biotecnologÍa para el desarrollo...
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BIOTECNOLOGÍA PARA EL DESARROLLO SUSTENTABLE DE LA PISCICULTURA EN AGUAS CONTINENTALES.
Por Emmerik MOTTE, Mario CUEVA, Jorge MEDINA, María Elena BERMUDES, Eric MIALHE, Virna CEDEÑO.
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Desembarques totales globales aumentaron: 18 mtm (1950) 158mtm (2012)
Producción mundial de la pesca de captura y la acuicultura
0
20
40
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80
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2016
2019
2022
2025
Mil
lon
es d
e T
m.
Producción mundial de acuicultura supera los 90,4 mtm, de los cuales 70,5 mtm, destinado al consumo humano, + 5,8% entre 2000-2013 (FAO 2014). AL&C ↗ 10% Se producen 78% más peces, 308% más crustáceos y 60% más moluscos que hace 20 años.
91,3 mtm
158 mtm
42,2%
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Producción mundial de la acuicultura
La producción en agua continental: alrededor de 63% en 2012 (41,9 mtm) En 2010, la producción en agua dulce represento el 58.1% del valor de la producción global.
La tasa de crecimiento anual promedio de la producción dulceacuícola entre 2000 y 2010 fue de 7.2%, comparado con 4.4% para la producción acuícola marina.
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Retos de la producción mundial de la acuicultura
Producción Rentable de Animales Sanos con un Impacto Ambiental Limitado mejorar las tasas de crecimiento , mejorar la eficacia de la alimentación mejorar la reproducción, disminuir las pérdidas causadas por las enfermedades, mejorando la respuesta inmune, mejorar las técnicas de diagnóstico y las medidas profilácticas.
La Revolución Biotecnológica “Omics” y mejor nutrición puede acelerar la consecución de estos objetivos.
La FAO proyectó que, para satisfacer las necesidades de la población humana, la producción total debería aumentar a 181mtm, con 161mtm para consumo humano (2022).
Aumentar Eficiencia en la Producción de las especies cultivadas. Para lograrlo Amplios esfuerzos en investigación en acuicultura.
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La Biotecnología Moderna ó Biotecnología Molecular
Actual y Futura Moderna Tradicional
La biotecnología moderna, basada en la aplicación de nuevos métodos moleculares y estudios celulares, con técnicas de “ingeniería genética”– es una ciencia fascinante que tiene un potencial enorme para responder a los problemas de la producción acuícola.
Diagnóstico molecular, cultivo celular,
domesticación de microorganismos, …
Genómica y Metagenómica, Transcriptómica, Proteómica;
Valorización de moléculas, Edicion de genomas (TALENs,
CRISPR/Cas9), …
Procesos de fermentación (Ej.: productos panificados, bebidas alcohólicas [vino,
cerveza] y lácteos [quesos, yogures], …
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MALDI TOF TOF Mass Imaging
Electroforesis 2D
Micro-Arrays Secuenciación, PCR, Q-PCR …
Del gen a la proteína y tecnologías “ómicas”
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Aplicaciones de la biotecnología en ambientes marinos y acuáticos: Diagnósticos moleculares,
Certificación de reproductores , ovas y larvas, Tratamientos y vacunas de nueva generación,
Domesticación de microorganismos,
Mejoramiento genético y marcadores eQTLs,
Control de la reproducción, sexaje,
Nuevas alternativas de nutrición,
Obtención de nuevos productos a partir de la biodiversidad marina y acuática.
BIOTECNOLOGÍA AZUL ó BIOTEC. ACUÁTICA
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1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
PCR Real-Time PCR LAMP
Inmunostrip
útiles cuando los microorganismos son difíciles de cultivar, ya que permiten
su identificación sin necesidad de aislarlos.
Herramientas biotecnológicas: - Inmuno-diagnósticos con Mabs - PCR y variantes, Real-Time PCR, LAMP - Secuenciación del ADN Diagnóstico rápido, sensible y preciso.
Aplicación para identificación de Bacterias, Rickettsias, Micobacterium, Parásitos, Hongos, Virus... Genotipificación, id. de factores de virulencia y resistencia a tratamientos.
