UNIVERSIDAD TECNOLOGICA METROPOLITANA

LABORATORIO DE BIOQUMICA

Informe

Practico N2

Centrifugacin

Autores:

Xiomara Campos Lorca

Sebastin Sandoval Grandon

Wladimir Vega Valdes

Fecha:

21 de Abril del 2015

IntroduccinPor muchos aos el hombre ha intentado estudiar las unidades estructurales que componen a las clulas y otros organismos microscpicos, con la finalidad de comprender su funcionamiento. Para separar y analizar estas clulas, organelos, y macromolculas biolgicas se ha implementado la tcnica de centrifugacin la cual no solo es aplicable en organismos vivientes sino que tambin se puede emplear en la materia inerte.

La centrifugacin es un mtodo por el cual se pueden separar slidos de lquidos de diferente densidad por medio de una fuerza giratoria. Esta fuerza es provista por una mquina llamada centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento de rotacin que origina una fuerza que produce la sedimentacin de los slidos o de las partculas de mayor densidad.

Los componentes ms densos de la mezcla se desplazan fuera del eje de rotacin de la centrfuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla se desplazan hacia el eje de rotacin. De esta manera los qumicos y bilogos pueden aumentar la fuerza de gravedad efectiva en un tubo de ensayo para producir una precipitacin del sedimento en la base del tubo de ensayo de manera ms rpida y completa.

La velocidad de sedimentacin (V) a la que es sometida una muestra depende directamente de la masa de la partcula (m), el volumen de la partcula (v), la densidad de la solucin (p), el coeficiente de roce () y del campo centrfugo de magnitud (w2r). Todos estos factores por los cuales depende la velocidad de sedimentacin se pueden definir por medio de la siguiente expresin:

V = m ( 1 v p ) w2 r /

Existen diversos tipos de centrifugacin que se utilizan de acuerdo a lo que se desee separar, empleando distintos rotores, velocidades, tiempos y medios. Como por ejemplo, existe la centrifugacin diferencial la cual permite separar componentes celulares por diferencias en coeficientes de sedimentacin a partir de un homogenizado celular. Por otro lado tambin existe la centrifugacin en gradientes la cual permite obtener un mayor grado de resolucin en la separacin lo que permite un anlisis ms especfico de los componentes.

Procedimientos1.-Una de la etapas ms relevantes, al comenzar un prctico de laboratorio, es la de limpiar, desinfectar e higienizar el lugar de trabajo, las herramientas, y el material que se utilizar. Esta accin permite que el resultado final de las reacciones qumicas efectuadas no sean alteradas desfavorablemente por el hecho de que ocurra una contaminacin por falta de higiene.

2.-En primera instancia se pesaron 15 gr de hojas de espinacas y se molieron en un mortero, agregndole paulatinamente 30 ml de medio homogenizante frio mientras se trituraba el vegetal.

3.-Rapidamente se filtr la pulpa a travs de un trozo de gaza, extrayendo as el lquido residual y depositndolo en un vaso precipitado.

4.-Inmediatamente se transfirieron 15 ml del filtrado en un tubo y se centrifug a 4C por 5 minutos a 1000 r/min para remover clulas enteras y otros restos de tejidos vegetales.

5.-Luego se retir el sobrenadante de la primera centrifugacin y se deposit en dos tubos de manera que tuviesen la misma cantidad del zumo. Posteriormente se centrifug a 4C por 10 minutos a 12.000 r/min en la centrfuga Sigma.

6.-Por otro parte, se prepararon dos tubos de centrfuga para la gradiente de sacarosa. Se colocaron las siguientes soluciones lentamente y en orden a cada tubo, escurriendo el lquido por las paredes del tubo:

1.5 ml de sacarosa 60%

3.0 ml de sacarosa 57%

4.5 ml de sacarosa 50%

4.5 ml de sacarosa 44%

1.5 ml de sacarosa 33%

7.-Luego de la segunda centrifugacin se retir el sobrenadante y se resuspendi el pellet en 1,5 ml de medio homogenizante. Seguido de esto se distribuy cuidadosamente 1 ml de pellet sobre la gradiente de sacarosa de los tubos de centrfuga que se haba preparado previamente.

