bloque bash (biotecnología animal y en salud humana) de cultivo, seguido por el crecimiento en...

Conceptos y Técnicas de Biotecnología I, CTBT

Bloque BASH (Biotecnología Animal

y en Salud Humana)

1 Sandra Ruzal CTBT 2011

VACUNAS

SANDRA RUZAL

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• VACUNAS → origen siglo XVIII, exposición

voluntaria a agente infeccioso era beneficiosa.

Generaba Protección a reinfección

• Inmunidad: respuesta del sistema inmunológico

→ memoria inmunológica Edward Jenner (médico británico)

inventó en 1796 la primera vacuna

contra la viruela.

El experimento consistió en inyectar

a un niño de 8 años la vacuna

procedente de una pústula del

brazo de una ordeñadora

(contagiada x VACA) a través de

dos cortes superficiales en el brazo,

consiguiendo inmunizar al niño ante

la viruela humana.

Sandra Ruzal CTBT 2011

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Aparición principales vacunas de uso humano:

- 1796: Vacunación contra la viruela

- 1885: Vacuna contra la rabia Pasteur

- 1925: Toxoide diftérico, Toxoide tetánico y tos combulsa

- 1937: Vacuna contra la fiebre amarilla

- 1943: Vacuna contra influenza

- 1954: Vacuna inactivada contra virus polio

- 1956: Vacuna viva atenuada contra virus polio

- 1960: Vacuna contra el sarampión

- 1966: Vacuna contra la rubeóla

- 1975: Vacuna contra hepatitis B→subunidades

- 1980: Viruela erradicada

- 1986: Primera vacuna recombinante (hepatitis B)

- 1988: Vacuna contra H. influenzae B → conjugada


cultivo celular y

desarrollo de virus

humanos fuera del

organismo vivo

Edad de oro

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Inmunización: procedimiento para generar

inmunidad adquirida: Especificidad y Memoria

Antígeno: molécula Inmunogénica, se aisla

del agente patógeno → identificar antígenos

responsables y eliminar componentes

patogénicos

Objetivo: PROTECCIÓN POR PREVENCIÓN

Qué son las vacunas: Preparados de antígenos que

introducidos en el organismos son capaces de estimular el

sistema inmunitario e inducir una respuesta protectora

Vacunas:


Inmunogénica: molécula capaz de despertar una

respuesta en el sistema inmune y producir memoria

inmunológica

Sandra Ruzal CTBT 2011 6

Respuesta secundaria

1-3 días

Mayor Intensidad

IgG, IgA, IgE

Mayor Afinidad de los Ac

Inmunnógeno Sólo proteínas

Respuesta primaria

5-10 días

Menor Intensidad

IgM>IgG


Respuestas inmunes que confieren protección:

Microorganismos extracelulares con una fase en sangre

crucial para la patogénesis (viremia o bacteriemia):

Respuesta Humoral

Microorganismos que ingresan por mucosas: Producción

de IgA secretoria neutralizante

Microorganismo intracelulares: Respuesta celular y

humoral.

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¿Que tipos de vacunas existen?

modificados para que no puedan generar enfermedad

Patógenos muertos

Sólo componentes



persisten en el organismo, hay una inmunización mantenida

que pasa progresivamente de vacunación primaria a

secundaria.

imitan a la infección, son baratos de producir y administrar

vía oral menor número de dosis requeridas

Ventajas vacunas vivas atenuadas vs. muertos o subunidades?

Desventajas

costos de almacenamiento y conservación, deben

mantener a 4°C, riesgo afecte al personal

riesgo potencial que revierta

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VACUNAS Atenuadas o Vivas: Microorganismos vivos que

multiplican con reducida patogenicidad (infección leve)

inmunidad humoral y celular


BCG

Una gran cantidad de estudios demuestran que NO induce

Ac pero sí una rta T CD4+ productora de IFN-. También

CD8+ y CD1.