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Aquabirnavirus: Necrosis Pancreatica Infecciosa “IPNv”
Novirhabdovirus: Necrosis Hematopoyética Infecciosa “IHNv” Septicemia hemorrágica viral “VHS”
Iridovirus: Necrosis Hematopoyética Epizoótica “EHNv” , Linfocistis virus
Isavirus
Herpesvirus: Channel Catfish Disease “Herpesvirosis”
“viral encephalopathy and retinopathy” “viral nervous necrosis”.
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
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Alineamiento de Secuencias Las secuencias conservadas se analizan en un editor de alineamientos
Todas las secuencias se alinean mecánicamente y se editan manualmente
IPNv1 IPNv2 IPNv3 IPNv4 IPNv5 IPNv6 IPNv7
Selección de primers
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
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1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
Ventajas: - Alta sensibilidad - Alta especificidad - Rapidez
35 a 40 ciclos Millones de copias
Reacción en cadena de la polimerasa “PCR”
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1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
REVERSE TRANSCRITASE PCR“RT-PCR”
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1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
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Lanes 2 to 4: fish infected with Y. ruckeri ; Lanes 5 to 7: fish infected F. psychrophilum ; Lanes 8 to 10: fish infected A. salmonicida ; Lanes 11 to 13: control fish with PBS; lane 14: non template control; Lane 15: fish from a Y. ruckeri outbreak; Lanes 16 to 18: fish from F. psychrophilum outbreaks
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
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ISA: anemia infecciosa del salmón; VHS: septicemia hemorrá-
-gica vírica; VER: retinopatía y encefalopatía vírica;
IPN: necrosis pancreática infecciosa; IHN: necrosis hemorrá-
-gica infecciosa; CC: viremia del pez gato;
SD: enfermedad del sueño.
Gen amplificado Gen amplificado
Gen amplificado
Agente Agente
Agente
Tipo de ensayo Tipo de ensayo
Tipo de ensayo
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
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- La Real-Time PCR detecta a acumulación del producto durante la reacción. - La detección y cuantificación de agentes fluorescentes en “tiempo real”. - La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad Cuantificación
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
SYBR Green
Taq-man
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• Basado en la utilización de una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena (Bst)
• Reacción auto-cíclica a temperatura constante
• Alta eficiencia de amplificación (109-1010 veces en 15-60 min)
NOTOMI et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. 2000
Electroforesis
Turbidez
Fluorescencia
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
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Síntomas: Peces débiles con descoloración oscura, abrasiones en la piel, y degeneración ocular. Mortalidades en 2011, 2013, …..
Resultados: Es un nuevo virus, patógeno emergente de tilapia. La caracterización del genoma Diagnostico por PCR y estudios epidemiológicos.
Tilapia lake virus (TiLV) genoma de 10-segmentos de ARN(-). El mas grande tiene homologías con la subunidad PB1 del virus de influenza C. 9 segmentos extremos con secuencias conservadas encontradas en otros orthomyxoviruses. La replicación y transcripción ocurre en el hígado y sistema nervioso.
Desde 2009, mortalidades masivas en Israel y Ecuador. Evidencia de un nuevo orthomyxo-like virus estos brotes.
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
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Láser (337nm)
Cámara
Microplaca
Zona de aceleración TOF1
Fuente de ionización 1
Fuente de iones 2
Zona de decaimiento TOF2
Detector
Selector de iones
Detector lineal
Espejos de iones (Reflectrón)
Pila de desaceleración
El MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time-Of-Flight Mass)
Alta capacidad de análisis Alta sensibilidad Alta precisión en la determinación de masas moleculares proteicas.
Poderosa técnica micro-analítica esencial que permite determinar con gran precisión la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z).
Proteómica: MALDI-TOF MS
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Proteómica: Identificación de virus y su caracterización
Espectros de péptidos de la capside viral
SDS-PAGE de proteínas obtenidas
de muestras infectadas (I)
y no infectadas (U).
La espectrometría de masa sola o combinada con otras técnicas, permite la separación e identificación de proteínas y péptidos simultáneamente.
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Gel de electroforesis 2D para proteínas
a) Individuo No Infectado b) Infectado
Proteómica “MALDI-TOF/TOF”
Secuenciación de la proteína por
HPLC-MS/MS
(Identificación de la proteína de
cápside del virus X)
Proteómica: Identificación de virus y su caracterización
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Identificación del espectro de cepas
bacterianas.