8.-En seguida se equilibr el peso de los tubos en porciones iguales y se procedi a centrifugarlos a 4C por 1 hora a 25.000 r/min en la centrfuga Beckman.

9.-Una vez completada la centrifugacin se eligi el tubo que mejor tenia enmarcada las zonas de sacarosa. Luego se fraccion su contenido con una micropipeta tomando volmenes de 1 ml colocndolos en tubos eppendorf.

10.-Finalmente con la ayuda de un refractmetro se determin el porcentaje de sacarosa en cada fraccin y su correspondiente densidad.

ResultadosLos siguientes resultados representan la concentracin de sacarosa en cada muestra de 1,0 ml de solucin, separada en los distintos tubos eppendorf y su correspondiente densidad segn su porcentaje de concentracin.N de muestraPorcentaje gr / 100 mlDensidad (gr/cm3)

134,51,14

234,41,14

334,51,14

433,81,14

532,61,13

635,51,15

737,51,16

838,71,16

940,31,17

1042,71,18

1143,61,19

1245,81,20

1346,91,20

1448,41,21

1548,91,21

1646,71,20

Una vez determinada la densidad de cada fraccionamiento, se prosigui a estimar en que fracciones se es posible encontrar las diferentes estructuras celulares segn su densidad.

Estructura celularDensidad de la estructura (gr/cm3)N de muestras donde se pueden encontrar

Membranas plasmticas1,167 y 8

Retculo endoplasmico liso1,167 y 8

Mitocondrias1,1911

Lisosomas1,2114 y 15

Discusin:

Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado (una solucin amortiguadora, salina o azcar isotnica). Para mantener la integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento del fraccionamiento, todas las soluciones y cristalera deben mantenerse fras. Despus de rebanar las hojas, el tejido est preparado para la homogenizacin, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin daar el medio en suspensin. La suspensin de clulas constituyentes se llama homogenado. Para los tejidos de plantas, la homogenizacin se realiz con un mortero, al cual se le aade homogenizante fro. Como resultado, queda una pasta fina que consiste de las clulas y sus organelos por separado. Se refiere al rompimiento de las clulas o el tejido del cual se pretende extraer la organelo o la molcula de inters biolgico.

Luego para poder extraer los organelos se dispuso a centrifugar en centrifuga sigma para poder remover clulas enteras y resto de tejidos vegetales.

Tanto la viscosidad de la disolucin-muestra como las propiedades fsicas de las partculas afectarn a la sedimentacin individual de las mismas.

Una vez terminado la primera centrifugacin se dispuso a realizar una sedimentacin a travs de un gradiente de concentracin previamente formada, las molculas en sedimentacin estaran constantemente entrando en una zona de mayor densidad. Su llegada aumentara la densidad de la regin, pero si el gradiente fuera suficientemente fuerte, el soporte de las molculas recin llegadas sera insuficiente para ocasionar una inversin de la densidad y el sistema permanecera estable.

El material utilizado para formar gradientes de densidad en esta centrifugacin es la sacarosa, dado su comportamiento inerte ante la presencia del material biolgico, su bajo costo y su naturaleza estable. Debido a su gran uso, se han caracterizado las propiedades de la sacarosa y de sus soluciones con respecto a sus relaciones de concentracin y viscosidad, densidad e ndice de refraccin en un gran rango de temperaturas, y es posible encontrar las descripciones de los gradientes disponibles y condiciones de centrifugacin para la separacin de un gran tipo de muestras biolgicas. La principal desventaja de la sacarosa son algunas de sus propiedades fisicoqumicas. Las soluciones de sacarosa tienen alta fuerza osmtica y las soluciones por arriba del 9% (p/V) son hipertnicas y solo tienen una densidad de 1.03 g/cm 3 lo que reduce su uso en la separacin de partculas osmticamente sensibles. Las soluciones concentradas de sacarosa requeridas para separaciones isopcnicas son muy viscosas, por lo que, las partculas pequeas son incapaces de alcanzar su posicin isopcnica en el gradiente. La sacarosa es muy susceptible a hidrlisis de los enlaces glicoslicos a pH menores a 3. Cuando se calientan, y a menos que se ajuste el pH a 5-6, las soluciones concentradas tienden a caramelizarse por arriba de los 100 0 C. Esta caramelizacin provoca cambios en las propiedades de la solucin de sacarosa.