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VACUNAS Inactivadas o Muertas:

Microorganismos enteros muertos no multiplican tratamientos

físicos o químicos eliminan infectividad, manteniendo

capacidad inmunogénica

(pertussis, fiebre tifoidea, via parenteral)

inmunidad generada sólo humoral,

grandes cantidades del Ag,

Pueden ocasionar efectos adversos (LPS)



· Pertussis acelular, subcomponentes proteicos purificados,

· Salmonella typhi, polisacárido capsular Vi,

· N. meningitidis grupos A y C, polisacáridos capsulares,

· Streptococcus pneumoniae (23-valente), polisacáridos

capsulares,

· Haemophilus influenzae tipo b conjugada, inmunogenicidad

polisacárido incrementada unida a proteína transportadora,

· N. meningitidis grupos A y C conjugadas Polisacaridos

capsulares conjugados con proteínas antigénicas

(meningococo, neumococo)

TOXOIDES: toxinas inactivadas (tetánica, difterica)

Subunidades procedimientos de fermentación y

purificación que han permitido la producción de vacunas a

base de subunidades o antígenos purificadas


Vacunas acelulares, vacunas con toxoides y

vacunas conjugadas, son débilmente

inmunogénicas

Adyuvantes

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Combinadas: varias especies

• Doble bacteriana (dT): difteria + tétanos.

• Triple bacteriana celular y acelular (DTP/Pa): difteria +

tétanos +pertussis.

• Cuádruple celular y acelular (DTP/Pa + Hib): difteria +

tétanos + pertussis + Haemophilus influenzae b.

• Quíntuple celular y acelular (cuádruple + IPV): DTP/Pa +

Hib + poliomelitis inactivada.

• Quíntuple celular (cuádruple + HB): DTP + Hib + hepatitis B.

Monovalentes: una única

especie un antígeno

Polivalentes: única especie

de distintos antígenos


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las bacterias deriva de lote de semillas de trabajo son inoculadas en

frasco de cultivo, seguido por el crecimiento en medio en biorreactores a

gran escala. Las bacterias son cosechadas por centrifugación. Para el

procesamiento las bacterias se mezclan con un estabilizador, liofilizadas

y encapsuladas a concentración de 2–10 x 109 bacterias Sandra Ruzal CTBT 2011

semilla inoculo

biorreactor

centrifugación

estabilizador liofilizada

encapsulado molienda

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Instalaciones de producción

1) Debe limpiarse fácilmente y

completamente;

2) Tienen ventilación adecuada y

aire filtrado;

3) tienen abundante agua limpia

caliente y fría y drenaje eficaz

4) tienen vestuarios y otras

instalaciones para el personal

que es accesible sin pasar a

través de áreas de preparación

de productos biológicos.

5) tienen diseño que evita

contaminación ambiental.

Material utilizado en producción

tiene que hacerse seguro antes

de salir de la instalación. Sandra Ruzal CTBT 2011

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1. Investigación pre-clínica se prueban pureza y seguridad en animales

2. Estudios clínicos en humanos:

• Fase I: pequeño grupo de voluntarios que habitan fuera del área

endémica. evalúa la seguridad y potencia de la vacuna.

• Fase II: análisis de la respuesta inmune de los voluntarios.

• Fase III: son pruebas “de campo”, se realizan con comunidades que

habitan en áreas endémicas. Seguimiento clínico de los individuos

vacunados.

3. Período de licencia procedimientos legales y administrativos a partir

de los resultados obtenidos en las etapas anteriores para la aprobación

(licencia) y registro de la vacuna.

4. Relevamiento post-licencia evalúa la vacuna durante algunos años.

Se estudian los cambios en la incidencia de la enfermedad y en la

transmisión y se registran los casos de reacciones indeseables. Sólo

después de esta etapa se considera o no la inclusión de la vacuna en los

planes de vacunación de la región.


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Bondades de una vacuna ideal

• Precio competitivo.

• Inocuidad.

• Estabilidad física y genética.

• Posible inmunización simultánea contra múltiples

componentes protectores de diversos patógenos.

• Protección de larga duración con 1 sola dosis Vía

Oral

• Inducción de inmunidad mucosas en máximo 2

semanas.

• Estimulación de respuesta inmune humoral y

celular a nivel sistémico. Sandra Ruzal CTBT 2011

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Problemas

i) no todos los agentes infecciosos son fáciles de crecer en

las condiciones normales de cultivo

ii) el trabajar con los agentes infecciosos requiere de

medidas de seguridad muy elevadas

iii) no todas las enfermedades infecciosas son prevenibles

por este tipo de vacunas;

iv) los agentes infecciosos usados en la producción de la

vacuna pueden estar insuficientemente atenuados o

muertos y por lo tanto pueden introducir la virulencia a la

vacuna;

v) componentes tóxicos de los agentes pueden no estar

completamente inactivados y mantener la toxicidad en la

vacuna final

El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas


22

Soluciones

a) identificar genes de virulencia y por lo tanto facilitar su

deleción en los agentes infecciosos creando clones

avirulentos pero que mantienen su habilidad de estimular

la respuesta inmune;

b) crear sistemas vivos no-patogénicos que acarreen los

determinantes antigénicos de un patógeno específico o de

varios;

c) para aquellos agentes de difícil crecimiento, se pueden

aislar los genes de las proteínas que contienen los

determinantes antigénicos críticos para la inmunidad y

expresarlos en otro huésped de mas fácil crecimiento

(bacteria)