Proteómica: Identificación de virus y su caracterización
Flavobacterium columnare
F. psychrophylum
Vibrio anguilarum
Yersinia ruckeri
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2) Prevención de enfermedades y
Domesticación de microorganismos benéficos
Prevención de enfermedades infecciosas: - Certificación de los genitores, alevines, ovas - Vacunación - Uso de probióticos
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Prevención de enfermedades: Certificación de genitores y
ovas
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Prevención de enfermedades: Certificación de genitores y
alevines
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La primera vacuna descubierta fue la usada para combatir la viruela por Edward Jenneren ,1796.
VACUNAS VIVAS Vacunas heterólogas Vacunas atenuadas
VACUNAS INERTES (NUEVA GENERACIÓN) Más seguras y eficaces
Vacunas inactivadas Vacunas de antígenos recombinantes Vacunas de ADN Péptidos sintéticos
Prevención de enfermedades: Vacunas
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Prevención de enfermedades: Vacunas de ADN
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Prevención de enfermedades: Vacunas
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Prevención de enfermedades: Vacunas
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PATÓGENO GEN PLÁSMIDO PEZ
VHSV Glico protein pcDNA (Invitrogen)
Promotor CMV Trucha arcoriris
IHNV Glico protein pcDNA (Invitrogen)
Promotor CMV Trucha arcoriris
NNV Viral P pET24a Larvas de bacalao
HIRRV Glico protein
N protein
pCI-neo (Promega)
pcDNA 3.1(Invitrogen)
Promotor CMV
Lenguado japonés
LCDV Major Capsid protein pEGFP-N2 (Invitrogen) Lenguado japonés
RSIV Major Capsid protein pCI-neo (Promega) Dorada
IPNV Viral Protein 2
Viral Protein 3, SegA
pEGFP-N1 (Clontech Lab)
Promotor CMV Zebra
Aeromonas
hydrophila
Outer Menbrane
Protein TS pQE30-UA Carpa india
Vibrio anguillarum Menbrane Protein 38 pcDNA3.1
Promotor CMV
Corvina
Robalo asiático
Mycobacterium
marinum
Fibrinogen-binding
protein A
pcDNA3.1
Promotor CMV
Robalo rayado
híbrido
Prevención de enfermedades: Vacunas
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Vacunas de nueva generación : Mapeo de Epítopes
El alto grado de mutaciones en las proteínas estructurales hacen difícil el desarrollo de vacunas. Los epítopes más conservados y preseleccionados por la bioinformática pueden ser candidatos para el desarrollo de péptidos vacunas
Estructura terciaria de la glicoproteína E viral
EPITOPE MAPPING
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Vacunas de nueva generación : Mapeo de Epítopes
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Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. benéficos
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Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. benéficos
Garantizan una mejor supervivencia y productividad.
Producción de biomasa - Estudios de los Bioflocs
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Análisis moleculares: Caracterización de cepas de interés Expresión de genes de interés → Nutrición, → Nitrificación → Colonización
Análisis proteómicos: Quorum sensing Interacciones microbianas Metabolitos de interés
Microbioma
Metagenómica
Identificación de comunidades microbianas
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. benéficos
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Domesticación µorg. Benéficos Metagenómica
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Marcador de Bacillus spp. = endoglucanase
Caracterización de bacterias benéficas por MALDI-TOF
Detección del péptido “leader” de nisina Z por MALDI TOF MS
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Análisis Molecular Instantáneo de microbios por “MALDI-TOF imaging”, obtenido en agares.
Interacción entre Bacillus subtilis y Streptomyces coelicolor
Imaging de bacterias por MALDI-TOF
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Gnotobiología
Aislamiento, caracterización molecular y domesticación
de microorganismos
naturalmente asociados al tracto digestivo
para la prevención de enfermedades bacterianas
y el incremento de la productividad.