Los gradientes de sacarosa pueden ser preformados para fraccionamiento zonal de macromolculas y complejos macromoleculares, por ejemplo, protenas, cidos nucleicos, ribosomas y polisomas, tambin se utiliza gradientes de sacarosa para la separacin isopcnica.

Para que el gradiente salga bien se tuvo que tomar las siguientes precauciones:

-La densidad de las partculas utilizadas debe estar dentro de los lmites de las densidades de los gradientes.

-Las disoluciones deben de estar fras (nevera).

-Cada capa debe depositarse muy lentamente sobre la anterior, para evitar que se mezclen las disoluciones.

-Con cada disolucin se utiliza una pipeta Pasteur diferente.

-Sobre la ltima capa se deposita la muestra biolgica que consiste en un ml de un homogenizado de clulas de espinaca, que fue preparado previamente.

Las partculas viajan a travs del gradiente hasta el punto en el que su densidad es igual a la de la sacarosa circundante.

Luego de disponer los tubos de sacarosa con el pellet homogenizado suspendidos en ella, se vuelve a centrifugar en ultracentrifuga Beckman. En centrifugaciones sucesivas de mayor fuerza gravitacional y mayor tiempo se obtiene las diferentes fracciones de nuestro inters. Resultado de la centrifugacin:

De acuerdo a la ley de Stokes, tambin podemos separar las organelos de acuerdo a sus densidades relativas con respecto a un gradiente de densidades. Esto se midi mediante refractmetro en base a su porcentaje de densidad en cada refraccin de sacarosa.

ConclusinA travs de esta experiencia se logr comprender los procedimientos adecuados para realizar las centrifugaciones y su importancia en el estudio del funcionamiento de las estructuras celulares, ya que, se es posible un mejor estudio y enfoque cuando la estructura se encuentra aislado de los dems organelos celulares.Tambin se puede concluir que existen diferentes tipos de centrifugaciones y su uso depende de la estructura que se desea observar, de esta manera se planifica el nmero de centrifugaciones, la intensidad y la cantidad de tiempo que se necesita para obtener el organelo deseado.

Trabajo de investigacinDeterminacin del valor de hematocrito mediante centrifugacinEl valor de hematocrito indica el porcentaje volumtrico de eritrocitos en sangre. El mtodo de referencia para la determinacin del hematocrito es la centrifugacin. Mediante la centrifugacin se separan los componentes slidos de la sangre de los lquidos y se envasan hermticamente. En este mtodo la sangre se centrifuga en tubos capilares para hematocrito hasta que se alcanza la densidad mxima de compactacin celular.Tras una centrifugacin de la sangre total se pueden apreciar dos niveles, uno con el depsito de los glbulos rojos principalmente en color rojo oscuro, otra capa blanca, de leucocitos y una delgada de color gris, que son plaquetas y finalmente otro nivel del plasma total, de un leve color amarillento. La parte corpuscular por ser ms densa queda en el fondo del tubo, mientras que sobrenada la fraccin plasmtica. La cantidad y proporcin relativa de cada una de estas partes se denomina valor o ndice hematocrito. La medicin del valor hematocrito se fundamenta en la simple centrifugacin de una muestra de sangre incoagulable colocada en un tubo especial (tubo hematocrito) que lleva una escala de diez divisiones y que, tras la centrifugacin, permite medir la altura del volumen que ocupan los glbulos en el fondo del tubo y la del plasma que sobrenada. El volumen de concentrado de glbulos rojos, dividido por el volumen total de la muestra de sangre da el PCVCon equipos de laboratorio modernos, el hematocrito se calcula por un analizador automtico y no se mide directamente. Se determina multiplicando el recuento de glbulos rojos por el volumen corpuscular medio. El hematocrito es un poco ms preciso como el PCV incluye pequeas cantidades de plasma de la sangre atrapada entre los glbulos rojos. Un hematocrito calcula como un porcentaje puede ser derivado al triplicar la hemoglobina concentracin en g/dL y colocar las unidades. Se usa el hematocrito para determinar los ndices de critrocticos, calcular el volumen de sangre y la masa eritroctica total, y establecer si el paciente es anmico.