40

kcal/g.cl/h. del mismo orden que reporta Shay y col. [4].

Existe otro pico mximo a las 15 horas, momento en que elflujo de adicin de sustrato y las condiciones de

operacin, permiten la mayor velocidad de crecimiento delmicroorganismo en metanol en el proceso. Posterior a estetiempo

4. CONCLUSIONES

Como conclusiones de este trabajo tenemos que fueposible estimar el valor de generacin de calor del cultivo

industrial en el tiempo con un valor mximo de 37700

kcal/hora a las 100 horas de Fermentacin. Este resultado

es del mismo orden del obtenido por Shay y col. [4] queobtiene 0.58 kcal/g.cl/h para un cultivo de Pichia pastorisde alta densidad, no obstante hay que considerar que en

nuestro proceso se reducen las velocidades decrecimiento a partir de las 60 horas para coadyuvar a laparticulacin intracelular del antgeno no llegando a las

concentraciones celulares reportadas por Shay y col [4].

Esta cantidad de calor no era posible extraerlo con losparmetros de operacin del sistema de enfriamientoinstalado en este tipo de Fermentador CHEMAP para unagua refrigerante de 20 C. Este valor de calor se tom

como criterio para reducir la temperatura de diseo para elagua refrigerante desde 20 C a 15 C.

REFERENCIAS

[1] J.M., Cregg Tschopp J.F., Stillmann C.A., Siegel C.,

Arkog R., Craig M., Buckholtz W.S., Madden R.G.,

Kellaris K.R., Davis A., Smiley G.R., Cruze B.L.,

T orregross J., Velicel..Biotechnology 5:479-485, 19 87

[2] J Bailey,.; D.F. Ollis, Biochemical Engineering

Fundamentals. McGraw-Hill Book Company Second

Edition. 1981[3] E Pentn, V. Muzio, M. Gonzlez-Griego, Biotecnologia

Aplicada. Vol 11. 1:1 -10. 1994.

[4] L. K Shay., H. R. Hunt. J. of Industrial Microbiology 2:

79-85, 1987