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. benéficos
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Criterios de Selección: - Forma – Tinción de Gram - Amilasa, Proteasa y Lipasa - Lactonasa (QUORUM-QUENCHING) - Pruebas de antagonismo
Extracción del ADN
Amplificación de los genes
16SrRNA and rpoB
Análisis de
secuencias
Animales silvestres
Aislamiento de
unidades
formadoras de
colonias
Homogeneización
y suspensión de
secciones del
intestino
DNA
Sequencer
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. benéficos
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Pruebas de
cultivo in vivo
Cepa L-A 1 Cepa L-A 2 Mezcla L-A 1/2
Resistencia
a patógenos
Incremento
del
crecimiento
y de la
sobrevivencia
Células inmunes
y expresión de
genes
inmunitarios
Infección
experimental con
vibrios patógenos
Pruebas
in vitro Pruebas in vitro
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. Benéficos
Convencionalización
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Análisis 3D espacio-temporal de la
colonización mono- y multi-específica
Día de eclosión Día 1 post-eclosión Día 2 post-eclosión Día 3 post-eclosión
Colonización controla por una cepa
probiótica de Lactobacillus en
Dicentrarchus labrax
Seguimiento de la apertura de la boca en la vieja azul “Aequidens rivulatus”
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. Benéficos
Convencionalización
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Hasta inicio alim., alevines mantenidos en agua estéril en baldes de (8Lt)
Densidad= huevos /balde con1lt agua al inicio
Inoculación de bacteria día 2 post-eclosión, 104UFC/mL , cada 2 días.
Desde 1 dph hasta 30 dph (1mes)
1
0,81 0,89 0,85
1,04 1
1,19 1,12
1,19
1,36
1
1,46
1,26
1,40 1,31
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
controle B. cereus B. pumilus B. megaterium Mix
Survival gain
Biomass gain
Weight gain 1
Aumento de la biomasa y peso individual en el primer mes de
cultivo, en un 36% and 31%, respectivamente.
Tilapia (O. niloticus)
convencionalizada
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1 1,05 1,07 1,08
0,89
1,29
0,86
2,05
1
1,26
1,00 1,06 1,07 0,95
2,34
1
1,2
0,93 0.98
0,83
1,18 1,13
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Controle B. cereus B. pumilis …
Lysinibacillus sp. Exiguobacterium sp. Kurthia sp.
Enterobacter sp. Acinetobacter sp. …
Ext. Tracto VA B. megaterium Bacillus sp. …
B. pumilus Bacillus sp. …
Survival gain Biomass gain Weight gain
Hasta inicio alim., alevines mantenidos en agua estéril en baldes de (8Lt)
Desinfección de huevos fertilizados y alevines..
Densidad= 100 alevines/balde con1lt agua al inicio.
Inoculación de bacteria día 2 post-eclosión, 104UFC/mL , cada 2 días.
Aumento sobrev. 105%, biomasa 134% y peso individual 20%
Con bacterias Gram +, amilasa, proteasa ylactonasa (+).
Vieja azul (Aequidens rivulatus)
convencionalizada
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Mejoramiento genético
Enfoque de la Transcriptómica y Proteómica para la identificación, caracterización, y la detección de genes y péptidos específicos de peces.
Pruebas moleculares
Microarrays
Real-Time PCR
Cuantificación
de la
expresión de
genes.
Genómica funcional: Transcriptómica / Proteómica
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Ensayos con diferentes dietas o variaciones en nutrientes para medir el efecto sobre los genes Id. de Biomarcadores
Selección asistida por Biomarcadores
Ef1 Ef2 Ef3 Muestras
Real-Time PCR Cuantificación precisa del nivel de expresión de los genes (Digestión, Transp. Nutrientes, Metabolismo proteico, lipídico, Hormonal, Sist. innmune, etc).
DIETA A DIETA B
“Chip” de ADN
Transcriptómica Expresión diferencial de genes
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- Altas mortalidades ocurren durante el desarrollo larval Destete
Comprender el desarrollo larval es de importancia para poder definir una correcta alimentación y condiciones de cultivo. La ontogenia de las funciones esenciales como: la digestión, la osmoregulación, la inmunidad y el metabolismo han sido extensamente investigadas durante el desarrollo larval de peces, a nivel de los componentes celulares, enzimas, metabolitos y la expresión de génica.
Transcriptómica Expresión diferencial de genes
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Fig- Agrupamiento hierárquico global de >400 familias de genes diferencialmente expresados durante el desarrollo larval de la lubina Europea. Rojo: AUMENTO y Verde: Reducción de la expresión relativa (Adapted from Darias et al. 2008).
Grupos de genes Co-expresados
1era fase, días 7 a 23 post-eclosión: - Genes involucrados en desarrollo visual
y neuronal. - Genes del metabolismo aeróbico.