El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas


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•Recombinantes: Se utiliza la manipulación genética para

producir alguno de los componentes del patógeno


4 subtipos


Las vacunas recombinantes de tipo subunidad

producto del gen expresado en bacteria, es cosechado,

purificado y administrado como una vacuna

Ej: lipoproteína superficie externa OspA de Borrelia

burgdorferi


Las vacunas recombinantes de gen deletado

vacunas con genes deletados asociados con la virulencia

o patogenicidad de una bacteria patógeno;

Ej: ensayos clínicos vacuna de cepas estables del agente

del cólera (Vibrio cholerae).

Las vacunas recombinantes vectoriales consisten de

organismos no patogénicos o de gen deletado en el que se

inserta un material genético específico de otro patógeno

Utilizan virus o bacterias vivos como vectores

27

Ej: Salmonella,

Mycobacterium

• HIV, Helicobacter

• La Salmonella entérica

viva atenuada es útil

como portadora de

antígenos heterólogos

para la vacunación,

capacidad de invadir

células de mucosa

• la eficacia fue

demostrada con

experimentos de

vacunación usando

antígenos protectores

con Listeria

monocytogenes.


Multiplicación si es en intracelular puede integrarse en el

genoma recombinación genética


vacunas recombinantes

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• Cumplir normativa sobre ecotoxicidad (Directiva 2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ):

• Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en diferentes especies

• Estudio de posible transmisión horizontal y recombinación potencial del vector vacunal o de parte de él.

• Estudio de especificidad de especie

• Estudio de la posible instalación en el ambiente.

• Método validado para poder distinguir entre vacuna y microorganismo “salvaje”, especialmente en situaciones de planes de control y erradicación de la enfermedad.

• Utilización de datos obtenidos de ensayos realizados con el mismo vector pero acompañado de otras secuencias.



Vacunas de ADN desnudo: El gen que codifica para el

antígeno es introducido en el organismo a ser

vacunado y él mismo produce el antígeno a partir de

ese gen

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inyectado directamente en las células, in vivo, donde luego

es traducido y expresado induciendo la respuesta inmune


•Efecto adyuvante

•5´-purina-purina-CG-

pirimidina-pirimidina-3´

• > Frecuencia en bacterias

•Metilados en C vertebrados

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Gene-gun para

Vacunas a ADN Inmunización

Transcutánea

intramuscular


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• Existen riesgos asociados:

• Integración potencial del

plásmido en el genoma de

las células hospedadoras.

• Inducción potencial de

anticuerpos contra ADN del

plásmido inyectado.

• Problema de conformación

no nativa de proteinas

bacterianas en vacunas con

ADN inoculadas en

animales.

• Liberación accidental de las

construcciones de ADN

desnudo pueden favorecer

transferencia horizontal de

genes

• Existen beneficios asociados:

• Efectivas en modelos animales sin necesidad de adyuvantes o sistemas de administración.

• Solo expresan genes que inducen inmunidad.

• Las produce el mismo animal, siguiendo las instrucciones del gen insertado en el plásmido de expresión.

• Menor dependencia de la cadena de frío que las vacunas con proteínas.



Vacunas comestibles. a partir de plantas modificadas

genéticamente que actúan como bioreactores de

antígenos

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Vacunas orales

Vehículos: células enteras LAB

o esporas Bacillus

sobrevivir aparato gastrointestinal

•retención de 2 a 3 días

•Vehículo de baja inmunogenicidad

•propiedades adyuvantes

•Sistemas genéticos (Food-Grade)

•No necesita aislamiento y purificación del antígeno

•producción IgA

•administración fácil, evita uso agujas

VACUNAS COMESTIBLES


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Vacunología Reversa

La vacunología reversa consiste en una búsqueda de

secuencias de genoma para la identificación de putativos

antígenos de superficie que podrían utilizarse como

candidatos para vacunas Sandra Ruzal CTBT 2011

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