2da fase, días 25 a 43 post-eclosión: - Grupos de genes relacionados con la
osificación y desarrollo muscular. - Metabolismo anaerobico y maduración
del tracto digestivo.
Transcriptómica Expresión diferencial de genes
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Proteomica funcional: Mass Imaging
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Revisión de la edición de genoma por TALEN y CRISPR/Cas9
Ó
Edición de genomas: Mutagenesis dirigida
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Edición de genomas: Mutagenesis dirigida
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Domesticación de nuevas especies
Aplicaciones de la GnRH en la producción acuícola Adelantar / retrasar / extender, la estación de reproducción natural; Sincronizar el lote de reproductores; Mejorar la cantidad y la calidad de la espermación; Mejorar la ovulación de las hembras (hidratación y de liberación de los ovocitos) Inducir una primera reproducción / maturación (Domesticación).
La GnRH : Hormona liberadora de Gonadotropinas La GnRH es un decapeptido bien conservado en los vertebrados. Liberación de manera pulsada en el organismo. El tamaño pequeño del gen permite su manipulación y también una posible síntesis artificial del decapeptido.
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Determinación genética del sexo de los reproductores Largo tiempo de mantenimiento antes la madurez sexual. No presencia de caracteres sexuales secundarios fácilmente identificables. Determinación genética y ambiental del sexo. Mejorar el comportamiento de los reproductores : - Sexo Ratio optimo - Inducir un cambio de sexo en función de la necesidad (Especies hermafroditas) Estudio de los genes del determinismo genético:
-DMRT1, DMY, Cyp19, Sox9, etc… Diagnóstico temprano (antes de la pubertad) Dosificación de hormonas en el plasma (periodo de reproducción).
Desarrollo de poblaciones mono-sexo Reversión hormonal, temperatura, Ginogenesis /Androgenesis
Poliploidía (control de la fertilidad) Triploidía, Tetraploidía…
Domesticación de nuevas especies
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Domesticación de nuevas especies
![Page 56: BIOTECNOLOGÍA PARA EL DESARROLLO …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/2-Biotecnología... · La biotecnología moderna, basada en la aplicación de nuevos métodos](https://reader031.vdocumento.com/reader031/viewer/2022020215/5ba985e609d3f28b6f8c5890/html5/thumbnails/56.jpg)
- Transcriptómica - Proteómica
Los nutrientes
afectan a la expresión de genes y a las
funciones celulares.
Food-Omics: Nutrigenética y Nutrigenómica
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Desafíos de Nutri-ómica en Acuacultura
Nuevas alternativas para reemplazar harinas y aceites de pescado: - Harinas de origen vegetal - Hidrolisados obtenidos de co-productos (desechos de carne y acuícolas,
menudencias, plumas, sangre), o subproductos de desechos animales = Fuente de péptidos de cadenas cortas (di, tri-péptidos) y amino ácidos libres, péptidos bioactivos…
Propiedades importantes: - Mejor absorción, digestión y asimilación… - Mejor atractabilidad (inosina) y sabor agradable… - Actividades antioxidantes (carotenoïdes, carnosina “dipéptido de
histidina”, ) y antimicrobianas (péptidos ricos en cisteínas, arginina)…
Calidad de las harinas (peptidos cortos) y aceites (contenido de PUFAs).
Genes asociados con la absorción de nutrientes = peptide transporter, glucose transporter...
Inmuno-Nutrición, Control de la Reproducción, etc…
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= Alternativas para la producción de ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs) de tipo “omega-3” (ácido docosahexaenóico [DHA] y ácido eicosapentaenóico [EPA]).
a Dunaliella sp. 100x, b Chaetoceros sp. 100x,
c Chlorella sp., d Haematococcus sp.,
e Spirulina sp.
Células de cepa de Schizochytrium sp. (Traustoquítrido) presantando numerosos
cuerpos lipídicos.(Bara 20 μm).
(MICRO)ALGAS PROTISTAS MARINOS (Traustoquítridos)
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Desarrollo de la acuacultura social y popularización de biotecnología acuícola
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Desarrollo de la acuacultura social y popularización de biotecnología acuícola
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EL FUTURO DE LA ACUICULTURA ESTA EN LA BIOTECNOLOGÍA La Revolución “Ómica”